ES2260301T3 - Vector de paramixovirus para transferencia de genes al sistema cardiovacular. - Google Patents

Vector de paramixovirus para transferencia de genes al sistema cardiovacular.

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ES2260301T3
ES2260301T3 ES01981031T ES01981031T ES2260301T3 ES 2260301 T3 ES2260301 T3 ES 2260301T3 ES 01981031 T ES01981031 T ES 01981031T ES 01981031 T ES01981031 T ES 01981031T ES 2260301 T3 ES2260301 T3 ES 2260301T3
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Uta Imp. College School of Medicine GRIESENBACH
Stefano Imp. College School of Medicine FERRARI
Duncan M. Imp. College School of Medicine GEDDES
Eric WFW Imp. College School of Medicine ALTON
Mamoru DNAVEC Research Inc. HASEGAWA
Xiaogang Hou
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Abstract

Uso de un vector de paramixovirus que comprende un Gen extraño que codifica una proteína secretora para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en el que dicho vector de paramixovirus se administra por vía intramuscular.

Description

Vector de paramixovirus para transferencia de genes al sistema cardiovascular.
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de un vector de paramixovirus que comprende un gen extraño que codifica una proteína secretora para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en donde dicho vector de paramixovirus se administrará por vía intramuscular.
Antecedentes de la técnica
Recientemente, la terapia génica está siendo estudiada en una diversidad de enfermedades. Este es un procedimiento de tratamiento en el cual un gen que tiene un efecto terapéutico se introduce de forma exógena en pacientes y se expresa in vivo. Ejemplos de vectores usados en terapia génica son, por ejemplo, el propio ADN, ADN contenido en liposomas o vectores víricos. Estos vectores pueden administrarse directamente (terapia génica in vivo) o usarse para transformar células que posteriormente se introducen en pacientes (terapia génica ex vivo).
Por ejemplo, las enfermedades que puede tratarse mediante terapia génica incluyen fibrosis pulmonares, tal como la fibrosis quística (FC). La FC es una enfermedad autonómica recesiva hereditaria que causa trastornos metabólicos congénitos. La FC aparece frecuentemente entre los caucásicos con una frecuencia de uno cada 2.000 ó 2.500 niños. En los pacientes con FC, la secreción mucosa se acumula en muchos tejidos, incluyendo los pulmones, tracto respiratorio, páncreas, hígado e intestino delgado debido a anomalías exocrinas. El control de las infecciones de pulmón mediante antibióticos y los trasplantes de pulmón constituyen el principal tratamiento para estos pacientes con FC en los que las infecciones de pulmón son especialmente mortales. En los pulmones de pacientes con FC, los tejidos del tracto respiratorio se destruyen progresivamente debido a inflamación crónica. En estos tejidos, se asume que se ha perdido el balance entre la producción de citoquinas proinflamatorias y citoquinas antiinflamatorias.
Una forma eficaz para realizar terapia génica en el caso anterior, es administrar un vector en el sitio de la enfermedad y expresar localmente el gen terapéutico. También es posible transferir el producto génico al organismo completo a través del sistema cardiovascular. En particular, cuando es difícil administrar localmente el vector para terapia génica, o si existe la posibilidad de causar efectos adversos no deseados, puede ser más eficaz la estrategia de tratamiento para expresar el gen terapéutico en el sistema cardiovascular completo, especialmente en el caso de genes que codifican sustancias biológicamente activas que tienen una semivida corta en sangre (tales como las citoquinas). En este contexto, se ha sugerido que los músculos son "factorías" apropiadas para producir proteínas secretoras que se espera sean transferidas a través del flujo sanguíneo y funcionen en un sitio remoto. Hasta el momento, los estudios de transfección de genes en los músculos se han usado principalmente ADN desnudo y virus adenoasociados (VAA). Estos vectores, sin embargo, no alcanzan un nivel de expresión suficiente. De este modo, es deseable desarrollar un nuevo vector que permita la secreción de un producto génico transfectado a un alto nivel en el sistema cardiovascular.
Descripción de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un vector de paramixovirus para la transferencia de genes al sistema cardiovascular y sus usos.
El virus Sendai, que pertenece a la familia Paramyxoviridae, se ha usado recientemente para desarrollar vectores para la transferencia de genes (Kato A. y col., EMBOJ., 1997, 16, 578-598; documentos WO97/16538 y WO97/16539). El vector del virus Sendai tiene una toxicidad baja y la cantidad de proteína expresada a partir del gen transfectado es extremadamente alta. Además, sobresale en seguridad ya que el gen dentro del vector no se integra en el genoma del hospedador. Los presentes inventores pensaron que el virus Sendai recombinante (SeV) podría utilizarse para expresar eficazmente productos génicos transfectados en el sistema cardiovascular. Los inventores construyeron un nuevo vector del virus Sendai para la expresión de la citoquina antiinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) (SeV-IL10) y realizaron estudios usando ésta.
Cuando se transfectaba en células COS7 in vitro, SeV-IL10 aumentaba de forma dependiente de dosis la secreción de IL-10, 16 h después de la transfección. El nivel de secreción de IL-10 con el valor más alto de SeV-IL10 (10^{6} ufp/pocillo en placas de 24 pocillos) era dos órdenes de magnitud mayor al alcanzado mediante la transfección mediada por liposomas de un plásmido que codificaba la IL-10. Por lo tanto, los inventores realizaron experimentos de transfección in vivo usando el vector SeV-IL10.
SeV-IL10 se administró localmente en el tracto respiratorio del ratón por medio de gotas intranasales. Dos días después, se midió el nivel de IL-10 secretado en el homogeneizado de pulmón y en el fluido del lavado broncoalveolar (FLBA) y se comparó con el obtenido mediante la transfección del ADN plasmídico mediado por liposomas. El nivel de secreción de IL-10 obtenido mediante la administración de SeV-IL10 era dos órdenes de magnitud mayor en el homogeneizado de pulmón que el obtenido mediante la transfección del plásmido (SeV-IL10: 21.457\pm5.122 pg/mg de proteína; plásmido: 310\pm54 pg/mg de proteína), y era tres órdenes de magnitud mayor en FLBA (SeV-IL10: 153.366\pm41.823 pg/ml; plásmido: 71\pm63 pg/ml. Adicionalmente, se examinó el nivel de IL10 en sangre. En que ratón que recibió SeV-IL-10, se secretaba una cantidad significativa de IL-10.
Además, SeV-IL10 se inyectó en un músculo esquelético que es un sitio adecuado para la producción de proteínas secretoras, y se examinó el efecto. El vector SeV-IL10 (4 x 10^{8} ufp/músculo) se inyectó en el músculo anterior tibial anterior y se examinó el nivel de expresión de IL-10 dos días después. El nivel de expresión en el homogeneizado del músculo era dos órdenes de magnitud mayor que en el caso de la inyección del ADN plasmídico (50 \mug de ADN) (Sev-IL10 1.067\pm32 pg/mg de proteína; plásmido: 50,9\pm11 pg/mg de proteína). No se detectó IL-10 en el suero tras la inyección de plásmido, mientras que se obtuvo un aumento significativo del nivel sérico de IL-10 dos días después de la inyección del vector SeV-IL10 (SeV-IL10: 393\pm132 pg/ml; Sev-\betagal: 0,31\pm0,26 pg/ml. Considerados en conjunto, la eficacia de la transferencia génica en los pulmones y en músculos usando SeV recombinante era mucho mayor, lo que sugería que el vector SeV podía expresar productos de genes transfectados a niveles elevados en el sistema cardiovascular. El vector descrito en este documento es útil como vector para terapia génica frente a una diversidad de enfermedades que son curables mediante la transferencia de genes al sistema cardiovascular. Especialmente, el vector permite la aplicación de la terapia génica a la neumonía en pacientes con FC.
La presente invención permite la transferencia eficaz de genes mediante la administración intramuscular de SeV recombinante. El nivel de expresión de un gen transfectado alcanza un nivel alto dos días después de la inyección. Este nivel es significativamente mayor que el obtenido usando ADN plasmídico o VAA. La producción mediada por SeV de productos génicos terapéuticos es extremadamente eficaz en afecciones clínicas, en las que rápidamente se requiere un alto nivel de expresión génica. Cuando es difícil descartar la posibilidad de que el vector en sí puede tener un efecto inflamatorio, es ventajoso administrar vectores en un músculo lejos del sitio de la enfermedad para evitar que empeore la inflamación, en comparación con la administración directa en el sitio. Por lo tanto, se espera que la administración por vía intramuscular del vector de la invención permita un tratamiento más eficaz. Además, el uso de SeV carente de capacidad de replicación podría reducir las reacciones inflamatorias y las reacciones de anticuerpos observadas cuando se usan vectores que pueden replicarse.
De este modo, la presente invención se refiere al uso de un vector de paramixovirus para la transferencia de genes al sistema cardiovascular según se especifica a continuación:
(1) uso de un vector de paramixovirus que comprende un gen extraño que codifica una proteína secretora para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en el que dicho vector de paramixovirus se administrará por vía intramuscular;
(2) el uso según (1), en el que dicha proteína secretora es una citoquina antiinflamatoria;
(3) el uso según (2), en el que dicha citoquina antiinflamatoria es IL-10;
(4) el uso según (1), (2) o (3), en el que dicho paramixovirus es el virus Sendai; y
(5) el uso según (1), en el que dicha enfermedad inflamatoria es la fibrosis pulmonar.
En este documento, un "vector de paramixovirus" se define como un vector (o vehículo) que deriva del paramixovirus y que se usa para transferir genes a células hospedadoras. El vector de paramixovirus descrito en este documento puede ser una ribonucleoproteína (RNP) o una partícula vírica que tiene infectividad. Aquí, la "infectividad" se define como la capacidad del vector de paramixovirus recombinante para transferir, mediante sus capacidades de adhesión a la célula y de fusión de membrana, un gen contenido en el vector a las células a las cuales el vector se adhiere. El vector de paramixovirus descrito en este documento porta un gen extraño en una forma expresable. El vector de paramixovirus puede tener capacidad de replicación o puede ser un vector defectivo sin la capacidad de replicación. En este documento, "capacidad de replicación" se define como la capacidad de los vectores víricos para replicarse y producir partículas víricas infectivas en las células hospedadoras infectadas con los vectores víricos.
En este documento, un vector de paramixovirus "recombinante" se define como uno construido por ingeniería genética o sus productos amplificados. Por ejemplo, pueden generarse vectores de paramixovirus recombinantes mediante la reconstitución del ADNc de un paramixovirus recombinante.
En este documento, un paramixovirus se define como un virus de la familia Paramyxoviridae o un derivado del mismo. La presente invención puede aplicarse a, por ejemplo, paramixovirus tales como el virus Sendai, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, virus de la peste bovina, virus del moquillo, virus de la parainfluenza del simio (SV5), virus de la parainfluenza humana de tipo I, II y III de la familia Paramyxoviridae. Los virus descritos en este documento preferiblemente pueden ser virus del género Paramyxovirus o un derivado del mismo. Los virus del género Paramyxovirus a los que puede aplicarse la presente invención incluyen el virus de la parainfluenza humana de tipo 1 (VPIH-1), el virus de la parainfluenza humana de tipo 3 (VPIH-3), el virus de la parainfluenza bovina de tipo 3 (VPIB-3), el virus Sendai (también denominado virus de la parainfluenza de ratón de tipo 1), el virus de la parainfluenza de simio de tipo 10 (VPIS-10) y muchos otros virus del género Paramyxovirus. Más preferiblemente, el paramixovirus es el virus Sendai. Estos virus pueden ser cepas de tipo silvestre, cepas mutantes, cepas cultivadas en laboratorio, cepas construidas artificialmente o etcétera. También pueden utilizarse como material para generar el vector vírico descrito en este documento virus incompletos, tales como la partícula DI (Willenbrink W. y Neubert W. J., J. Virol., 1994, 68, 8413-8417), oligopéptidos sintéticos y
etcétera.
Los genes que codifican proteínas de paramixovirus incluyen los genes NP, P, M, F, HN y L. Aquí, los "genes NP, P, M, F, HN y L" representan aquellos que codifican la proteína de la nucleocápside, fosfoproteína, proteína de matriz, proteína de fusión, hemaglutinina-neuraminidasa y proteína grande, respectivamente. Los genes de cada virus de la subfamilia paramixovirus generalmente se describen como sigue. En general, el gen NP también puede indicarse como "gen N".
Paramyxovirus NP P/C/VM F HN - L
Rubulavirus NP P/V M F HN (SH) L
Morbillivirus NP P/C/VM F H - L
Por ejemplo, los números de acceso de la base de datos de secuencias de nucleótidos de cada gen del virus Sendai, clasificado como un Respirovirus de Paramyxoviridae son M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046 y X17218 para el gen NP; M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007 y X17008 para el gen P; D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056 para el gen M; D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 y X02131 para el gen F; D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131 para el gen HN y D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587 y X58886 para el gen L.
