CN1555417A - 用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于将基因转移至心血管系统的副粘病毒载体以及该载体的用途。本发明通过利用所述副粘病毒载体，确保能将外源基因产物有效转移至心血管系统中。通过鼻内或肌肉内给药副粘病毒载体而引入的基因的产物可以在血液中以较高水平被检测到。表达抗炎细胞因子IL－10的载体的给药抑制了肺纤维变性模型动物中胶原的肺沉积。因此，本发明的载体适于将基因转移至心血管系统。

Description

用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体
技术领域
本发明涉及用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体。
背景技术
最近，人们针对多种疾病研究了基因治疗。基因治疗是将具有治疗作用的基因外源性导入患者，并使该基因在体内表达的治疗方法。基因治疗所用载体的例子是例如：DNA自身，包含在脂质体中的DNA，或病毒载体。可以直接施用这些载体(体内基因治疗)，或者使用这些载体转化细胞，随后，将细胞导入患者(回体基因治疗)。
例如，可使用基因治疗的疾病包括肺纤维变性，如囊性纤维变性(CF)。CF是导致先天性代谢紊乱的常染色体隐性遗传病。CF多发于白种人，发病率为每2000至2500个儿童中有1例。在CF患者中，由于外分泌的异常，粘液分泌物累积于多个组织，包括肺、呼吸道、胰腺、肝脏和小肠。对于肺部感染特别致命的这些CF患者而言，主要的治疗是通过抗生素来控制肺部感染和进行肺移植。在CF患者的肺中，呼吸道组织被慢性炎症渐进破坏。据认为，在这些组织中，促炎细胞因子和抗炎细胞因子产生之间的平衡已遭破坏。
在上述病例中，进行基因治疗的有效方法是在患病位点施用载体，并局部表达治疗性基因。也可以通过心血管系统将基因产物转移至全身。特别是，当难以局部施用基因治疗的载体，或者如果有可能导致不良副作用时，在整个心血管系统表达治疗基因可能是有效的治疗策略，对于编码在血液中半寿期短的生物活性物质(如细胞因子)的基因而言，更适用于此方法。在本文的上下文中，肌肉被建议为用于生产分泌性蛋白质的适宜的“工厂”，所述蛋白质有望通过血流进行转移，并可在远处的位点起作用。迄今为止，人们最常使用裸露DNA和腺伴随病毒(AAV)来研究对肌肉的基因转染。然而，这些载体未能获得足够的表达水平。因此，需要开发新的载体，该载体应能使转染的基因产物高水平地分泌至心血管系统。
发明内容
本发明的目的是提供用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体及其用途。
最近，人们利用属于副粘病毒科的仙台病毒来开发用于基因转移的载体(Kato A等，EMBO J.，1997，16，578-598；WO97/16538和WO97/16539)。仙台病毒载体毒性低，由转染基因表达的蛋白质的量非常高。另外，由于其载体内的基因不会整合至宿主基因组，因此，仙台病毒载体在安全性上优于其它载体。本发明人认为可以利用重组的仙台病毒(SeV)在心血管系统中有效表达转染的基因产物。本发明人构建了用于表达抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的新的仙台病毒载体(SeV-IL10)，并使用该载体进行研究。
当在体外转染COS7细胞时，在转染后16小时，SeV-IL10以依赖于剂量的形式增加IL-10的分泌。与编码IL-10的质粒经脂质体介导的转染所获得的结果相比，最高滴度的SeV-IL10(24-孔培养板，106pfu/孔)所致的IL-10分泌水平要高两个数量级。因此，本发明人使用SeV-IL10载体进行体内转染实验。
