JP2002142770A - 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター - Google Patents

循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター

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JP2002142770A JP2000339942A JP2000339942A JP2002142770A JP 2002142770 A JP2002142770 A JP 2002142770A JP 2000339942 A JP2000339942 A JP 2000339942A JP 2000339942 A JP2000339942 A JP 2000339942A JP 2002142770 A JP2002142770 A JP 2002142770A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルス
ベクターおよびその利用を提供する。 【解決手段】 パラミクソウイルスベクターを用いるこ
とにより、外来遺伝子の発現産物を効率良く循環系に送
達することが可能となった。パラミクソウイルスベクタ
ーを介した鼻腔内投与または筋肉内投与で導入された遺
伝子の発現産物は、高いレベルで血中に検出された。抗
炎症性サイトカイン IL-10 を発現するベクターの投与
は、肺線維症モデル動物の肺におけるコラーゲン沈着を
抑制した。本発明のベクターは、循環系への遺伝子送達
に好適に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は循環系への遺伝子送
達用パラミクソウイルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、様々な疾患において、外来的に治
療遺伝子を導入する遺伝子治療の研究が進められてい
る。遺伝子治療は、治療効果のある遺伝子を患者に導入
し、それを生体内で発現させる治療法である。遺伝子治
療において用いられるベクターとしては、例えばDNAそ
のもの、リポソームに包含されたDNA、およびウイルス
ベクターなどが用いられる。これらのベクターは直接投
与されたり（in vivo遺伝子治療）、あるいはこれらの
ベクターで細胞を形質転換し、形質転換された細胞が患
者に導入される（ex vivo遺伝子治療）。
【０００３】例えば、遺伝子治療により治療効果が期待
される疾患として嚢胞性繊維症（cystic fibrosis; C
F）を含む肺線維症が挙げられる。CFは、先天的代謝異
常を起こす常染色体劣性遺伝病である。CFは欧米白色人
種にきわめて多く、2,000〜2,500児に１人の頻度で発生
する。本疾患では肺、気道、膵臓、肝臓、小腸などの臓
器において、外分泌異常による粘液性分泌物が貯留す
る。CFの治療は抗生物質による肺感染症のコントロール
及び肺移植を中心に治療が行われているが、特に肺の感
染症は致命的である。CFの肺では、気道の慢性炎症が徐
々に組織を破壊する。このような組織では、炎症性サイ
トカインおよび抗炎症性サイトカイン産生の平衡は崩れ
ていると予想されている。
【０００４】このような場合の遺伝子治療としては、患
部へのベクター投与による治療遺伝子の局所発現も有効
であるが、治療遺伝子産物を全身循環系に送達すること
により治療することも考えられる。特に、遺伝子治療ベ
クターの患部へ局所投与が困難であったり、患部におい
て望ましくない副作用を併発する可能性がある場合にお
いては、血中半減期の短い生理活性物質(例えばサイト
カインなど）等において、全身循環系に治療遺伝子を発
現させることが有効な治療戦略となり得る。これに関し
て、筋肉は分泌蛋白質の産生「工場」として適している
ことが提唱されており、生産された蛋白質が血流に運ば
れれば離れた部位でも作用することが期待される。従
来、筋中への遺伝子導入の研究には、naked DNAやアデ
ノ随伴ウイルス（AAV）が最も多く用いられてきた。し
かしながら、これらのベクターを用いた場合の発現量は
十分ではなく、導入遺伝子産物をより高いレベルで循環
系に分泌することができるベクターの開発が望まれてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は循環系への遺
伝子送達用パラミクソウイルスベクターおよびその用途
を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】パラミクソウイルス科に
属するセンダイウイルスは最近、遺伝子導入ベクターと
して開発が進められている（Kato, A. et al., EMBO J.
16: 578-598, 1997,国際公開97/16538号および国際公
開97/16539号）。センダイウイルスベクターは毒性が低
く、導入した遺伝子から発現される蛋白質量が極めて高
い。また、ベクター内の遺伝子が宿主染色体へ導入され
ることがないため、安全性にも優れている。本発明者ら
は、この組み換えセンダイウイルス（SeV）が、循環系
への効率的な導入遺伝子産物の発現に利用できるのでは
ないかと考え、抗炎症性サイトカインであるインターロ
イキン 10（IL-10）を発現するセンダイウイルスベクタ
ー（SeV-IL10）を新規に構築し、このベクターを用いて
研究を行った。
【０００７】COS7細胞へのSeV-IL10の in vitro 導入で
は、導入後16時間のIL-10の分泌はSeV-IL10の用量依存
的に増加した。最も高い力価（106 pfu/well 24-well-p
late）のSeV-IL10を感染させた場合のIL-10の分泌は、I
L-10をコードするプラスミドをリポソームを介してトラ
ンスフェクションする場合よりも２桁高いことが判明し
た。そこで、このSeV-IL10を用いて in vivo 導入試験
を行った。
【０００８】まず、鼻腔内への滴下によりSeV-IL10をマ
ウス気道に局所投与し、２日後に肺のホモジェネートお
よび気管支肺胞洗浄液（broncho-alveolar lavage flui
d; BALF）へのIL-10分泌量を測定して、リポソームを介
したプラスミドDNAのトランスフェクションによるIL-10
分泌と比較した。肺のホモジェネートでは、SeV投与に
おけるIL-10分泌量は、プラスミドのトランスフェクシ
ョンに比べ２桁高く（SeV-IL10: 21457±5112 pg/mg pr
otein、プラスミド: 310±54 pg/mg protein）、BALFで
は３桁高かった（SeV-IL10: 153366±41823 pg/ml、プ
ラスミド: 71±63 pg/ml）。さらに血中のIL-10レベル
を測定したところ、SeV-IL10を投与したマウスでは有意
な量のIL-10が分泌されていることが判明した。
【０００９】さらに、分泌蛋白質を生産させる場として
適している骨格筋へのSeV-IL10ベクターの注入を行い、
その効果を調べた。SeV-IL10ベクター（4×108 pfu/mus
cle）を前脛骨筋に注入して２日後の筋ホモジェネート
中でのIL-1の発現を定量したところ、プラスミドDNAの
注入（50μg DNA）よりも１〜２桁高かった（SeV-IL10:
1067±32 pg/mg protein、プラスミド: 50.9±11 pg/m
g protein）。プラスミド注入では血清中のIL-10は検出
されなかったが、SeV-IL10注入では、注入２日後の血清
IL-10は有意に上昇した（SeV-IL10: 393±132 pg/ml、S
eV-βgal: 0.31±0.26 pg/ml）。これらをまとめると、
組み換えSeVの肺および筋肉を介した遺伝子導入の効率
は非常に高く、循環系に高いレベルで導入遺伝子産物を
発現させることが可能であることを示している。本発明
のベクターは、全身循環系への遺伝子送達により治療可
能な各種疾患に対する遺伝子治療ベクターとして有用で
ある。特に本発明のベクターは、CFの肺炎症への遺伝子
治療への適用を可能とするものである。
【００１０】本発明によれば、組み換えSeVの筋中への
投与により効率的に遺伝子導入を行うことが可能であ
り、導入遺伝子の発現レベルは注入２日後に高いレベル
に達する。この発現レベルは naked DNAやAAVを用いる
場合に比べ有意に高い。SeVを介した治療遺伝子産物の
産生は、早急に高レベルで遺伝子を発現させることが必
要な臨床条件において極めて有用である。患部から離れ
た筋肉中へのベクター投与は、特に遺伝子導入ベクター
自体の潜在的な炎症効果の可能性が排除できない場合に
おいて、患部への直接的な投与に比べ患部の炎症を噌悪
させないなどの利点を持っている。従って、本発明のベ
クターを筋肉中に投与することにより、より効果的に治
療効果を得ることが可能になるものと思われる。さらに
複製能を欠損させたSeVを用いることで、複製能を持つ
ベクターで見られた炎症および抗体反応を低減させるこ
とも可能である。
【００１１】即ち、本発明は循環系への遺伝子送達用パ
ラミクソウイルスベクターおよびその利用に関し、より
具体的には、（１）ベクターに含まれる遺伝子の発現産
物を該ベクターの導入部位とは異なる部位に血流を介し
て送達するための、循環系送達用パラミクソウイルスベ
クター、（２）外来遺伝子を有する、（１）に記載のベ
クター、（３）外来遺伝子がサイトカインである、
（２）に記載のベクター、（４）サイトカインが抗炎症
性サイトカインである、（３）に記載のベクター、
（５）抗炎症性サイトカインがIL-10である、（４）に
記載のベクター、（６）炎症性疾患の処置に用いられ
る、（４）または（５）に記載のベクター、（７）炎症
性疾患が肺線維症である、（６）に記載のベクター、
（８）鼻腔内投与用である、（１）から（７）のいずれ
かに記載のベクター、（９）筋肉内投与用である、
（１）から（７）のいずれかに記載のベクター、（１
０）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、
（１）から（９）のいずれかに記載のベクター、（１
１）（１）から（１０）のいずれかに記載のパラミクソ
ウイルスベクターのゲノムをコードするDNA、（１２）
（１）から（１０）のいずれかに記載のパラミクソウイ
ルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を含む組成
物、（１３）抗炎症性サイトカインをコードする外来遺
伝子を有するパラミクソウイルスベクターを投与するこ
とを特徴とする、該サイトカインを循環系に送達する方
法、（１４）抗炎症性サイトカインがインターロイキン
10である、（１３）に記載の方法、（１５）投与が鼻腔
内投与である、（１３）または（１４）に記載の方法、
（１６）鼻腔内投与が鼻甲介への投与を含む、（１５）
に記載の方法、（１７）投与が筋肉内投与である、（１
３）または（１４）に記載の方法、（１８）パラミクソ
ウイルスがセンダイウイルスである、（１３）から（１
７）のいずれかに記載の方法、（１９）（１３）から
（１８）のいずれかに記載の方法により炎症性疾患を処
置する方法、（２０）炎症性疾患が肺線維症である、
（１９）に記載の方法、に関する。
【００１２】本発明において「パラミクソウイルスベク
ター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主
細胞に導入するベクター（担体）を指す。本発明のパラ
ミクソウイルスベクターはリボ核タンパク質（RNP）で
あってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であっ
てもよい。ここで「感染力」とは、組み換えパラミクソ
ウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保
持していることにより、接着した細胞の内部にベクター
内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。好ま
しい態様では、本発明のパラミクソウイルスベクター
は、外来遺伝子を発現することができるように保持す
る。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を
有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターで
あってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベク
ターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイル
スが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを
指す。
【００１３】本明細書において、「組み換え」パラミク
ソウイルスベクターとは、遺伝子操作により構築された
パラミクソウイルスベクターまたはそれを増幅して得ら
れるパラミクソウイルスベクターを言う。組み換えパラ
ミクソウイルスベクターは、例えば、組み換えパラミク
ソウイルスcDNAを再構成して生成することができる。
【００１４】本発明においてパラミクソウイルスとはパ
ラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体
を指す。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとして
は、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)の
センダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウ
イルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイ
ルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RS
ウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイル
ス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemp
er virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、
ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型等が挙げられ
る。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイル
ス属（Paramyxovirus）に属するウイルスまたはその誘
導体である。本発明を適用可能なパラミクソウイルス属
ウイルスとしては、例えばセンダイウイルス(Sendai vi
rus)およびヒトHA2などを含むパラインフルエンザウイ
ルス１型、サルSV5およびSV41並びにヒトCAなどを含む
パラインフルエンザウイルス２型、ウシSFおよびヒトHA
1などを含むパラインフルエンザ３型、パラインフルエ
ンザ４型（A亜型およびB亜型を含む）、ムンプスウイル
ス、ニューカッスルウイルス、並びにその他の多くのパ
ラミクソウイルス属ウイルスが含まれる。本発明のパラ
ミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスで
ある。これらのウイルスは、天然株、変異株、ラボ継代
株、および人為的に構築された株などであり得る。DI粒
子（J. Virol. 68, 8413-8417(1994)）等の不完全ウイ
ルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウ
イルスベクターを製造するための材料として使用するこ
とができる。
【００１５】パラミクソウイルスのウイルスタンパク質
をコードする遺伝子としては、NP、P、M、F、HN、およ
びL遺伝子が含まれる。「NP、P、M、F、HN、およびL遺
伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マ
トリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミ
ニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のこ
とを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルス
における各遺伝子は、一般に次のように表記される。一
般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもあ
る。 パラミクソウイルス属 NP P/C/V M F HN - L ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
【００１６】例えばパラミクソウイルス科（Paramyxovi
ridae）のレスピロウイルス（Respirovirus）に分類さ
れるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベ
ースのアクセッション番号は、NP遺伝子については M29
343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M6904
6, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M3020
4, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子
については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204,
M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については
D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M
30204, M69046,X00152, X02131、HN遺伝子については D
26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00
586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30
202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照
のこと。
【００１７】本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を
指し、RNAおよびDNA等の核酸が含まれる。遺伝子は天然
由来または人為的に設計された配列であり得る。本発明
において「遺伝子送達」とは遺伝子を介した送達を意味
し、「循環系への遺伝子送達」とは循環系への遺伝子の
発現産物の送達を含む。「分泌性蛋白質」とは細胞外に
分泌され得る蛋白質を指す。このような分泌性蛋白質
は、細胞外に分泌され得る限り、明確な分泌シグナル配
列を有していなくてもよい。分泌性蛋白質は天然由来ま
たは人為的に設計された蛋白質であり得る。分泌シグナ
ルを付加することにより、所望の蛋白質を細胞外に分泌
させることが可能である。人工的な蛋白質としては、例