Aquí, un "gen" se define con una sustancia genética, que incluye ácidos nucleicos tales como ARN y ADN. En general, un gen puede o no codificar una proteína. Por ejemplo, un gen puede ser un gen que codifique un ARN funcional tal como una ribozima, ARN complementario, etc. Los genes pueden ser secuencias derivadas de la naturaleza o diseñadas artificialmente. En este documento, "transferencia de genes" se define como una transferencia mediada de genes, y "transferencia de genes al sistema cardiovascular" incluye la transferencia de los productos de los genes al sistema. Una "proteína secretora" se define como una proteína secretada al exterior de las células. No necesariamente la proteína puede tener una señal de secreción obvia siempre que pueda secretarse al exterior. La proteína secretora puede ser una proteína derivada de la naturaleza o diseñada artificialmente. Es posible secretar una proteína deseada al exterior añadiendo una señal de secreción. Una proteína diseñada artificialmente, por ejemplo, puede ser una proteína de fusión con otra proteína, una proteína dominante negativa, incluyendo una forma soluble de un receptor o un receptor negativo dominante unido a la membrana, una forma de deleción de una molécula de adhesión celular y una forma soluble de una molécula de la superficie celular. En este documento, "ADN" incluye ADN de cadena sencilla o ADN de cadena doble.
En este documento, las citoquinas se definen como todas las proteínas y polipéptidos distintas de los anticuerpos, que se secretan a partir de células y que muestran funciones fisiológicas tales como la regulación del sistema inmune, una función antitumoral, una función antivírica o la regulación de la diferenciación celular (Aggarwal B. B. y Pocsik E., "Cytokines: from clone to clinic," Arch. Biochem. Biophys., 1992, 292(2), 335-359). Linfoquinas y monoquinas son sustancialmente lo mismo que citoquinas y se incluyen en la citoquina de la presente invención. Además, las citoquinas antiinflamatorios se definen como citoquinas que inhiben la síntesis de una o más citoquinas que se secretan a partir de cualquiera de las células Th1, células NK, monocitos y macrófagos (tales como INF-\gamma, TNF-\beta, IL-2, IL-1, IL-6, IL-8 o TNF-\alpha). Las citoquinas pueden ser proteínas naturales o proteínas alteradas artificialmente. Las citoquinas antiinflamatorias incluyen IL-10, IL-4 e IL-12, pero no se limitan a éstas. Los genes que codifican las citoquinas pueden prepararse mediante un procedimiento conocido, tal como la PCR usando cebadores que se diseñan en base a sus secuencias de nucleótidos. Más preferiblemente, la citoquina antiinflamatoria de la presente invención es
la IL-10.
En este documento se describe el uso de un vector de paramixovirus para la transferencia de genes al sistema cardiovascular. Los presentes inventores han conseguido sobreexpresar un producto de un gen transfectado no sólo en el sitio de inyección, sino también en sangre mediante la administración in vivo de un vector de paramixovirus que codifica un gen extraño. El vector del virus Sendai para la expresión de IL-10 (SeV-IL10), administrado por vía intranasal a ratones mediante inhalación, se introdujo en el epitelio nasal (cornete) y en el pulmón. El producto génico se sobreexpresó en el sitio de inyección y también se observó un aumento significativo en el nivel de IL-10 en sangre. La administración mediante perfusión en el epitelio nasal (cornete) también daba sitio a un aumento significativo del nivel de IL-10 en sangre. Además, también se examinó la administración de SeV-IL10 en músculo esquelético, que se supone es un sitio adecuado para producir proteínas secretoras. Cuando se administraba SeV-IL10 al músculo tibial anterior (TA), el nivel de expresión de IL-10 aumentó significativamente no sólo en el músculo que es el sitio de inyección, sino también en la sangre. Además, la administración por vía intramuscular de SeV-IL10 inhibía significativamente el depósito de colágeno en el pulmón de los ratones de un modelo de fibrosis pulmonar preparados mediante la administración de bleomicina. De este modo, se confirmó el efecto terapéutico de la inyección por vía intramuscular de SeV-IL10 en la fibrosis pulmonar. El vector descrito en este documento es extremadamente útil para la transferencia de productos génicos terapéuticos al sistema cardiovascular completo. Por ejemplo, es posible realizar terapia génica para diversas enfermedades inflamatorias expresando una citoquina antiinflamatoria usando el vector de la presente invención. También es posible utilizar el vector para terapia génica usando un gen que tiene una función antiinflamatoria para reducir la inflamación e inhibir la acumulación de secreciones mucosas.
Los presentes inventores mostraron que los genes introducidos mediante administración por vía intramuscular de vectores de paramixovirus recombinantes se expresaban al nivel más alto dos días después de la inyección y que se expresaban de forma persistente durante una semana. Además, la administración repetitiva aumentaba la expresión génica. Estas características son ventajosas para obtener un efecto terapéutico rápido y mantenido en la terapia génica usando vectores de paramixovirus recombinante.
Los vectores de paramixovirus también pueden utilizarse preferiblemente en ensayos clínicos de terapia génica humana en términos de seguridad. En primer lugar, un obstáculo principal en una transferencia génica de alta eficacia es que el ADN transfectado debe ser transportado dentro del núcleo para la expresión de un gen extraño. Sin embargo, en el caso del virus Sendai y esta expresión de un gen extraño es dirigida en el citoplasma tanto por la tubulina celular como por su ARN polimerasa (proteína L). Esto sugiere que el virus Sendai no interacciona con el genoma de las células hospedadores, lo que evita problemas de seguridad tales como la tumorigénesis. En segundo sitio, se sabe que el virus Sendai es patogénico causando neumonía en roedores, pero no en humanos, lo que está apoyado por estudios que muestran que la administración intranasal del virus Sendai de tipo silvestre no perjudica a primates no humanos (Hurwitz J. L. y col., Vaccine, 1997, 15, 533-540). Estas características sugieren que el vector del virus Sendai puede utilizarse en terapia humana, y además, apoyan la noción de que el virus Sendai puede ser una de las alternativas prometedoras en terapia génica que apuntan hacia la transferencia de productos de un gen extraño al sistema cardiovascular.
El vector usado según la presente invención puede utilizarse preferiblemente en terapia génica usando citoquinas antiinflamatorias, que específicamente se dirige hacia enfermedades inflamatorias. El vector de paramixovirus para la expresión de una citoquina antiinflamatoria es especialmente útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. En otras palabras, la introducción de genes que codifican una citoquina antiinflamatoria usando el vector de paramixovirus puede inhibir la inflamación y aliviar los síntomas de la enfermedad. Las enfermedades incluyen, por ejemplo, fibrosis pulmonar, peritonitis esclerosante, prostatomegalia, esclerosis múltiple, rechazo postrasplante, diabetes de tipo I, reumatismo articular crónico, enteropatía inflamatoria, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, iritis, enfermedades granumolatosas, nefritis crónica, escleroderma, histeromioma, queloide, cirrosis y otras enfermedades acompañadas de inflamación. En este documento, el tratamiento de enfermedades incluye la terapia y prevención de las enfermedades.
El vector de paramixovirus usado para la transferencia de genes al sistema cardiovascular no está limitado a ninguna clase en especial. Por ejemplo, pueden utilizarse preferiblemente vectores que tienen la capacidad de replicación y que son capaces de propagación autónoma. En general, el genoma del paramixovirus de tipo silvestre contiene una corta región líder 3' seguido de seis genes que codifican las proteínas N (nucleocápside), P (fosfo), M (matriz), F (fusión), HN (hemaglutinina-neuraminidasa) y L (grande) y tiene una corta región cola 5' en el otro extremo. Puede obtenerse el vector que es capaz de replicarse de forma autónoma diseñando un genoma que tenga una estructura similar a la descrita anteriormente. Además, puede obtenerse un vector para expresar un gen extraño mediante la inserción del gen extraño en el genoma del vector anterior. El vector de paramixovirus puede tener un alineamiento alterado de los genes del virus en comparación con el virus de tipo silvestre.
El vector de paramixovirus de la invención puede tener deleción(es) de alguno(s) de los genes que están contenidos en el virus de tipo silvestre. Por ejemplo, en el caso de la reconstitución del vector del virus Sendai, se piensa que se necesita que los genes que codifican las proteínas NP, P/C y L estén en trans, pero los genes puede no ser un componente del vector del virus. Un vector de expresión que porta los genes que codifican las proteínas que puede ser transfectadas conjuntamente con otro vector de expresión que codifica el genoma del vector en células hospedadoras para reconstituir un vector vírico. Alternativamente, se transfiere en las células hospedadoras un vector de expresión que codifica el genoma del virus que lleva los genes que codifican las proteínas y, de este modo, puede reconstituirse un vector vírico usando las proteínas proporcionadas por la célula hospedadora. Puede que las secuencias de aminoácidos de estas proteínas no sean idénticas a las derivadas del virus original siempre que tengan una actividad equivalente o mayor en la transferencia del ácido nucleico y puede ser mutado o sustituido por el de un gen homólogo de otro virus.
Se piensa que las proteínas codificadas por los genes M, F y HN son esenciales para la propagación célula a célula de un vector de paramixovirus. Sin embargo, estas proteínas no son necesarias cuando el vector se prepara como una RNP. Sin los genes M, F y HN son componentes del genoma contenido en la RNP, los productos de estos genes se producen cuando se introducen dentro de las células hospedadoras y se generan partículas víricas que tiene infectividad. Los vectores de RNP que producen un virus infectivo incluyen una RNP que contiene un ARN genómico vírico que codifica los genes N, P, M, F, HN y L y las proteínas N, P y L. Cuando esta RNP se introducen en las células, se expresa el genoma del virus y se replica mediante las funciones de las proteínas N, P y L y, de este modo, se amplifican vectores víricos infectivos.
La RNP puede introducirse en células como un complejo formado con lipofectamina, liposoma policatiónico y similares. Específicamente, pueden usarse una diversidad de reactivos de transfección, por ejemplo, DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN Nº 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer Nº 1811169). Puede añadirse cloroquina para prevenir la degradación en el endosoma (Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). En el caso de virus replicativos, los virus producidos pueden amplificarse o cultivarse mediante la reinfección en células cultivadas, huevos de gallina o animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones).
Por el contrario, el vector de paramixovirus puede carecer de los genes M, F y/o HN. Estos vectores pueden reconstituirse proporcionando de forma exógena los productos génicos delecionados. Estos vectores pueden permanecer adheridos a las células hospedadoras e inducir la fusión celular tal como el tipo silvestre. Sin embargo, las partículas víricas hijas que tienen la misma infectividad que las originales no se producen debido a que el genoma del vector introducido en las células carece de uno de los genes anteriores. Por lo tanto, estos vectores pueden ser útiles como vectores víricos seguros que son capaces de transferir sólo un único gen. Por ejemplo, los genes delecionados del genoma pueden ser los genes F y/o HN. Los vectores víricos pueden reconstituirse mediante la transfección conjunta de un plásmido de expresión que codifica el genoma de un paramixovirus recombinante carente del gen F, un vector de expresión para la proteína F y para las proteínas NP, P/C y L dentro de las células hospedadoras (documentos WO00/70055 y WO00/70070). Alternativamente, pueden usarse células hospedadoras en las que el gen F se integra en el cromosoma. La secuencia de aminoácidos de estas proteínas proporcionada de forma exógena, puede no ser idéntica a las de tipo silvestre y puede mutarse o sustituirse por una proteína homóloga de otro virus siempre que proporcione una actividad de transferencia génica equivalente o mayor.
La proteína de la cubierta del vector de paramixovirus puede contener otra proteína diferente de la proteína de la cubierta del genoma del vector original. No hay limitaciones para estas proteínas. Estas pueden incluir proteínas de la cubierta de otros virus tales como la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G). De este modo, el vector de paramixovirus de la invención incluye un vector vírico de tipo pseudo que tiene una proteína de la cubierta derivada de un virus diferente del virus original.
También, el vector de paramixovirus puede tener en la superficie de su cubierta una proteína dirigida hacia células en particular, tales como moléculas de adhesión, ligandos y receptores, o una proteína quimérica que tanga estas proteínas en su dominio extracelular y un polipéptido derivado de la proteína de la cubierta vírica en su dominio intracelular. Este permite la producción hacia un vector dirigido a un tejido en particular. Estas proteínas pueden ser codificadas por el mismo genoma vírico, o suministrarse en el momento de la reconstitución del virus mediante la expresión de genes diferentes a los del genoma vírico (por ejemplo, otro vector de expresión o cromosoma de la célula hospedadora).
Pueden alterarse los genes víricos contenidos en el vector de la invención para reducir la antigenicidad o potenciar la eficacia de la transcripción del ARN o la eficacia de la replicación. Específicamente, es posible alterar al menos uno de los genes NP, P/C y L, que son genes de factores de replicación, para potenciar la transcripción o la replicación. También es posible alterar la proteína HN, una proteína estructural que tiene actividad hemaglutinina y actividad neuraminidasa, para potenciar la estabilidad del virus en sangre debilitando la primera actividad y regular la infectividad alterando la segunda actividad. También es posible alterar la proteína F, que está implicada en la fusión con la membrana, para regular la capacidad de fusión. Además, es posible generar un vector de paramixovirus que se manipule genéticamente para tener una antigenicidad débil mediante el análisis de los epítopes presentadores de antígeno y las posibles moléculas antigénicas de la superficie celular, tales como la proteína F y la proteína HN.
