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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine genetisch manipulierte infektiöse replizierende
Tollwutvirusmutante und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen
Mutante.
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Tollwutvirus
(RV) ist ein Beispiel eines nicht segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus
der Rhabdovirdae-Familie. Andere Arten, die zu dieser Familie gehören, sind
das Virus der vesikulären
Stromatitis (VSV), das Virus der infektiösen hämatopoetischen Nekrose (IHNV),
das Virus der viralen hämorrhagischen
Septikämie
(VHS, Egtved-Virus), das Virus des Ephemeral-Fiebers des Rindes
(BEFV) und das Sonchus-Yellow-Net-Virus (SYNV).
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Neben
der Familie der Rhabdoviridae besitzen auch Viren, die zu den Paramyxoviridae
(z. B. Sendai-Virus (SV), Parainfluenza-Virus (PIV) Typ 2 und 3,
Virus der atypischen Geflügelpest
(NDV), Mumps-Virus (MUV), Maser-Virus (MEV) und Staupe-Virus des
Hundes (CDV)) und Filoviridae gehören, und etliche Viren, die
nicht einer Familie zugeordnet sind (z. B. das Virus der Borna'schen Krankheit;
BDV), ein nicht segmentiertes Negativ-Strang-RNA-Genom.
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Die
Gesamtheit der genomischen Organisation in den nicht segmentierten
Negativ-Strang-RNA-Viren
der verschiedenen Familien ist vergleichbar. Insbesondere gibt es
zwischen den Paramyxoviridae und den Rhabdoviridae lediglich geringe
Unterschiede in der Gesamtheit der genomischen Organisation (Tordo
et al., Seminars in Virology 3: 341–357, 1992).
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RV
kann alle warmblütigen
Tiere infizieren und in nahezu allen Fällen nach dem Auftreten von Symptomen
führt die
Infektion zum Tode. Tollwut beim Hund ist immer noch in vielen Teilen
der Welt wichtig: infizierte Hunde verursachen die meisten der schätzungsweise
75.000 menschlichen Tollwutfälle, die
jedes Jahr weltweit auftreten. In vielen europäi schen Ländern und in den Vereinigten
Staaten und Canada hat die Tollwut bei wild lebenden Tieren an Bedeutung
zugenommen.
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Die
klinischen Merkmale von Tollwut sind in den meisten Arten ähnlich,
jedoch gibt es große
Variation zwischen Individuen. Nach dem Biss von einem Tier mit
Tollwut beträgt
die Inkubationszeit üblicherweise
zwischen 14 und 90 Tagen, sie kann jedoch beträchtlich länger sein. Inkubationszeiten
von mehr als einem Jahr sind dokumentiert worden. Zwei klinische
Formen der Erkrankung werden als rasend und stumm oder paralytisch
erkannt. In der rasenden Form wird das Tier ruhelos, nervös, aggressiv
und oftmals gefährlich,
da es jegliche Angst vor Menschen verliert und nach allem beißt, das
seine Aufmerksamkeit erregt. Das Tier kann oftmals nicht schlucken,
was zu dem Synonym für
die Erkrankung ”Hydrophobie” führt. Oftmals
treten übermäßiger Speichelfluss, übertriebene
Reaktionen auf Licht und Geräusche
und Hyperästhesie
auf. Mit fortschreitender Enzephalitis nimmt die Wut zugunsten der
Paralyse ab und das Tier offenbart die gleichen klinischen Merkmale
wie sie durchweg in der stummen Form der Erkrankung beobachtet werden.
Im letzten Abschnitt treten häufig
krampfhafte Anfälle,
Koma und Atemstillstand auf, wobei der Tod 2–7 Tage nach Beginn der klinischen
Anzeichen eintritt.
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Das
Tollwutvirus dringt über
den Biss oder gelegentlich die Kratzwunde eines Tollwuttieres in den
Körper
ein oder, wenn Virus-beladener Speichel aus einem Tollwuttier in
eine offene Wunde eindringt. Die virale Replikation in der Bissstelle,
im Muskel, wird gefolgt von der Invasion von peripheren Nervenendungen
und die zentrale Bewegung von viralem Genom im Zytoplasma von Axonen
zum Zentralnervensystem. Der virale Eintritt in das Rückenmark
und anschließend
das Gehirn (insbesondere das limbische System) wird von klinischen
Anzeichen neuronaler Fehlfunktion begleitet. Üblicherweise werden, etwa zur
gleichen Zeit, bei der die Infektion des Zentralnervensystems die
Wut hervorruft, Virionen auch aus dem apikalen Ende von Schleim
absondernden Zellen in den Speicheldrüsen ausgeschüttet und
in hohen Konzentrationen in den Speichel abgegeben.
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Während des
gesamten Ablaufs der Tollwut werden die Entzündungs- und spezifischen Immunantworten
des Wirtes nur geringfügig
stimuliert; die wahrscheinlichsten Gründe dafür sind, dass die Infektion
im Muskel und in Nervenzellen nicht zytopathisch ist und dass die
Infektion hauptsächlich
in der immunologisch abgeschiedenen Umgebung des Nervensystems konzentriert
ist.
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RV-Virionen,
wie alle Rhabdoviren, sind aus zwei Hauptstrukturkomponenten zusammengesetzt: einem
Nukleokapsid- oder Ribonukleoprotein(RNP)-Kern und einer Hülle in Form
einer doppellagigen Membran, die den RNP-Kern umschließt. Die infektiöse Komponente
aller Rhabdoviren ist der RNP-Kern. Die genomische RNA ist negativ-sinnig und
kann somit nicht als ein Messenger dienen, sondern benötigt ihre
eigene endogene RNA-Polymerase
für die
Transkription von mRNA. Das RNA-Genom wird von dem Nukleokapsid(N)-Protein
in Kombination mit zwei Nebenproteinen, d. h., RNA-abhängige RNA-Polymerase (L) und
Phosphoprotein (P), eingekapselt, um den RNP-Kern zu bilden. Die
Membran-Komponente enthält
zwei Proteine: ein Transmembran-Glykoprotein (G) und ein Matrix(M)-Protein,
das an der inneren Seite der Membran lokalisiert ist. Das G-Protein ist für die Zellanheftung
und Membran-Fusion bei RV verantwortlich und ist zusätzlich das
Hauptziel für
das Immunsystem des Wirtes.
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Während der
Transkription steuert das Genom die sequentielle Synthese einer
kurzen Führungs-RNA
und fünf
monocistronischen, gekappten und polyadenylierten mRNAs. Während der
Replikation werden die konditionalen transkriptionellen Stopp- und
Startsignale zwischen den Cistronen von der viralen Polymerase ignoriert.
Sowohl für
die Transkriptase- als auch die Replikase-Reaktion wird die Anwesenheit
des N-Proteins, das mit dem RNA-Genom komplexiert ist, sowie der
L- und P-Proteine benötigt.
Die Gen-Anordnung auf dem RV-Genom ist bestimmt worden und ist 3'-Leader-N-P-M-G-L-5', wie in 1 gezeigt.
Jedes der mRNAs von RV wird ummittelbar nach der Transkription translatiert.
Zwei Ereignisse finden sequentiell während der Replikation statt:
zunächst
die Herstellung einer eingekapselten vollständigen Positiv-Strang-RNA,
die zu dem Genom komplementär
ist, gefolgt von der Herstellung vollständiger Negativ-Strang-RNA,
die ebenfalls von den N-, L- und P-Proteinen eingekapselt ist. Schließlich assoziieren
die neu zusammengesetzten RNP-Kerne mit M-Protein und G-Protein
während des
Zusammenbaus und des Knospungsprozesses, was zur Freisetzung von
vollständig
ausgebildeten und infektiösen
RV-Virionen führt.
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Die
11,9 kb genomische RV-RNA enthält
fünf offene
Leseraster (ORFs), die für
die N-, P-, M-, G- und L-Proteine kodieren, zusätzlich zur Anwesenheit einer
Pseudogen-Region (ψ)
zwischen den G- und L-Genen (1).
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Gegenwärtige Vakzine
für nicht
segmentierte Negativ-Strang-RNA-Viren umfassen chemisch inaktivierte
Virus-Vakzine oder modifizierte Lebendvirus-Vakzine, die einen abge schwächten Virus-Stamm
umfassen, dessen Pathogenität
durch mehrfaches Passagieren in Zellkultur herabgesetzt ist. Chemisch
inaktivierte Tollwut-Vakzine sind z. B.: Rabivac, Behringwerke (menschlich),
HDC, Rhone-Poulenc (menschlich), Bayovac-LT, Bayer (tierisch), Madivac,
Hoechst (tierisch), Epivax-LT, Pitman-Moore, Rabisin, Rhone-Merieux.
RV-Beispiele von solchen abgeschwächten Viren sind die Vakzin-Stämme SAD
B19 und ERA. Inaktivierte Vakzine induzieren im Allgemeinen nur
ein geringes Maß an Immunität, was wiederholte
Immunisierungen erfordert. Weiterhin können die neutralisationsinduzierenden
antigenischen Determinanten der Pathogene durch die Inaktivierungsbehandlung
verändert
werden, was das Schutzpotential des Vakzins herabsetzt.
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Im
Allgemeinen werden abgeschwächte
Lebendvirus-Vakzine bevorzugt, da sie eine Immunantwort hervorrufen,
die oftmals sowohl auf humorale sowie zelluläre Reaktionen basiert. Während der Zellkultur-Passage
können
jedoch unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt werden, was
zu einer Population von Virus-Partikeln führt, die hinsichtlich der Virulenz
und immunisierenden Eigenschaften heterogen sind. Eine übermäßige Abschwächung während der
Passage in Zellkultur kann ebenfalls ein Problem bei diesen Vakzinen
sein. Es muss eine empfindliche Balance hergestellt werden, wobei gewährleistet
sein muss, dass das Vakzin nicht virulent ist, während sichergestellt sein muss,
dass es noch schützend
ist. Außerdem
ist es wohl bekannt, dass solche traditionellen, abgeschwächten Lebendvirus-Vakzine
zur Virulenz zurückkehren
können, was
zu einer massenhaften Ausbreitung der Erkrankung in geimpften Tieren
und zur möglichen
Ausbreitung des Pathogens auf andere Tiere führt.
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Darüber hinaus
ist ein Problem mit kombinierten viralen Lebend-Vakzinen die gegenseitige Beeinflussung
der antigenischen Komponenten, was zu einer Verringerung der Stärke von
einem oder mehreren der bildenden Komponenten führt.
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Weiterhin
ist es mit gegenwärtig
verabreichten abgeschwächten
oder inaktivierten RV-Lebend-Vakzinen
nicht möglich
zu bestimmen, ob ein bestimmtes Tier ein Träger von RV-Feld-Virus ist oder ob das Tier geimpft
wurde. Somit kann es wichtig sein, zwischen Tieren, die mit einem
RV-Vakzin geimpft wurden, und denen, die mit einem Feld-Virus infiziert
wurden, unterscheiden zu können,
um in der Lage zu sein, geeignete Maßnahmen zu ergreifen, um die
Ausbreitung eines virulenten Feld-Virus herabzusetzen. Das Einführen beispielsweise
eines serologisch identifzierbaren Markers kann durch Einführen einer
Mu tation in ein Gen erreicht werden, das für ein (Glyko-)Protein von RV
kodiert, das normalerweise die Herstellung von Antikörpern in
einem infizierten Wirtstier verursacht.