经由鼻内滴液将SeV-IL10局部施用于小鼠呼吸道。两天后，测定分泌至肺组织匀浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-10水平，并与经脂质体介导的质粒DNA转染所得的结果相比较。在肺组织匀浆中，通过施用SeV-IL10所得的IL-10分泌水平比通过质粒转染所得的结果高两个数量级(SeV-IL10：21457±5112pg/mg蛋白质；质粒：310±54pg/mg蛋白质)，而在BALF中，要高三个数量级(SeV-IL10：153366±41823pg/ml；质粒：71±63pg/ml)。进一步检测血液中的IL-10水平。在施用了SeV-IL10的小鼠体内，分泌出显著量的IL-10。
另外，将SeV-IL10注射至生产分泌性蛋白质的适宜位点，即骨骼肌内，并检查效果。将SeV-IL10载体(4×108pfu/肌肉)注射至前胫骨肌，两天后，检查IL-10的表达水平。肌肉组织匀浆中的表达水平比通过质粒DNA注射所得的结果高一至两个数量级(50μg DNA)(SeV-IL10：1067±32pg/mg蛋白质；质粒：50.9±11pg/mg蛋白质)。在通过质粒注射的血清中未检测到IL-10，而在注射SeV-IL10载体两天后，血清IL-10水平显著增加(SeV-IL10：393±132pg/ml；SeV-βgal：0.31±0.26pg/ml)。总之，使用重组SeV对肺和肌肉的基因转移效率很高，这表明SeV载体可在心血管系统中高水平地表达转染基因的产物。本发明的载体可用作多种疾病的基因治疗载体，所述疾病是通过将基因转移至心血管系统即可治愈的疾病。特别是，本发明的载体能将基因治疗应用于CF患者的肺炎。
本发明能通过肌内施用重组SeV有效地转移基因。注射的两天后，转染基因的表达水平达到高水平。该水平显著高于使用质粒DNA或AAV获得的水平。在迫切需求高水平基因表达的临床病症中，由SeV介导的治疗性基因产物的产生十分有效。当难以排除载体自身具有炎性作用的可能性时，与直接在患病位点处给药相比，更为有利的是在远离患病位点的肌肉内施用载体以避免使炎症更加恶化。因此，肌内施用本发明的载体有望能进行更有效的治疗。另外，使用缺乏复制能力的SeV可降低使用可复制的载体时所观察到的炎症反应和抗体反应。
因此，本发明涉及用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体及其用途，更具体地涉及：
(1)用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体，其中所述载体中所含基因的表达产物经由血流被转移至不同于给药位点的位点处；
(2)(1)的载体，其中所述载体含有外源基因；
(3)(2)的载体，其中所述外源基因是细胞因子基因；
(4)(3)的载体，其中所述细胞因子是抗炎细胞因子；
(5)(4)的载体，其中所述抗炎细胞因子是白细胞介素-10(IL-10)；
(6)(4)或(5)的载体，其用于治疗炎性疾病；
(7)(6)的载体，其中所述炎性疾病是肺纤维变性；
(8)(1)至(7)中任一项的载体，其中载体用于鼻内给药；
(9)(1)至(7)中任一项的载体，其中载体用于肌内给药；
(10)(1)至(9)中任一项的载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒；
(11)编码(1)至(10)中任一项的副粘病毒基因组的DNA；
(12)含有(1)至(10)中任一项的副粘病毒载体或含有包含所述载体的细胞的组合物；
(13)将分泌性蛋白质转移至心血管系统的方法，所述方法包括给药含有编码所述蛋白质的外源基因的副粘病毒载体；
(14)(13)的方法，其中所述分泌性蛋白质是抗炎细胞因子；
(15)(14)的方法，其中所述抗炎细胞因子是IL-10；
(16)权利要求(13)至(15)中任一项的方法，其中所述给药是鼻内给药；
(17)(16)的方法，其中所述鼻内给药包括给药于鼻甲；
(18)权利要求(13)至(15)中任一项的方法，其中所述给药是肌内给药；
(19)(13)至(18)中任一项的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒；
(20)通过(13)至(19)中任一项的方法治疗炎性疾病的方法；和
(21)(20)的方法，其中所述炎性疾病是肺纤维变性。