Además, puede usarse según la presente invención un paramixovirus cuyo gen accesorio es deficiente. Por ejemplo, anulando la expresión del gen V, uno de los genes accesorios de SeV, la patogenicidad de SeV para hospedadores tales como ratones, desciende marcadamente sin daños en la expresión y replicación de los genes en los cultivos celulares (Kato, A. y col., J. Virol., 1997, 71, 7266-7272; Kato. A. y col., EMBO J., 1997, 16, 578-587; Curran, J. y col., documento WO01/04272, documento EP1067179). Estos vectores atenuados son especialmente preferidos como vectores víricos para la transferencia de genes in vivo o ex vivo.
El vector vírico descrito en este documento puede contener un gen extraño en el ARN genómico. Puede obtenerse un vector de paramixovirus recombinante que contiene un gen extraño insertando el gen en el genoma del vector de paramixovirus descrito anteriormente. El gen extraño puede ser un gen que codifica una proteína deseada que se expresará en la sangre. Puede codifica una proteína natural o una proteína alterada que tiene una deleción, sustitución o inserción siempre que la proteína tenga una función equivalente a la de la proteína natural. Alternativamente, puede ser una proteína diseñada artificialmente, tal como un mutante negativo dominante. Por ejemplo, con el fin de la terapia génica y como tal, puede insertarse un gen usado para tratar una enfermedad diana en el ADN que codifica el genoma del vector vírico (el ADN del vector vírico). En el caso de la inserción de un gen extraño dentro del ADN del vector del virus Sendai, es deseable insertar una secuencia que comprende un número de nucleótidos múltiplo de seis entre la secuencia de final de la transcripción (E) y la secuencia de inicio de la transcripción (S) (Calain P. y Roux L., J. Virol., 1993, 67(8), 4822-4830). Puede insertarse un gen extraño antes del extremo 5' y/o después del extremo 3' de cada uno de los genes víricos (genes NP, P, M, F, HN y L). Para no interferir con la expresión de los genes antes del extremo 5' y después del extremo 3', puede colocarse de forma apropiada una secuencia E-I-S (secuencia de final de la transcripción- secuencia intermedia- secuencia de inicio de la transcripción) o una porción de esta, antes del extremo 5' o después del extremo 3' de un gen extraño de modo que esta secuencia E-I-S se localiza entre cada gen. Alternativamente, puede insertarse un en extraño con SEIR.
El nivel de expresión de los genes insertados puede regularse mediante el tipo de secuencia de inicio de la transcripción que se une antes del extremo 5' de los genes (documento WO01/18223). También puede regularse mediante la posición de inserción y la secuencia que rodea al gen. En el virus Sendai, por ejemplo, cuanto más cerca esté la posición de la inserción del extremo 3' terminal de la cadena de ARN negativa del genoma vírico (cuanto más cerca del gen NP en el ordenamiento génico del genoma vírico de tipo silvestre), mayor será el nivel de expresión del gen insertado. Para alcanzar una alta expresión de un gen extraño, es preferible insertarlo en la región antes del extremo 5' del genoma de cadena negativa, es decir, antes del extremo 5' del gen NP (región flanqueante 3' de la cadena negativa) o entre los genes NP y P. Por el contrario, cuanto más cerca esté la posición de la inserción del extremo 5' terminal de la cadena de ARN negativa (cuanto más cerca del gen L en el ordenamiento génico del genoma vírico de tipo silvestre), menor será el nivel de expresión del gen insertado. Para reducir la expresión de un gen extraño, puede insertarse en la posición más 5' de la cadena negativa, es decir, después del extremo 3' del gen L en el genoma del virus de tipo silvestre (región flanqueante 5' del gen L en la cadena negativa) o antes del extremo 5' del gen L (región flanqueante 3' del gen L de la cadena negativa). De este modo, la posición de inserción de un gen extraño puede ajustarse correctamente para obtener así un nivel de expresión del gen deseado o para optimizar la combinación de la inserción con los genes víricos que lo rodean. Por ejemplo, si la sobreexpresión de un gen introducido por un vector vírico a valor elevado puede causar toxicidad, es posible no sólo controlar el valor del virus sino también reducir el valor de expresión de vectores individuales diseñando la posición de inserción más próxima al extremo 5' terminal del cadena negativa o sustituyendo la secuencia de inicio de la transcripción por una que tenga menor eficacia obteniendo así un efecto terapéutico apropiado.
Para ayudar a una inserción fácil de un gen extraño, puede diseñarse un sitio de clonación en la posición de inserción. Por ejemplo, el sitio de clonación puede ser la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción. Pueden usarse los sitios de restricción del ADN del vector vírico para insertar un gen extraño. El sitio de clonación puede ser un sitio de clonación múltiple que contenga secuencias de reconocimiento para múltiples enzimas de restricción. El vector de la presente invención puede tener otros genes extraños en posiciones diferentes a las que se usan para la inserción anterior. Estos genes extraños no están limitados, pero puede ser genes de citoquinas antiinflamatorias, o puede ser genes de otras clases.
La construcción de un vector del virus Sendai recombinante que tiene un gen extraño, puede realizarse como sigue, por ejemplo, según el procedimiento descrito (Hasan M. K. y col., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820; Kato A. y col., EMBO J., 1997, 16, 578-587; Yu D. y col., Genes Cells, 1997, 2, 457-466).
En primer lugar, se prepara una muestra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del ADNc de un gen extraño deseado. Es preferible que la muestra de ADN pueda identificarse electroforéticamente como un único plásmido a concentraciones de 25 ng/\mul o más. A continuación, se describirá como ejemplo un caso en el que se inserta un gen extraño en un ADN que codifica el genoma vírico utilizando un sitio NotI. Cuando se incluye el sitio de restricción NotI en la secuencia de nucleótidos del ADNc objetivo, es preferible eliminar con antelación el sitio NotI modificando la secuencia de nucleótido mediante el usan de la mutagénesis específica de sitio y este método no alterará la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. A partir de esta muestra de ADN, el fragmento génico deseado se amplifica y recupera mediante PCR. Para tener sitios NotI en ambos extremos del fragmento de ADN amplificado y, adicionalmente, añadir una copia de la secuencia de terminación de la transcripción (E), secuencia intermedia (I) y secuencia de iniciación de la transcripción (S) (secuencia EIS) del virus Sendai en un extremo, se preparan una secuencia de ADN sintético de secuencia codificadora y una secuencia de ADN sintético de secuencia complementaria) como par de cebadores que contenían la secuencia del sitio de escisión de la enzima de restricción NotI, la secuencia de terminación de la transcripción (E), secuencia intermedia (I), secuencia de iniciación de la transcripción (S) y una secuencia parcial del gen objetivo.
Por ejemplo, para asegurarse de la escisión por NotI, la secuencia del ADN sintético de secuencia codificadora se ordena de forma que se selecciona cualquiera de los dos o más nucleótidos (preferiblemente 4 nucleótidos excluyendo GCG y GCC, secuencias que se originan en el sitio de reconocimiento de NotI, más preferiblemente ACTT) en el extremo 5' del ADN sintético, se añade el sitio de reconocimiento NotI "gcggccgc" en su extremo 3' y al extremo 3' del mismo se añaden 9 nucleótidos deseados cualesquiera o nucleótidos de 9 más un múltiplo de 6 nucleótidos como secuencia espaciadora, y se añade al extremo 3' del mismo, aproximadamente 25 nucleótidos equivalente a la FLA que incluyen el codon de iniciación ATG del ADNc deseado. Es preferible seleccionar aproximadamente 25 nucleótidos a partir del ADNc deseado como la secuencia de ADN sintético de la secuencia codificadora de modo que tenga G o C como el nucleótido final de su extremo 3' terminal.
En la secuencia de ADN sintético de la secuencia complementaria, cualquiera de los dos o más nucleótidos (preferiblemente 4 nucleótidos excluyendo GCG y GCC, secuencias que se originan en el sitio de reconocimiento NotI, más preferiblemente ACTT) se seleccionan en el extremo 5' del ADN sintético, se añade el sitio de reconocimiento de NotI "gcggccgc" a su extremo 3' y se añade además a su extremo 3', un oligo ADN como el fragmento de inserción para ajustar la longitud. Este oligo ADN se diseña de modo que el número total de nucleótidos incluyendo el sitio de reconocimiento NotI "gcggccgc", la secuencia complementaria del ADNc y la secuencia de nucleótidos EIS del genoma del virus Sendai originario del virus descrito a continuación, sea un múltiplo de seis (denominado "regla del seis"; Kolakofski D. y col., J. Virol., 1998, 72, 891-899; Calain P. y Roux L., J. Virol., 1993, 67, 4822-4830; Calain, P. y Roux, L., J. Virol., 1993, 67, 4822-4830). Además al extremo 3' del fragmento insertado se añade una secuencia complementaria a la secuencia S del virus Sendai, preferiblemente 5'-CTTTCACCCT-3' (SEC ID Nº 1), una secuencia complementaria a la secuencia I, preferiblemente 5'-AAG-3' y una secuencia complementaria a la secuencia E, preferiblemente 5'-TTTTTCTTACTACGG-3' (SEC ID Nº 2) y además del extremo 3' del mismo se selecciona una secuencia complementaria equivalente de aproximadamente 25 nucleótidos contados en la dirección complementaria a partir del codon de terminación de la secuencia de ADNc deseada, cuya longitud se ajusta para que tenga G o C como el nucleótido final, se selecciona y añade como el extremo 3' del ADN sintético la secuencia complementaria.
Puede hacerse una PCR según el procedimientos usual con, por ejemplo, ExTaq polimerasa (Takara Shuzo). Preferiblemente, la PCR se realiza usando la polimerasa Vent (NEB) y los fragmentos deseados amplificados de este modo se digieren con NotI, y a continuación se inserta en el sitio NotI del vector plasmídico pBluescript. Las secuencias de nucleótidos de los productos de PCR, obtenidos de este modo se confirman con un secuenciador para seleccionar un plásmido que tenga la secuencia correcta. El fragmento insertado se escinde a partir del plásmido usando NotI y se clona en el sitio NotI del plásmido que lleva el ADNc genómico. Alternativamente, también es posible obtener el ADNc del virus Sendai recombinante insertando directamente el fragmento en el sito NotI sin la mediación del vector plasmídico pBluescript.
Por ejemplo, el ADNc genómico del virus Sendai recombinante puede construirse según los procedimientos de la bibliografía (Kato A. y col., EMBO J., 1997, 16, 578-598; Hasan M. K. y col., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820; Yu, D. y col., Genes Cells, 1997, 2, 457-466). Por ejemplo, una secuencia espaciadora de 18 pb que contiene el sitio NotI ((5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEC ID Nº 3) se inserta en un locus génico adyacente de un ADNc genómico del virus Sendai (pSeV(+)) entre la secuencia líder y el extremo 5' terminal de una secuencia que codifica la proteína N y se obtiene el plásmido pSeV18^{+}b(+) que contiene un sitio ribozima autoescindible derivado de la cadena antigenómica del virus de la hepatitis delta (Hasan M. K. y col., J. General Virol., 1997, 78, 2813-2820). Se inserta un fragmento génico extraño en el sitio NotI del pSeV18^{+}b(+) para obtener un ADNc del virus Sendai recombinante dentro del que se ha insertado un gen extraño deseado.
El ADN del vector de paramixovirus recombinante se transcribe in vitro o en células, y la RNP se reconstituye en presencia de las proteínas L, P y NP para generar un vector vírico que comprende la RNP. Un procedimiento para producir el vector de paramixovirus puede comprende la transcripción de un ADN que codifica el genoma del vector vírico. Un ADN para producir el vector de paramixovirus puede comprende transcribir el ADN que codifica el genoma del vector vírico. En este documento también se describe el uso de un ADN que codifica el genoma del vector para producir el vector de paramixovirus de la invención. La reconstitución de un virus a partir del ADN del vector vírico puede realizarse según los procedimientos conocidos (documento WO97/16539; documento WO97/16538; Durbin A. P. y col., Virol., 1997, 235, 323-332; Whelan S. P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 8388-8392; Schnell M. J. y col., EMBO J., 1994, 13, 4195-4203; Radecke F. y col., EMBO J., 1995, 14, 5773-5784; Lawson N. D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 4477-4481; Garcin D. y col., EMBO J., 1995, 14, 6087-6094; Kato A. y col, Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Baron M. D. y Barrett T., J. Virol., 1997, 71, 1265-1271; Bridgen A. y Elliott R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15400-15404). Estos procedimientos permiten reconstituir, a partir del ADN, vectores de paramixovirus deseados incluyendo vectores del virus de la parainfluenza, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus de las paperas, virus de la peste bovina, virus Sendai, etc. Cuando un ADN de un vector vírico se hace deficiente en los genes F, HN y/o M, no se forman partículas víricas infecciosas con este vector defectivo. Sin embargo, es posible formar partículas víricas infecciosas transfiriendo separadamente estos genes deficientes, genes que codifican otras proteínas de la cubierta vírica y similar, a células y expresarlos en estas.