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Es
ist erwünscht,
eine Mutation in das RV-RNA-Genom in einer kontrollierten Weise
einzuführen,
so dass beispielsweise das resultierende mutierte RV abgeschwächt ist
oder eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz
umfasst, die für
Epitope von fremden Proteinen kodiert, beispielsweise immunologische
Marker-Proteine oder Antigene von Pathogenen. Rekombinante DNA-Techniken
sind bereits weithin zu diesem Zweck mit DNA-Viren und Positiv-Strang-RNA-Viren
im Gebrauch. Beispiele für
rekombinante DNA-Viren: Aujeszky-Virus
(PRV); Adenviren; Vaccinia-Viren. Beispiele für rekombinante Positiv-Strang-RNA-Viren: Alphaviren
(Sindbis-V., Semliki Forest-Virus: H. V. Huang, C. M. Rise, C. Xiong,
S. Schlesinger (1989) RNA viruses as gene expression vectors. Virus
Genes 3, 85–91).
Picornaviren (Polio-Virus, Hepatitis-A-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus:
J. W. Almond und K. L. Burke (1990) Poliovirus as a vector for the
presentation of foreign antigens. Semin. Virol. 1, 11–20). Die
gerichtete genetische Manipulation von RNA-Virus-Genomen hängt von der Fähigkeit
ab, rekombinante RNAs herzustellen, die als eine Matrize von den
speziellen RNA-abhängigen
RNA-Polymerasen angenommen werden. Transkripte, die von vielen Standard-DNA-abhängigen RNA-Polymerasen
erzeugt werden (z. B. T7 RNA-Polymerase oder zelluläre RNA-Polymerase
II) und die virale Genome imitieren, werden von den Polymerasen
von vielen Positiv-Strang-RNA-Viren erkannt. Dies ermöglichte
die Gewinnung von infektiösen
Viren oder Replikons von cDNA-Transkripten und die Anwendung der
rekombinanten DNA-Technologie, um diese Genome in einer stellenspezifischen
Weise zu manipulieren. Da RNAs, die den Genomen von Positiv-Strang-RNA-Viren
entsprechen, als mRNA für
die Translation von viralen Polymerasen fungieren können, kann
ein infektiöser
Zyklus durch Einführen
der Genom-Analoga in eine Zelle initiiert werden. Die Matrize der
Polymerasen von Negativ-Strang-RNA-Viren ist jedoch ausschließlich der
RNP-Komplex. Darüber
hinaus und im Gegensatz zu Positiv-Strang-RNA-Viren mag ihre genomische
oder antigenomische RNA nicht als mRNA funktionieren und somit müssen alle
viralen Proteine, die an der Replikation und Transkription von künstlichen
RNAs beteiligt sind, in trans bereitgestellt werden.
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Ein
geeignetes System für
das Einkapseln von genomischen RNA-Analoga von Negativ-Strang-RNA-Viren
mit einem segmentierten Genom, um die geeignete Matrize bereitzustellen,
ist kürzlich
von Palese, P. et al.. (
WO 91/03552 )
offenbart worden. RNA-Transkripte
von Influenza-Virus-Genom-Segmenten wurden von gereinigten Proteinen
in vitro eingekapselt, die verwendet werden können, um gemeinsam mit einem
Helfer-Virus Zellen zu transfizieren. Es zeigte sich jedoch, dass
dieser Ansatz nicht erfolgreich mit RV war, einem Virus, das ein
nicht segmentiertes Genom aufweist. Kurze Model-Genome von VSV und
RV, denen der Großteil des
RNA-Genoms fehlt, das die Gene, die für die viralen Proteine kodieren,
umfasst, könnten
von durch Plasmid-kodierten Proteinen eingekapselt und exprimiert
werden (Pattnaik, A. K. et al., Cell 69, 1011–1020, 1992, Conzelmann, K-K.
und M. Schnell, J. Virology 68, 713–719, 1994). Dieser Ansatz
umfasste die Ko-Expression sowohl von den Genom-Analoga, die gegebenenfalls
Reportergen-Inserts umfassen, als auch spezifischen viralen Proteinen
von transfizierten Plasmiden, um fehlerhafte Viruspartikel herzustellen.
Ballart et al. beschrieben ein Verfahren, um ein infektiöses Masern-Virus, ebenfalls
ein nicht segmentiertes Negativ-Strang-RNA-Virus, aus klovierter
cDNA zu erhalten (The EMBO-Journal, 9: 379–384 (1990)). Eine europäische Patentanmeldung,
die dieses Verfahren betrifft, wurde mit dem Verfasser als einem
der Erfinder eingereicht.
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Sowohl
die Publikation als auch die Anmeldung wurden jedoch zurückgezogen,
da weitere Forschung enthüllte,
dass alle vermuteten rekombinanten Viren gar keine Rekombinanten
waren, sondern nur Virusabkömmlinge
des ursprünglich
verwendeten Vakzin-Strangs.
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Somit
muss gefolgert werden, dass Versuche, infektiöse rekombinante Negativ-Strang-RNA-Viren mit einem
großen
nicht segmentierten Genom zu erhalten, das die Manipulation von
ganzen Genomen erfordert, bis heute gescheitert sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine genetisch manipulierte, infektiöse, replizierende
Tollwutvirusmutante bereit, die durch rekombinante DNA-Techniken
erhältlich
ist, umfassend eine Insertion oder Deletion in einem ORF, einer
Pseudogen-Region oder einer nicht kodierenden Region des RV-Genoms.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine genetisch
manipulierte, infektiöse,
replizierende Tollwutvirusmutante bereit, die eine Insertion und/oder
Deletion in einem offenen Leseraster, einer Pseudogen-Region oder
einer intergenischen Region des Virusgenoms umfasst, dadurch gekennzeichnet,
dass die Virusmutante eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die für ein Epitop oder
Polypeptid eines pathogenen Virus oder Mikroorganismus kodiert,
trägt.
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Spezifische
Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen genetisch
manipulierten, infektiösen, replizierenden
Tollwutviren sind in den Ansprüchen
2 bis 6 und 8 bis 13 definiert.
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Wie
oben beschrieben ist eine große
Homologie in der genomischen Organisation zwischen den nicht segmentierten
Negativ-Strang-RNA-Virus-Familien vorhanden. Wo die Funktion von
kodierten Proteinen im Prozess der Replikation, des Zusammenbaus,
der Zellanheftung oder der Zellfusion vergleichbar ist, werden diese
Proteine im Weiteren als ”Analoga” bezeichnet.
Es kann sein, dass die Funktion von z. B. zwei Proteinen einer Familie
in einem Protein einer anderen Familie vereinigt ist. Dies ist z. B.
bei den F- und HN-Proteinen
der Paramyxoviridae der Fall, die gemeinsam die gleiche Funktion
aufweisen wie Glykoprotein G der Rhabdoviridae. In diesem Fall werden
die beiden Proteine der einen Familie als Analoga des einen Proteins
der anderen Familie betrachtet.
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Die
Insertion und Deletion von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten
können
in das RV-Genom durch Einführen
der geeigneten Mutationen in das korrespondierende virale ORF, die
Pseudogen-Region oder die nicht kodierende Region eingeführt werden.
Diese Veränderung
wird als Änderung
der genetischen Information in dem RV-ORF oder Pseudogen eines Stamm-RV
verstanden, wodurch die erfindungsgemäße Insertions- oder Deletions-RV-Mutante
erhalten wird.
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Eine
Mutation, bei der ein oder mehrere Nukleotide durch andere Nukleotide
ersetzt sind, ein sogenannter Substitutionsaustausch, wird als das
Ergebnis einer kombinierten Deletions- und Insertions-Aktivität betrachtet.
Diese Art von Mutation wird somit auch in dem Wortlaut: Deletion
und(/oder) Insertion als eingeschlossen betrachtet.
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Es
ist ersichtlich, dass eine beliebige Mutation, wie hierin definiert,
eine Veränderung
von geeigneten RV-Sequenzen umfasst, so dass die resultierende RV-Mutante
immer noch infektiös
und replizierend ist, d. h. das mutierte RV ist fähig, empfängliche Zellen
zu infizieren und sein mutiertes RNA-Genom ist zur autonomen Replikation
und Transkription fähig,
d. h. keine Ko-Expression von N-, P- und L-Proteinen von RV ist
erforderlich.
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Es
ist selbstverständlich,
dass in der vorliegenden Erfindung mutierte RVs ebenfalls umfasst sind,
die nur zu einer einzigen Infektionsrunde fähig sind, gefolgt von Replikation
(s. unten).
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Die
genomische Organisation verschiedener RV-Stämme ist identisch. Die Analyse
der Nukleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Vakzinstammes
SAD B19 und des virulenten Stammes PV sind bestimmt worden (Conzelmann
et al., Virology 175, 485–499,
1990 und Tordo et al., Nucleic Acids Res. 14, 2671–2683, 1986;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3914–3918, 1986; Virology 165, 565–567, 1988).
In Conzelmann et al., 1990 (oben) wird bestimmt, dass das virale
Genom des SAD B19-Stammes 11928 Nukleotide umfasst und dass die
abgeleitete Aminosäure-Sequenz
der fünf
viralen Proteine N, P, M, G und L in hohem Maße zu denjenigen des pathogenen
PV-Stammes ähnlich
sind. Die Lage der jeweiligen ORFs, der Pseudoregion und der intergenetischen
nicht kodierenden Regionen in RV sind hierin bestimmt worden: die
kodierende Region der N-, P-, M-, G- und L-Gene von RV korrespondieren jeweils
mit Positionen 71–1423,
1514–2407, 2496–3104, 3317–4891 bzw.
5414–11797.
Die Pseudogen-Region (ψ)
ist an Position 4961–5359
kartiert, während
die intergenischen Regionen, die die fünf Cistrone trennen und die
von nicht kodierenden Sequenzen flankiert sind, die transkriptionelle
Start- und Stopp/Poly-Adenylierungssignale
enthalten, an Positionen 1483–1484,
2476–2480,
3285–3289, 5360–5383 kartiert
sind. Obwohl die Nummerierung und die Nukleotid-Sequenz von den
ORFs, der Pseudogen-Region oder den nicht kodierenden Regionen des
Stamm-RV-Stamms, der hierin verwendet wird, um eine Mutation einzuführen, nicht
notwendigerweise die gleichen sind wie diejenigen des SAD B19- oder
PV-Stammes, definieren die oben genannten Charakterisierungen dieser
Regionen genau ihre Lokalisation in dem Genom eines jeden beliebigen RV-Stammes.
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Ein
Verfahren, um ein abgeschwächtes
RV aus einem virulenten Stamm-RV-Stamm zu erhalten, ist das Einführen der
Insertion und/oder Deletion in einem ORF, das für ein virales Protein kodiert,
beispielsweise derart, dass die Aktivität des viralen Proteins für eine Wirtszell-Anheftung
und -Membranfusion modifiziert, d. h. vermindert, ist. Für RV ist
bekannt, dass Veränderungen
in der Aminosäure-Sequenz
des Transmembran-Glykoproteins G signifikante Auswirkungen auf die
Pathogenität
des RV haben. Zusätzlich
können,
hinsichtlich der Abschwächung,
auch Änderungen
in dem Matrix(M)-Protein die Konformation des G-Proteins beeinflussen,
was in einer Abschwächung
des Virus resultiert. Somit sind mutierte RV, die eine Deletion
oder Insertion in dem ORF umfassen, das für das G- oder M-Protein kodiert, hierin besonders
bevorzugt.
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Ebenfalls
werden in der vorliegenden Erfindung infektiöse replizierende Tollwutvirusmutanten umfasst,
die nur zu einer einzigen Infektionsrunde, gefolgt von Replikation
fähig sind.
Der Vorteil davon wird unten erläutert:
Obwohl
allgemein gesprochen rekombinante Lebend-Vakzine sich als sicher
und wirksam erwiesen haben, besteht ein Risiko, dass die Vakzin-Viren
sich auf andere Tiere ausbreiten, die für das Virus empfänglicher
sind.