在本文中，“副粘病毒载体”被定义为衍生自副粘病毒，并可用于将基因转移至宿主细胞的载体。本发明的副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染性的病毒颗粒。此处所述的“感染性”被定义为重组副粘病毒载体通过其细胞吸附和膜融合能力，将载体中包含的基因转移至被载体吸附的细胞的能力。在优选的实施方案中，本发明的副粘病毒载体以可表达的方式携带外源基因。副粘病毒载体可具有复制能力，或者也可以是不具备复制能力的缺损载体。此处的“复制能力”被定义为病毒载体在被其感染的宿主细胞中复制并产生感染性病毒颗粒的能力。
在本文中，“重组”副粘病毒载体被定义为通过基因工程构建的副粘病毒载体或其扩增产物。例如，通过重建重组副粘病毒cDNA即可产生重组副粘病毒载体。
在本文中，副粘病毒被定义为副粘病毒科的病毒或其衍生物。本发明可应用于例如副粘病毒科的副粘病毒，如仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴(simian)副流感病毒(SV5)，I，II和III型人副流感病毒。优选本发明的病毒是副粘病毒属的病毒或其衍生物。适用于本发明的副粘病毒属病毒包括人1型副流感病毒(HPIV-1)，人3型副流感病毒(HPIV-3)，牛3型副流感病毒(BPIV-3)，仙台病毒(也称作小鼠1型副流感病毒)，猴10型副流感病毒(SPIV-10)和副粘病毒属的很多其它病毒。最优选本发明的副粘病毒是仙台病毒。这些病毒可以是野生型毒株，突变株，实验室-传代株，人工构建株等等。不完整的病毒，如DI颗粒(Willenbrink W和Neubert W.J，J.Virol，1994，68，8413-8417)，合成的寡核苷酸等也可用作产生本发明的病毒载体所需的材料。
编码副粘病毒蛋白质的基因包括NP，P，M，F，HN和L基因。此处的“NP，P，M，F，HN和L基因”分别表示编码核衣壳蛋白，磷蛋白，基质蛋白，融合蛋白，血凝素-神经氨酸酶和大蛋白的基因。有关每种副粘病毒亚科病毒的基因的一般性描述如下。一般说来，也可将NP基因表示为“N基因”。
副粘病毒属 NP  P/C/VM  F  HN  -  L
风疹病毒属 NP  P/V  M  F  HN (SH)  L
麻疹病毒属 NP  P/C/VM  F  H  -  L
例如，被分类为副粘病毒科呼吸道病毒的仙台病毒的每种基因在核苷酸序列数据库中的登记号为：NP基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056；F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131；和L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。
此处的“基因”被定义为遗传物质，它包括核酸，如RNA和DNA。一般说来，基因可编码蛋白质，或者也可以不编码蛋白质。例如，基因可以编码功能性RNA，如核酶，反义RNA等。基因可具有天然或人工设计的序列。此处的“基因转移”被定义为基因-介导的转移，“向心血管系统转移基因”包括将基因产物转移至该系统中。“分泌性蛋白质”被定义为分泌至细胞外的蛋白质。蛋白质无需具有明显的分泌信号，只要它能分泌至细胞外即可。分泌性蛋白质可以是天然或人工设计的蛋白质。通过添加分泌信号可将所需蛋白质分泌至细胞外。例如，人工设计的蛋白质可以是与另一种蛋白质的融合蛋白，显性失活的蛋白质，包括可溶形式的受体或与膜-结合的显性失活受体，细胞粘附分子的缺失形式和可溶形式的细胞表面分子。在本文中，“DNA”包括单链DNA或双链DNA。