Los procedimientos para transferir el ADN del vector vírico en las células incluyen lo siguiente: 1) el procedimiento de preparación precipitados de ADN que pueden entrar en las células objetivo; 2) el procedimiento de preparación de un complejo cargado positivamente que comprende el ADN adecuado para introducirse en las células objetivo y que tampoco es muy citotóxico y 3) el procedimiento para producir de forma instantánea poros de la membrana celular objetivo suficientemente anchos para permitir que las moléculas de ADN los atraviesen con un pulso eléctrico.
En el Procedimiento 2), puede utilizarse una diversidad de reactivos de transfección, siendo ejemplos DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN Nº 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Boehringer Nº 1811169), etc. Un ejemplo del Procedimiento 1) es un procedimiento de transfección usando fosfato cálcico, en el que el ADN que entra en las células se incorpora a los fagosomas, y también se incorpora una cantidad suficiente en los núcleos (Graham, F. L. y Van Der Eb, J., Virology, 1973, 52, 456; Wigler, M. y Silverstein, S., Cell, 1977, 11, 223). Chen y Okayama investigaron la optimización de la técnica de transferencia, informando de que pueden obtenerse precipitados de ADN óptimos en condiciones donde 1) las células se incuban con ADN en una atmósfera del 2 al 4% del CO_{2} a 35ºC durante 15 a 24 h, 2) se usa ADN cíclico con mayor actividad para formar precipitados que el ADN lineal, y 3) la concentración óptima de ADN en la mezcla de precipitación es de 20 a 30 \mug/ml (Chen, C. y Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). El Procedimiento 2) es adecuado para una transfección transitoria. En la técnica se conoce un procedimiento antiguo en el que se prepara una mezcla de DEAE-dextrano (Sigma Nº D-9885, P.M. 5 x 10^{5}) a una proporción de concentración de ADN deseada para realizar la transfección. Puesto que la mayoría de los complejos se degradan en los endosomas, puede añadirse cloroquina para potenciar la eficacia de la transfección (Calos M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 3015). El Procedimiento 3) se denomina como electroporación y, en comparación con los procedimientos 1) y 2), es más versátil porque no tiene selectividad celular. Se dice que el procedimiento 3) es eficaz en condiciones óptimas de duración de la corriente del pulso eléctrico, forma del pulso, potencia del campo eléctrico (distancia entre electrodos, voltaje), conductividad de los tampones, concentración de ADN y densidad
celular.
Entre las tres categorías descritas anteriormente, en la presente invención son apropiados los reactivos de transfección (procedimiento 2), ya que el procedimiento 2) se puede realizar fácilmente y facilita el examen de muchas muestras de ensayo usando una gran cantidad de células. Preferiblemente, se usan el Reactivo de Transfección Superfect (QIAGEN, Nº de catálogo 301305) o el Reactivo de Transfección Liposomal DOSPER (Boehringer Mannheim, Nº de Cat. 1811169), pero los reactivos de transfección no se limitan a estos.
Específicamente, la reconstitución del vector vírico a partir del ADNc, puede realizarse como sigue:
Una línea celular derivada de riñón de simio, LLC-MK2, se cultiva en placas de cultivo de plástico de 24 pocillos a 6 pocillos, en placas de cultivo de 100 mm de diámetro o similares, y usando un medio mínimo esencial (MEM) que contiene suero fetal de ternera (SFT) al 10% y antibióticos (100 unidades/ml de penicilina G y 100 \mug/ml de estreptomicina) hasta del 70 al 80% de confluencia e infectadas, por ejemplo, a 2 UFP/célula con el virus vaccinia recombinante, vTF7-3 que expresan la polimerasa T7 que se había inactivado mediante tratamiento con irradiación UV durante 20 min en presencia de 1 \mug/ml de psoraleno (Fuerst, T. R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986; Kato, A. y col., Genes Cells 1: 569-579, 1996). La cantidad de psoraleno añadido y el tiempo de irradiación UV pueden ajustarse de forma apropiada. Una hora después de la infección, las células se transfectaron con de 2 a 60 \mug, más preferiblemente de 3 a 5 \mug, del ADNc del virus Sendai recombinante descrito anteriormente, mediante el procedimiento de lipofección o similares y usando plásmidos (24 a 0,5 \mug de pGEM-N, 12 a 0,25 \mug de pGEM-P y 24 a 0,5 \mug de pGEM-L, más preferiblemente 1 \mug de pGEM-N, 0,5 \mug de pGEM-P y 1 \mug de pGEM-L) (Kato, A. y col., Genes Cells, 1996, 1, 569-579) expresando las proteínas víricas que actúan en trans requeridas para la producción del genoma vírico Sendai de longitud completa junto con Superfect (QIAGEN). Las células transfectadas se cultivan en MEM sin suero que contenía rifampicina (Sigma) y arabinósido de citosina (AraC), si se desea, a 100 \mug/ml cada una, conteniendo más preferiblemente sólo 40 \mug/ml de arabinósido de citosina (AraC) (Sigma), y se fijaron las concentraciones óptimas de los reactivos para minimizar la citotoxicidad debida al virus vaccinia y maximizar la velocidad de recuperación del virus (Kato A. y col., Genes Cells, 1996, 1, 569-579). Tras cultivar durante aproximadamente 48 a 72 h tras de la transfección, las células se recuperan, se rompen mediante tres ciclos de congelación y descongelación, se transfieren a células LLC-MK2 y se cultivan. Tras cultivar las células de 3 a 7 días, se recoge la solución de cultivo. Para reconstituir un vector vírico carente de un gen que codifica una proteína de la cubierta que es incapaz de replicación, el vector puede transfectarse en células LLC-MK2 que expresan una proteína de la cubierta o transfectar conjuntamente con el plásmido de expresión de la proteína de la cubierta. Alternativamente, las células LLC-MK2, que expresan la proteína de la cubierta, pueden recubrirse con células transfectadas y cultivarse para propagar el vector vírico delecionado (documentos WO00/70055 y WO00/70070). El valor del virus contenido en el sobrenadante del cultivo puede determinarse midiendo la actividad de hemaglutinación (HA), que puede analizarse mediante el "procedimiento de dilución límite" (Kato. A. y col., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Yonemitsu Y. y Kaneda Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells., Molecular Biology of Vascular Diseases. Methods in Molecular Medicine, Ed. por Baker A. H., Humana Press, 1999, 295-306). La posible contaminación del virus vaccinia vTF7-3 puede eliminarse mediante reamplificación en huevos de gallina tras diluir apropiadamente (por ejemplo, 10^{6} veces) la muestra alantoidea obtenida. La reamplificación Puede repetirse, por ejemplo, tres o más veces. La disolución madre del virus obtenido de este modo, puede conservarse
a -80ºC.
El tipo de células hospedadoras usadas para la reconstitución del virus no está especialmente limitado, siempre que el vector vírico pueda reconstituirse en él. Por ejemplo, pueden usarse cultivos celulares tales como células derivadas de riñón de simio CV-1 y células LLC-MK2, células derivadas de riñón de hámster BHK, células derivadas de humanos, y etcétera. Para obtener el vector del virus Sendai en gran cantidad, el vector puede amplificarse, por ejemplo, mediante la infección de huevos embrionados de gallina con el vector vírico obtenido de las células hospedadoras descritas anteriormente. Los procedimientos para producir fluido vírico usando huevos de gallina ya se han desarrollado (Nakanishi, y col. (editores), 1993, "Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III" (Protoloco III de alta tecnología de Investigación en Neurociencia), Molecular Neurocyte Physiology, Koseisha, Osaka, pág. 153-172). Específicamente, por ejemplo, los huevos fertilizados se ponen en un incubador y se incuban de 9 a 12 días a 37 o 38ºC para que crezcan los embriones. El vector del virus Sendai se inocula en la cavidad alantoidea de los huevos y se cultivan durante varios días para que el virus prolifere. Las condiciones, tales como la duración del cultivo, pueden variar dependiendo del tipo de virus Sendai recombinante usado. Posteriormente, se recupera el fluido alantoidea que contiene el virus. La separación y purificación del vector del virus Sendai puede realizarse según los procedimientos convencionales (Tashiro, M., "Virus Experiment Protocols", Nagai e Ishihama (editores), Medicalview, 1995,
68-73).
Por ejemplo, puede construirse un vector del virus Sendai carente de la proteína F y prepararse como sigue (documentos WO00/70055 y WO00/70070).
(1) Construcción del ADNc genómico del virus Sendai carente del gen F y de un plásmido de expresión para el gen F
El ADNc genómico del virus Sendai (SeV) de longitud completa, pSeV18^{+}b(+) (Hasan M. K. y col., J. General Virol., 1997, 78, 2813-2820) (pSeV18^{+}b(+) también puede llamarse pSeV18^{+}), se digiere con SphI y KpnI y el fragmento resultante (14.673 pb) se recupera y clona en pUC18 para obtener pUC18/KS-pUC18/KS se usa para construir una región carente del gen F. La deleción del gen F se realiza mediante combinación de PCR-ligamiento y la FLA del gen F (1.698 pb, de ATG a TGA) se sustituye por la secuencia 5'-atgcatgccggcagatga (SEC ID Nº 4) en el ADNc genómico de SeV delecionado en el gen F resultante (pSeV18^{+}/\DeltaF). Los productos de PCR obtenidos usando los cebadores (sentido: 5'-gttgagtactgcaagagc/SEC ID Nº 5; complementaria: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEC ID Nº 6) y con los cebadores (sentido: 5'-atgcatgccggcagatga/SEC ID Nº 7; complementaria: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/SEC ID Nº 8) se digieren con EcoT22I y se clonan antes del extremo 5' y después del extremo 3' del gen F, respectivamente. El plásmido resultante se digiere con SacI y SalI, y se recupera el fragmento que contiene el sitio de deleción del gen F (4.931 pb) y se clona en pUC18 para obtener pUC18/dFss. pUC18/dFss se digiere con DraIII, y el fragmento recuperado se sustituye por el fragmento DraIII del pSeV18^{+} que contiene el gen F y se liga para obtener pSeV18^{+}/\DeltaF.
Puede insertarse un gen extraño en el sitio NsiI o NgoMIV en el sitio de deleción del gen F de pUC18/dFSS. Para este fin, puede amplificarse un fragmento que contiene un gen extraño usando cebadores con la cola NsiI o cebadores con la cola NgoMIV.
(2) Preparación de células colaboradoras para la expresión inducible de la proteína SeV-F
Se construye como sigue un plásmido de expresión inducible Cre/loxP para el gen F del virus Sendai (SeV-F). El gen SeV-F se amplifica mediante PCR, y se clona en el sitio único SwaI del plásmido pCALNdLw (Arai T. y col., J. Virol., 1998, 72, 1115-1121), que se diseña para la expresión inducible de productos génicos a través de la función de la ADN recombinasa Cre, para obtener pCALNdLw/F.
Para recuperar partículas víricas infecciosas a partir del genoma con el gen F delecionado, se establece una línea celular colaboradora que expresa la proteína SeV-F. Pueden usarse células LLC-MK2, derivadas del riñón de Simio y usadas normalmente para la propagación de SeV. Las células LLC-MK2 se cultivan a 37ºC, con CO_{2} al 5% en MEM que contiene suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor e inmovilizado al 10%, 50 U/ml de penicilina G sódica y 50 \mug/ml de estreptomicina. Debido a la citotoxicidad del producto génico SeV-F, el gen se clona en el pCALNdLw, donde la expresión de un gen clonado se induce mediante la ADN recombinasa Cre. El pCALNdLw/F anterior se usa para transfectar células LLC-MK2 mediante el procedimiento del fosfato cálcico (kit de transfección de mamíferos (Stratagene)) según el protocolo convencional.
Las células LLC-MK2 cultivada en placas de 10 cm hasta el 40% de confluencia se transfectan con 10 \mug de pCALNdLw/F y se incuban en 10 ml de MEM que contiene SFB al 10% a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 24 h. A continuación, las células se dispersan, se resuspenden en 10 ml de medio de cultivo y se colocan en placas de 10 cm, donde se colocan 5 ml de suspensión celular en una placa, 2 ml en dos y 0,2 ml en dos. Las células se cultivan en 10 ml de MEM que contiene SFB al 10% más G418 (GIBCO-BRL) a 1.200 \mug/ml durante 14 días con cambio de medio cada dos días y se seleccionan los transfectantes estables. Las células cultivadas en el medio que son resistentes a G418 se recuperan usando anillos de clonación. Las células de cada clon se cultivan adicionalmente hasta que crecen al 100% de confluencia en una placa de 10 cm.
Para inducir la expresión de la proteína F, las células se crecen al 100% de confluencia en placas de 6 cm y se infectan con adenovirus AxCANCre a mdi=3 según el procedimiento de Saito y col. (Saito y col., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 3816-3821; Arai T. y col., J. Virol., 1998, 72, 1115-1121).