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Somit
gibt es einen starken Widerwillen sowohl auf politischer, ethischer
als auch zum Teil wissenschaftlicher Ebene, die Verwendung von rekombinanten
Viren auf dem Gebiet zu genehmigen.
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Insbesondere
für Studien
zur Risikoabschätzung
durch Regulierungsbehörden
hinsichtlich genetisch modifizierter Vakzin-Viren, insbesondere
Lebendviren, die Fremdgene exprimieren, ist der Aspekt, dass Viren
möglicherweise
in die Umwelt freigesetzt werden, ein sehr wichtiger Aspekt.
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Somit
kann anerkannt werden, dass Tollwutvirus-Vakzine, die alle Vorteile
von Lebendvirus-Vakzinen aufweisen, jedoch auf die geimpften Tiere
beschränkt
sind und nicht freigesetzt werden, in höchstem Maße erwünscht sind.
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Solche
Viren können
z. B. durch Mutation des M-Gens, das für das M(atrix-)-Protein kodiert, hergestellt
werden. Das M-Protein spielt eine Hauptrolle beim Zusammenbau des
Virus, wobei es zusätzlich
den Einbau und die Konformation des Glykoproteins G beeinflusst.
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Wenn
M(–)-Mutanten,
denen ein funktionelles M-Protein fehlt, in manipulierten Zellen
wachsen, die das M-Protein in trans herstellen, werden intakte Viruspartikel
hergestellt, die sich wie Wildtyp-Virus verhalten, insoweit es ihren
infektiösen
Charakter gegen ihren natürlichen
Wirt betrifft. Sobald sie jedoch eine Wirtszelle infiziert haben,
gibt es keine Möglichkeit, neue
infektiöse
Viren zu bilden, da ihnen die genetische Information zur Synthese
des M-Proteins fehlt.
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Somit
verbleiben sie im Wirt. Die Vorteile solcher Viren werden unten
diskutiert.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform
eine Insertion und/oder Deletion in dem offenen Leseraster, das
für das
Matrix-Protein M kodiert, so dass es ein nicht funktionelles Matrix-Protein
M oder sogar die Abwesenheit von Matrix-Protein M zur Folge hat. Die M(–)-mutierten
Viren mit dem nicht funktionellen oder feh lenden Matrix-Protein
M müssen
in Zellen wachsen gelassen werden, die ein Matrix-Protein M-Analog
in trans bereitstellen, um das Virus phenotypisch zu komplementieren.
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Alternativ
können
solche Viren z. B. durch Mutation des G-Gens hergestellt werden.
Das G-Protein spielt eine Hauptrolle frühzeitig in der Infektion, im
Prozess der Zellanheftung und Membranfusion, wie vorher erwähnt.
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Es
ist möglich,
das G-Gen durch Insertion und/oder Deletion (oder sogar durch Deletion
des gesamten G-Gens) in einem solchen Ausmaß zu mutieren, dass das resultierende
G–-mutierte Virus aufgrund
des schwer beschädigten
(oder sogar fehlenden) Glykoproteins G nicht länger fähig ist, andere Zellen erfolgreich
zu infizieren. Solche Mutanten werden im Weiteren als G-minus (G–-)Mutanten
bezeichnet.
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Diese
Art der Mutationen des G-Gens ist somit schwerwiegender als die
vorher beschriebenen Mutationen, die lediglich zu einer verminderten
Virulenz führen:
wirkliche G–-Mutanten sind nicht
infektiös,
da ihnen ein funktionelles Glykoprotein G fehlt.
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Wenn
solche G–-mutierten
Viren in rekombinanten Wirtszellen wachsen gelassen werden, die
für das
G-Protein komplementieren, werden Viren-Abkömmlinge ausgeschieden, die
phenotypisch G-positiv, jedoch gentypisch G-negativ sind.
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Diese
Viren besitzen einen wichtigen Vorteil gegenüber G-positiven Viren: auf
der einen Seite sind sie zur Infektion von nicht komplementierenden Wirtszellen
fähig,
da sie das G-Protein
in ihrer Membran besitzen. In den infizierten Fällen replizieren die G–-mutierten
Viren wie Wildtyp-Viren. Dies hat den Vorteil, dass das gesamte
virale Genom einschließlich
der heterologen Gene, die in das rekombinante Virus kloniert sind,
multipliziert wird und die kodierten Genom-Produkte wie beim Wildtyp-Virus
exprimiert und prozessiert werden.
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Auf
der anderen Seite kann jedoch kein Virus-Abkömmling in dem Wirt hergestellt
werden, da normale Wirtszellen das G-Protein nicht synthetisieren
und das mutierte Virus selbst gentypisch G-negativ ist.
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Somit
setzen mit G–-mutiertem
Virus infizierte Tiere kein infektiöses Virus in die Umwelt frei.
Dies macht G–-Mutanten
(wie auch die oben beschriebenen M(–)-Mutanten)
sehr sicher als Basis für
Vakzine.
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Alternativ
können
die erfindungsgemäßen G–-Mutanten
phenotypisch durch andere, Nicht-Tollwut-,
Glykoproteine komplementiert werden, von denen bekannt ist, dass
sie eine Rolle in der Zellanheftung spielen.
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Da
von Glykoprotein(en), das/die aus der viralen Membran in die Umgebung
herausragt/herausragen, bekannt ist, dass es/sie die Zellspezifität bestimmt/bestimmen,
ist es somit möglich,
durch Wahl des richtigen komplementierenden Glykoproteins die rekombinante
infektiöse
Tollwutvirusmutante auf andere spezifische Zellen als die natürlichen
Wirtszellen von Tollwut zu richten.
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Diese
Glykoproteine werden im Weiteren ”Glykoprotein-G-Analoga” genannt,
um darauf hinzudeuten, dass sie wie Glykoprotein G an der zellspezifischen
Anheftung beteiligt sind.
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Es
sollte bemerkt werden, dass in einigen Viren die ”Glykoprotein-G-Analoga”, die die
Zellspezifität
bestimmen, nicht Glykoproteine sondern nicht glykosylierte Proteine
sind. Es ist ersichtlich, dass diese Proteine ebenfalls innerhalb
des Umfangs der Erfindung liegen.
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Somit
ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung die Insertion und/oder Deletion in dem offenen Leseraster,
das für
das Glykoprotein G kodiert, solcher Art, dass ein nicht funktionelles
Glykoprotein G oder sogar die Abwesenheit von Glykoprotein G resultiert.
Die G(–)-mutierten
Viren mit dem nicht funktionellen oder fehlenden Glykoprotein G
müssen
in Zellen wachsen gelassen werden, die ein Glykoprotein G-Analog
in trans bereitstellen, um das Virus phänotypisch zu komplementieren.
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In
einer noch bevorzugteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das Glykoprotein-Analog, das für die Komplementierung
verwendet wird, das Tollwutvirus Glykoprotein G selbst.
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Rekombinante
infektiöse
Tollwutviren mit einem Glykoprotein-G-Analog besitzen mehrere wichtige
Vorteile:
- a) Sie können spezifisch auf bestimmte
Zellen, Organe oder Wirte gerichtet werden, in Abhängigkeit
von dem Ziel des Glykoprotein-G-Analogs, das gewählt wurde.
Dies impliziert,
dass beispielsweise speziell der Respirationstrakt oder der Verdauungstrakt
anvisiert werden kann. Somit können
z. B. Schleimhautreaktionen an einer vorbestimmten Stelle erhalten
werden.
Alternativ können
spezifische Zellen des Immunsystems anvisiert werden.
- b) Sie können
zusätzlich
Träger
von fremder genetischer Information sein, die für Epitope aus Nicht-Tollwut-Pathogenen,
wie oben beschrieben, kodieren.
Alternativ können sie
Träger
von fremder genetischer Information sein, die für toxische Substanzen kodieren.
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Eine
sehr wichtige Anwendung von erfindungsgemäßen Viren wird mit Viren erreicht,
die sowohl ein Glykoprotein-G-Analog gemäß a), als auch fremde genetische
Information gemäß b) aufweisen.
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Rekombinante
infektiöse
Tollwutviren können
gemäß der vorliegenden
Erfindung gewonnen werden, die auf einen spezifischen Zelltyp gerichtet sind,
der normalerweise von einem Nicht-Tollwutvirus angegriffen wird,
während
sie gleichzeitig eine immunprotektive Determinante dieses Nicht-Tollwutvirus
tragen.
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Solch
ein Virus induziert eine Immunität
in dem Wirt gegen das Nicht-Tollwutvirus, während es zur gleichen Zeit
aufgrund des Fehlens von genetischer Information für das Glykoprotein-G-Analog
völlig
sicher ist.
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Eine
weitere wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind erfindungsgemäße Viren, die beispielsweise
auf CD4-Zellen, die Zielzellen von HIV darstellen, durch genotypische
Komplementierung mit HIV gp120 gerichtet sind und die fakultativ für ein zytotoxisches
Protein kodieren.
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Solche
Viren werden in selektiver Weise CD4-Zellen angreifen und, sofern
sie einmal innerhalb dieser Zellen sind, werden sie diese töten.
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Alternativ
können
erfindungsgemäße rekombinante
infektiöse
Tollwutviren sehr sichere Vakzine gegen virulente/pathogene Viren
bereitstellen, gegen die es im Moment keine sichere Lebend-Vakzine
gibt: ein rekombinantes, infektiöses
Tollwutvirus, das z. B. gegen die natürlichen Zielzellen des Bovinen
respiratorischen Synzytial-Virus (BRSV) durch Komplementierung mit
BRSV-Glykoprotein-G-Analog gerichtet ist und immunprotektive Epitope
von BRSV exprimiert, stellt ein sehr sicheres Vakzin gegen diese
Erkrankung dar.
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Parainfluenza-Virus-Vakzine
standen bislang den gleichen Problemen gegenüber wie BRSV-Vakzine. Somit
stellt das rekombinante, infektiöse
Tollwutvirus mit dem Parainfluenza-Glykoprotein-G-Analog und zusätzlichen
immunogenen Epitopen von Parainfluenza ein gutes und sicheres Vakzin gegen
diese Erkrankung bereit.
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Weitere
wichtige Veterinär-Vakzine,
die auf dem rekombinanten, infektiösen Tollwutvirus basieren,
werden durch Einführung
von immunogenen Determinanten von:
- i) den Toroviren;
Pferde-, Rinder- und Schweine-Torovirus,
- ii) den Koronarviren: Rinder-, Hunde-, Schweine- und Katzen-Koronarvirus,
insbesondere die Spike-Proteine davon.
in das rekombinante
Tollwutvirus hergestellt
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Somit
betrifft eine am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung rekombinante, infektiöse
Tollwutvirus-Glykoprotein-G(–)-Mutanten, die mit
einem Glykoprotein-G-Analog komplementiert sind und eine heterologe
Nukleinsäure-Sequenz
tragen, die für
ein Epitop oder Polypeptid eines pathogenen Virus oder Mikroorganismus
kodieren.
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Alternativ
kann die Abschwächung
von RV durch Veränderung
der Enzymaktivität
der RV-Replikase oder -Transkriptase erhalten werden, so dass das
Enzym weniger aktiv ist, was zur Produktion von weniger infektiösen Virionen
nach Infektion eines Wirtstieres führt. Da die N-, P- und L-Proteine
an der RV-Polymeras-Aktivität
beteiligt sind, sind RV-Mutanten,
die eine Insertion oder Deletion in dem ORF aufweisen, das für die N-,
P- oder L-Proteine kodiert, ebenfalls Teil der Erfindung.