えば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティ
ブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナン
トネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子お
よび可溶型細胞表面分子などの形態であり得る。また、
本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DN
Aを含む。
【００１８】本発明においてサイトカインとは、細胞か
ら放出され、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイ
ルス作用、細胞分化・調節作用等の生理活性を示す物質
で抗体以外の全ての蛋白質およびポリペプチドを意味す
る［Aggarwal, B. B. and Pocsik, E.,"クローンから臨
床へのサイトカイン" (Cytokines: from clone to clin
ic), Arch. Biochem. Biophys. 292(2):335-59, 199
2］。リンフォカインおよびモノカインは、サイトカイ
ンと実質上同じであり、これらは本発明においてサイト
カインに含まれる。また抗炎症性サイトカインとは Th1
細胞、NK細胞、単球、およびマクロファージの少なくと
もいずれかの細胞から放出されるサイトカイン（例えば
INF-γ、TNF-β、IL-2、IL-1、IL-6、IL-8、および TN
F-αなどが挙げられる）の１つまたはそれ以上の合成を
抑制するサイトカインを意味する。サイトカインは天然
の蛋白質であってもよく、人工的に改変された蛋白質で
あってもよい。抗炎症性サイトカインとしは、例えば、
IL-10、IL-4、IL-12が挙げられるがこれらに限定されな
い。これらのサイトカインをコードする遺伝子は、例え
ば塩基配列情報を基にして設計したプライマーを用いた
PCRなどの公知の方法により調製することができる。本
発明において用いられる特に好ましい抗炎症性サイトカ
インとしては、インターロイキン10（IL-10）が例示で
きる。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明は循環系への遺伝子送達用
パラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供す
る。本発明者等は、外来遺伝子をコードするパラミクソ
ウイルスベクターを in vivo で投与することにより、
投与部位のみならず血中において導入遺伝子産物を高発
現させることができることを実証した。鼻滴下（sniffi
ng）によるIL-10発現センダイウイルスベクター（SeV-I
L10）のマウス鼻腔内投与では、ベクターは鼻上皮（鼻
甲介）および肺に導入され、投与部位において導入遺伝
子の高い発現が得られるのみならず、血中IL-10の有意
な上昇が観察された。また、鼻上皮（鼻甲介）への灌流
による投与においても血中IL-10は有意に上昇した。さ
らに、分泌蛋白質を生産させる場として適していると言
われる骨格筋への投与においても、SeV-IL10の前脛骨筋
［tibialis anterior (TA) muscle］への注入は投与部
位の筋中IL-10のみならず、血中IL-10レベルを有意に上
昇させた。加えて、ブレオマイシン投与によるマウス肺
線維症モデルにおいては、筋肉内投与によるSeV-IL10の
投与は肺内のコラーゲン沈着を有意に減少させたことか
ら、SeV-IL10の筋肉内投与が、肺線維症に対する治療効
果を有することが確かめられた。本発明のベクターは、
全身循環系に治療遺伝子産物を送達するために極めて有
用であり、例えば本発明のベクターを用いて抗炎症性サ
イトカインを発現させることにより、各種炎症性疾患に
対する遺伝子治療を実施することが可能である。例えば
抗炎症作用のある遺伝子による遺伝子治療により炎症を
抑え、粘液性分泌物の貯留を抑制することにより治療効
果を得るために、本発明のベクターを利用することが可
能である。
【００２０】また、本発明者等により、組み換えパラミ
クソウイルスベクターを利用して筋肉中に投与された遺
伝子は、投与２日目に最大の発現を示し、１週間以上に
わたり持続的な発現を示すことが示された。また、反復
投与により発現を上昇させることも可能であった。この
ことは、組み換えパラミクソウイルスベクターを利用し
て遺伝子治療を行った場合に、早急かつ持続的な治療効
果を得ることができるという利点をもたらす。
【００２１】また、安全性の面においても、パラミクソ
ウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好
適に用いられうる可能性が示唆される。第一に、外来遺
伝子の発現は、多くの場合、導入したDNAの核局在化が
必要であることが、遺伝子導入の成功率を低下させる主
要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイル
スなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において
細胞性チューブリンおよび自身が持つRNAポリメラーゼ
（L蛋白質）の両方によって駆動される。これは、セン
ダイウイルスが宿主のゲノムと相互作用しないことを示
しており、癌化などの安全面における問題が生じないと
考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっ
ては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に
は病原性ではない。これはまた、野生型センダイウイル
スの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有
害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持
されている（Hurwitz, J.L. et al., Vaccine 15: 533-
540, 1997）。センダイウイルスのこれらの特徴は、セ
ンダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうるこ
とを示唆し、センダイウイルスベクターが、循環系への
外来遺伝子産物の送達を目的とした遺伝子治療における
有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものであ
る。
【００２２】本発明のベクターは、特に炎症性疾患を対
象とする、抗炎症性サイトカインによる遺伝子治療に好
適に利用され得る。抗炎症性サイトカインを発現する本
発明のパラミクソウイルスベクターは、特に炎症性疾患
の処置に有用である。すなわち、本発明のベクターを用
いた抗炎症性サイトカイン遺伝子の遺伝子導入により、
炎症を抑制し、疾患症状を緩和することができる。炎症
性疾患としては、例えば肺線維症、硬化性腹膜炎、前立
腺肥大症、多発性硬化症、移植後の拒否反応、I型糖尿
病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、全身性エ
リテマトーデス、虹彩炎、肉芽腫性疾患、慢性腎炎、強
皮症、子宮平滑筋腫、ケロイド、肝硬変、およびその他
の炎症症状を伴う疾患などが挙げられる。本発明におい
て疾患の処置とは疾患の治療または予防を含む。
【００２３】本発明において循環系への遺伝子送達用パ
ラミクソウイルスベクターとしては、特に制限はない。
好適なパラミクソウイルスベクターとして、例えば、複
製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げら
れる。例えば、一般に天然型パラミクソウイルスのゲノ
ムは、3'の短いリーダー領域に続き、N（ヌクレオキャ
プシド）、P（ホスホ）、M（マトリックス）、F（フュ
ージョン）、HN（ヘマグルチニン-ノイラミニダー
ゼ）、およびL（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺
伝子が並んでおり、短い5'トレイラー領域を他端に有す
る。これと同様の構造を有するゲノムを設計することに
より、自律複製可能な本発明のベクターを製造すること
ができる。ゲノム内に外来遺伝子を挿入することによ
り、外来遺伝子を発現するベクターを製造することがで
きる。なお、本発明のパラミクソウイルスベクターにお
いては、ウイルス遺伝子の配置は野生型ウイルスから改
変されていてもよい。
【００２４】また、本発明に用いるパラミクソウイルス
ベクターとしては、野生型パラミクソウイルスが持つ遺
伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例え
ば、センダイウイルスベクターを再構成させる場合、N
P、P/CおよびL遺伝子から作られる蛋白質群がトランス
に必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする
遺伝子自体は、本発明のウイルスベクターに必ずしも含
まれている必要なはい。例えば、該蛋白質群をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコ
ードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェク
ションすることにより、ベクターの再構成を行うことが
できる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する
宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを
導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を
行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウ
イルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入にお
ける活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異
を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代
用してもよい。
【００２５】また、パラミクソウイルスベクターが細胞
に伝播してゆくためには、M、FおよびHN遺伝子から作ら
れる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソ
ウイルスベクターをRNPとして調製する場合は、これら
の蛋白質は必要ない。RNPに含まれるゲノムに、M、Fお
よびHN遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時
に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイ
ルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するRNP
ベクターとしては、例えば N、P、M、F、HN、およびL遺
伝子をコードするウイルスゲノムRNAと、N蛋白質、P蛋
白質、およびL蛋白質とを含むRNPが挙げられる。このよ
うなRNPを細胞内に導入すると、N蛋白質、P蛋白質、お
よびL蛋白質の働きによりウイルスゲノムが発現、複製
され、感染性ウイルスベクターが増幅する。
【００２６】RNPを細胞に導入するには、例えばリポフ
ェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に
複合体を形成させて導入することが可能である。具体的
には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。
例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #30
1305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）
などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐた
め、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1
983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。複製型
ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏
卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染
させて増幅または継代することができる。
【００２７】逆に、M、Fおよび/またはHN遺伝子が含ま
れていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパ
ラミクソウイルスベクターとして用いることができる。
このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損
している遺伝子産物を外来的に供給することにより行う
ことができる。このようにして製造されたウイルスベク
ターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細
胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムは
これらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と
同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されな
い。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウ
イルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させ
る遺伝子としては、例えばF遺伝子および／またはHN遺
伝子が挙げられる。例えば、F遺伝子が欠損した組み換
えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラス
ミドを、F蛋白質の発現ベクターならびにNP、P/Cおよび
L蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェ
クションすることにより、ウイルスベクターの再構成を
行うことができる（国際出願番号 PCT/JP00/03194 およ
び PCT/JP00/03195）。また、例えば、F遺伝子が染色体
に組込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。
これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸
配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の
導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上なら
ば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺
伝子で代用してもよい。
【００２８】また、ベクターゲノムが由来するウイルス
のエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエ
ンベロープに含むベクターを作製することもできる。こ
のようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウ
イルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎
ウイルス（VSV）のGタンパク質（VSV-G）を挙げること
ができる。本発明のパラミクソウイルスベクターは、VS
V-Gタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイル
ス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を
含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
【００２９】また、本発明のパラミクソウイルスベクタ
ーは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着し
うるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あ
るいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエ
ンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキ
メラタンパク質などを含むものであってもよい。これに
より、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこと
もできる。これらはウイルスゲノムにコードされていて
もよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲ
ノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主
染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。
【００３０】また、本発明のウイルスベクターは、例え
ば免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率
や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイル
ス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的に
は、例えば複製因子であるNP遺伝子、P/C遺伝子およびL
遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機
能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１
つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニ
ン（hemagglutinin）活性とノイラミニダーゼ（neurami
nidase）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の
活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安
定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の
活性を改変することにより、感染能を調節することも可
能である。また、膜融合に関わるF蛋白質を改変するこ
とにより、膜融合リポソームの融合能を調節することも
できる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうる
F蛋白質やHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、