在本文中，细胞因子被定义为除抗体外的所有蛋白质和多肽，它们可从细胞中分泌出来，并表现出生理学功能，例如调节免疫系统，抗肿瘤作用，抗病毒作用或调节细胞分化(Aggarwal B.B.和Pocsik E.，“Cytokines：from clone to clinic，”Arch.Biochem.Biophys.，1992，292(2)，335-359)。淋巴因子和单核因子与细胞因子基本上相同，也包括在本发明的细胞因子中。另外，抗炎细胞因子被定义为能抑制一种或多种从Th1细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞中的任一种中分泌的细胞因子(例如INF-γ、TNF-β、IL-2、IL-1、IL-6、IL-8或TNF-α)合成的细胞因子。细胞因子可以是天然蛋白质或经人工改变的蛋白质。抗炎细胞因子包括IL-10、IL-4和IL-12，但并不局限于此。可通过已知方法制备编码所述细胞因子的基因，所述方法包括例如使用基于它们的核苷酸序列设计的引物进行PCR。最优选本发明的抗炎细胞因子是IL-10。
本发明提供了用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体及其用途。本发明已成功地通过体内施用编码外源基因的副粘病毒载体，在注射位点及血液中都过量表达了转染基因的产物。将通过吸气而鼻内施用于小鼠的用于表达IL-10的仙台病毒载体(SeV-IL10)导入鼻上皮(鼻甲)和肺。注射位点处过量表达基因产物，在血液中也观察到IL-10水平的显著增加。通过灌流施用于鼻上皮(鼻甲)也会导致血液中IL-10水平的显著增加。另外，还在据认为是产生分泌性蛋白质的适宜位点的骨骼肌中施用SeV-IL10，并检查结果。当将SeV-IL10施用于前胫骨(TA)肌时，在注射位点，即肌肉中以及血液中，IL-10的表达水平都显著增加。另外，肌内施用SeV-IL10显著抑制了通过施用博来霉素制备的肺纤维变性模型小鼠肺中的胶原沉积。由此证实了肌内注射SeV-IL10对肺纤维变性的治疗效果。本发明的载体对于将治疗性基因产物转移至整个心血管系统十分有用。例如，有可能通过使用本发明的载体表达抗炎细胞因子，对多种炎性疾病进行基因治疗。也可以利用使用具有抗炎功能之基因的基因治疗载体来缓解炎症和抑制粘液分泌物的积累。
本发明人表明：通过肌内施用重组副粘病毒载体而导入的基因，在注射的两天后，其表达达到峰值水平，并在一周内持续表达。另外，重复给药可增加基因表达。这些特征有利于在使用重组副粘病毒载体进行的基因治疗中获得快速而持久的治疗效果。
在安全性方面，也优选在人基因治疗的临床试验中使用副粘病毒载体。首先，在高效基因转移中，转染的DNA必须被运送至核中才能表达外源基因就是一大阻碍。然而，就仙台病毒而言，外源基因的表达由胞质中的细胞微管蛋白及其RNA聚合酶(L蛋白)来驱动。这说明仙台病毒不与宿主细胞的基因组相互作用，这样就避免了安全性问题，如肿瘤的生成。第二，已知仙台病毒对啮齿类动物而言是致病的，会导致肺炎，但对人却是不致病的，这一点已得到多项研究的支持，这些研究表明鼻内给予野生型仙台病毒不会伤及非人灵长类动物(Hurwitz J.L等，Vaccine，1997，15，533-540)。这些特征暗示仙台病毒载体可用于人类的治疗，另外还支持以下观点：即仙台病毒可以成为旨在将外源基因产物转移至心血管系统的基因治疗中较有前途的替代物之一。
本发明的载体优选用于使用抗炎细胞因子、特异性靶向炎性疾病的基因治疗。用于表达抗炎细胞因子的本发明的副粘病毒载体对于治疗炎性疾病特别有用。换句话说，利用副粘病毒载体导入编码抗炎细胞因子的基因可以抑制炎症和减缓疾病症状。所述疾病包括例如肺纤维变性、致硬化的腹膜炎、前列腺肥大、多发性硬化、移植后排斥、I型糖尿病、慢性关节风湿病、炎性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、虹膜炎、肉芽肿病、慢性肾炎、硬皮病、子宫肌瘤、瘢痕瘤、肝硬化和炎症并发的其它疾病。此处的治疗疾病包括治疗和预防疾病。
用于将基因转移至心血管系统的本发明的副粘病毒载体不局限于任何特定的类型。例如，可以优选使用具有复制能力并能自我增殖的载体。一般说来，野生型副粘病毒的基因组含有短的3’前导区，后面接着6个编码N(核衣壳)，P(磷)，M(基质)，F(融合)，HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白的基因，在另一末端具有短的5’尾随(trailer)区域。通过设计与上述基因组结构类似的基因组，可以获得能自我复制的本发明的载体。另外，通过将外源基因插入上述载体的基因组，可以获得表达外源基因的载体。与野生型病毒相比，本发明副粘病毒载体的病毒基因的排列可以有所改变。