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Die
erfindungsgemäßen RV-Deletions- und/oder
-Insertionsmutanten können
ebenfalls verwendet werden, um einen Wirt zu impfen, um in der Lage
zu sein, zwischen einem Wirt, dem ein Vakzin verabreicht wird, das
die genannte RV-Mutante umfasst, und einem Wirt, der mit einem Stamm-RV
infiziert ist, (serologisch) zu unterscheiden. In dieser Ausführungsform
der Erfindung kann das Insert in der RV-Insertionsmutante für ein heterologes
Epitop, das zum Auslösen
einer spezifischen Nicht-RV-Immunantwort in einem geimpften Wirt
fähig ist,
kodieren oder für
ein Protein mit enzymatischer Aktivität, wie beispielsweise CAT oder
lacZ, kodieren (Conzelmann und Schnell, 1994, oben). Eine bevorzugte
Region für
den Einbau solcher Inserts ist die RV-Pseudogen-Region. Wie in den
Beispielen gezeigt, können
Insertionen und Deletionen in dieser Region durchgeführt werden,
ohne essentielle Funktionen von RV, wie diejenigen, die für die Infektion
oder Replikation notwendig sind, zu stören. Der RV-Deletionsmutante
kann ein Epitop eines RV-Proteins
fehlen, gegen das eine Immunantwort normalerweise durch die Vakzine
hervorgerufen wird, insbesondere ist eine RV-Mutante, die eine Deletion
in dem ORF umfasst, das für
das G-Protein kodiert, für
diesen Zweck geeignet. Im Fall einer RV-Insertionsmutante umfasst
die Insertion eine Nukleinsäure-Sequenz, die
für ein
serologisches Marker-Antigen oder ein Epitop davon kodiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine RV-Mutante bereitgestellt, die zur Expression
von einem oder mehreren verschiedenen heterologen Epitopen oder
Polypeptiden eines spezifischen Pathogens fähig ist. Eine solche Mutante kann
verwendet werden, um Tiere, sowohl Haustiere als auch Nicht-Haustiere,
gegen Tollwut wild lebender Tiere und das genannte Pathogen zu impfen.
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Die
Vakzinierung mit solch einem Lebend-Vektor-Vakzin wird vorzugsweise
gefolgt von der Replikation der RV-Mutante innerhalb des geimpften
Wirtes, der in vivo das heterologe Epitop oder Polypeptid gemeinsam
mit den RV-Polypeptiden exprimiert. Die Polypeptide, die in dem
geimpften Wirt exprimiert werden, werden dann eine Immunantwort gegen
sowohl RV als auch das spezifische Pathogen hervorrufen. Wenn das
heterologe Polypeptid, das von dem spezifischen Pathogen abgeleitet
ist, eine protektive Immunantwort stimulieren kann, wird dann das
Tier, das mit der erfindungsgemäßen RV-Mutante
geimpft wurde, gegenüber
einer nachfolgenden Infektion durch das Pathogen sowie gegenüber einer Infektion
durch RV immun sein. Somit kann eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz,
die in eine geeignete Region des RV-Genoms eingeführt wird,
fortwährend
in vivo exprimiert sein, was eine stabile, sichere und dauerhafte
Immunität
gegenüber
dem Pathogen bereitstellt.
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Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung einen RV-Vektor bereit, der eine
Insertion von einer Nukleinsäure-Sequenz
umfasst, die für
ein Epitop oder Polypeptid eines spezifischen Pathogens kodiert,
wobei die Insertion in der Pseudogen-Region gemacht wurde.
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Falls
gewünscht,
kann die Pseudogen-Region teilweise oder gänzlich in dem oben beschriebenen
RV-Vektor deletiert sein.
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Vorzugsweise
sind Nukleinsäure-Sequenzen,
die für
ein Epitop oder Polypeptid von Parvovirus des Hundes, Koronavirus
des Hundes und klassischem Schweinepest-Virus (CSFV) kodieren, für den Einbau
in eine geeignete Region des RV-Genoms angedacht.
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Die
Möglichkeit,
das nicht segmentierte Negativ-Strang-RNA-Genom von RV auf der DNA-Ebene
durch rekombinante DNA-Verfahren zu manipulieren, war bislang nicht
möglich,
da kein infektiöses,
replizierendes Virus erzeugt werden konnte. Jedoch wird hier ein
Verfahren bereitgestellt, das die Konstruktion einer Mutation in
einem kodierenden Bereich oder nicht kodierenden Bereich des viralen
Genoms auf der DNA-Ebene mittels rekombinanter DNA-Techniken erlaubt,
gefolgt von dem Erzeugen eines infektiösen, replizierenden RV, das
die Mutation in seinem Genom trägt.
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Dieses
erfindungsgemäße Verfahren
ist wie in Anspruch 15.
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Normalerweise
ist die cDNA des Tollwutvirus-Genoms durch den Einbau einer Mutation
in das Genom modifiziert.
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Das
Verfahren kann jedoch ebenfalls verwendet werden, um beispielsweise
kontaminierte RV-Pools zu reinigen. In solch einem Fall wird die
ursprüngliche
nicht mutierte cDNA verwendet werden.
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Hinsichtlich
der Tatsache, dass die Ausbeute-Effizienz eines modellhaften Mini-Genoms
von RV, das heterologe Inserts umfasst, mit Plasmid-kodierten Proteinen
extrem gering ist und darüber
hinaus mit der Insert-Länge
korreliert (Conzelmann und Schnell, 1994, oben), konnte nicht erwartet
werden, dass die Initiierung einer produktiven Infektion von transfizierter
genomischer RNA voller Länge
durch eine Ko-Transfektion mit Plasmiden, die für die N-, P- und L-Proteine
von RV kodieren, erreicht werden könnte. Dies ist um so mehr der
Fall, da große
Mengen von Positiv-Sinn-N-, P- und -L-spezifischen RNAs von den transfizierten
Protein-kodierenden Plasmiden produziert werden, von denen angenommen
wurde, dass sie mit gleichzeitig exprimierten Negativ-Strang-genomische
RNA-Transkripten hybridisieren. Jedoch wurde angenommen, dass eine
mögliche
Hybridisierung, die mehr als die Hälfte des Genoms beeinflussen
könnte,
auf den entscheidenden Einkapselungsschritt störend eingreift. Außerdem könnte die
Translation von N-, P- und L-mRNA beeinflusst werden. In der Tat
wurde gefunden, dass mit dem Standard-Transfektionsprotokoll keine
infektiösen
Viren erhalten werden konnten. Jedoch, wie in den Beispielen gezeigt,
führte
die Anwendung eines alternativen Transfektionsprotokolls in Kombination mit
der Verwendung eines RV-cDNA-Genoms, das Positiv-Strang-antigenomische
RNA-Transkripte
erzeugt, zu einem replizierenden, genetisch manipulierten RV.
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Das
oben genannte Verfahren ermöglicht das
in vitro-Einführen
einer Mutation in das Genom eines Stamm-RV mittels rekombinanter
DNA-Techniken, gefolgt von der Erzeugung einer infektiösen replizierenden
RV-Mutante, die die genannte Mutation trägt. Die Mutation schließt in nicht
begrenzender Weise eine Insertion, Deletion oder Substitution von Nukleinsäure-Resten
in einem ORF, das für
ein RV-Protein kodiert, einem nicht kodierenden Bereich, z. B. der
Pseudogen-Region, oder einer transkriptionellen Signalsequenz des
Stamm-Genoms von RV ein.
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Die
Konstruktion einer Mutation in einem nicht kodierenden intergenischen
Bereich kann die Transkription eines spezifischen, viralen Gens
in einer solchen Weise beeinflussen, dass die Transkription der
mRNA und die nachfolgende Translation des Proteins, entweder eines
Hüll-Proteins,
wie das M- und G-Protein, oder eines Proteins, das an der Polymerase-Aktivität beteiligt
ist, wie das N-, P- oder L-Protein, herabgesetzt ist, was zu einer
Virus-Mutante führt, die
abgeschwächte
Eigenschaften aufweist, da die Fähigkeit
der Mutante, (infektiöse)
Virus-Nachkommen herzustellen, vermindert ist. Insbesondere kann
die Substitution von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten
in diesem intergenischen Bereich und/oder diesen transkriptionellen
Signal-Sequenzen die Wirksamkeit der Transkription beeinflussen.
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Weiterhin
ist die Substitution von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten
in einem Bereich des Genoms eines virulenten RV, der an der Virulenz
beteiligt ist, wie z. B. das ORF, das für das G-Protein kodiert, durch
die Anwendung des hier beschriebenen Verfahrens Teil der Erfindung
ist.
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Solch
eine Mutation kann zu einem Austausch einer einzigen Aminosäure in dem
G-Protein eines
virulenten RV-Stammes, was in einem (teilweisen) Verlust von Pathogenität resultiert,
führen,
z. B. Austausch von Arg (333) mit Ile, Glu oder Gln, oder Leu (132)
durch Phe oder Trp.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
umfasst das DNA-Molekül,
das die genetische Information von RV enthält, vorzugsweise ein Plasmid,
das mit geeigneten Transkriptionsinitiierungs- und -terminations-Sequenzen
ausgestattet ist, die von einer Polymerase erkannt werden können, die
von den transfizierten Wirtszellen ko-exprimiert wird.
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Ein
bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren
umfasst die Verwendung von Wirtszellen, die mit RV-DNA transfiziert
sind, wobei die Zellen zur Expression von DNA-abhängiger RNA-Polymerase
des Bakteriophagen T7, die beispielsweise zytoplasmatisch von einer
Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert wird, fähig sind. In diesem Fall werden
die Plasmide, die die RV-DNA enthalten, mit dem T7-Promoter und
-Terminationssequenzen bereitgestellt (Conzelmann und Schnell 1994,
oben)
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Für die Herstellung
eines Lebend-Vakzins kann die erfindungsgemäße rekombinante RV-Mutante auf einer
Zellkultur, die beispielsweise von BHK- oder menschlichen Diploiden
Zellen abgeleitet ist, wachsen gelassen werden. Die so gewachsenen Viren
können
durch Sammeln der Gewebszellkultur-Flüssigkeiten und/oder -Zellen
geerntet werden. Das Lebend-Vakzin kann in Form einer Suspension hergestellt
werden oder kann lyophilisiert sein.
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Zusätzlich zu
einer immunogenetisch wirksamen Menge des rekombinanten RV kann
das Vakzin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch
verträgliches
Verdünnungsmittel enthalten.
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Beispiele
von pharmazeutisch verträglichen Trägern oder
Verdünnungsmitteln,
die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Stabilisatoren,
wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbitol, Mannitol, Stärke, Saccharose,
Glukose, Dextran), Proteine, wie Rinderserum oder entrahmte Milch, und
Puffer (z. B. Phosphatpuffer) ein.
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Gegebenenfalls
können
eine oder mehrere Verbindungen, die Adjuvanz-Aktivität aufweisen,
zu dem Vakzin hinzugefügt
werden. Geeignete Adjuvanzien sind beispielsweise Alu miniumhydroxid,
-phosphat- oder -oxid, Öl-Emulsionen
(z. B. von Bayol F(R) oder Marcol 52(R), Saponine oder Vitamin-E-Solubilisate.
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Die
verwendbare Dosierung, die verabreicht werden soll, wird in Abhängigkeit
der Säugetierart, die
geimpft werden soll, des Alters, des Gewichts und der Art der Verabreichung
variieren.
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Die
Dosierung kann in weiten Bereichen variieren: 102 bis
107 pfu/Tier würden beispielsweise geeignete
Dosierungen sein.
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Eine
spezifische Dosierung kann beispielsweise etwa 106 pfu/Tier
sein.