これを利用して抗原提示能を弱めたパラミクソウイルス
を作製することもできる。
【００３１】本発明のウイルスベクターは、ゲノムRNA
中に外来遺伝子をコードすることができる。外来遺伝子
を含む組み換えパラミクソウイルスベクターは、上記の
パラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入
することによって得られる。外来遺伝子としては、血中
に発現させたい所望の蛋白質をコードする遺伝子を用い
ることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードす
る遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機
能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または
挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする
遺伝子であってもよい。また、ドミナントネガティブ変
異体等の人工的な蛋白質であってもよい。例えば、遺伝
子治療などを目的とする場合には、該ウイルスベクター
のゲノムをコードするDNA（ウイルスベクターDNA）に対
象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウイルスベク
ターDNAに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、セン
ダイウイルスベクターDNAにおいては、転写終結(E)配列
と転写開始(S)配列との間などに、6の倍数の塩基数を有
する配列を挿入することが望ましい（Journal ofVirolo
gy, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830）。外来遺伝子
は、ウイルスの各遺伝子（NP、P、M、F、HN、およびL遺
伝子）の前および/または後ろに挿入することができ
る。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外
来遺伝子の前または後ろに適宜 E-I-S配列（転写開始配
列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入
し、各遺伝子の間にE-I-S配列を配置する。あるいは、I
RESを介して外来遺伝子を挿入し得る。
【００３２】挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺
伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節す
ることができる（国際出願番号 PCT/JP00/06051）。ま
た、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列
により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいて
は、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖RNAの3'
端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置
においては、NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子
の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るために
は、外来遺伝子をNP遺伝子の上流（マイナス鎖において
は3'側）またはNP遺伝子とP遺伝子の間など、ネガティ
ブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好まし
い。逆に、挿入位置がネガティブ鎖RNAの5'端に近いほ
ど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置において
は、L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量
が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、
例えばネガティブ鎖の最も5'側、すなわち野生型ウイル
スゲノムにおいてはL遺伝子の下流（ネガティブ鎖にお
いてはL遺伝子の5'隣接部位）、またはL遺伝子の上流
（ネガティブ鎖においてはL遺伝子の3'隣接部位）に外
来遺伝子を挿入する（日本国出願番号 特願2000-152726
参照）。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺
伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス
タンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適と
なる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウ
イルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性
を示す場合は、投与するウイルス力価を制限することが
できる他、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位
置をネガティブ鎖のなるべく5'側に設定したり、転写開
始配列を効率の低いものにするなどして、個々のウイル
スベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な
治療効果が得られるすることも可能である。
【００３３】外来遺伝子を容易に挿入できるようにする
ために、挿入部位にクローニングサイトを設計すること
ができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認
識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクタ
ーDNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入す
ることができる。クローニングサイトは、複数の制限酵
素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイ
トとしてもよい。また、本発明のベクターは、このよう
に外来遺伝子を挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を
保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制
限はなく、他の抗炎症サイトカイン遺伝子であってもよ
く、また、その他の遺伝子であってもよい。
【００３４】外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイ
ルスベクターは、例えば、Kato, A.et al., 1997, EMBO
J. 16: 578-587及びYu, D. et al., 1997, Genes Cell
s 2: 457-466の記載に準じて、次のようにして構築する
ことができる。まず、所望の外来遺伝子のcDNA塩基配列
を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の
濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できること
が好ましい。以下、外来遺伝子を、NotI部位を利用して
ウイルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例に
とって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認
識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを
用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように
塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが
好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより
増幅回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、
さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（E）、
介在配列（I）及び転写開始配列（S）（EIS配列）のコ
ピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び
転写終結配列（E）、介在配列（I）及び転写開始配列
（S）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対と
して、フォワード側（センス鎖）合成DNA配列及びリバ
ース側（アンチセンス鎖）合成DNA配列（プライマーセ
ット）を作成する。
【００３５】例えば、フォワード側合成DNA配列は、Not
Iによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌ
クレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部
位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACT
T）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加
し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩
基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さら
にその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含
めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。
最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約
25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末
端とすることが好ましい。
【００３６】リバース側合成DNA配列は5'側から任意の
２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどの
NotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ま
しくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggcc
gcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿
入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さ
は、NotI認識部位gcggccgcを含め、cDNAの相補鎖塩基配
列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイ
ルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるよ
うに塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of
six）」；Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-
899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J.Virol. 67:48
22-4830, 1993）。さらに挿入断片の3'側にセンダイウ
イルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-CTTTCACCC
T-3'（配列番号：１）、Ｉ配列、好ましくは5'-AAG-
3'、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは5'-TTTTTCTTACTAC
GG-3'（配列番号：２）、さらにその3'側に所望のcDNA
配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖
の最後の塩基がGまたはCになるように長さを選択して配
列を付加し、リバース側合成オリゴDNAの3'の末端とす
る。
【００３７】PCRは、例えば、ExTaqポリメラーゼ（宝酒
造）を用いる通常の方法を用いることができる。好まし
くはVentポリメラーゼ（NEB）を用いて行い、増幅した
目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBlu
escriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基
配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミ
ドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切
り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクロ
ーニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを
介さずにNotI部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイ
ルスcDNAを得ることも可能である。
【００３８】例えば、組み換えセンダイウイルスゲノム
cDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することが
できる（Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 199
7, Hasan, M.K. et al. J. Gen. Virol. 78: 2813-282
0, 1997）。例えば、まずNotI制限部位を有する18bpの
スペーサー配列（5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'）（配
列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルス
ゲノムcDNA（pSeV(+)）のリーダー配列とN-タンパク質
をコードする配列の5'末端との間の隣接遺伝子座に挿入
し、肝炎デルタウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomi
c strand）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラス
ミドpSeV18+b(+)を得る（Hasan, M. K. etal., 1997,
J. General Virology 78: 2813-2820）。pSeV18+b(+)の
NotI部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子
が組込まれた組み換えセンダイウイルスcDNAを得ること
ができる。
【００３９】このようにして作製した組み換えパラミク
ソウイルスベクターDNAを試験管内または細胞内で転写
させ、ウイルスのL、P、およびNPタンパク質の共存下で
RNPを再構成させると、このRNPを含むウイルスベクター
を生成させることができる。本発明は、本発明のパラミ
クソウイルスベクターのゲノムをコードするDNAを転写
させる工程を含む、該ベクターの製造方法を提供する。
また本発明は、該DNAからなる、本発明のパラミクソウ
イルスベクター製造用DNAを提供する。また本発明は、
本発明のパラミクソウイルスベクターを製造するため
の、該ベクターのゲノムをコードするDNAの使用に関す
る。ウイルスベクターDNAからのウイルスの再構成は公
知の方法に従って行うことができる（国際公開97/16539
号; 国際公開97/16538号; Durbin, A.P. et al., 1997,
Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnel
l. M.J.et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radeck
e, F. et al., 1995, EMBO J.14: 5773-5784; Lawson,
N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4
481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-609
4; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579;
Baron, M.D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1
265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの
方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイル
ス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウ
イルス、センダイウイルスなどを含むパラミクソウイル
スベクターをDNAから再構成させることができる。ウイ
ルスベクターDNAにおいて、F遺伝子、HN遺伝子、および
/またはM遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感
染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これ
ら欠失させた遺伝子および/または他のウイルスのエン
ベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し
発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成さ
せることが可能である。
【００４０】例えば、ベクターDNAを細胞内に導入する
方法には、次のような方法、目的の細胞が取り込める
ようなDNA沈殿物を作る方法、目的の細胞による取り
こみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDN
Aを含む複合体を作る方法、目的の細胞膜に、DNA分子
が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって
瞬間的に開ける方法などがある。
【００４１】としては、種々のトランスフェクション
試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Sup
erfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boe
hringer #1811169）などが挙げられる。としては例え
ばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が
挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食
小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入る
ことが知られている（Graham, F.L. and Van Der Eb,
J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silvers
tein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayama
はトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞を共
沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2 、35
℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性
が高く、3)沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30μg/mlのとき
最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and O
kayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。の
方法は、一過的なトランスフェクションに適している。
古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105
）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクシ
ョンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンド
ソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるため
にクロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 198
3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。の方法
は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないとい
う点でやの方法に比べて汎用性が高い。効率はパル
ス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャッ
プ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細
胞密度の最適条件下で良いとされている。
【００４２】以上、３つのカテゴリーの中での方法は
操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討する
ことができるので、本発明においては、トランスフェク
ション試薬が適している。好適には Superfect Transfe
ction Ragent（QIAGEN, CatNo. 301305）、または DOSP
ER Liposomal Transfection Reagent（Boehringer Mann
heim, Cat No. 1811169）が用いられる。
【００４３】cDNAからの再構成は具体的には次のように
して行うことができる。24穴から６穴程度のプラスチッ
クプレートまたは100mmペトリ皿上で、10％ウシ胎児血
清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGお
よび100μg/mlストレプトマイシン）を含む最少必須培
地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2を70〜80
％コンフルエントになるまで培養し、例えば 1μg/ml p
soralen（ソラレン）存在下 UV照射処理を20分処理で不
活化した、T7ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニ
アウイルスvTF7-3（Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986、Kato, A. et a
l., Genes Cells 1: 569-579, 1996）を2 PFU/細胞で感
染させる。ソラレンの添加量およびUV照射時間が適宜調
整することができる。感染1時間後、2〜60μg、より好
ましくは3〜5μgの上記の組み換えセンダイウイルスcDN
Aを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトラ
ンスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミ
ド（24-0.5μgのpGEM-N、12-0.25μgのpGEM-P、および2
4-0.5μgのpGEM-L、より好ましくは例えば1μgのpGEM-
N、0.5μgのpGEM-P、および1μgのpGEM-L)（Kato, A. e
t al.,Genes Cells 1: 569-579,1996）と共にSuperfect
（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等によりトラ
ンスフェクションする。トランスフェクションを行った
細胞は、所望により100μg/mlのリファンピシン（Sigm
a）及びシトシンアラビノシド（AraC）、より好ましく
は40μg/mlのシトシンアラビノシド（AraC）（Sigma）
のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウイル
スによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を
最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A.
et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579）。トランス
フェクションから48〜72時間程度培養後、細胞を回収
し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、LLC-
MK2細胞にトランスフェクションして培養する。培養３
〜７日後に培養液を回収する。エンベロープ蛋白質をコ
ードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベ
クターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を
発現するLLC-MK2細胞をトランスフェクションに使用す
るか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトラン
スフェクションすればよい。また、トランスフェクショ
ンを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するLL
C-MK2細胞に重層して培養することによって欠損型ウイ
ルスベクターを増幅することもできる（国際出願番号 P
CT/JP00/03194 および PCT/JP00/03195参照）。培養上
清に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性(HA)を測定
することにより決定することができる。HAは「endo-poi
nt 希釈法」（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1:
569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutin
ating virus of Japan-liposome-mediated gene delive
ry to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular B
iology of Vascular Diseases. Method in Molecular M
edicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）により決
定することができる。混入し得るワクシニアウイルスvT
F7-3を除去するために、得られた漿尿液試料を適宜希釈
（例えば106 倍）して、鶏卵で再増幅させることができ
る。再増幅は、例えば３回上繰り返すことができる。得
られたウイルスストックは-80℃で保存することができ
る。
【００４４】ウイルスベクターが再構成する限り、再構
成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、LLCM
K2細胞、サル腎由来のCV-1細胞、ハムスター腎由来のBH
K細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことがで
きる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るた
めに、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育
鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。
鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発さ
れている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術
プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大
阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養
器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させ
る。ウイルスベクターを漿尿膜腔へ接種し、数日間卵を
培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の
条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わ
り得る。その後、ウイルスを含んだ漿尿液を回収する。
漿尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は
常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス
実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー
社, pp.68-73,(1995)）。
【００４５】例えば、F蛋白質を欠失したセンダイウイ
ルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことが
できる（国際出願番号 PCT/JP00/03194 および PCT/JP0
0/03195参照）。 <1> F欠失型センダイウイルスゲノムcDNAおよびF発現プ
ラスミドの構築 センダイウイルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV18+ b
(+)（Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virolog
y 78: 2813-2820）（「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」と
もいう）のcDNAをSphI/KpnIで消化してフラグメント(14
673bp)を回収し、pUC18にクローニングしてプラスミドp
UC18/KSとする。F欠損部位の構築はこのpUC18/KS上で行
う。F遺伝子の欠損は、PCR-ライゲーション方法の組み
合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のORF（ATG-TGA=169
8bp）を除いてatgcatgccggcagatga（配列番号：４）で
連結し、Ｆ欠失型SeVゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF）を構築
する。PCRは、Fの上流には（forward: 5'-gttgagtactgc
aagagc／配列番号：５, reverse: 5'-tttgccggcatgcatg
tttcccaaggggagagttttgcaacc／配列番号：６）、F遺伝
子の下流には（forward: 5'-atgcatgccggcagatga／配列
番号：７, reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc／配列
番号：８）のPCR産物をEcoT22Iで連結する。このように
得られたプラスミドをSacIとSalIで消化して、F欠損部
位を含む領域の断片（4931bp）を回収してpUC18にクロ
ーニングし、pUC18/dFSSとする。このpUC18/dFSSをDraI
IIで消化して、断片を回収してpSeV18+のF遺伝子を含む
領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてプラ
スミドpSeV18+/ΔF を得る。外来遺伝子は、pUC18/dFSS
のＦ欠失部位にある制限酵素 NsiI および NgoMIV部位
に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、
NsiI-taildプライマーおよびNgoMIV-tailedプライマー
で増幅すればよい。
【００４６】 <2> SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製 センダイウイルスのF遺伝子（SeV-F）を発現するCre/lo
xP誘導型発現プラスミドの構築はSeV-F遺伝子をPCRで増
幅し、Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導
発現されるように設計されたプラスミドpCALNdlw(Arai
ら J. Virology72,1998,p1115-1121)のユニークサイト
SwaI部位に挿入し、プラスミドpCALNdLw/Fを構築する。
F欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、SeV
-F蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、
例えばSeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細
胞株LLC-MK2細胞を用いることができる。LLC-MK2細胞
は、10％の熱処理した不動化ウシ胎児血清(FBS)、ペニ
シリンGナトリウム 50単位/ml、およびストレプトマイ
シン 50μg/mlを添加したMEMで37℃、5％ CO2で培養す
る。SeV-F遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Cre D
NAリコンビナーゼによりF遺伝子産物を誘導発現される
ように設計された上記プラスミドpCALNdLw/Fを、リン酸
カルシウム法（mammalian transfection kit (Stratage
ne)）により、周知のプロトコールに従ってLLC-MK2細胞
に遺伝子導入を行う。10cmプレートを用い、40％コンフ
ルエントまで生育したLLC-MK2細胞に10μgのプラスミド
pCALNdLw/Fを導入後、10mlの10% FBSを含むMEM培地に
て、37℃の５％CO2 インキュベーター中で24時間培養す
る。24時間後に細胞をはがし、10ml培地に懸濁後、10cm
シャーレ５枚を用い、5ml 1枚、2ml 2枚、0.2ml 2枚に
蒔き、G418 (GIBCO-BRL)を1200μg/mlを含む10mlの10%F
BSを含むMEM培地にて培養を行い、２日毎に培地交換し
ながら、14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行
う。該培地により生育してきたG418に耐性を示す細胞は
クローニングリングを用いて回収する。回収した各クロ
ーンは10cmプレートでコンフルエントになるまで拡大培
養を続ける。F蛋白質の発現誘導は、細胞を6cmシャーレ
にてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルス
AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al., Nucl. Acids
Res.23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J Virol
72,1115-1121 (1998)）により moi=3 で感染させて行
う。
【００４７】<3> Ｆ欠失SeVウイルスの再構築及び増幅 上記 pSeV18+/ΔF の外来遺伝子が挿入されたプラスミ
ドを以下のようにしてLLC-MK2細胞にトランスフェクシ
ョンする。LLC-MK2 細胞を5x106cells/dish で 100mm
ペトリ皿に蒔き、24時間培養後、ソラレンと長波長紫外
線（365nm）で 20分間処理したT7 RNAポリメラーゼを発
現するリコンビナントワクシニアウイルス（Fuerst, T.
R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-812
6 (1986)）に室温で１時間感染させる（moi=2）（moi=2
〜3、好適にはmoi=2が用いられる）。ワクシニアウイル
スへの紫外線照射には、例えば15ワットバルブを5本が
装備された UV Stratakinker 2400（カタログ番号 4006
76 (100V), ストラタジーン社, La Jolla, CA, USA）を
用いる。細胞を３回洗浄してからプラスミド pSeV18 +/
ΔF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P, 及びpGEM/L(Kato, A. et
al., Genes cells 1,569-579 (1996)) をそれぞれ12μ
g, 4μg, 2μg, 及び4μg /dish の量比でOptiMEM(GIBC
O)に懸濁し、SuperFect transfection reagent(1μg DN
A/5μl の SuperFect, QIAGEN)を入れて混合し、室温で
10 分間放置後、最終的に3%FBSを含むOptiMEM 3mlに入
れ、細胞に添加して培養する。３時間培養後、細胞を、
血清を含まないMEM で２回洗浄し、シトシンβ-D-アラ
ビノフラノシド40μg/ml (AraC, Sigma), トリプシン7.