(3) Reconstitución y propagación del virus Sev delecionado para el gen F
El pSeV18^{+}/\DeltaF con la inserción de un gen extraño se transfecta en células LLC-MK2 como sigue. Las células se pusieron en placas a 5 x 10^{6} células/placas en placas de petri de 100 mm, se cultivan durante 24 h y, a continuación, se infectan a temperatura ambiente durante 1 h con el virus vaccinia recombinante que expresa la ARN polimerasa T7, y que se habían tratado con psoraleno y UV larga (365 nm) durante 20 min (Fuerst T. R. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8122-8126) (mdi = 2 a 3: preferiblemente, mdi = 2). La exposición a UV puede realizarse usando un Stratalinker 2400 UV equipado con cinco bombillas de 15 vatios (número de catálogo 400676 (100 V), Stratagene, La Jolla, CA, EEUU). Después de lavar las células tres veces, los plásmidos pSeV18^{+}/\DeltaF-GFP, pGEM/NP, pGEM/P y pGEM/L (Kato A. y col., Genes Cells, 1996, 1, 569-579) se resuspenden con OptiMEM (GIBCO) a una proporción de 12 \mug/placa, 4 \mug/placa, 2 \mug/placa y 4 \mug/placa, respectivamente, y se mezcla con el reactivo de transfección SuperFect (5 \mul de SuperFect (QIAGEN) para 1 \mug de ADN). La mezcla se incuba durante 10 min a temperatura ambiente, a continuación se resuspende con 3 ml de OptiMEM con una concentración final de SFB al 3% y se añade a las células. Tras un cultivo de 3 h en un incubador, las células se lavan dos veces con MEM sin suero y adicionalmente se cultivan en MEM que contiene 40 \mug/ml de \beta-D-arabinofuranosido de citosina (AraC, Sigma) y 7,5 \mug/ml de tripsina (GIBCO) durante 70 h. A continuación, las células se recogen y resuspenden en OptiMEM a 10^{7} células/ml. Las células se congelan y descongelan tres veces, a continuación se mezclan con reactivo de lipofección DOSPER (Boehringer Mannheim) (10^{6} células para 25 \mul de DOSPER), se incuban a temperatura ambiente durante 15 min y se transfectaron en células LLC-MK2/F7 (10^{6} células/pocillo en placas de 12 pocillos), que es uno de los clones de células cooperadoras que expresan el gen F, seleccionado como se describe anteriormente. Las células se cultivan en MEM sin suero que contiene 40 \mug/ml de AraC y 7,5 \mug/ml de tripsina, y se recoge el sobrenadante del
cultivo.
Para preparar la deleción de los vectores víricos, se transfieren a la misma célula dos tipos de vectores en los que el gen de la cubierta deficiente del genoma vírico es diferente. En este caso, la expresión de un vector aporta la proteína de la cubierta deficiente en el otro vector para complementarse entre si, llevando así a la formación de partículas víricas infecciosas y a la activación del ciclo de replicación para amplificar los vectores víricos. Es decir, cuando se inoculan las células con dos o más tipos de vectores en combinaciones de manera que las proteínas de la cubierta se complementan entre sí, pueden producirse a gran escala y a bajo costo mezclas de vectores víricos deficientes en los genes respectivos de la cubierta. Debido a la deficiencia de los genes de la cubierta, estos virus tienen un tamaño genómico más pequeño que el del virus completo, de modo que puede portar un gen extraño largo. También, debido a que estos virus originalmente no infecciosos se diluyen extracelularmente y es difícil retener su coinfección, se vuelven estériles, lo que es una ventaja para gestionar sus liberación al medio ambiente.
Si se prepara un vector usando como gen extraño un gen terapéutico para una enfermedad específica, la terapia génica puede realizarse administrando este vector. El vector vírico de la presente invención permite la expresión de un gen extraño que puede ayudar a curar una enfermedad, un gen endógeno del que carecen los pacientes o es insuficiente en ellos, a través de administración directa o administración indirecta (ex vivo). Un gen extraño no está limitado, y puede incluir los que codifican una proteína secretora que se desea sea secretada en el sistema cardiovascular. Son ejemplos los factores humorales tales como diversas citoquinas, hormonas, factores de crecimiento y similares. Para tratar enfermedades inflamatorias es preferible que se use como gen extraño un gen de citoquina antiinflamatoria.
El paramixovirus recuperado puede purificarse de modo que esté sustancialmente puro. La purificación puede realizarse por procedimientos de purificación y separación conocidos, incluyendo filtración, centrifugación, purificación por cromatografía en columna y similares, o por una combinación de los mismos. La expresión "sustancialmente puro" usada en este documento, significa que el virus ocupa la proporción principal como componente de la muestra en la que se encuentra el virus. Típicamente, pueden detectarse vectores víricos sustancialmente puros confirmando que la proporción de las proteínas derivadas del virus con respecto a las proteínas totales en la mezcla, supone el 50% o más, preferiblemente el 70% o más, más preferiblemente el 80% o más e incluso más preferiblemente el 90% o más. Específicamente, puede purificarse el paramixovirus, por ejemplo, mediante un procedimiento en el que se usa éster de sulfato de celulosa o éster sulfato de polisacárido reticulado (Examinado en la publicación de solicitud de patente japonesa (JP-B) Nº Sho 62-30752; documento JP-B Sho 62-33879; documento JP-B Sho 62-30753), se usa un procedimiento en el que se da la adsorción a los polisacáridos que contienen fucosa sulfato y/o un producto de degradación de los mismos (documento WO97/32010), etc.
El vector de paramixovirus puede prepararse como una composición junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable deseado. En ese documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se define como un material que puede administrarse con un vector, pero que no inhibe la transferencia génica del vector. Por ejemplo, el vector de paramixovirus puede diluirse de forma apropiada con solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y similares, para preparar una composición. Cuando los vectores de paramixovirus de esta invención se hacen proliferan en huevos de gallina y similares, la composición puede incluir líquido alantoideo. Las composiciones que comprenden los vectores de paramixovirus de esta invención pueden contener medios fisiológicamente aceptables, tales como agua desionizada, solución acuosa de dextrosa y similares, y, además, también pueden contener otros agentes estabilizantes y antibióticos. La composición puede usarse como una composición farmacéutica. De este modo, la presente invención también se refiere al uso del vector o de la composición anterior como un producto farmacéutico como se describe anteriormente.
Específicamente, la composición usada según la presente invención incluye:
(1) una composición para el tratamiento de enfermedades inflamatorias que comprende el vector de paramixovirus descrito en este documento, o células que contienen dicho vector, en la que el producto génico de dicho vector se introduce en un sitio diferente al sitio de inyección a través del flujo sanguíneo;
(2) la composición para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de (1), en la que dicho vector contiene un gen extraño;
(3) la composición de (2), en la que dicho gen extraño es un gen de citoquina;
(4) la composición de (3), en la que dicha citoquina es una citoquina antiinflamatoria;
(5) la composición de (4), en la que dicha citoquina antiinflamatoria es la IL-10;
(6) la composición de (1) y (5), en la que dicha enfermedad inflamatoria es fibrosis pulmonar;
(7) la composición de cualquiera de (1) a (6), que se administra por vía intramuscular; y
(8) la composición de cualquiera de (1) a (7), en la que dicho paramixovirus es el virus Sendai.
El vector de paramixovirus anterior, o una composición que comprende dicho vector, se administra para transducir un gen extraño portado por el vector según la definición de las reivindicaciones.
El sitio de administración es la administración por vía intramuscular (IM). El vector puede administrarse in vivo o ex vivo, y en un único sitio o en múltiples sitios. Además, el vector puede administrarse sólo una vez o múltiples veces.
El gen transferido por el vector de paramixovirus no está limitado siempre que codifique una proteína secretora, pero puede ser un gen que codifica una diversidad de citoquinas u hormonas. Estas proteínas pueden incluir miembros de sus respectivas familias así como isoformas. El vector de paramixovirus es particularmente útil para la expresión, en todo el sistema cardiovascular, de genes terapéuticos de sustancias biológicamente activas y similares, que tienen una semivida corta en sangre (tales como citoquinas). La semivida de una citoquina natural en el sistema cardiovascular generalmente es muy corta. Por ejemplo, la IL-10 natural sólo es eficaz durante los 30 min iniciales tras su administración (Gerard y col., J. Exp. Med., 1993, 177 (2), 547). El uso del vector de paramixovirus de la invención permite un suministro continuo a la sangre de sustancias biológicamente activas con una semivida corta, incluyendo citoquinas, durante un periodo de tiempo largo.
En particular, las citoquinas tienen un amplio espectro de funciones relacionadas con la proliferación y diferenciación celular. Por ejemplo, la IL-1 tiene una diversidad de funciones incluyendo la activación de células T, la expresión del receptor de IL-2, la inducción de genes de citoquinas y otros, la regulación de la proliferación celular y la regulación de la secreción de hormonas. La IL-1 estimula la liberación de factores de crecimiento y de diferenciación celular a partir de líneas celulares de la médula ósea y de linfocitos. Además, la IL-1 induce en la médula ósea la proliferación de progenitores pluripotentes y de promotores de hematopoyesis. Se usa eficazmente en terapia contra el cáncer. También, la IL-1 está implicada en la angiogénesis y en la activación de fibroblastos y también es útil en la curación de heridas.
La IL-2 está implicada en la activación de las células T, NK y LAK, en la promoción del crecimiento de tipos celulares específicos, en la potenciación de la producción de inmunoglobulina y de IFN-\gamma, en la inducción de la producción de IL-6 a partir de monocitos, etc. La IL-2 se usa eficazmente para el tratamiento de tumores y de enfermedades de inmunodeficiencia o para la activación de células NK tras el trasplante de médula ósea. La IL-3 está implicada en la proliferación de mastocitos, en la producción de células sanguíneas a partir de células progenitoras hematopoyéticas, etc. Actúa junto con otras citoquinas (por ejemplo IL-6) regulando la diferenciación de una diversidad de células sanguíneas. La IL-3 puede usarse eficazmente en el tratamiento de, por ejemplo, la anemia aplásica.
La IL-4 está implicada en el aumento de la expresión de los genes de MHC de clase II en células B en reposo, en la proliferación de células T activadas y en la promoción de las funciones de la célula efectora. La IL-4 también está implicada en la proliferación de mastocitos, en la promoción de la maduración celular en el timo, en la proliferación de células sanguíneas, etc. La IL-4, en presencia de IL-1, potencia la presentación antigénica y la fagocitosis en macrófagos. La IL-4 participa en la reconstitución funcional de los sistemas inmunes celular y humoral tras el trasplante de médula ósea, cura la inmunodeficiencia con el aumento de IgM, induce la diferenciación terminal en leucemia linfoblástica aguda, inhibe el crecimiento de tumores sólidos y de linfomas de células B, suprime la inflamación mediante la inhibición de la producción de IL-1, TNF e IL-6, etc. Además, se espera que la IL-4 sea útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunes dependientes de células T, tales como la diabetes autoinmune y la encefalomielitis alérgica y de otras enfermedades en las que está implicada la función inmune dependiente de células T (Rapoport y col., J. Exp. Med., 1993, 178, 87-99; Racke y col., J. Exp. Med., 1994, 180, 1961).
La IL-5 es eficaz en la estimulación de la producción de IgA y en la promoción del crecimiento de leucocitos eosinófilos, y se conoce su aplicación en el tratamiento de la esquistosomiasis (Sanderson, "International Conference on the Clinical Impact of Interleukins" en el Real Colegio de Médicos de Londres, abril 1989) y de tumores (Kolb y col., Br. J. Cancer, 1979, 40, 410; Pretlow y col., Cancer Res., 1983, 43, 2997; Iwasaki y col., Cancer, 1986, 58, 1321). Además, se ha informado de que la IL-6 tiene muchas funciones incluyendo la inducción o inhibición de la proliferación de una diversidad de células. La IL-7 induce la proliferación de un tipo especial de células B y de células T. La IL-9 está implicada en la diferenciación de eritrocitos, en la supervivencia de células T, en la producción de inmunoglobulinas a partir de linfocitos B y en la estimulación de la producción de IL-6 a partir de masto-
citos.
La IL-10 es producida por células Th2 activadas, células B, queratinocitos, monocitos y macrófagos (Moore y col., Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 165). La IL-10 es eficaz en la estimulación de la proliferación y diferenciación de células B. Además, la IL-10 suprime la producción de citoquinas (tales como IFN-\gamma, TNF-\beta e IL-2) por parte de células Th1, células NK, monocitos y macrófagos (Fiorentino y col., J. Exp. Med., 1989, 170, 2081-2095; Fiorentino y col., J. Immunol., 1991, 146, 3444; Hsu y col., Int. Immunol., 1992, 4, 563; D'Andrea y col., J. Exp. Med., 1993, 178, 1041; de Waal Malefyt y col., J. Exp. Med., 1991, 174, 915; Fiorentino y col., Int. Immunol., 1991, 147, 3815). Por lo tanto, la IL-10 es eficaz, a través de la supresión de la reacción de células Th1, para prevenir el rechazo tras el trasplante, y en enfermedades autoinmunes mediadas por células T, tales como la diabetes de tipo I y la esclerosis múltiple. La IL-10 inhibe la secreción de citoquinas proinflamatorias (tales como IL_1, IL-6, IL-8 y TNF-\alpha). Por tanto, puede usarse IL-10 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias que incluyen artritis reumatoide y psoriasis. Debido a que la IL-10 inhibe la secreción del factor de necrosis tumoral y que suprime el choque séptico, puede ser útil para el tratamiento de la sepsis. La IL-10 también puede ser útil para suprimir la formación del granuloma debido a esquistosomas y también la supresión de la fibrosis hepática. Los interferones-\alpha y -\beta tienen funciones antivirales frente al virus del papiloma, virus de la hepatitis, virus del herpes y etcétera, y pueden ser útiles para el tratamiento de la leucemia de células pilosas, mieloma y otros tumores en los órganos hematopoyé-
ticos.