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Eine
erfindungsgemäße RV-Mutante
kann auch verwendet werden, um ein inaktiviertes Vakzin herzustellen.
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Zur
Verabreichung an Tieren kann die erfindungsgemäße RV-Mutante u. a. oral, intranasal,
intradermal, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
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Das
erfindungsgemäße RV-Vakzin
kann Hunden, jedoch auch den Hauptvektoren, d. h. Waschbaren, Stinktieren
und Füchsen
verabreicht werden. Weiterhin wird auch die Impfung von Wildschweinen
mit einem Lebend-RV-Vektor, der zur Expression eines heterologen
Gens eines Schweine-Pathogens, wie z. B. das klassische Schweinepest-Virus,
fähig ist,
in Betracht gezogen.
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Beispiel 1
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Herstellung von infektiösen, replizierenden
RV-Virionen
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Konstruktion einer RV-cDNA voller Länge (2)
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Die
Klonierung von cDNA, die das gesamte Genom des RV-Stammes SAD B19
umfasst, wurde vorher beschrieben (Conzelmann et al., 1990, oben; GenBank
Zugangsnummer M31046). Die Nummerierung von RV-Nukleotiden und -Aminosäuren, die
hier verwendet wird, entspricht der von Conzelmann et al., 1990
(oben). Als Basis für
den Zusammenbau eines DNA-Klons voller Länge von SAD B19 wurde die RV-Mini-Genom-Sequenz,
die in dem Transkriptionsplasmid pSDI-1 enthalten ist (Canzelmann
und Schnell, 1994, oben), verwendet (2). pSDI-1
enthält
die genomischen 3'-
und 5'-Enden von
SAD B19 (SAD B19-Nukleotide 1–68
bzw. 11760–11928),
die zwischen einem T7-RNA-Polymerase-Promotor und der antigenomischen Ribozym-Sequenz
des Hepatitis-Deltavirus (HDV) eingefügt worden ist. Um ein Plasmid
zur Herstellung von Positiv-Strang-SDI-1-Transkripten (pSDI-1plus) zu erzeugen,
wurden die RV-Sequenzen, die in pSDI-1 enthalten sind, zunächst mittels
PCR unter Verwendung eines 11-Basen-Primers (5'-ACGCTTAACAA-3') amplifiziert, der
aufgrund von komplementären
genomischen Enden von RV den 5'-Termini
von sowohl positiv- als auch negativ-sinnigen viralen RNAs entspricht.
Nach anschließender
partieller Ligation eines synthetischen EcoRI/Blunt-Adaptors (T7/3),
der eine T7-Promotor-Sequenz enthält, gefolgt von drei G-Resten
(unterstrichen) (5'-AATTCCTGCAGTAATACGACTCACTATAGGG-3') an die amplifizierte RV-Sequenz, wurden
die Ligationsprodukte in die EcoRI/SmaI-Stellen von pX8dT kloniert.
Dieses Plasmid ist ein Derivat von pBluescriptII (Stratagene), aus dem
ein BssHII/ClaI-Fragment der multiplen Klonierungsstelle, die den
ursprünglichen
T7-Promotor enthält, deletiert
wurde. Es enthält
die 84-Basen-HDV-antigenomische Ribozym-Sequenz in der SmaI-Stelle, unmittelbar
gefolgt von einer T7-Transkriptions-Terminationssequenz, die in
die BamHI-Stelle kloniert worden ist. Konstrukte, die einen T7-Promotor stromaufwärts der
Plus-Sinn-RV-Sequenz enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse und
-sequenzierung identifiziert. Das MunI-BgIII-Fragment von pSDI-1
(SAD B19-Nukleotide 40–68) wurde
dann durch ein 1 kb MunI/BglII-cDNA-Konstrukt ersetzt, das in pBluescriptII
aus drei Fragmenten verschiedener SAD B19-cDNA-Klone (MunI-SphI (SAD B19-Nukleotide
40–482
aus pZAD1–9); SphI-AatII
(4041–4273
aus pSAD13) und AatII-BglII (11472–11759 aus pSAD85)) zusammengesetzt
worden war, was zu pSDI-1170
führte.
Durch Einführen eines
SphI-Fragments, das aus den Klonen pSAD25 und pSAD13 über NcoI
(SAD B19-Nukleotide 482–4041)
zusammengesetzt war, und eines AatII-Fragments, das aus den Klonen
pSAD49 und pSAD85 über
XhoI (SAD B19-Nukleotide 4273–11472)
zusammengesetzt war, in die einzigen SphI- und AatII-Stellen von
pSDI-1170, wurde der endgültige
grundlegende Klon pSAD L16 voller Länge fertig gestellt. Unter
Verwendung des zirkulären Plasmids
wurden in vitro-Transkriptionen durchgeführt und die Produkte auf denaturierenden
Agarose-Gelen analysiert. Das Vorhandensein von RNA-Transkripten,
die mit der 12 kb genomischen RNA von RV komigrierten, deutete daraufhin,
dass antigenomische RNA voller Länge
von T7-Polymerase transkribiert wird.
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Gewinnung von infektiösem rekombinantem
RV
-
Die
Ko-Transfektion von Plasmid pSAD L16 und Plasmiden, die für die RV-Proteine
N, P und L kodieren, wurde wie in Conzelmann und Schnell, 1994 (oben)
beschrieben durchgeführt.
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Transfektionsexperimente
wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. BHK-21, Klon BSR-Zellen wurden über Nacht
in Schalen von 3,2 cm Durchmesser in Eagle's Medium, das mit 10% Kälberserum supplementiert
war, bis zu einer Konfluenz von 80% wachsen gelassen und bei einer
m.o.i. von 5 mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3 infiziert
(Fours et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 8122–8126, 1986).
Eine Stunde lang inkubierte („pontificating”) Zellen
wurden zweimal mit Kulturmedium ohne Kälberserum gewaschen und mit
einem Plasmidgemisch, das 5 μg
pT7T-N, 2,5 μg
pT7T-P und 2,5 μg pT7T-L
enthielt, und mit 2 μg
pSAD L16-Plasmid unter Verwendung des Säugetier-Transfektionskits (Stratagene; CaPO4-Protokoll) unter Beachtung der Vorschriften
des Herstellers transfiziert. Das Präzipitat wurde 4 Stunden nach
Transfektion entfernt und Zellen wurden in Eagle's Medium, das 10% Kälberserum enthielt, gewaschen
und inkubiert. Eine mögliche
Einkapselung von pSAD L16-abgeleiteten T7-RNA-Polymerase-Transkripten und
die resultierende Expression von RV-Proteinen aus den Nukleokapsiden
wurde durch indirekte Fluoreszenz geprüft. Ein monoklonaler Antikörper, der
gegen das RV-G-Protein gerichtet war, das nur von dem rekombinanten
RV-Genom exprimiert werden konnte, wurde verwendet, um die Kulturen
zu durchmustern. Einen Tag nach der Transfektion waren gefärbte Zellen vorhanden,
was die Expression von Genen von dem RV-Genom zeigte. Jedoch wurden
nur einzelne positive Zellen in einer Serie von 20 Transfektionsexperimenten
beobachtet. Keine fluoreszierende Zellfoci, die das Vorhandensein
von infektiösem
Virus anzeigen, wurden in diesen Experimenten erhalten. Zusätzlich konnte
zwei Tage später
kein infektiöses
Virus aus Zellkulturen erhalten werden, die mit dem gesamten Überstand
von den transfizierten Zellen geimpft worden waren. Um eine mutmaßlich sehr
kleine Anzahl von infektiösen
Viren zu isolieren, die in transfizierten Zellen erzeugt worden
waren, wurde daher das experimentelle Verfahren modifiziert. Zur
Isolierung von transfizierenden Viren wurden Zellen und Überstände 2 Tage
nach Transfektion geerntet. Zellen wurden in dem Überstand
durch Kratzen mit einem Gummirührstab
suspendiert. Die Suspension wurde drei Gefrier-Auftau-Zyklen (–70°C/37°C, jeweils
5 Minuten) unterzogen. Zelltrümmer
und der Überschuss
an Vaccinia-Virus, der unter diesen Bedingungen Aggregate bildet,
wurde durch eine 10-minütige
Zentrifugation bei 10000 g in einer Mikrozentrifuge pelletiert.
Der gesamte Überstand
wurde verwendet, um eine Kulturplatte mit einem konfluenten Monolayer
von Zellen zu beimpfen. Nach Inkubation für 2 Stunden wurde der Überstand
durch 2 ml frisches Kulturmedium ersetzt. Ein zytopathogener Effekt
(cpe), der durch Vaccinia-Virus hervorgerufen wurde, wurde ein bis
zwei Tage nach der Infektion beobachtet. Im Durchschnitt wurden
lediglich zehn Plaques nach Zentrifugation bei 10000 g beobachtet. Eine
RV-Infektion von Zellen, die nicht zu einem nachweisbaren cpe führt, wurde
zwei Tage nach der Infektion durch eine direkte Immun-Fluoreszenz-Färbung des
gesamten Monolayers mit einem Anti-N-Konjugat (Centocore) gezeigt.
In zwei von 20 Experimenten wurden fluoreszierende Foci beobachtet und
die jeweiligen Überstände enthielten
infektiöses RV
(SAD L16), das vermutlich transfektantes Virus darstellte, das aus
cDNA-Transkripten erzeugt worden war.
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Die
Hälfte
der Überstände aus
den Kulturen, in denen Foci beobachtet wurden, wurde für die zweite
Passage nach Zentrifugation bei 10000 g verwendet. Für weiteres
Passagieren (jeweils 2 Tage) wurden abnehmende Aliquote von Überständen gemäß des RV-Infektionsgrades
verwendet. Um das Vaccinia-Virus vollständig zu beseitigen, wurden Überstände von
Kulturen, in denen nahezu alle Zellen infiziert waren (dritte Passage),
zweimal für
10 Minuten bei 14000 g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der endgültige Überstand
wurde dann unter Verwendung einer sterilen MILLEX-VV-Filtereinheit
mit 0,1 μm (Millipore
Products, Redford, MA 01730) filtriert und dann verwendet, um Stammlösungen von
rekombinanten RVs mit hohem Titer herzustellen.
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Das
letztere Transfektions- und Isolierungsprotokoll wurde in den nachfolgenden
Beispielen verwendet.
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Beispiel 2
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Einfügen
eines Oligonukleotides in die RV-Pseudogen-Region
-
Manipulationen
von ψ wurden
in dem Sub-Klon pPsiX8 durchgeführt,
der ein 2,8 kb XhoI-ScaI-Fragment von pSAD L16 enthält, das
die SAD B19-Nukleotide 3823 bis 6668 darstellt. Die StuI-Fragmente
der modifizierten pPsiX8-Plasmide wurden daraufhin isoliert und
verwendet, um das entsprechende Fragment (SAD B19-Position 4014
bis 6364) des Klons pSAD L16 voller Länge (1) zu ersetzen.
Das Einfügen
von 4 Nukleotiden in ψ und das
Erzeugen einer neuen NheI-Stelle wurden durch einen Verdau von pPsiX8
mit HindIII, Auffüllen
der Überhänge mit
Klenow-Enzym und Religation erreicht. Der endgültige Klon pSAD U2 voller Länge unterscheidet
sich von SAD L16 durch die Verdoppelung der Nukleotide 5338 bis
5341.
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Die
Erzeugung von infektiösen
Viren wurde nach Übertragung
von Extrakten von transfizierten Zellen zusammen mit dem Überstand
auf frische Zellen gezeigt. In jeder der Reihen wurde Fokusbildung in
einem Experiment beobachtet. Die transfizierenden Viren (Klone SAD
U2-13 und SAD U2-32) wurden durch Übertragung der Überstände auf
frische Zellen für
zwei weitere Male passagiert, was zu einer nahezu 100%igen Infektion
der Zellen führt.