5μg/ml (GIBCO) を含むMEMで70時間培養する。これら
の細胞を回収し、ペレットをOptiMEM に懸濁する（107
cells/ ml）。凍結融解を３回繰り返してlipofection r
eagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し（10 6ce
lls/25μl DOSPER）室温で15分放置した後、上記でクロ
ーニングしたF発現ヘルパー細胞の一つLLC-MK2/F7細胞
にトランスフェクション（106cells /well 12-well-pla
te）し、血清を含まないMEM（40μg/ml AraC, 7.5μg/m
l トリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。
【００４８】欠損型ウイルスベクターを調製する場合、
例えば、ゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が
異なる２種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞ
れで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方の複
合体からの発現により供給されるため、互いに相補しあ
って感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイク
ルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、
２種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロー
プタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それ
ぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混
合物を大量かつ低コストで生産することができる。これ
らのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているた
め、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比
べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持する
ことができる。また、元々感染性のないこれらのウイル
スは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることか
ら、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
【００４９】外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用
いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投
与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウ
イルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投
与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝
子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待でき
る外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している
内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝
子としては特に制限はなく、循環系に分泌させたい所望
の分泌蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。例え
ば、各種サイトカイン、ホルモン、増殖因子などの液性
因子が例示できる。炎症性疾患の治療を行うためには、
外来遺伝子として抗炎症性サイトカイン遺伝子を用いる
ことが好ましい。
【００５０】本発明のパラミクソウイルスベクターは、
薬学的に許容される所望の媒体と共に組成物とすること
ができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクター
と共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝
子導入を阻害しない材料である。例えば本発明のパラミ
クソウイルスベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）などで適宜希釈して組成物とすることがで
きる。本発明のパラミクソウイルスベクターを鶏卵で増
殖させた場合等においては漿尿液を含んでよい。また本
発明のパラミクソウイルスベクターを含む組成物は、脱
イオン水、5%デキストロース水溶液等の媒体を含んでい
てもよい。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が
含有されていてもよい。本発明の組成物は医薬組成物を
含む。また本発明は、本発明のベクターまたは上記組成
物の医薬としての使用にも関する。
【００５１】本発明の組成物には、具体的には以下のも
のを含む。 〔１〕パラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを
含む細胞を含む、ベクターに含まれる遺伝子の発現産物
を該ベクターの導入部位とは異なる部位に血流を介して
導入するための、循環系への遺伝子送達用組成物。 〔２〕外来遺伝子を有する、〔１〕に記載の循環系への
遺伝子送達用組成物。 〔３〕外来遺伝子がサイトカインである、〔２〕に記載
の組成物、 〔４〕サイトカインが抗炎症性サイトカインである、
〔３〕に記載の組成物、 〔５〕抗炎症性サイトカインがIL-10である、〔４〕に
記載の組成物、 〔６〕炎症性疾患の処置に用いられる、〔４〕または
〔５〕に記載の組成物、 〔７〕炎症性疾患が肺線維症である、〔６〕に記載の組
成物、 〔８〕鼻腔内投与用である、〔１〕から〔７〕のいずれ
かに記載の組成物、
〔９〕筋肉内投与用である、〔１〕から〔７〕のいずれ
かに記載の組成物、 〔１０〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスであ
る、〔１〕から
〔９〕のいずれかに記載の組成物。
【００５２】上記のようにして得られたパラミクソウイ
ルスベクターまたは該ベクターを含む組成物を投与する
ことで、パラミクソウイルスベクターが持つ外来遺伝子
を導入することができる。投与部位に特に制限はない
が、例えば鼻腔内（intranasal; IN）投与（吸引による
投与、およびカテーテルを介した投与などを含む）また
は筋肉内（intramuscular; IM）投与等が挙げられる。
投与は in vivo または ex vivo で行い得る。投与は一
箇所または複数箇所に投与し得る。また、投与は１回ま
たは複数回行うことができる。
【００５３】本発明のパラミクソウイルスベクターによ
り導入する遺伝子としては、分泌性蛋白質をコードする
遺伝子であれば特に制限はないが、例えば各種サイトカ
インおよびホルモン等が挙げられる。これらの蛋白質に
は、それぞれのファミリーに属する各メンバーやアイソ
フォームなどを含む。本発明のパラミクソウイルスベク
ターは、特に血中半減期の短い生理活性物質(例えばサ
イトカインなど）等において、全身循環系に治療遺伝子
を発現させるために有用である。天然のサイトカインの
循環血中での半減期が短い。例えば、天然のIL-10が治
療的に有効であるのは投与後約30分に過ぎない（Gerard
ら、1993，J.Exp.Med．177（2）:547）。本発明のベク
ターを用いることにより、サイトカインと含む半減期の
短い生理活性物質を長期に亘って血中に供給することが
可能となる。
【００５４】特にサイトカインは細胞の増殖および分化
に関連する広範な作用を持っている。例えばIL-1は、T
細胞の活性化、IL-2受容体の発現、サイトカイン遺伝子
およびその他の遺伝子の発現の誘導、細胞増殖、ホルモ
ン分泌調節などの様々な機能を持つ。また、IL-1は、骨
髄細胞およびリンパ系細胞株から細胞増殖および分化に
関連する因子の放出を促進する。またIL-1は骨髄内の多
能性前駆細胞の増殖を誘導し造血を促す。IL-1が癌治療
において有用である。また、IL-1は血管新生や線維芽細
胞の活性化にも関与しており、創傷治癒においても有用
である。
【００５５】IL-2は、T細胞、NK細胞、およびLAK細胞の
活性化、特定の細胞に対する増殖促進、イムノグロブリ
ン産生の増強、IFN-γ産生の増強、単球からのIL-6産生
の誘導などに関与している。IL-2は腫瘍や免疫不全疾患
を治療するために有用である。また、骨髄移植後のNK細
胞活性化にも有用である。またIL-3は、肥満細胞の増
殖、造血前駆細胞からの血液細胞の形成などに関与して
いる。IL-3は、他のサイトカイン（例えばIL-6）と協調
して作用し、様々な血液細胞を分化させる。IL-3は、例
えば再生不良性貧血の治療に有用である。
【００５６】IL-4は、休止期のB細胞におけるMHCクラス
II遺伝子の発現の上昇、活性化T細胞の増殖およびエフ
ェクター細胞の機能を促進する。また、肥満細胞の増
殖、胸腺細胞の成熟の促進、血液細胞の増殖などに関与
している。IL-4はIL-1の共存下で、マクロファージの抗
原提示および食作用を増強させる。IL-4は、骨髄移植後
の細胞性免疫および体液性免疫の機能の再構築、IgM過
剰血症に伴う免疫不全の寛解、急性リンパ芽球腫性白血
病の最終分化の誘導、固形腫瘍およびB細胞リンパ腫の
成長の抑制、IL-1、TNF、およびIL-6の産生の抑制を介
する炎症過程の抑制などの作用を有する。IL-4は、例え
ば自己免疫性糖尿病、およびアレルギー性脳脊髄炎など
のT細胞依存性の自己免疫疾患、およびT細胞依存性の免
疫活動が関与するその他の種々の疾患への適用が期待さ
れる（Rapoport et al., 1993, J.Exp. Med. 178: 87-9
9; Racke et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 1961）。
【００５７】IL-5は IgAの産生を増加させ、好酸球の増
殖を促すために有用であり、住血吸虫症の治療への適用
（Sanderson，April，1989，"International Conferenc
e onthe Clinical Impact of Interleukins"at the Roy
al College of Physiciansin London）や、腫瘍への適
用（Kolbら、1979，Br. J．Cancer 40: 410; Pretlow
ら、1983，Cancer Res. 43: 2997; Iwasakiら、1986, C
ancer 58: 1321）が知られている。さらにIL-6は多くの
細胞の増殖の誘導または抑制を含む多様な機能を示すこ
とが報告されている。またIL-7は、特定のB細胞およびT
細胞の増殖を誘導する。IL-9は赤血球の分化、T細胞細
胞の生存、およびBリンパ球からのIg産生に関与し、肥
満細胞からのIL-6の産生も促進する。
【００５８】IL-10は、活性化Th2細胞、B細胞、ケラチ
ノサイト、単球、およびマクロファージによって産生さ
れる（Mooreら、1993,Annu.Rev.Immunol. 11:165）。IL
-10は、B細胞の増殖および分化を促すために有用であ
る。また、IL-10は Th1細胞、NK細胞、単球、およびマ
クロファージによるサイトカイン（例えばIFN-γ、TNF-
β、およびIL-2）の合成を抑制する（Fiorentinoら、19
89,J.Exp.Med.,170:2081-2095; Fiorentinoら、1991,J.
Immunol.146:3444; Hsuら、1992,Int.Immunol.4:563; H
suら、1992,Int.Immunol.4:563; D'Andreaら、1993,J.E
xp.Med.178:1041;de Waal Malefytら、1991,J.Exp.Med.