Para transferir las citoquinas descritas anteriormente al sistema cardiovascular, puede usarse adecuadamente el vector de paramixovirus de la presente invención que expresa estas citoquinas. En una realización deseable, el vector de paramixovirus contiene un gen que codifica una citoquina antiinflamatoria. Las citoquinas antiinflamatorias pueden incluir, por ejemplo, IL-10, IL-4 e IL-2. El vector de paramixovirus que expresa citoquinas antiinflamatorias puede usarse como un fármaco antiinflamatorio útil.
El vector descrito en este documento puede ser aplicable a la terapia génica de diversas enfermedades. Esta terapia génica puede incluir el tratamiento de enfermedades acompañadas de inflamación, incluyendo fibrosis pulmonar, peritonitis esclerosante, prostatomegalia, esclerosis múltiple, rechazo postrasplante, diabetes de tipo I, artritis reumatoide, enteropatía inflamatoria, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, iritis, enfermedades granulomatosas, nefritis crónica, escleroderma, histeromioma, queloide, cirrosis y otras enfermedades acompañadas de inflamación. El vector también puede ser útil para la creación de diversos modelos animales de enfermedad y también en el desarrollo o evaluación de procedimientos para el tratamiento de los modelos de enfermedad y similares.
Por ejemplo, el vector descrito en este documento puede usarse preferiblemente en la terapia génica de la fibrosis pulmonar. La fibrosis pulmonar es una enfermedad con fibrosis en el pulmón que incluye neumonitis intersticial crónica donde, en muchos casos, no está clara la causa de la enfermedad pero se acompaña de fibrosis pulmonar causada por una enfermedad infecciosa crónica o por un sistema autoinmune anómalo. Especialmente, la enfermedad incluye neumonitis y fibrosis quística (FC).
El vector de paramixovirus de la invención puede administrarse a una dosis suficiente para que pueda transferirse a las células del tejido diana una dosis eficaz de vectores. En este documento, la "dosis eficaz" se define como una dosis que permite la introducción de genes en las células del tejido diana llevando así, al menos parcialmente, el efecto terapéutico o el efecto preventivo deseado. La administración de una dosis eficaz del vector de paramixovirus que contiene un gen deseado permite que las células transfectadas produzcan el producto génico. Preferiblemente, la administración de una dosis eficaz del vector de paramixovirus que contiene un gen deseado puede permitir la detección de un nivel de expresión significativo del gen transfectado en el tejido de administración o en la sangre. Un "nivel significativo" se define como el nivel al cual se detecta la expresión del gen transfectado (la cantidad de productos transcritos o traducidos). Por ejemplo, si hay un equivalente endógeno al gen transfectado, el nivel máximo del gen transfectado debe ser significativamente mayor que el nivel de expresión del endógeno. La expresión del gen transfectado puede ser de aproximadamente 1,2 veces o más, preferiblemente de aproximadamente 1,5 o más, más preferiblemente de aproximadamente 2 veces o más, mucho más preferiblemente de aproximadamente 10 veces o más y lo más preferiblemente de aproximadamente 20 veces mayor que el nivel de expresión del gen endógeno en el sitio de administración o en la sangre. Sin embargo, el nivel de expresión del gen transfectado debe determinarse considerando su nivel eficaz y su nivel tóxico.
El nivel de expresión de genes transfectados en las células puede determinarse mediante ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Las transcripciones pueden detectarse y cuantificarse mediante hibridaciones de ARN, PCR-TI, ensayo de protección de ARN y similares. La detección de hibridación de ARN, PCR-TI y similares pueden realizarse in situ. Para detector los productos traducidos, pueden adoptarse una inmunotransferencia, inmunoprecipitación, RIA, ELISA; ensayo de interacción de proteínas in vitro y similares, usando anticuerpos. Para un ensayo de detección de productos génicos transfectados, la proteína que se va a expresar puede estar marcada o el vector puede contener un gen indicador. El gen indicador puede ser aquel que codifica la \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), fosfatasa alcalina o proteína fluorescente verde (GFP), pero no se limita a estos.
La dosis del vector usado para la administración puede variar dependiendo de la enfermedad, peso corporal, edad, sexo, síntoma, propósito de la administración y gen que se va a introducir y similar, pero un experto en la técnica puede determinarlo adecuadamente. Es preferible inocular, con vehículos farmacéuticamente aceptables, los vectores a dosis que están en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 10^{5} ufp/ml a aproximadamente 10^{11} ufp/ml, más preferiblemente de aproximadamente 10^{7} ufp/ml a aproximadamente 10^{9} ufp/ml y los más preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{8} ufp/ml a aproximadamente 5 x 10^{8} ufp/ml. El sujeto de inoculación de las composiciones que contienen los vectores de paramixovirus incluye a todos los mamíferos tales como humanos, monos, ratones, ratas, conejos, ovejas, bóvidos, perros, etc.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la expresión dependiente de dosis de IL-10 en células COS7 transfectadas con SeV-IL10 en placas de 24 pocillos. Las células COS7 se infectaron con SeV-IL10 a la dosis indicada, y después de 16 h, se midió la concentración de IL-10 secretada al medio de cultivo. Como control, las células se transfectaron con un ADN plasmídico para la expresión de IL-10. Para cada grupo, n=6.
La Figura 2 muestra la expresión de IL-10 en el pulmón de ratones que recibieron SeV-IL10 por vía intranasal. SeV-IL10 (6,8 x 10^{7} ufp/100 \mul) se administró por vía intranasal mediante inhalación. Dos días después de la administración, los ratones se sacrificaron y se cuantificó el nivel de expresión de IL-10 en los homogenizados del pulmón. La expresión de IL-10 en los ratones control que recibieron el plásmido de expresión de IL-10 era de 310\pm54 pg/mg (media \pm ETM).
La Figura 3 muestra la secreción de IL-10 en el FLBA de ratones que recibieron SeV-IL10 por vía intranasal. SeV-IL10 (6,8 x 10^{7} ufp/100 \mul) se administró por vía intranasal mediante inhalación. Dos días después de la administración, los ratones se sacrificaron y se determinó el nivel de expresión de IL-10 en el FLBA. La expresión de IL-10 en los ratones control que recibieron el plásmido de expresión de IL-10 era de 71\pm63 pg/mg (media \pm
ETM).
La Figura 4 muestra la secreción de IL-10 en la sangre de ratones que recibieron SeV-IL10 por vía intranasal. SeV-IL10 (6,8 x 10^{7} ufp/100 \mul) se administró por vía intranasal mediante inhalación. Dos días después de la administración, los ratones se sacrificaron y se determinó el nivel de IL-10 en el suero.
La Figura 5 muestra la expresión de los genes transfectados en el cornete y en el pulmón por la administración del vector del virus Sendai mediante inhalación o perfusión. Se administró SeV-Luc (7 x 10^{7} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete) y después de 48 h, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de luciferasa en el pulmón y en el cornete (n=3).
La Figura 6 muestra la expresión de IL-10 en el cornete y en el pulmón por la administración del vector del virus Sendai mediante inhalación o perfusión. Se administró SeV-IL10 (7 x 10^{7} ufp/100 \mul y 7 x 10^{8} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete) y después de 48 h, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de IL-10 en el pulmón y en el cornete (n=6).
La Figura 7 muestra la expresión de IL-10 en la sangre por la administración de SeV-IL10 mediante inhalación o perfusión. Se administró SeV-IL10 (7 x 10^{7} ufp/100 \mul y 7 x 10^{8} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete) y después de 48 h, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de IL-10 en el suero (n=6).
La Figura 8 muestra la expresión dependiente de dosis de la \beta-galactosidasa tras la inyección de SeV-\betagal en los músculos tibiales anteriores (TA). Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con cantidades crecientes de SeV-\betagal, ADN plasmídico o VAA que expresaba el gen indicador \beta-galactosidasa, o se mantuvieron sin inyectar (SI). La dosis del virus y la cantidad de ADN representan la cantidad inyectada en cada TA. Dos días después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se determinó el nivel de expresión de \beta-galactosidasa en el homogeneizado del músculo. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6 a 12m ** p<0,01 en comparación con el grupo inyectado con ADN y el grupo inyectado con VAA.
La Figura 9 muestra la expresión con el tiempo de \beta-galactosidasa tras la inyección de SeV-\betagal en los músculos tibiales anteriores (TA). Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) o SeV-luciferasa (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) como control. Tras la inyección, los ratones se sacrificaron a los tiempos indicados y se determinó el nivel de expresión de \beta-galactosidasa en el homogeneizado del músculo. Los ratones inyectados con el virus de control se sacrificaron dos días después de la inyección. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6, * p<0,05 en comparación con el valor a día 4 tras la inyección.
La Figura 10 muestra el efecto de la inyección repetitiva del vector del virus Sendai en los músculos. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) y recibieron inyecciones posteriores con SeV-luciferasa (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) a los valores de tiempo indicados. Dos días después de la segunda inyección, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de la luciferasa en el homogeneizado del músculo. El nivel de expresión de la luciferasa en cada ratón se comparó con el de los ratones que recibieron sólo una inyección de SeV-luciferasa o con los ratones sin inyectar. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6 a 10. *p<0,05 en comparación con el valor en los ratones sin tratar.
La Figura 11 muestra los resultados del examen de la presencia de anticuerpo anti-SeV sistémico tras la inyección intramuscular del vector del virus Sendai. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo). Tras la inyección, los ratones se sacrificaron al tiempo indicado y se examinó la presencia de anticuerpos específicos para SeV en el suero. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6.
La Figura 12 muestra la expresión de IL-10 en el músculo tras la inyección intramuscular de SeV-IL10. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-IL10 a la dosis indicada y, dos días después, los ratones se sacrificaron y se midió el nivel de IL-10 en el homogeneizado del músculo. Como control, se inyectó el ADN plasmídico para la expresión de IL-10 (pCI-IL10) o SeV-\betagal.
La Figura 13 muestra la secreción de IL-10 a la sangre tras la inyección intramuscular de SeV-IL10. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-IL10 a la dosis indicada y, dos días después, se determinó el nivel de IL-10 en el suero. Como controles se inyectaron el ADN plasmídico para la expresión de IL-10 (pCI-IL10) o SeV-\betagal. El nivel de IL-10 en el suero de los ratones inyectados con el ADN plasmídico para la expresión de IL-10 estaba por debajo del límite de detección. (n=4 a 6).
La Figura 14 muestra la sobreexpresión de IL-10 en el músculo tras la inyección intramuscular de SeV-IL10. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-IL10 (3,5 x 10^{7} ó 3,5 x 10^{8} ufp/músculo), con el ADN plasmídico o con VAA (VAA de IL10) para la expresión de IL-10. También se examinaron los ratones sin tratar. Dos días después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se examinó el nivel de IL-10 en el homogeneizado del músculo. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6, *p<0,5 en comparación con todos los demás grupos.
La Figura 15 muestra la secreción de IL-10 en la sangre tras la inyección intramuscular de SeV-IL10. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con SeV-IL10 (3,5 x 10^{7} ó 3,5 x 10^{8} ufp/músculo), con el ADN plasmídico o con VAA (VAA de IL10) para la expresión de IL-10. También se examinaron los ratones sin tratar. Dos días después, los ratones se sacrificaron y se determinó el nivel de expresión de IL-10 en el suero. Los datos se representan como media \pm ETM. Para cada grupo, n=6, *p<0,5 en comparación con todos los demás grupos.
La Figura 16 muestra el efecto de la inyección intramuscular de SeV-IL10 en ratones modelo de fibrosis pulmonar. Los ratones se inyectaron en cada músculo TA con Sev-IL10 o con SeV para la expresión de luciferasa y SeV para la expresión de \beta-galactosidasa usados como controles (7 x 10^{8} ufp/cada ratón). Dos días después de la inyección, los ratones recibieron una inyección intratecal de bleomicina (0,075 U/100 \mul) o de solución salina. Once días después de la inyección de bleomicina, los ratones se sacrificaron y se examinó el depósito de colágeno mediante el ensayo de la hidroxiprolina. Para cada grupo, n=15 a 21. *p<0,05 en comparación con el grupo de control inyectado con SeV-luciferasa/\beta-gal.
El mejor modo para realizar la invención
A continuación, la presente invención se ilustra en detalle con referencia a ejemplos, pero no debe interpretarse como que está limitado por ellos. Todas las referencias citadas en este documento se incorporan como referencia.