Um die Insertion in das SAD U2-Virus-Genom zu zeigen, wurde Gesamt-RNA
aus Zellen, die mit SAD U2-13 infiziert worden waren, isoliert und
eine reverse Transkriptase-PCR
(RT-PCR) von ψ wurde
durchgeführt. Mit
den Primern G3P und L4M (1), die spezifisch für die G-
bzw. L-Gene sind, wurden DNA-Fragmente von ungefähr 730 bp aus den Genomen der
transfizierenden Viren SAD U2 und SAD L16 und aus dem Standard-RV SAD B19 erhalten.
Jedoch wurde ein nachfolgender Verdau mit HindIII nur für die PCR-DNA,
die aus SAD B19 und SAD L16 erhalten wurde, nicht aber für diejenige
aus SAD U2 beobachtet. Umgekehrt wurde nur SAD U2-abgeleitete DNA mit
NheI verdaut, was zwei Fragmente von etwa 530 bzw. 200 bp zur Folge
hatte (3). Die direkte RT-Sequenzierung der genomischen RNA aus
dem transfizierenden Virus SAD U2 bestätigte weiterhin das Vorhandensein
der erwarteten Insertion von 4 Resten an der vorhergesagten Stelle,
während
der Rest der bestimmten Sequenz derjenigen des ursprünglichen
SAD B19-Genoms entsprach. Somit war es eindeutig, dass das SAD U2-Virus
ein transfizierendes Virus darstellte, dessen Genom aus konstruierter
cDNA stammte.
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Das
Einführen
von vier zusätzlichen
Nukleotiden in der Nähe
des Endes von RV-ψ beeinflusste weder
die Lebensfähigkeit
des transfizierenden Virus SAD U2, noch störte es die korrekte Transkriptionstermination
der G-mRNA.
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Beispiel 3
-
Änderung der RV-Transkription
durch eine Insertion oder Deletion zwischen der G- und L-kodierenden Region
-
Durch
einen Doppelverdau mit StyI und HindIII, Klenow-Auffüllen und
Religation wurden 396 Basen (SAD B19-Nukleotide 4942 bis 5337) entfernt, das
endgültige
Konstrukt war pSAD W9. Für
die Konstruktion von pSAD V* wurde ein BglII-AsuII-Fragment mit
180 bp, das die Grenzregion des SAD B19-n/P-Cistrons enthielt, aus
pSAD13 isoliert (Conzelmann et al., 1990, oben). Das Fragment enthielt 97
Nukleotide der N-kodierenden Region, die gesamte 3' nicht kodierende
Region und die Grenze des N/P-Citrons, die aus dem N-transkriptionellen Stopp/Polyadenylierungssignal,
der intergenischen Region und den ersten 16 Nukleotiden des P-Cistrons,
einschließlich
des transkriptionellen Startsignals, bestand. Das cDNA-Fragment
wurde zunächst in
die EcoRI-Stelle von pBluescript nach dem Auffüllen der 3'-eingerückten Enden mit Klenow-Enzym subkloniert
(pNigP-180). Nach
Herausschneiden mit HindIII/XbaI aus pNigP und Erzeugung von stumpfen Enden
wurde das erhaltene 230 bp-Fragment, das das RV-Insert enthielt,
das von 16 bzw. 34 bp von Vektor abgeleiteten Sequenzen flankiert
wurde, in die aufgefüllte
StyI von pPsiX8 kloniert. Das endgültige Konstrukt (pSAD V*) voller
Länge wies
somit eine 234 bp-Insertion im Vergleich zu pSAD L16 auf.
-
Wie
vorher wurden pSAD V* und pSAD W9 verwendet, um jeweils 20 Kulturplatten
zu transfizieren. In drei Kulturen, die mit SAD V* transfiziert
wurden, und in einer, die mit SAD W9 transfiziert wurde, wurde eine
Ausbeute durch die nachfolgende Isolierung von lebensfähigem Virus
angezeigt. Nach fünf aufeinanderfolgenden
Passagen wurde RNA aus infizierten Zellen und Überstand isoliert und mittels RT-PCR
unter Verwendung der gleichen Primer wie in den vorherigen Experimenten
analysiert. Im Vergleich zum Standard SAD B19-Virus resultierte
ein vergrößertes DNA-Fragment
von ungefähr
0,9 kb aus RNA von Zellen, die mit SAD V* infiziert worden waren,
was somit zeigte, dass die zusätzlichen
Sequenzen in der ψ-Region
dieses transfizierenden Virus vorhanden waren (4).
Im Gegensatz dazu wurde ein DNA-Fragment von nur 0,3 kb aus RNA von
Zellen, die mit SAD W9 infiziert worden waren, erhalten; diese Größe wurde
erwartet gemäß der Deletion,
die in der cDNA-Kopie des Genoms durchgeführt worden war. Die Sequenzierung
von PCR-Produkten bestätigte
weiterhin, dass die ursprünglich konstruierten
cDNA-Sequenzen in die Genome der transfizierenden Viren SAD V* und
SAD W9 gerettet wurden. Dementsprechend beeinträchtigte weder das Vorhandensein
zusätzlicher
Sequenzen, einschließlich
50 Vektor-abgeleiteten Nukleotiden, zwischen dem offenen Leseraster
von G und ψ,
noch die Deletion der gesamten ψ die
Infektiösität und Ausbreitung
der transfizierenden Tollwutviren. Die Änderungen, die in den Genomen
von SAD V* und SAD W9 konstruiert worden waren, wurden derart entworfen,
um zu phenotypischen Veränderungen
in dem Transkriptionsmuster zu führen,
und es wurde untersucht, ob dies die Wachstumseigenschaften der
jeweiligen transfizierenden Viren beeinflusste. Jedoch war die Ausbreitung
in der Zellkultur sowie die endgültigen
Titer von infektiösen
SAD V*- und SAD W9-Viren ähnlich
zu denen des Standard SAD B19-RV. Drei Tage nach Infektion von Zellen
mit einem m.o.i. von 0,01 wurden Titer von 108 Fokus-bildenden
Einheiten (ffu) in den Überstanden
für SAD B19,
SAD V* und SAD W9 erreicht, was zeigte, dass RV-ψ nicht essentiell für die Ausbreitung
in der Zellkultur ist.
-
Unter
Verwendung einer ψ-spezifischen Sonde
wurde keine Hybridisierung mit RNA aus Zellen nachgewiesen, die
mit dem ψ-deletierten
SAD W9-Virus infiziert worden waren. Während die genomischen RNAs
der anderen Viren und G-mRNAs von SAD B19 und SAD L16 durch diese
Sonde erkannt wurden, reagierte die SAD V* G-mRNA nicht. Im Gegensatz
dazu trat eine schwache RNA-Bande auf, die in der Größe der neuen
zusätzlichen ψ-mRNA entsprach,
die durch das Vorhandensein des transkriptionellen Startsignals
des zusätzlichen
P-Gens, das den SAD V*-ψ-Sequenzen
vorausgeht, vorausgesagt wurde. Im Gegensatz zu natürlich vorkommendem
RV repräsentiert
das transfizierende Virus SAD V* ein RV, dessen Genom aus sechs
funktionellen Cistronen zusammengesetzt ist.
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Beispiel 4
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Expression eines fremden, für ein Protein
kodierenden Gens aus rekombinantem RV
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Das
230 bp cDNA-Fragment, das die in Beispiel 3 beschriebene N/P-Citron-Grenze
enthält,
die von mehreren Restriktionsstellen flankiert wird, wurde in die
BstXI-Stelle der Pseudogen-Region der cDNA pSAD L16 voller Länge (SAD
B19-Position 4995) nach Erzeugung von stumpfen Enden mit Klenow-Enzym
eingeführt.
Die resultierende cDNA pSAD V wurde als eine Basis für die Einführung des bakteriellen
Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gens
verwendet. Um pSAD XCAT zu erhalten, wurde ein 0,8 kb DNA-Fragment
von pCM7 (Pharmacia), das die gesamte CAT-kodierende Region enthält, in die
AsuII-Stelle von pSAD V kloniert, die in der N/P-Cistron-Grenze
stromaufwärts
der Pseudogen-Sequenz enthalten war. Für die Konstruktion von pSAD
VCAT wurde die eDNA zwischen der AsuII-Stelle und der HindIII-Stelle,
die nahe dem Ende der Pseudogen-Sequenz (SAD B19-Position 5337) lokalisiert
war, deletiert und durch die für
CAT-kodierende HindIII-DNA
aus pCM7 nach der Erzeugung von stumpfen Enden mit Klenow-Enzym
ersetzt. Dementsprechend sollte die Transkription des rekombinanten
RV SAD XCAT zu einer CAT-mRNA führen,
die die Pseudo-Sequenzen als eine nicht transla tierte 3'-Region enthält, wobei
SAD VCAT eine CAT-mRNA transkribieren sollte, der die Pseudogen-Sequenz
fehlt.
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Rekombinante
Tollwutviren wurden nach Transfektion von Plasmiden, die für die N-,
P- und L-Proteine
von RV kodieren, und pSAD-XCAT bzw. pSAD-VCAT, wie in Beispiel 1
beschrieben, gewonnen. Nach Entfernen von Vaccinia-Virus wurde das Transkriptionsmuster
der rekombinanten RVs mittels Northern-Hybridisierung analysiert.
Beide Viren transkribierten CAT-mRNAs der erwarteten Größe und Zusammensetzung
(5). Die Expression der CAT-Enzym-Aktivität wurde
in Zellen, die jeweils mit den zwei Viren infiziert worden waren,
durch Standard CAT-Assays (Conzelmann und Schnell, 1994, oben) bestimmt.
Für beide
wurde gefunden, dass sie CAT wirksam exprimieren. Nachfolgende Passagen in
Zellkulturzellen zeigten, dass die eingeführten fremden Sequenzen genetisch
stabil sind. Selbst nach 40 Passagen exprimierten beide Viren CAT wirksam
(6). Zusätzliche
Experimente wurden durchgeführt,
um die Expression und das Verhalten der rekombinanten Viren in infizierten
Tieren zu untersuchen. Sechs Wochen alte Mäuse (jeweils fünf) wurden
intrazerebral mit 104 ffu von SAD VCAT,
SAD CXCAT bzw. RV-Standard-Sequenz
SAD L16 geimpft. Sieben Tage nach Infektion zeigten alle Tiere typische
Tollwut-Symptome und starben an Tollwut innerhalb der folgenden
Woche. CAT-Aktivität wurde in
Gehirnen von Mäusen
gezeigt, die mit SAD VCAT bzw. SAD CXCAT infiziert worden waren.
Beide Viren konnten aus Mäusegehirnen
wieder isoliert und in CAT-Zellkultur exprimiert werden. Somit kann
ein fremdes Gen in das Genom von infektiösem RV eingeführt und
stabil exprimiert werden und kann außerdem als ein Marker dienen,
um rekombinante Viren zu unterscheiden.
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Beispiel 5
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Expression eines heterologen viralen Antigens
aus rekombinantem RV und Induktion einer Immunantwort gegen RV und
dem heterologen Virus
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Das
Genom des klassischen Schweinepestvirus (CSFV) kodiert für drei strukturelle
Glykoproteine (E0, E1 und E2). In CSFV-infizierten Tieren sind neutralisierende
Antikörper
gegen E2 gerichtet, wohingegen E0 eine zelluläre Immunantwort induziert. cDNA,
die die kodierende Region des E2-Proteins bzw. des E0-Proteins von
CSFV-Stamm Alfort umfassen, wurden verwendet, um die Pseudogen-Region zwischen
den AsuII- und HindIII-Stellen
von pSAD V, wie in Beispiel 4 beschrieben, zu ersetzen. Rekombinante
Viren (SAD-VE0 bzw. SAD-VE2) wurden, wie in Beispiel 1 ausgeführt, aus
Transfektionsexperimenten gewonnen. In infizierten Zellen exprimierten die
Viren das CSFV E0-Protein bzw. CSFV E2-Protein (7).