174:915; Fiorentinoら、1991,I.Imunol.147:3815）。
このため、IL-10は、Th1細胞の反応を阻害することによ
って、移植時の拒絶反応、ならびにI型糖尿病および多
発性硬化症などのT細胞を介する自己免疫疾患を予防す
るために有用である。IL-10は炎症性サイトカイン（例
えばIL-1、IL-6、IL-8、およびTNF-α）の分泌を抑制す
る。従って、IL-10は慢性関節リウマチおよび乾癬等を
含む炎症性疾患の治療に用いることができる。また、IL
-10は敗血症の治療にも有用である。IL-10は腫瘍壊死因
子の分泌を抑制し、敗血性ショックを抑制する。また、
住血吸虫による肉芽腫形成および肝組織の線維化の抑制
にも有用である。また、インターフェロンαおよびβ
は、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、およびヘルペ
スウイルスなどに対する抗ウイルス作用を有し、毛状細
胞白血病、骨髄腫、およびその他の造血器系癌に対する
治療に用いられ得る。
【００５９】上記のようなサイトカインを循環系に送達
するために、これらのサイトカインを発現する本発明の
パラミクソウイルスは好適に用いられる。中でも、本発
明のパラミクソウイルスにより導入する遺伝子の好適な
一例として、抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子
が挙げられる。抗炎症性サイトカインとしては、例え
ば、IL-10、IL-4、および IL-12が挙げられる。抗炎症
性サイトカインを発現する本発明のベクターは、有用な
抗炎症薬となる。
【００６０】本発明のベクターは、様々な疾患に対する
遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺
伝子治療には、例えば、炎症と伴う疾患に対する治療が
挙げられる。本発明のベクター投与の対象となる炎症性
疾患には、例えば肺線維症、硬化性腹膜炎、前立腺肥大
症、多発性硬化症、移植時の拒否反応、I型糖尿病、慢
性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、全身性エリテマ
トーデス、虹彩炎、肉芽腫性疾患、慢性腎炎、強皮症、
子宮平滑筋腫、ケロイド、肝硬変、およびその他の炎症
症状を伴う疾患などが挙げられる。また、様々な疾患モ
デルの作製や、疾患モデル等における治療方法の開発ま
たは評価においても有用である。
【００６１】例えば、本発明のベクターは、肺線維症の
遺伝子治療に好適に用いられる。肺線維症とは、慢性間
質性肺炎を含む疾患で、肺組織の線維化を伴う。多くの
場合、原因は不明であるが、自己免疫の異常または慢性
化した感染症により肺組織が線維化する疾患を総称す
る。具体的には、肺線維症としては、間質性肺炎（pneu
monitis）、および嚢胞性肺線維症（cystic fibrosis;
CF）が含まれる。
【００６２】本発明のパラミクソウイルスベクターは、
有効量のベクターが対象組織の細胞に導入されるのに十
分な量を投与される。「有効量」とは、本発明に方法に
おいて、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的
にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子が導入される
量を言う。所望の遺伝子を含む本発明のパラミクソウイ
ルスベクターの有効量が投与されることにより、ベクタ
ーが導入された細胞から導入遺伝子産物が産生される。
好ましくは、所望の導入遺伝子を有する本発明のベクタ
ーの有効量が投与されることにより、投与された組織中
または血中で有意なレベルの導入遺伝子の発現が検出さ
れる。「有意なレベル」とは、本発明のベクターにより
導入された遺伝子の発現（転写産物または翻訳産物の
量）が検出可能であることを指す。例えば、導入する遺
伝子に対応する内因性遺伝子がある場合、導入した遺伝
子の最大発現レベルが内因的な発現レベルに対し有意に
高いことを指す。好ましくは、投与部位または血中にお
ける導入遺伝子の発現量が、内因的な発現量の約1.2倍
以上、好ましくは約1.5倍以上、より好ましくは約2倍以
上、より好ましくは約10倍以上、最も好ましくは約20倍
以上の発現が得られることを言う。但し、導入遺伝子の
発現量は、その有効発現量レベルおよび中毒レベルを考
慮して決められるべきである。
【００６３】細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業
者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。
遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼ
ーション、RT-PCR、RNAプロテクションアッセイ等によ
り検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイ
ゼーションやRT-PCR等による検出は in situ でも行い
得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウ
ェスタンブロット、免疫沈降、RIA、ELISA、プルダウン
アッセイ等により行うことができる。また、導入遺伝子
発現の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグ
を付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み
込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、β
ガラクトシダーゼ、CAT、アルカリホスファターゼ、ま
たはGFPをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに
制限されない。
【００６４】ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、
年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子等により異な
るが、当業者であれば適宜決定することが可能である。
好ましくは、投与するベクター量は約105 pfu/mlから約
1011 pfu/mlの範囲内であるとよい。より好ましくは、
投与するベクタの量は約107 pfu/mlから約109 pfu/mlの
範囲内であるとよい。最も好ましくは、約1×108 pfu/m
lから約5×108 pfu/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な
担体中で投与することが好ましい。
【００６５】本発明のウイルス含有組成物の投与対象と
しては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
【００６６】
【実施例】実施例により本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。な
お、本明細書全体を通じて引用された文献（文献、特
許、公開特許出願を含めて）の内容はすべて、本明細書
に組み込まれる。
【００６７】[実施例１] センダイウイルスベクターの
in vivo 投与 IL-10、β-ガラクトシダーゼ、およびルシフェラーゼ遺
伝子を有する複製型の組換えセンダイウイルスベクター
（それぞれ SeV-IL10、SeV-βgal、および SeV-lucifer
ase）は、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-58
7及びYu, D. etal., 1997, Genes Cells 2: 457-466の
記載に従って作製した。鶏卵で増幅されたウイルスを含
む漿尿液を、本発明の組換えセンダイウイルスベクター
含有組成物として、使用直前まで-80℃で保存した。
【００６８】本実施例におけるセンダイウイルスの投与
は以下のように行った。 １．鼻腔内投与 Sniffing（自然吸気）による投与：metophane吸入によ
りマウスを麻酔した。特に記載しない限り、7×106 か
ら 7×108 PFU のSeV-IL10または対照ウイルスSeV-βga
lactosidase（SeV-βgal）を全容量100μlでマウス鼻部
に接種し、10〜20秒間 sniffing（自然吸気）によるボ
ーラス（bolus）投与を行った。この方法により、ウイ
ルスは肺内および鼻内に沈着した。 ２．灌流 マウスを hipnom/hipnoval で麻酔した。細いカテーテ
ルを介してウイルスを直接鼻上皮に投与することによ
り、特に記載しない限り 7×107 または 7×108PFU のS
eV-IL10または対照ウイルスSeV-βgalを全容量100μlで
マウス鼻上皮（鼻甲介; turbinate）に10分間選択的に
アプライした。この操作の間、マウスは頭を下に逆位に
した。これにより、過剰なウイルス溶液は鼻外に滴下さ
れた。この方法により、ウイルスは主に鼻内に沈着し、
肺にはほとんど達しなかった。 ３．筋肉内投与 特に記載しない限り、7×107 または 7×108 PFU のSeV
-IL10、または対照ウイルスであるSeV-βgalactosidase
（SeV-βgal）をC57BL/6マウスの両側の前脛骨筋［tibi
alis anterior (TA) muscle］に注入した（各筋肉に 50
μl, n=6〜11）。SeV-βgalを用いた予備的な実験によ
り、用量依存的な応答が得られた（7×104 〜7×108 pf
u/animal）。
【００６９】[実施例２] 組織ライセート、血清、およ
び気管支肺胞洗浄液（broncho-alveolar lavage fluid;
BALF）の調製 ウイルス投与の48時間後にマウスを屠殺した。組織ライ
セート、血清、およびBALFは以下のようにして調製し
た。 １．組織ライセート 前脛骨筋（tibialis anterior; TA）、肺、および鼻甲
介を摘出し、300μl の0.25M Tris-HCl pH 8 中でホモ
ジェナイズした。凍結融解を３回繰り返して細胞を溶解
させた。試料は 14,000 rpm で 10分遠心して上清を -8
0℃で凍結して続く解析に用いた。各試料の蛋白質濃度
は改変 Folin-Lowry蛋白質アッセイ法により決定した。 ２．血清 心臓から血液を回収し、37℃で2時間保存して凝固を誘
導した。試料を 4,000rpm で 10分遠心して血清を新し
いチューブに移し、-80℃で凍結して続く解析に用い
た。 ３．気管支肺胞洗浄液（broncho-alveolar lavage flui
d; BALF） 気管を露出しカテーテルを挿入した。0.5mlのPBSで３回
肺を洗浄した。4,000rpm で 5分遠心してBALFを回収
し、-80℃で凍結して続く解析に用いた。
【００７０】 [実施例３] インターロイキン 10（IL-10）ELISA ヒトIL-10のELISAは R&D社より購入したキットにより添
付の説明書に従って行った。組織ライセートのIL-10は
蛋白質濃度で標準化し、データは pg IL-10/mgprotein
で表した。
【００７１】[実施例４] レポーター遺伝子アッセイ ルシフェラーゼアッセイは Promega社より購入したキッ
トにより添付の説明書に従って行った。β-ガラクトシ
ダーゼアッセイは Clontech社より購入したキットによ
り添付の説明書に従って行った。これらのレポーター遺
伝子アッセイは組織ライセートを用いて行い、蛋白質濃
度で標準化した。
【００７２】[実施例５] 統計解析 全ての値は平均±標準誤差（SEM）で表した。偏差の解
析にはMann-Whitney検定を行い、p<0.05を有意とした。
【００７３】[実施例６] COS7細胞へのIL-10発現セン
ダイウイルスベクターの導入 COS7細胞（24 well プレートに 104〜106 pfu/well）
に、SeV-IL10を用量を変えて導入した。ベクター導入の
16時間後に培養上清中の IL-10分泌量を測定した。ま
た、IL-10発現プラスミド（pCI-IL10）（80μg/ml, 100