Ejemplo 1 Administración in vivo del vector del virus Sendai
Los vectores del virus Sendai recombinante que contienen un gen que codifica IL-10, \beta-galactosidasa o luciferasa (SeV-IL10, SeV-\betagal y SeV-luciferasa, respectivamente) que son capaces de replicarse, se construyeron según el procedimiento descrito en Kato A. y col., EMBO J., 1997, 16, 578-587 y Yu D. y col., Genes Cells, 1997, 2, 457-466. Los vectores se propagaron en huevos de gallina y las soluciones alantoideas que contenían los virus se conservaron a -80ºC hasta su uso como una composición que comprende el vector de virus Sendai recombinante de la presente invención.
Los vectores del virus Sendai se administraron en los siguientes ejemplos.
1. Administración intranasal
Los ratones se anestesiaron mediante inhalación de metofane y el vector se administro por inhalación. A no ser que se especifique otra cosa, se inoculó una dosis de 7 x 10^{6} a 7 x 10^{8} ufp de SeV-IL10 o de virus SeV-\betagal control en un volumen total de 100 \mul en la nariz del ratón y se inhalaba como un bolo durante un periodo de 10 a 20 segundos. Este procedimiento daba lugar al depósito del virus en el pulmón y en la nariz.
2. Perfusión
Los ratones se anestesiaron con hipnom/hipnoval. SeV-IL10 o el virus SeV-\betagal control se aplicaron selectivamente al epitelio nasal (cornete) durante un periodo de 10 minutos administrando el virus directamente en el epitelio nasal mediante un catéter fino a 7 x 10^{7} ó 7 x 10^{8} ufp en un volumen total de 100 \mul, a no ser que es especifique otra cosa. Durante el procedimiento, el ratón se mantuvo en posición invertida con su cabeza hacia abajo. Por tanto, el exceso de virus goteaba fuera de la nariz. Este procedimiento daba lugar al depósito del virus predominantemente en la nariz, alcanzando muy pocos virus el pulmón.
3. Administración por vía intramuscular
A no ser que se especifique otra cosa, ratones C57BL/6 se inyectaron con 7 x 10^{7} ó 7 x 10^{8} ufp de SeV-IL10 o de SeV-\betagal control en ambos músculos tibiales anteriores (TA) (50 \mul por cada músculo, n=6 a 11). Se observó una respuesta dependiente de dosis en un experimento piloto usando SeV-\betagal (de 7 x 10^{4} a 7 x 10^{8} ufp/animal).
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Ejemplo 2 Preparación de lisados de tejidos, suero y fluido del lavado broncoalveolar (FLBA)
Los ratones se sacrificaron 48 h después de la administración del virus. Los lisados de tejidos, sueros y FLBA se prepararon como sigue.
1. Lisados de tejidos
Los músculos TA, el pulmón y el cornete se cortaron y homogeneizaron en 300 \mul de solución de Tris-HCl 0,25 M (pH 8). Las células se lisaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 min y los sobrenadantes se conservaron a -80ºC para un análisis posterior. La concentración de proteínas de cada muestra se determinó mediante el ensayo de proteínas de Lowry modificado por
Folin.
2. Sueros
Se recogió una muestra de sangre del corazón y se incubó a 37ºC durante 2 h para inducir la formación del coágulo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 min y los sueros obtenidos se transfirieron a un tubo nuevo y se congelaron a -80ºC para un análisis posterior.
3. FLBA
Se dejó la traquea al descubierto y se insertó un catéter. El pulmón se lavó tres veces con 0,5 ml de PBS. Se recogió el FLBA, se centrifugó a 4.000 rpm durante 5 min y se congeló a -80ºC para un análisis posterior.
Ejemplo 3 ELISA de interleuquina-10 (IL-10)
El ELISA de IL-10 humana se realizó usando un kit obtenido de R&D según las instrucciones del fabricante. La cantidad de IL-10 en los lisados de los tejidos se estandarizó con respecto a la concentración de proteínas y los datos se calcularon como la cantidad de IL-10 en picogramos por miligramo de proteína citosólica.
Ejemplo 4 Ensayo del gen indicador
El ensayo de la luciferasa se realizó usando un kit obtenido de Promega según las instrucciones del fabricante. El ensayo de la \beta-galactosidasa se realizó usando un kit obtenido de Clontech también según las instrucciones del fabricante. Estos ensayos se realizaron usando lisados de tejidos y los datos se estandarizaron con respecto la concentración de proteínas.
Ejemplo 5 Análisis estadístico
Todos los datos se mostraban como valores medios \pm errores típicos de la media (ETM). La varianza se analizó mediante la prueba de Mann-Whitney y los datos con p<0,05 se consideraron como significativos.
Ejemplo 6 Transfección del vector del virus Sendai que expresa IL-10 en células COS7
Las células COS7 se transfectaron con SeV-IL10 a diferente dosis (10^{4} a 10^{6} ufp/pocillo en placas de 24 pocillos). Después de 16 h de transfección, se examinó la cantidad de IL-10 secretada en el sobrenadante del cultivo. El plásmido que expresaba la IL-10 (pCI-IL10) (80 \mug/ml, 100 \mul) se transfectó de forma transitoria (mediante lipofección) y la expresión de IL-10 se comparó con la de SeV-IL10. Se usó SeV-\betagal como control.
En las células transfectadas con SeV-IL10, la cantidad de IL-10 secretada aumentaba de forma dependiente de dosis (Figura 1). La cantidad de IL-10 secretada por las células infectadas con SeV-IL10 al valor más elevado (10^{6} ufp/pocillo) era dos órdenes de magnitud mayor al de las células transfectadas por lipofección con un plásmido que codificaba IL-10 (SeV-IL10: 333\pm47 ng/ml/mg de proteína, plásmido: 6,8\pm1,4 ng/ml/mg de pro-
teína).
Ejemplo 7 Administración intranasal por inhalación del vector del virus Sendai en los ratones
Tras la administración por vía tópica de los vectores del virus (6,7 x 10^{7} ufp/100 \mul) en las vías respiratorias del ratón mediante instilación intranasal, se midió la secreción de IL-10 en los homogeneizados de pulmón y el FLBA dos días después de la transfección, y se comparó con la secreción de IL-10 tras la transfección mediada por liposomas con ADN plasmídico. También se determinó la concentración de IL-10 en el suero.
En los homogeneizados de pulmón, la cantidad de IL-10 secretada era dos órdenes de magnitud mayor que la obtenida mediante la transfección con el plásmido (SeV-IL10: 21.457\pm5.122 pg/mg de proteína; plásmido: 310\pm54 pg/mg de proteína) (Figura 2). Además, en el FLBA, la cantidad de IL-10 secretada después de dos días de infección era tres órdenes de magnitud mayor que la obtenida mediante la transfección con el plásmido (SeV-IL10: 153.366\pm41.823 pg/ml; plásmido: 71\pm63 pg/ml) (Figura 3). Dos días después de la administración, el nivel de IL-10 en el suero era significativamente mayor en los ratones infectados con SeV-IL10 que en los ratones infectados con el virus control (SeV-IL10: 393\pm132 pg/ml; Sev-\betagal: 0,31\pm0,26 pg/ml) (Figura 4).
Ejemplo 8 Administración intranasal del vector del virus Sendai mediante inhalación o perfusión
Los vectores del virus se administraron mediante inhalación intranasal como en el Ejemplo 7 o se administraron directamente al epitelio nasal (cornete) mediante perfusión, y se comparó la expresión del gen transfectado. Los ratones se infectaron con SeV-luc (7 x 10^{7} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete), se sacrificaron a las 48 h y se examinó la expresión de luciferasa en el pulmón y en el cornete (n=3). En los ratones infectados por inhalación, se observó una expresión significativa del gen de la luciferasa tanto en pulmones como en el cornete. Por el contrario, en los ratones infectados mediante perfusión, la expresión de luciferasa estaba restringida al cornete y se detectaba con dificultad en los pulmones (Figura 5).
A continuación, se administró SeV-IL10 (7 x 10^{7} ufp/100 \mul y 7 x 10^{8} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete) y después de 48 h, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de IL-10 en los pulmones y en el cornete (n=6). Se detectó una cantidad significativa de IL-10 en los pulmones de los ratones a los que se les había administrado los vectores del virus mediante inhalación. Aunque también se detectó un nivel significativo de expresión en los homogeneizados del cornete de los ratones infectados por perfusión, sólo se detectó un nivel traza de IL-10 en sus homogeneizados de pulmón (Figura 6).
El nivel de IL-10 secretada en el suero se determinó en los ratones anteriores a los que se administró SeV-IL10. SeV-IL10 se administró (7 x 10^{7} ufp/100 \mul y 7 x 10^{8} ufp/100 \mul) mediante inhalación o perfusión en el epitelio nasal (cornete) y después de 48 h, los ratones se sacrificaron y se examinó la expresión de IL-10 en el suero (n=6). Se observó alto nivel de secreción de IL-10 en el suero de los ratones a los que se les administró por inhalación. En el suero de los ratones a los que se administró mediante transfusión, aunque la secreción de IL-10 era menor que en los ratones a los que se les administró por inhalación, se observó aún un nivel significativo de secreción de IL10 (Figura 7). En los ratones control infectados con SeV-luc (7 x 10^{7} ufp/100 \mul), no se observó secreción significativa de IL-10.
Ejemplo 9 Administración intramuscular del vector del virus Sendai en ratones
SeV-\betagal se inyectó en los músculos TA de los ratones y dos días después se examinó el nivel de expresión de \betagal mediante el ensayo de la \beta-galactosidasa. La expresión de \betagal aumentaba de forma dependiente de la dosis (Figura 8). El nivel de expresión (61.672 pg de \betagal/mg de proteína) obtenido por la administración de SeV-\betagal al valor más elevado (3,5 x 10^{8} ufp) era 300 veces y 7 veces mayor que los alcanzados con ADN desnudo y con VAA (VAA de \betagal), respectivamente a sus dosis optimizadas.
Se examinó el tiempo de expresión de \betagal tras la administración de SeV-\betagal. Se inyectaron SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) o SeV-luc control (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) en el músculo TA, los ratones se sacrificaron a tiempos diferentes y se determinó la expresión de \betagal en los homogeneizados del músculo. El resultado mostraba que la expresión del gen transfectado alcanzaba el nivel máximo dos días después de la inyección y, a continuación, descendía hasta el nivel basal, el nivel antes de la inyección, después de 28 días (Figura 9).
Se examinó el nivel de expresión obtenido tras la administración repetitiva del vector del virus Sendai. Cada uno de los músculos TA de los ratones se infectó con SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) y, adicionalmente, se infectó con SeV-luc (3,5 x 10^{7} ufp/músculo) al tiempo indicado. Los ratones se sacrificaron dos días después de la segunda inyección y se examinó la expresión de luciferasa en los homogeneizados del músculo. Se comparó el nivel de luciferasa con la de los ratones con una única inyección de SeV-luc, o con la de los ratones no inyectados con SeV-luc. Mediante inyección repetitiva, disminuía el nivel de expresión, pero aún se observó un aumento significativo del nivel de expresión después de la segunda inyección (Figura 10). También se podía seguir obteniendo un aumento significativo del nivel de expresión mediante inyecciones repetitivas después de 28 días de la inyección inicial (el nivel de expresión disminuyó hasta 1/65 del obtenido mediante una única administración).
Se examinó el aumento de anticuerpos sistémicos anti-SeV inducidos por la administración intramuscular de SeV. Cada músculo TA de los ratones se infectó con SeV-\betagal (3,5 x 10^{7} ufp/músculo), los ratones se sacrificaron a los tiempos indicados y se detectaron los anticuerpos específicos para SeV en el suero. Como se muestra en la Figura 11, se observó claramente una reacción sistémica de anticuerpos dependientes de dosis. Además, se observa inflamación en el TA, que también dependía de la dosis de SeV. La reacción de anticuerpos y la inflamación en TA causada por la administración de SeV podría ser la razón del descenso de la expresión tras la inyección repetitiva.
Ejemplo 10 Administración intramuscular del vector del virus Sendai que expresa IL-10
SeV-IL10 se administró en el músculo TA y se examinó la eficiencia de la secreción de IL-10 (4 x 10^{8} ufp/músculo). Dos días después de la inyección, se prepararon homogeneizados del músculo y se determinó la expresión de IL-10. El resultado se comparó con el obtenido mediante la transfección de ADN plasmídico mediada por liposomas. Además, también se determinó el nivel de IL-10 en el suero.
Se encontró que el nivel de expresión de IL-10 en los homogeneizados del músculo dos días después de la inyección era de uno o dos órdenes de magnitud mayor que el obtenido mediante la inyección del ADN plasmídico (50 \mug de ADN/TA) (SeV-IL10: 1.067\pm32 pg/mg de proteína; plásmido: 50,9\pm11 pg/mg de proteína) (Figura 12). El nivel de IL-10 en el suero aumentó dos días después de la administración de SeV-IL10, mientras que no se detectó IL-10 en el suero de los ratón que había recibido el ADN plasmídico (Figura 13).