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Die
rekombinanten Viren SAD VE0 und SAD VE2 wurden verwendet, um Schweine über den
oralen Weg zu immunisieren. Standardköder für Füchse, die üblicherweise für die orale
Immunisierung von Füchsen
mit dem abgeschwächten
SAD B19 RV-Stamm verwendet werden, wurden mit 107 pfu von SAD VE0,
SAD VE2 bzw. SAD B19 beladen. Jeweils zwei Schweine wurden mit zwei
Ködern
einer jeden Zubereitung gefüttert
(Schwein #1 und #2: SAD VE0, #3 und #4, SAD B19, #5 und #6, SAD
VE2). Vier Wochen nach der Immunisierung wurde das Vorkommen von
neutralisierenden Antikörpern
gegen RV und CSFV analysiert. Mit Ausnahme von #5 wiesen alle Schweine
RV-neutralisierende Antikörper
auf (Titer > 250),
was die Aufnahme der Vakzin-Köder
bestätigt.
Schwein 5 wurde deshalb nicht weiter betrachtet. Schwein #6 entwickelte
CSFV-neutralisierende Antikörper
bei einem Titer von > 16.
Wie erwartet, entwickelten Schweine #1 bis 4 keine CSFV-neutralisierenden
Antikörper.
Eine intranasale Verabreichung mit 107 pfu
von CSFV-Stamm Alfort
wurde 5 Wochen nach Immunisierung durchgeführt. Leukozyten-Zahlen von
Schweinen und Körpertemperatur wurden
nach der Challenge überwacht
und sind in 8 bzw. 9 gezeigt.
Alle Schweine entwickelten Fieber, jedoch erholten sich Schweine
#1 und #2 sowie #6 schneller. Das Kontrolltier #5 starb 15 Tage nach
der Challenge mit typischen CSFV-Symptomen, die Kontrolle #3 wurde
am Tag 21 getötet.
Das Vorhandensein von CSFV-neutralisierenden Antikörpern in
dem Schwein, das mit SAD VE2 gefüttert
wurde, und der partielle Schutz der Schweine, die entweder SAD VE0
oder SAD VE2 erhielten, zeigen, dass sowohl orale als auch zelluläre Immunantworten
gegen zwei heterologe Viren durch rekombinante RV-Lebend-Vakzine
nach Verabreichung über
den oralen Weg induziert werden können.
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Beispiel 6
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Erzeugung eines abgeschwächten RV
durch Einführen
einer Mutation in G-Gen-Sequenzen
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Um
ein Virus zu erzeugen, das sich weniger effizient als das Standardvirus
SAD B19 ausbreitet, wurde eine Rekombinante hergestellt, die ein
mutiertes G-Protein enthält.
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Zu
diesem Zweck wurde die Sequenz, die für die letzten 46 Aminsäuren des
G-Proteins kodieren, deletiert. Zuerst wurde das Plasmid, das für das G-Protein
kodiert, pT7T-G (Conzelmann und Schnell, 1994, oben) mit AflIII
(Position 4752 der SAD B19-Sequenz) und EcoRV (die letztere Stelle
ist in der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids vorhanden) verdaut
und stumpfe Enden wurden mittels Klenow-Enzym erzeugt. Die Ligation
der resultierenden AflIII- und EcoRV-Enden führte zur Erzeugung eines Translationsterminationskodons
an der vorherigen AflIII-Sequenz. Ein 0,3 kb PpuMI-SmaI-DNA-Fragment,
das die modifizierte Region enthält,
wurde verwendet, um das authentische PpuMI-BstXI-Fragment 4469–4995 von pSAD L16 zu ersetzen.
Diese Manipulation führte
zur Deletion der SAD B19-Nukleotide 4753–4995, die für die carboxyterminalen
46-Aminosäuren
des zytoplasmatischen Schwanzes des G-Proteins und einen Teil der
Pseudogen-Sequenz kodiert. Ein weiteres Ergebnis ist die Einführung von 18
Vektor-abgeleiteten Nukleotiden unmittelbar stromabwärts des
neuen G-Translationsterminationskodons.
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Rekombinantes
RV (SAD DCD) wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, wiedergewonnen.
Wie erwartet, wurde ein verkürztes
G-Protein in Zellen, die mit SAD DCD infiziert worden waren, exprimiert (10).
Im Vergleich zum Standard-Sequenz-Virus SAD L16 wurden 100fach geringere
Titer mit SAD DCD-Virus nach Infektion von Zellen bei einer m.o.i. von
1 erhalten. Darüber
hinaus wurde eine verminderte Ausbreitungsrate in Zellkulturen beobachtet (11),
was darauf hindeutete, dass die Verkürzung des G-Proteins zu einem
verminderten Zusammenbau von Virionen oder zu einer verminderten Zellinfektiosität von Virionen
führte.
Um das Verhalten von SAD DCD in infizierten Tieren zu analysieren, wurden
fünf Mäuse intrazerebral
mit 105 ffu von SAD DCD und 5 Mäuse mit
der selben Dosis von SD L16 geimpft.
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Beispiel 7
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Erzeugung einer Tollwutvirus-G-minus(G–)-Mutante durch
Komplementierung in trans
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Um
die vollständige
kodierende Region des G-Proteins aus dem RV-Genom zu deletieren,
wurde der Klon pSAD UE voller Länge
(Beispiel 2) verwendet. Dieser Klon unterscheidet sich von pSAD
L16 durch die Anwesenheit einer einzigen NheI-Stelle innerhalb der
nicht translatierten 3'-Region
des G-Gens (SAD B19-Position 5339). Durch partiellen Verdau von
pSAD U2 mit PflMI (SAD-Position 3176) und vollständigen Verdau mit NheI, nachfolgendes Auffüllen durch
Klenow-Enzym und Religation wurde ein cDNA-Fragment ent fernt, das
SAD B19-Nukleotide 3177–5339
umfasst. Der resultierende Klon pSAD dG wurde in Transfektionsexperimenten
verwendet, um rekombinantes Virus wiederzugewinnen. Zusätzlich zu
Plasmiden, die für
N-, P- und L-Proteine kodieren, wurde jedoch ein Plasmid, das für das G-Protein kodiert,
mit pSAD dG ko-transfiziert, um die G-Defizienz des viralen Genoms
zu komplementieren. Das resultierende Virus SAD dG wurde auf Zellen übertragen,
die nochmals mit dem G-kodierenden Plasmid transfiziert und mit
den vTF-7-3 des Vaccinia-Virus infiziert worden waren, um das G-Protein
bereitzustellen.
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RNA-Transkripte
von SAD dG wurden durch Northern-Blotting-Experimente analysiert.
Nach Hybridisierung mit einer N-spezifischen Sonde wurde ermittelt,
dass das SAD dG-Genom
wesentlich kleiner als das Tollwutvirus wt-Genom ist, was die cDNA-Deletion
von 2,1 kb widerspiegelt. Eine Sonde, die die gesamte G-kodierende
Region umspannt, konnte jedoch nicht mit SAD dG RNAs hybridisieren,
was das Fehlen von G-kodierenden Sequenzen zeigt (12).
Die Identität
der Deletion wurde weiterhin durch RT-PCR und Sequenzieren bestätigt.
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Phenotypisch
komplementiertes SAD dG war in der Lage, nicht komplementierende
BSR-Zellen zu infizieren,
sein Genom zu replizieren und die Gene zu exprimieren, die von dem
Genom kodiert werden. Jedoch war es nicht in der Lage, infektiöse Virionen
herzustellen, und somit konnte sich die Infektion nicht auf andere
Zellen ausbreiten (13) oder durch Passage von Kulturüberständen auf
andere Zellkulturen übertragen
werden.
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Beispiel 8
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Komplementierung von G-Mutanten durch
heterologe Glykoproteine: Richten des Virus auf spezifische Zellen
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Um
zu zeigen, dass heterologe Oberflächen-Proteine funktionell in
die Hülle
eines rekombinanten Virus eingebaut werden können, wurde die G-Mutante SAD
dG durch rekombinante virale Glykoproteine, wie in Beispiel 7 für das Tollwutvirus
G beschrieben, komplementiert. Infektiöse pseudotypische Partikel
wurden erzeugt, die die Spike-Proteine aus Mokola-Virus, ein weiteres
Mitglied der Lyssavirus-Gattung, dem Rhabdovirus Stomatitisvesikulären Virus
(VSV; Serotyp New Jersey, Gattung Vesiculovirus) und dem Retrovirus
humanes Immundefizienz-Virus (HIV-1, Stamm NL-43) enthielten.
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Die
Expression des authentischen Mokola- und VSV-G-Proteins von transfizierten
Plasmiden und die Infektion von Zellen mit SAD dG führte zur Bildung
von infektiösen
Pseudotyp-Viren. Im Vergleich zum Tollwutvirus G und dem nahe verwandten Mokola-Virus
G wurde jedoch ein verminderter Titer mit VSV-G beobachtet (104/ml im Gegensatz zu 106/ml).
Jedoch wurde nach dem Ersetzen der Sequenzen der zytoplasmatischen
und Transmembrandomäne
von VSV-G durch die entsprechenden Domänen des Tollwutvirus-G-Proteins 106 infektiöse Partikel
erzeugt, was darauf hindeutet, dass die zytoplasmatische Domäne von RV-G
das Protein in die virale Hülle
lenkt.
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Die
Herstellung von pseudotypischen Partikeln, die authentische HIV
gp160 (gp 120/40)-Spikes enthalten,
wurde nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu führte die Expression eines chimären Proteins, das
aus der Ecto- und Transmembrandomäne des HIV gp zusammengesetzt
und an die zytoplasmatische Domäne
von RV-G fusioniert war, zur Bildung von RV(HIV)-Pseudotypen. Dies
bestätigte,
dass die zytoplasmatische Domäne
des G-Proteins verantwortlich ist für einen wirksamen Einbau von Spike-Proteinen
in die Hülle
von Rhabdoviren. Die Pseudotyp-Partikel von RV(HIV) infizierten
erfolgreich Vero-Zellen, die das humane CD4 Oberflächenprotein
exprimieren (T4+-Zellen), aber nicht die
Kontrollzellen, die CD8 exprimieren (T8+-Zellen)
(Zellen wurden von dem AIDS Research and Reference Reagent Programme
erhalten). Die Pseudotyp-Viren weisen somit den Wirtsbereich und
die Zellspezifität von
HIV auf.
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BESCHRIFTUNG DER ZEICHNUNGEN
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1:
Organisation der RV-Pseudogen-Region (ψ) und Konstruktion von rekombinanten RV-Genomen (maßstabsgerecht
gezeichnet). Die Zahlen bezeichnen die Nukleotid-Positionen in der Anti-Genom-Sequenz
von SAD B19. Oben ist das gesamte RV-Genom mit seinen fünf offenen
Leserastern gezeigt. Mutationen wurden in pPsiX8 durchgeführt, das
einen Teil des Genoms enthielt (3823–6668), und in den Klon pSAD
L16 voller Länge durch
Austausch des Stuf-Fragments (4041–6364) wieder eingeführt. In
der detaillierten Zeichnung sind kodierende Bereiche durch graue
Kästen,
nicht kodierende Sequenzen als Linien dargestellt. Funktionelle
transkriptionelle Signalsequenzen sind durch gefüllte Balken (Stopp/Polyadenylierung)
und Pfeilspitzen (mRNA-Transkriptionsstart) angezeigt. Die nicht
funktionelle, signalähnliche
Sequenz, die den Start der ψ-Region
definiert, ist durch den offenen Balken gezeigt. Pfeile zeigen die
Position von Oligonukleotid-Primern G3P und L4M an, die für die RT-PCR-Analyse
der ψ-Region
verwendet wurden. In SAD U2 führte
das Auffüllen
von HindIII-Extensionen zur Insertion von 4 Nukleotiden und der
Erzeugung einer einzigen NheI-Stelle. In SAD V* wurde ein cDNA-Fragment,
das die N/P-Cistron-Grenze von RV enthielt (SAD B19-Nukleotide 1323–1502),
in die StyI-Stelle eingeführt;
SAD W9 weist eine Deletion des Styl/HindIII-Fragments auf.