μl）を用いた一過的トランスフェクション（リポフェ
クション）を行い、IL-10の発現量を比較した。また、
対照としてβ-ガラクトシダーゼを発現するSeVベクター
（SeV-βgal）を用いた実験も行った。SeV-IL10を導入
した細胞では、IL-10の分泌は用量依存的に増加した
（図１）。最も高い力価（106 pfu/well）のSeVを感染
させた場合のIL-10の分泌は、IL-10をコードするプラス
ミドをリポソームを介してトランスフェクションする場
合よりも２桁高かった（SeV-IL10: 333±47 ng/ml/mg p
rotein、プラスミド: 6.8±1.4 ng/ml）。
【００７４】[実施例７] マウス鼻腔内滴下（sniffin
g）投与によるセンダイウイルスベクターの導入 鼻腔内への滴下によりウイルスベクターをマウス気道に
局所投与（6.7×107 pfu/100μl）し、２日後に肺のホ
モジェネートおよび気管支肺胞洗浄液（broncho-alveol
ar lavage fluid; BALF）へのIL-10分泌量を測定して、
リポソームを介したプラスミドDNAのトランスフェクシ
ョンによるIL-10分泌と比較した。また、血清中のIL-10
濃度も測定した。肺のホモジェネートでは、SeV投与に
おけるIL-10分泌量は、プラスミドのトランスフェクシ
ョンに比べ２桁高かった（SeV-IL10: 21457±5112 pg/m
g protein、プラスミド: 310±54 pg/mg protein）（図
２）。さらに、BALFにおいては、SeV投与２日目におけ
るIL-10分泌量は、プラスミドのトランスフェクション
に比べ３桁高かった（SeV-IL10: 153366±41823 pg/m
l、プラスミド: 71±63 pg/ml）（図３）。血清中のIL-
10量を測定したところ、SeV投与２日目におけるIL-10分
泌量は、対照のSeV-βgal投与に比べ有意に上昇してい
た（SeV-IL10: 393±132 pg/ml、SeV-βgal: 0.31±0.2
6 pg/ml）（図４）。
【００７５】[実施例８] Sniffingまたは灌流によるセ
ンダイウイルスベクターの経鼻投与 実施例７と同様の鼻腔内への滴下投与（sniffing）に加
え、灌流による鼻上皮（鼻甲介）への直接投与によるセ
ンダイウイルスベクターの投与実験を行い、両者の投与
による導入遺伝子の発現を比較した。マウスにSeV-luc
（7×107 pfu/100μl）を鼻滴下（sniffing）または鼻
上皮（鼻甲介）への灌流により投与し、48時間後にマウ
スを屠殺し肺および鼻甲介でのルシフェラーゼの発現を
調べた（n=3）。その結果、sniffingによる投与では鼻
甲介および肺においてルシフェラーゼの有意な発現が観
察された。灌流による投与ではルシフェラーゼの発現は
鼻甲介に限られ肺ではほとんど発現は観察されなかった
（図５）。次に、IL-10を発現するSeV（SeV-IL10）（7
×107 pfu/100μlおよび7×108 pfu/100μl）を鼻滴下
（sniffing）または鼻上皮（鼻甲介）への灌流によりマ
ウスに投与し、48時間後に投与マウスを屠殺し肺および
鼻甲介でのIL-10の発現を調べた（n=6）。その結果、sn
iffingによる投与では肺において有意なIL-10が検出さ
れた。灌流による投与では鼻甲介のホモジェネートにお
いて有意なIL-10の発現が検出されたが肺のホモジェネ
ートではごく低レベルのIL-10が検出されたにとどまっ
た（図６）。上記と同様のSeV-IL10投与マウスの血清中
のIL-10分泌を測定した。マウスにSeV-IL10（7×107 pf
u/100μlおよび7×108 pfu/100μl）を鼻滴下（sniffin
g）または鼻上皮（鼻甲介）への灌流により投与し、48
時間後にマウスを屠殺し血清中のIL-10量を調べた（n=
6）。その結果、sniffingによる投与では高いレベルの
血清IL-10が検出され、灌流による投与でも、sniffing
による投与より低いが有意な量のIL-10の分泌が観察さ
れた（図７）。対照に用いたSeV-luciferase（7×107 p
fu/100μl）ではIL-10の有意な分泌は見られなかった。
【００７６】[実施例９] マウス筋肉内投与によるセン
ダイウイルスベクターの導入 SeV-βgalをマウスの前脛骨（tibialis anterior; TA）
筋に注入し、２日後の発現をβ-ガラクトシダーゼアッ
セイにより調べた。その結果、β-ガラクトシダーゼの
用量依存的な発現の増加が観察された（図８）。最も高
い力価（3.5×108pfu）でのSeV-βgal投与におけるβガ
ラクトシダーゼの発現（61,672 pg β-gal/mg protei
n）は、最適化した用量での naked DNAおよびAAV（βga
l AAV）投与における発現に比べ、それぞれ 300倍およ
び7倍高かった。
【００７７】SeV-βgalの筋肉内投与後のβ-ガラクトシ
ダーゼ発現の時間経過を調べた。マウスの各前脛骨筋に
SeV-βgal（3.5×107 pfu/muscle）または対照のSeV-lu
ciferase（3.5×107 pfu/muscle）を注入し、経時的に
マウスを屠殺し、筋ホモジェネート中のβ-ガラクトシ
ダーゼの発現を決定した。その結果、導入遺伝子の発現
は投与後２日で最高に達し、28日で投与前の基底レベル
まで低下した（図９）。
【００７８】センダイウイルスベクターの筋肉内への反
復注入による発現量を測定した。マウスの各前脛骨（T
A）筋にSeV-βgal（3.5×107 pfu/muscle）を注入し
た。図示した時間にさらにSeV-luciferase（3.5×107 p
fu/muscle）を注入した。２回目の注入の２日後にマウ
スを屠殺し、筋ホモジェネート中のルシフェラーゼの発
現を決定した。ルシフェラーゼの発現を、SeV-lucifera
seを一回のみ注入したマウスまたは非注入マウスと比較
した。その結果、発現レベルは低下するものの、反復注
入による有意な発現上昇が観察された（図１０）。最初
の投与の28日後に再び注入して導入遺伝子を有意なレベ
ルで発現させることも可能であった（発現レベルは一回
限りの投与に比べ65分の1に減少した）。
【００７９】SeVの筋肉内投与による全身性の抗SeV抗体
の上昇を調べた。マウスの各前脛骨（TA）筋にSeV-βga
l（3.5×107 pfu/muscle）を注入した。注入後、経時的
にマウスを屠殺し、血清中のSeV特異的抗体を検出し
た。その結果、用量依存的に全身的な抗体反応が明確に
観察された（図１１）。また、SeVの用量依存的に前脛
骨筋（TA）の炎症も観察された。SeV投与による抗体反
応およびTAの炎症の両者が再投与における発現の減少に
貢献しているものと考えられる。
【００８０】[実施例１０] IL-10発現センダイウイル
スベクターの筋肉内投与 センダイウイルスベクター（SeV-IL10）を前脛骨（tibi
alis anterior; TA）筋に注入し、IL-10分泌の効率を調
べた（TA, 4×108 pfu/muscle）。注入２日後に筋ホモ
ジェネートを調製し、IL-10発現量を測定して、リポソ
ームを介したプラスミドDNAのトランスフェクションに
よるIL-10発現量と比較した。また、血清中のIL-10濃度
も測定した。その結果、注入２日後、筋ホモジェネート
中でのIL-1の発現は、プラスミドDNAの注入（50μg DNA
/TA）よりも１〜２桁高いことが判明した（SeV-IL10: 1
067±32 pg/mg protein、プラスミド: 50.9±11 pg/mg
protein）（図１２）。プラスミド注入では血清中のIL-
10は検出されなかったが、SeV-IL10注入では、注入２日
後の血清IL-10は上昇した（図１３）。
【００８１】別に行った上記と同様の実験では、SeV-IL
10の注入の２日後、筋ホモジェネート中でのIL-10のレ
ベルは、IL-10を発現する naked プラスミドDNAの注入
に比べ160倍高かった（図１４）。IL-10を発現するこれ
に対しAAV（IL10 AAV）を用いた場合は、注入の２日後
の筋中のIL-10は検出できなかった。プラスミドDNAおよ
びAAVを用いた場合、血清中にIL-10は上記と同様に検出
されなかったのに対し、SeV-IL10の注入では血清IL-10
のレベルは注入２日後には 797±383 pg/ml に増加した
（図１５）。これらの結果から、組み換えSeVは筋中へ
の投与により効率的に遺伝子導入を行うことが可能であ
ることが示された。
【００８２】[実施例１１] 肺線維症モデルにおけるSe
V-IL10投与の効果 ブレオマイシン（bleomycin）により肺の炎症および線
維症を誘発させたマウスモデルを用いて、SeV-IL10の効
果を検証した。マウスにSeV-IL10（7×108 pfu/mouse）
を前脛骨筋に注入した。対照として、ルシフェラーゼ発
現SeVおよびβ-ガラクトシダーゼ発現SeV（各 7×108 p
fu/mouse）を前脛骨筋に注入した。筋中投与の2日後
に、ブレオマイシンまたは生理食塩種を気管内注入した
（0.075 u/100μl; 0.075 unitsを含む100μlの生理食
塩水）。ブレオマイシン注入の11日後にマウスを屠殺
し、6-ヒドロキシプロリンを測定することにより、文献
（Pettipher, E. R. J. Pharmacology 110: 423-427, 1
993）の記載に従ってヒドロキシプロリンアッセイを行
い、肺内のコラーゲン沈着量を決定した。SeVの投与自
体は、気道のコラーゲン沈着を増加させることが判明し
た［図１６ 左から1番目（SeV-βgal + SeV-luc + ブレ
オマイシン）と3番目（ブレオマイシン）のカラムを比
較のこと］。しかし、IL-10を発現するSeVの投与はこの
コラーゲン沈着を有意に減少させた［左から1番目（SeV
-βgal + SeV-luc + ブレオマイシン）と2番目（SeV-IL
10 + ブレオマイシン）のカラムを比較のこと］。この
ことから、SeV-IL10の筋肉内投与が、肺線維症に対する
治療効果を有することが実証された。
【００８３】
【発明の効果】本発明により、循環系に高いレベルで外
来遺伝子産物を発現させることが可能となる。これによ
り嚢胞性線維症（cystic fibrosis; CF）を含む肺線維
症を始めとする各種炎症性疾患に対する遺伝子治療のた
めの基盤技術が提供された。
【００８４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC Research Inc. <120> Paramyxovirus vectors for gene delivery to circulation <130> D3-A0008 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 1 ctttcaccct 10 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 2 tttttcttac tacgg 15 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 3 cggccgcaga tcttcacg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Sequence <400> 4 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 gttgagtact gcaagagc 18 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 tgggtgaatg agagaatcag c 21
【図面の簡単な説明】
【図１】SeV-IL10導入COS7細胞（24wellプレート中）に
おけるIL-10の発現の用量依存性を示す図である。図示
した用量のSeV-IL10をCOS7細胞に感染させ、16時間後に
培養上清中に分泌されたIL-10濃度を測定した。対照と
してIL-10発現プラスミドDNAを用いた実験も行った。各
群 n=6。
【図２】SeV-IL10のマウス鼻腔内投与による肺組織中で