本发明的副粘病毒载体可以缺失野生型病毒所包含的一些基因。例如，在重建仙台病毒载体时，认为由NP，P/C和L基因编码的蛋白质本身是必需的，但这些基因未必是该病毒载体的组分。在一个实施方案中，携有编码上述蛋白质之基因的表达载体可以与另一个编码载体基因组的表达载体共转染至宿主细胞以重建病毒载体。或者，将编码病毒基因组的表达载体转染至携有编码上述蛋白质之基因的宿主细胞中，从而通过使用由宿主细胞提供的蛋白质来重建病毒载体。这些蛋白质的氨基酸序列可以与得自原始病毒的相应序列不同，只要它们在核酸转移中具有相同或更高的活性即可，所述氨基酸序列可以是突变的，或者被另一种病毒的同源基因所编码的氨基酸序列取代。
据认为由M，F和HN基因编码的蛋白质是副粘病毒载体在由细胞到细胞的增殖所必需的。然而，当将载体制备成RNP时，就可以不需要这些蛋白质。如果基因M，F和HN是RNP所含基因组的组分，导入宿主细胞时即会产生这些基因的产物，并产生具有感染性的病毒颗粒。产生感染性病毒的RNP载体包括含有编码N，P，M，F，HN和L基因的病毒基因组RNA并含有N，P和L蛋白的RNP。当将这种RNP导入细胞中时，通过N，P和L蛋白的功能来表达和复制病毒基因组，从而扩增出感染性的病毒载体。
RNP可作为与脂质转染胺，聚阳离子脂质体等形成的复合物被导入细胞。具体地说，可以使用多种转染试剂，例如，DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN  #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Boehringer#1811169)。可以加入氯喹以防止核内体中的降解(Calos M.P，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。就复制型病毒而言，可通过重新-感染至培养的细胞，鸡卵或动物(例如哺乳动物，如小鼠)来扩增或传代所产生的病毒。
形成对照的是，本发明的副粘病毒载体可以是缺乏M，F和/或HN基因的载体。通过外源性地提供缺失的基因产物即可重建这些载体。所述载体仍可象野生型一样粘附于宿主细胞，并诱导细胞融合。然而，不会产生与原始病毒颗粒具有相同感染性的子代病毒颗粒，因为导入细胞的载体基因组缺乏上述的一个基因。因此，这些载体可用作仅能进行一次基因转移的安全的病毒载体。例如，从基因组中缺失的基因可以是F和/或HN基因。通过将编码缺乏F基因的重组副粘病毒基因组的表达质粒，F蛋白表达载体和NP，P/C和L蛋白表达载体共转染至宿主细胞，即可重建病毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。或者，可以使用F基因被整合至染色体的宿主细胞。这些外源性提供的蛋白质的氨基酸序列可以与得自野生型的相应序列不同，也可以是突变的，或者被另一种病毒的同源蛋白质取代，只要它们能提供相同或更高的基因转移活性即可。
本发明副粘病毒载体的包膜蛋白可含有另一种不同于原始载体基因组的包膜蛋白的蛋白质。对这种蛋白质没有限制。它们可包括其它病毒的包膜蛋白，例如水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。因此，本发明的副粘病毒载体包括假型病毒载体，它具有得自不同于原始病毒之病毒的包膜蛋白。
另外，本发明的副粘病毒载体可在其包膜表面含有靶向特定细胞的蛋白质，例如粘附分子，配体和受体，或嵌合蛋白，所述嵌合蛋白在其胞外结构域中具有这些蛋白质而在其胞内结构域中具有衍生自病毒包膜蛋白的多肽。这样就可以产生靶向特定组织的载体。这些蛋白质可由病毒基因组自身来编码，或者在通过表达非病毒基因组的基因(例如，另一种表达载体或宿主细胞染色体)来重建病毒时提供。