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2:
Vereinfachtes Schema für
die Konstruktion von Transkriptionsplasmiden, die cDNA voller Länge von
RV enthalten. Die Zahlen beziehen sich auf Nukleotid-Positionen
der antigenomischen Sequenz des SAD B19 RV (Conzelmann et al., 1990).
Das Plasmid pSDI-1plus,
das als Basis für
die Rekonstruktion von RV-genomischer DNA voller Länge diente,
ist das Gegenstück
von pSDI-1 (Conzelmann und Schnell, 1994), das das Mini-Genom von SDI-1
RV enthält,
welches die terminalen Nukleotide 1–68 und 11760–11928 in
umgekehrter Richtung bezüglich
des T7 RNA-Polymerasen-Promoters (T7) und der antigenomischen Ribozym-Sequenz
des Hepatitis-Delta-Virus (HDV) umfasst. Das MunI-BglII-Fragment von pSDI-1plus
wurde mit einem 1 kb-cDNA-Konstrukt ersetzt, das aus drei SAD B19-cDNA-Klonen,
wie angedeutet, zusammengesetzt worden war. Die Insertion eines
3,6 kb SphI- und eines 7,2 kb AatII-Fragments, die aus zwei cDNA-Klonen
zusammengesetzt worden waren, führte zum
endgültigen
Plasmid pSAD L16, das die SAD B19-cDNA in voller Länge enthält. Die Transkription dieses
Plasmids durch T7 RNA-Polymerase
sollte Positiv-Strang-(antigenomische)-RNA ergeben, die drei zusätzliche
nicht virale G-Reste am 5'-Ende
und ein genaues 3'-Ende
nach Autolyse des Ribozyms aufweist. (T7) T7-Promoter; (T7T) T7-Transkriptionsterminator;
(HDV) HDV-antigenomische
Ribozym-Sequenz von HDV.
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3:
Darstellung des genetischen Tags in dem Genom des transfizierenden
Virus SAD U2. Gesamt-RNA aus Zellen, die mit Standard-RV SAD B19 (B19)
und den transfizierenden Viren SAD L16 (L16) und SAD U2 (U2) infiziert
worden waren, wurde 2 Tage nach Infektion isoliert und für die RT-PCR-Amplifikation
der entsprechenden ψ-Regionen
mit Primern G3P und L4M verwendet. Die amplifizierte DNA wurde in
einem 1%igen Agarosegel direkt und nach Verdau mit HindIII bzw.
NheI getrennt. Eine NheI-Restriktionsstelle ist nur in der DNA vorhanden,
die aus SAD U2 abgeleitet ist. M, DNA-Größen-Marker.
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4:
PCR-Analyse von SAD B19 (B19)-, SAD V* (V*)- und SAD W9 (W9)-Genomen.
RT-PCR wurde wie
in 3 beschrieben mit den Primern G3P und L4M durchgeführt. Die
Amplifikationsprodukte wurden in einem 1%igen Agarosegel getrennt.
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5:
Darstellung von CAT-mRNAs, die von rekombinantem RVS transkribiert
werden Ein Northern-Blot von Gesamt-RNA aus Zellen, die mit SAD L16
(L16), SAD XCAT (X6) und SAD VCAT (VC18) infiziert worden waren,
wurde mit Sonden hybridisiert, die jeweils spezifisch für das G-Gen
(G), Pseudogen (Y) bzw. CAT-Gen waren. Auf der linken Seite sind
die viralen Genome (v) und bestimmte mRNAs gezeigt. Während SAD
XCAT eine mRNA transkribiert, die sowohl CAT- als auch Pseudogen-Sequenzen
(”CATY”) enthält, fehlen
SAD VCAT Pseudogen-Sequenzen und es transkribiert eine mRNA (”CAT”), die
nur CAT-Sequenzen besitzt. Die Größe der RNA-Marker ist in kb
angegeben.
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6:
CAT-Aktivität
von SAD XCAT und SAD VCAT nach mehreren Passagen in Zellkultur. Zellen
wurden mit Viren aus den einzelnen Passagen infiziert (Nummer der
Passage wie angegeben) und gleiche Mengen an Zellextrakten wurden
hinsichtlich CAT-Aktivität
zwei Tage nach der Infektion analysiert. In Spur ”–” wurden
Extrakte von Zellen, die mit SAD L16 infiziert worden waren, analysiert.
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7:
Expression von E0- und E2-Protein durch rekombinante RVs. Zellen
wurden mit SAD VE0 (Isolate 1, 2, 3) bzw. SAD VE2 (Isolate a, b,
c) infiziert. Zwei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte in
PAA-Gelen unter reduzierenden Bedingungen getrennt und auf Nitrozellulose-Membranen übertragen.
Nach Inkubation mit monoklonalen Antikörpern, die gegen CSFV E0- bzw.
E2-Protein gerichtet sind, und anschließend mit einem an alkalischer Phosphatase
gekoppelten sekundären
Antikörper wurden
die Proteine durch Hinzugabe von Substrat und Belichtung eines Röntgenfilms
sichtbar gemacht. Als Kontrolle wurde Baculovirus-exprimiertes und
gereinigtes E0- und E2-Protein
verwendet (B). Zusätzlich
dienten Extrakte aus Zellen, die mit CSFV (V) infiziert waren, als
Vergleich.
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8:
Leukozyten von Schweinen, die mit SAD VE0 (#1 und 2), SAD VE2 (#6)
und Standard-Tollwutvirus
SAD B19 (#3 und #4) immunisiert und einer CSVF-Challenge ausgesetzt
wurden. Die Leukozyten-Mengen sind in Prozent der absoluten Zahlen
angegeben, die vor dem Tag der Challenge vorhanden waren (Tag 0).
*(#1, Tag 10 nach der Ch.): nicht durchgeführt, geschätzter Wert.
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9: Körpertemperatur
von Schweinen nach CSFV-Challenge (Tag 0).
- a)
Tiere, die mit SAD VE0 (#1 und #2) immunisiert worden waren, entwickelten
schwaches Fieber bis Tag 11 (#1) oder kein Fieber (#2). Beide Kontrolltiere,
die mit SAD B19 (#3 und #4) immunisiert worden waren, zeigten hohes
Fieber über
einen langen Zeitraum. #4 starb am Tag 15 nach der Challenge an
klassischer Schweinepest aufgrund der schweren Symptome, #4 wurde
21 Tage nach der Challenge getötet.
- b) Das Tier, das mit SAD VE2 immunisiert worden war, entwickelte
schwaches Fieber nur an den Tagen 6 bis 8. Kontrollen sind die gleichen
wie a).
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10:
Expression eines verkürzten
G-Proteins in mit SAD DCD-infizierten Zellen. BSR-Zellen wurden
bei einer m.o.i. von 1 mit SAD DCD oder SAD L16 infiziert und 16
Stunden nach der Infektion mit 50 μCi von [35S]-Methionin
für 3 Stunden
markiert. Zellextrakte wurden mit einem Antitollwut-G MAb inkubiert
und Aliquote von immunpräzipitierten
Proben wurden entweder mit PNGase F (+PF) verdaut, um die Protein-Grundgerüste zu zeigen,
oder scheinbehandelt (–),
um die glykosylierten Proteine zu zeigen. +TM: infizierte Zellen
wurden in Gegenwart von 2 μg/ml
Tunicamycin für
90 Minuten vor Markierung und während
der 3-stündigen
Markierungsperiode inkubiert. Proteine wurden auf 10% SDS-PAGE getrennt
und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Zellextrakte wurden
wie oben analysiert. L16, SAD L16-Virus; ΔCD, SAD DCD-mutiertes Virus.
M: Protein-Größen-Marker.
-
11:
Ausbreitung von SAD L16 und SAD DCD in Zellkultur. Kulturzellen
wurden bei einer m.o.i. von 0,05 mit SAD L16 (L16) bzw. SAD DCD
(DCD) infiziert und bei den angegebenen Zeiten nach Infektion mittels
direkter Immunfluoreszenz mit einem Konjugat (Centocor®),
das gegen Tollwutvirus-N-Protein gerichtet war, analysiert. Eine
langsamere Ausbreitung der Infektion von benachbarten Zellen ist
in Zellen, die mit SAD DCD infiziert wurden, beobachtet worden.
-
12:
Analyse von RNAs, die für
SAD dG (Beispiel 7) und SAD dCD (Beispiel 6) spezifisch sind. Gesamt-RNA
von BSR-Zellen, die mit SAD L16 (Beispiel 1), SAD dCD (ΔCD) und phenotypisch
komplementiertem SAD dG-Virus (ΔG)
bei m.o.i.s. von 1 infiziert worden waren, wurde zwei Tage nach
Infektion isoliert und mittels Northern-Hybridisierung analysiert.
Wie mittels Hybridisierung mit einer N-Gen-spezifischen Probe (A)
gezeigt, ist das Genom von SAD dG beträchtlich kleiner als das Standard-Tollwutvirus-Genom
(v), was die 2.1 kb-Deletion des G-Gens widerspiegelt. Eine Sonde,
die die gesamte G-Protein-kodierende
Sequenz umspannt, kann nicht mit SAD dG-RNAs hybridisieren. Die
kleine Deletion der zytoplasmatischen Domain-kodierenden Region
in dem SAD dCD-Genom wird durch das Auftreten einer G-mRNA (G),
die kürzer
als die Standard-Tollwutvirus-GmRNA ist, veranschaulicht.
v:
genomische RNA; N, G: monocistronische mRNAs; N + P. M + G, G +
L: bicistronische mRNAs.
-
13:
Fehlen der Ausbreitung des G–-mutierten SAD dG. BSR-Zellen
wurden mit phenotypisch komplementiertem SAD dG infiziert und 36 Stunden
nach Transfektion mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert.
In (A) ist die N-Protein-Expression
durch die Inkubation von Zellen mit einem FITC-gekoppelten Antikörper gezeigt,
der gegen das N-Protein gerichtet ist (Centocore). Nur einzelne
Zellen werden infiziert, keine Ausbreitung von Virus auf benachbarte
Zellen wird beobachtet. (B): Kontrolle mit einem G-spezifischen
Antikörper.
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14:
Zusammensetzung des funktionellen chimären HIV/RV-Glykoproteins, das
für die
Erzeugung von RV(HIV)-Pseudotyp-Virionen verwendet wurde. Die gesamte
zytoplasmatische Domäne von
HIV-NL43 gp 160, mit Ausnahme von drei Aminosäuren unmittelbar stromabwärts der
Transmembrandomäne,
wurde durch die vollständige
RV-G-zytoplasmatische Domäne
ersetzt. ”p” stellt
einen Prolinrest dar, der in den Stamm-Proteinen nicht vorhanden
ist. Zytoplasmatische und Transmembrandomäne-Sequenzen sind durch einen
Schrägstrich
(/) getrennt.