En un experimento independiente realizado de forma similar al experimento anterior, el nivel de IL-10 en los homogeneizados del músculo dos días después de la inyección de SeV-IL10 era 160 veces mayor que el obtenido mediante la transfección de ADN plasmídico desnudo que expresaba IL-10 (Figura 14). Por el contrario, en ratones que recibieron VAA que expresaba IL-10 (VAA IL10), no se detectó IL-10 en los homogeneizados del músculo dos días después de la inyección. No se detectó IL-10 en los sueros de los ratones transfectados con el ADN plasmídico o infectados con VAA, mientras que el nivel de IL-10 en los sueros de los ratones inyectados con SeV-IL10 aumentaba hasta 797\pm383 pg/ml dos días después de la inyección (Figura 15). Estos datos indican que SeV recombinante puede transferir genes de forma eficaz mediante su administración intramuscular.
Ejemplo 11 Efecto de la administración de SeV-IL10 en los ratones del modelo de fibrosis pulmonar
Se examinó el efecto de SeV-IL10 en los ratones del modelo con neumonitis y fibrosis inducidas por bleomicina. Se administraron en el músculo TA SeV-IL10, o SeV-\betagal y SeV-luc (cada uno a 7 x 10^{8} ufp/ratón) como controles. Dos días después de la administración intramuscular, se inyecto por vía intratraqueal bleomicina (0,075 u/100 \mul; 0,075 unidades contenidos en 100 \mul de solución salina) o solución salina. Once días después de la inyección de bleomicina, se sacrificaron los ratones y se determinó el depósito de colágeno en el pulmón mediante el ensayo de la hidroxiprolina según el procedimiento descrito (Pettipher E.R., Br. J. Pharmacol., 1993, 110, 423-427) mediante la determinación de la cantidad de 6-hidroxiprolina.
Se encontró que la administración de SeV en sí aumentaba el depósito de colágeno en el tracto respiratorio (Figura 16; comparación de la 1ª (SeV-\betagal + SeV-luc + bleomicina) y la 3ª (bleomicina) columna desde la izquierda). Sin embargo, la administración de SeV-IL10 reducía significativamente el depósito de colágeno (comparación de la 1ª (SeV-\betagal + SeV-luc + bleomicina) y la 2ª (SeV-IL10 + bleomicina) columna desde la izquierda). De este modo, se confirmó que la administración intramuscular de SeV-IL10 tenía efecto terapéutico en la fibrosis pulmonar.
Aplicabilidad industrial
La presente invención permite una expresión a alto nivel de un gen extraño en el sistema cardiovascular. También proporciona una tecnología fundamental para terapia génica frente a una diversidad de enfermedades inflamatorias, incluyendo fibrosis pulmonar que está representada por la fibrosis cística.
<110> DNAVEC Research Inc.
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<120> VECTOR DE PARAMIXOVIRUS PARA TRANSFERENCIA DE GENES AL SISTEMA CARDIOVASCULAR
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<130> D3-A0008P
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<140>
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<141>
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<150> JP 2000-339942
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<151> 08-11-2000
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<160> 8
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia sintetizada artificialmente
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tgggtgaatg agagaatcag c 
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21 
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Claims (5)

1. Uso de un vector de paramixovirus que comprende un Gen extraño que codifica una proteína secretora para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en el que dicho vector de paramixovirus se administra por vía intramuscular.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha proteína secretora es una citoquina antiinflamatoria.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha citoquina antiinflamatoria es la IL-10.
4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho paramixovirus es el virus Sendai.
5. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad inflamatoria es la fibrosis pulmonar.
ES01981031T 2000-11-08 2001-11-08 Vector de paramixovirus para transferencia de genes al sistema cardiovacular. Expired - Lifetime ES2260301T3 (es)

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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6490775B1 (en) * 1999-04-23 2002-12-10 Veri-Tek Inc. Press operation verification system
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
ATE369435T1 (de) 1999-09-06 2007-08-15 Dnavec Research Inc Paramyxoviren, die eine modifizierte transkriptionsstartsequenz umfassen
US7314614B1 (en) 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
KR20070094989A (ko) 2000-03-30 2007-09-27 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 센다이바이러스 벡터를 사용한 ａｉｄｓ 바이러스 백신
WO2001092508A1 (fr) * 2000-06-01 2001-12-06 Dnavec Research Inc. Vecteur de retrovirus de pseudo-type contenant une proteine de membrane possedant une activite d'hemagglutinine
EP1297852A4 (en) * 2000-06-27 2004-12-29 Dnavec Research Inc VIRAL VECTOR FOR THE INTRODUCTION OF GENES IN KIDNEY CELLS (03.02.03)
CA2424992A1 (en) * 2000-10-06 2003-04-04 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors for introducing foreign genes into skeletal muscle
KR100812884B1 (ko) * 2000-11-27 2008-03-11 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용
CA2484287A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Dnavec Research Inc. Pharmaceutical- or gene-carrier compositions with reduced hemagglutinating activity
WO2004022731A1 (ja) * 2002-09-04 2004-03-18 Dnavec Research Inc. シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて製造する方法
JPWO2004038029A1 (ja) * 2002-10-24 2006-02-23 株式会社ディナベック研究所 Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法
EP1642966B1 (en) * 2003-06-30 2010-03-03 Dnavec Research Inc. Minus strand rna viral vectors carrying a gene with altered hypermutable regions
AU2005205441A1 (en) * 2004-01-13 2005-07-28 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumor using minus-strand RNA virus vector encoding immunostimulating cytokine
CN1934257A (zh) * 2004-01-22 2007-03-21 株式会社载体研究所 病毒载体的制备方法
JPWO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2008-02-28 株式会社ディナベック研究所 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
AU2006237903A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dna Vec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating Alzheimer's disease
EP1916298B1 (en) * 2005-06-14 2011-12-28 Dnavec Corporation Methods for producing monoclonal antibodies
US20090162320A1 (en) 2005-10-28 2009-06-25 Dnavec Corporation Gene transfer into airway epithelial stem cell by using lentiviral vector pseudotyped with rna virus or dna virus spike protein
CA2636600A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Dnavec Corporation Novel protein expression system
RU2679889C2 (ru) 2013-04-18 2019-02-14 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
CA2914837A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
WO2015070060A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN106573072A (zh) 2014-06-02 2017-04-19 阿尔莫生物科技股份有限公司 降低血清胆固醇的方法
CN107106655A (zh) 2014-10-22 2017-08-29 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
AU2016312510A1 (en) 2015-08-25 2018-03-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5155214A (en) * 1984-03-05 1992-10-13 The Salk Institute For Biological Studies Basic fibroblast growth factor
JPS6147185A (ja) 1984-08-09 1986-03-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst 日本脳炎ウイルスの精製方法
JPS6147186A (ja) 1984-08-09 1986-03-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst インフルエンザウイルスの精製方法
JPS6147187A (ja) 1984-08-10 1986-03-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst 狂犬病ウイルスの精製方法
US4994559A (en) * 1985-12-17 1991-02-19 Synergen, Inc. Human basic fibroblast growth factor
US5215745A (en) * 1988-04-27 1993-06-01 United Cancer Research Institute Method for treating viral diseases with attenuated virus
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US5827513A (en) * 1990-06-29 1998-10-27 Schering Corporation Methods of treating insulin-dependent diabetes mellitus by administration of IL-10
US5631237A (en) * 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US6562596B1 (en) * 1993-10-06 2003-05-13 Amgen Inc. Tissue inhibitor of metalloproteinase type three (TIMP-3) composition and methods
US5635380A (en) * 1994-01-18 1997-06-03 Vanderbilt University Enhancement of nucleic acid transfer by coupling virus to nucleic acid via lipids
US5639661A (en) * 1994-03-23 1997-06-17 The University Of Iowa Research Foundation Genes and proteins for treating cystic fibrosis
ES2210273T5 (es) * 1994-07-18 2010-03-29 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso.
US5824655A (en) * 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5744304A (en) * 1995-05-30 1998-04-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inflammation-induced expression of a recombinant gene
US6022536A (en) * 1995-08-09 2000-02-08 Schering Corporation Combined use of interleukin 10 and cyclosporin for immunosuppression therapy
US6121246A (en) * 1995-10-20 2000-09-19 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for treating ischemic tissue
EP0864645B9 (en) * 1995-10-31 2006-03-22 Dnavec Research Inc. Negative-strand rna virus vector having autonomously replicating activity
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
EP0884383A4 (en) 1996-02-29 2001-12-05 Takara Shuzo Co METHOD FOR CLEANING AND REMOVING VIRUSES.
US5833651A (en) * 1996-11-08 1998-11-10 Medtronic, Inc. Therapeutic intraluminal stents
DE69739351D1 (de) * 1996-12-16 2009-05-20 Eisai R&D Man Co Ltd DNA-Konstrukt umfassend ein Medikamenten-Resistenzgen und ein fremdes Gen
CA2205076A1 (en) * 1997-05-14 1998-11-14 Jim Hu Episomal expression cassettes for gene therapy
FR2766706B1 (fr) * 1997-07-30 2001-05-25 Biovector Therapeutics Sa Complexes particulaires stables de charge globale neutre ou negative de structure multilamellaire composes par au moins une substance biologiquement active globalement anionique et un constituant cationique, leur preparation et utilisation
US5962274A (en) * 1998-03-13 1999-10-05 Wake Forest University Viral vector directed to predetermined target cells
US6828138B1 (en) * 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
EP1013667B1 (en) * 1998-11-09 2006-10-11 Nippon Biologicals, Inc. Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system
JP2000201689A (ja) * 1998-11-09 2000-07-25 Nippon Bio Capital Limited:Kk センダイウイルス発現系を用いたサイトカインの製造方法
JP2000253876A (ja) * 1999-03-08 2000-09-19 Dnavec Research Inc センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質
EP1179594B1 (en) 1999-05-18 2008-06-25 Dnavec Research Inc. Ribonucleoprotein complex in paramyxovirus
DK1186667T3 (da) 1999-05-18 2007-10-22 Dnavec Research Inc Kappegendeficient virusvektor af Paramyxoviridae
US20030022376A1 (en) * 1999-05-18 2003-01-30 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
EP1067179A1 (en) 1999-07-09 2001-01-10 Pierre Fabre Medicament Method to select attenuated paramyxoviridae useful for vaccines and therapeutics
ATE369435T1 (de) * 1999-09-06 2007-08-15 Dnavec Research Inc Paramyxoviren, die eine modifizierte transkriptionsstartsequenz umfassen
US7314614B1 (en) * 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
US20030170210A1 (en) * 2000-01-19 2003-09-11 Ichiro Masaki Use of paramyxovirus vector in gene transfer into blood vessel
KR20070094989A (ko) * 2000-03-30 2007-09-27 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 센다이바이러스 벡터를 사용한 ａｉｄｓ 바이러스 백신
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
WO2001092508A1 (fr) * 2000-06-01 2001-12-06 Dnavec Research Inc. Vecteur de retrovirus de pseudo-type contenant une proteine de membrane possedant une activite d'hemagglutinine
EP1297852A4 (en) * 2000-06-27 2004-12-29 Dnavec Research Inc VIRAL VECTOR FOR THE INTRODUCTION OF GENES IN KIDNEY CELLS (03.02.03)
CA2424992A1 (en) * 2000-10-06 2003-04-04 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors for introducing foreign genes into skeletal muscle
KR100812884B1 (ko) * 2000-11-27 2008-03-11 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 혈관신생 유전자를 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그 이용
JPWO2004038029A1 (ja) * 2002-10-24 2006-02-23 株式会社ディナベック研究所 Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法
KR20050100379A (ko) * 2003-01-31 2005-10-18 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 리보자임을 코드하는 파라믹소바이러스 벡터 및 그의 이용
EP1642966B1 (en) * 2003-06-30 2010-03-03 Dnavec Research Inc. Minus strand rna viral vectors carrying a gene with altered hypermutable regions
JPWO2005042737A1 (ja) * 2003-11-04 2007-05-10 株式会社ディナベック研究所 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
AU2005205441A1 (en) * 2004-01-13 2005-07-28 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumor using minus-strand RNA virus vector encoding immunostimulating cytokine
JPWO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2008-02-28 株式会社ディナベック研究所 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
AU2006237903A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dna Vec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating Alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002142770A (ja) 2002-05-21
DE60118771D1 (de) 2006-05-24
WO2002038726A3 (en) 2003-03-20
CN1555417A (zh) 2004-12-15
CA2428073A1 (en) 2002-05-16
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KR20030074617A (ko) 2003-09-19
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EP1662003A3 (en) 2006-06-14
US20040101965A1 (en) 2004-05-27
ATE323149T1 (de) 2006-04-15
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DK1334174T3 (da) 2006-06-26
CA2428073C (en) 2012-01-10
EP1662003A2 (en) 2006-05-31
DE60118771T2 (de) 2007-04-12
EP1334174B1 (en) 2006-04-12
EP1334174A2 (en) 2003-08-13
HK1070100A1 (en) 2005-06-10
KR100852078B1 (ko) 2008-08-13

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