のIL-10の発現を示す図である。6.8×107 pfu/100μlの
SeV-IL10 をsniffingにより経鼻接種した。注入２日後
にマウスを屠殺し、肺のホモジェネート中のIL-10の発
現を定量した。対照として行ったIL-10発現プラスミド
投与におけるIL-10の発現量（平均±SEM）は 310±54 p
g/mg protein であった。
【図３】SeV-IL10のマウス鼻腔内投与によるBALF中への
IL-10分泌を示す図である。6.8×107 pfu/100μlの SeV
-IL10 を sniffingにより経鼻接種した。注入２日後に
マウスを屠殺し、BALF中のIL-10量を定量した。対照と
して行ったIL-10発現プラスミド投与におけるIL-10の発
現量（平均±SEM）は 71±63 pg/ml であった。
【図４】SeV-IL10のマウス鼻腔内投与による血中へのIL
-10分泌を示す図である。6.8×107 pfu/100μlの SeV-I
L10 を sniffingにより経鼻接種した。注入２日後にマ
ウスを屠殺し、血清中のIL-10量を定量した。
【図５】鼻腔内投与（sniffing）または灌流によるセン
ダイウイルスベクター投与における、鼻甲介および肺で
の導入遺伝子の発現を示す図である。マウスにSeV-luc
（7×107 pfu/100μl）を鼻滴下（sniffing）または鼻
上皮（鼻甲介）への灌流により投与し、48時間後にマウ
スを屠殺し肺および鼻甲介でのルシフェラーゼの発現を
調べた（n=3）。
【図６】鼻腔内投与（sniffing）または灌流によるSeV-
IL10投与における、鼻甲介および肺でのIL-10の発現を
示す図である。マウスにSeV-IL10（7×107 pfu/100μl
および7×108 pfu/100μl）を鼻滴下（sniffing）また
は鼻上皮（鼻甲介）への灌流により投与し、48時間後に
マウスを屠殺し肺および鼻甲介でのIL-10の発現を調べ
た（n=6）。
【図７】鼻腔内投与（sniffing）または灌流によるSeV-
IL10投与における、血中へのIL-10分泌を示す図であ
る。マウスにSeV-IL10（7×107 pfu/100μlおよび7×10
8 pfu/100μl）を鼻滴下（sniffing）または鼻上皮（鼻
甲介）への灌流により投与し、48時間後にマウスを屠殺
し血清中のIL-10量を調べた（n=6）。
【図８】前脛骨筋へのSeV-βgal注入後のβ-ガラクトシ
ダーゼ発現の用量依存性を示す図である。マウスの各前
脛骨（TA）筋に様々な量のSeV-βgal、あるいはβ-ガラ
クトシダーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドDN
AまたはAAVを注入した。また、非注入マウス（UT）も設
定した。ウイルスの用量およびDNAは各TAに注入した量
を表す。注入の２日後にマウスを屠殺し、筋ホモジェネ
ート中のβ-ガラクトシダーゼの発現を決定した。デー
タは平均±SEMで表す。各群ともn=6〜12。** DNA注入群
およびAAV注入群と比べp<0.01。
【図９】前脛骨筋へのSeV-βgal注入後のβ-ガラクトシ
ダーゼ発現の時間経過を示す図である。マウスの各前脛
骨（TA）筋にSeV-βgal（3.5×107 pfu/muscle）または
対照のSeV-luciferase（3.5×107 pfu/muscle）を注入
した。注入後、図示した時間にマウスを屠殺し、筋ホモ
ジェネート中のβ-ガラクトシダーゼの発現を決定し
た。対照ウイルスを注入したマウスは注入２日後に屠殺
した。データは平均±SEMで表す。各群ともn=6。* ４日
後の値と比べp<0.05。
【図１０】センダイウイルスベクターの筋肉内への反復
注入の効果を示す図である。マウスの各前脛骨（TA）筋
にSeV-βgal（3.5×107 pfu/muscle）を注入した。図示
した時間にさらにSeV-luciferase（3.5×107 pfu/muscl
e）を注入した。２回目の注入の２日後にマウスを屠殺
し、筋ホモジェネート中のルシフェラーゼの発現を決定
した。ルシフェラーゼの発現を、SeV-luciferaseを一回
のみ注入したマウスまたは非注入マウスと比較した。デ
ータは平均±SEMで表す。各群ともn=6〜10。* 非注入マ
ウスの値と比べp<0.05。
【図１１】センダイウイルスベクターの筋肉内投与にお
ける全身性抗SeV抗体の検出結果を示す図である。マウ
スの各前脛骨（TA）筋にSeV-βgal（3.5×107 pfu/musc
le）を注入した。注入後、図示した時間にマウスを屠殺
し、血清中のSeV特異的抗体を検出した。データは平均
±SEMで表す。各群ともn=6。
【図１２】SeV-IL10の筋肉内投与における筋中でのIL-1
0の発現を示す図である。図示した用量のSeV-IL10をマ
ウス前脛骨（TA）筋に注入し、２日後にマウスを屠殺し
筋ホモジェネート中のIL-10量を測定した。対照としてI
L-10発現プラスミド（pCI-IL10）またはSeV-βgalを用
いた実験も行った。
【図１３】SeV-IL10の筋肉内投与における血中へのIL-1
0分泌を示す図である。図示した用量のSeV-IL10をマウ
ス前脛骨（TA）筋に注入し、２日後の血清中のIL-10を
定量した。対照としてIL-10発現プラスミド（pCI-IL1
0）またはSeV-βgalを用いた実験も行った。IL-10発現
プラスミドにおける血清IL-10量は検出限界以下であっ
た。n=4〜6。
【図１４】SeV-IL10の筋肉内投与における筋中でのIL-1
0の過剰発現を示す図である。マウスの各前脛骨（TA）
筋にSeV-interleukin 10（SeV-IL10）（3.5×107 また
は3.5×108 pfu/muscle）あるいはIL-10を発現するプラ
スミドDNAまたはAAV（IL10AAV）を注入した。非注入群
も設定した。注入の２日後にマウスを屠殺し、筋ホモジ
ェネート中のIL-10を測定した。データは平均±SEMで表
す。各群ともn=6。*他の全群と比べp<0.05。
【図１５】SeV-IL10の筋肉内投与における血中へのIL-1
0の分泌を示す図である。マウスの各前脛骨（TA）筋にS
eV-interleukin 10（SeV-IL10）（3.5×107 または 3.5
×108 pfu/muscle）あるいはIL-10を発現するプラスミ
ドDNAまたはAAV（IL10 AAV）を注入した。非注入群も設
定した。注入の２日後にマウスを屠殺し、血清中のIL-1
0を測定した。データは平均±SEMで表す。各群ともn=
6。* 他の全群と比べp<0.05。
【図１６】肺線維症モデルマウスへのSeV-IL10筋肉内投
与の効果を示す図である。マウスにSeV-IL10、あるいは
対照のルシフェラーゼ発現SeVおよびβ-ガラクトシダー
ゼ発現SeV（各 7×108 pfu/mouse）を前脛骨筋に注入し
た。筋中投与の2日後に、ブレオマイシンまたは生理食
塩種を気管内注入した（0.075 u/100μl）。ブレオマイ
シン注入の11日後にマウスを屠殺し、肺内のコラーゲン
沈着をヒドロキシプロリンアッセイにより決定した。各
群で個体数 N=15〜21。* 対照のSeV-luciferase/β-gal
投与群と比べ有意水準 p<0.05。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ステファノ フェラーリ 英国 ロンドン マンレサロード エマニ ュエル ケイエ ビルディング インペリ アル カレッジ スクール オブ メディ シン内 (72)発明者 ダンカン エム ゲッデス 英国 ロンドン マンレサロード エマニ ュエル ケイエ ビルディング インペリ アル カレッジ スクール オブ メディ シン内 (72)発明者 エリック ダブリューエフダブリュー オ ールトン 英国 ロンドン マンレサロード エマニ ュエル ケイエ ビルディング インペリ アル カレッジ スクール オブ メディ シン内 (72)発明者 長谷川 護 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 株 式会社ディナベック研究所内 (72)発明者 侯 暁剛 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 株 式会社ディナベック研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA26 CA01 DA20 EA02 FA10 GA11 HA17 4B065 AA95X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA03 AA13 DA01 DA12 MA05 MA59 MA66 ZA592 ZB112 4C087 AA01 AA02 BC83 MA59 MA66 ZA59 ZB11

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ベクターに含まれる遺伝子の発現産物を
    該ベクターの導入部位とは異なる部位に血流を介して送
    達するための、循環系送達用パラミクソウイルスベクタ
    ー。
  2. 【請求項２】 外来遺伝子を有する、請求項１に記載の
    ベクター。
  3. 【請求項３】 外来遺伝子がサイトカインである、請求
    項２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 サイトカインが抗炎症性サイトカインで
    ある、請求項３に記載のベクター。
  5. 【請求項５】 抗炎症性サイトカインがIL-10である、
    請求項４に記載のベクター。
  6. 【請求項６】 炎症性疾患の処置に用いられる、請求項
    ４または５に記載のベクター。
  7. 【請求項７】 炎症性疾患が肺線維症である、請求項６
    に記載のベクター。
  8. 【請求項８】 鼻腔内投与用である、請求項１から７の
    いずれかに記載のベクター。
  9. 【請求項９】 筋肉内投与用である、請求項１から７の
    いずれかに記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 パラミクソウイルスがセンダイウイル
    スである、請求項１から９のいずれかに記載のベクタ
    ー。
  11. 【請求項１１】 請求項１から１０のいずれかに記載の
    パラミクソウイルスベクターのゲノムをコードするDN
    A。
  12. 【請求項１２】 請求項１から１０のいずれかに記載の
    パラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細
    胞を含む組成物。
  13. 【請求項１３】 抗炎症性サイトカインをコードする外
    来遺伝子を有するパラミクソウイルスベクターを投与す
    ることを特徴とする、該サイトカインを循環系に送達す
    る方法。
  14. 【請求項１４】 抗炎症性サイトカインがインターロイ
    キン10である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 投与が鼻腔内投与である、請求項１３
    または１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 鼻腔内投与が鼻甲介への投与を含む、
    請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 投与が筋肉内投与である、請求項１３
    または１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 パラミクソウイルスがセンダイウイル
    スである、請求項１３から１７のいずれかに記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 請求項１３から１８のいずれかに記載
    の方法により炎症性疾患を処置する方法。
  20. 【請求項２０】 炎症性疾患が肺線維症である、請求項
    １９に記載の方法。
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