可以改变本发明的载体中所含的病毒基因，以降低抗原性或提高RNA转录效率或复制效率。具体地说，可以改变复制因子的基因，即NP，P/C和L基因中的至少一个以增强转录或复制。也可以改变具有血凝素活性和神经氨酸酶活性的结构蛋白，即HN蛋白，以通过削弱前一活性来增强病毒在血液中的稳定性，并通过改变后一活性来调节感染性。也可以改变与膜融合有关的F蛋白以调节融合能力。另外，还可以产生一种副粘病毒载体，通过分析抗原呈递表位和可能存在于细胞表面的抗原分子，如F蛋白和HN蛋白，已将所述载体改造成具有微弱的抗原性。
另外，可将辅助基因缺损的副粘病毒用作本发明的载体。例如，通过剔除SeV的一个辅助基因，即V基因，SeV对诸如小鼠等宿主的致病性显著降低，同时不会损害培养细胞中基因的表达和复制(Kato，A.等，J.Virol.，1997，71，7266-7272；Kato，A.等，EMBO J.，1997，16，578-587；Curran，J.等，WO01/04272，EP1067179)。特别优选将这种减毒的载体用作体内或回体基因转移的病毒载体。
本发明的病毒载体可在其基因组RNA中含有外源基因。通过将外源基因插入上述副粘病毒载体的基因组，可以得到含有外源基因的重组副粘病毒载体。外源基因可以是编码欲在血液中表达的所需蛋白质的基因。它可以编码天然蛋白质，或编码具有缺失，取代或插入的经改变的蛋白质，只要该蛋白质具有与天然蛋白质相同的功能即可。或者，它也可以是人工设计的蛋白质，如显性失活的突变体。例如，为了进行基因治疗，可将用于治疗靶疾病的基因插入编码病毒载体基因组的DNA(病毒载体DNA)。当将外源基因插入仙台病毒载体DNA时，需要将含有6的倍数个核苷酸的序列插入转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间(Calain P和Roux L，J.Virol，1993，67(8)，4822-4830)。可将外源基因插入每个病毒基因(NP，P，M，F，HN和L基因)的上游和/或下游。为了不干扰上游和下游基因的表达，可在外源基因的上游或下游适当插入E-I-S序列(转录终止序列-间插序列-转录起始序列)或其部分，使得E-I-S序列位于每个基因之间。或者，用IRES插入外源基因。
通过连接于基因上游的转录起始序列的类型，可以调节所插入基因的表达水平(WO01/18223)。通过插入的位置和基因周围的序列也可以进行上述调节。例如，在仙台病毒中，插入的位置越靠近病毒基因组负链RNA的3’-末端(越靠近野生型病毒基因组基因排列中的NP基因)，插入基因的表达水平就会越高。为了获得外源基因的高表达，优选将其插入负链基因组的上游区域，例如NP基因的上游(负链上的3’侧翼序列)，或者插入NP和P基因之间。相反，插入的位置越靠近负链RNA的5’-末端(越靠近野生型病毒基因组基因排列中的L基因)，插入基因的表达水平就会越低。为了减少外源基因的表达，可以将其插入负链上最靠5’方向的位置，即野生型病毒基因组中L基因的下游(负链上L基因的5’侧翼区)，或L基因的上游(负链上L基因的3’侧翼区)。因此，可以适当调节外源基因的插入位置，以获得合乎需要的基因表达水平，或尽可能完善插入物与其周围的病毒基因的组合。例如，如果过量表达通过高滴度病毒载体导入的基因会导致毒性，不仅可以控制病毒滴度，也可以通过设计较靠近负链5’-末端的插入位置，或用效率较低的转录起始序列替代原有的转录起始序列来降低各个载体的表达水平，从而获得适当的疗效。
为了有助于容易地插入外源基因，可在插入位置设计克隆位点。例如，克隆位点可以是限制性酶的识别序列。可以使用病毒载体DNA中的限制性位点插入外源基因。克隆位点可以是含有多个限制性酶识别序列的多克隆位点。本发明的载体可在除了用于上述插入的位置以外的位置处具有其它外源基因。所述外源基因不限于此，也可以是其它抗炎细胞因子基因，或者也可以是其它类型的基因。
例如，可根据已被描述的方法(Kato A等，EMBO J.1997，16，578-587；YuD等，Genes Cells，1997，2，457-466)，按下述构建具有外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备含有所需外源基因之cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选该DNA样品经电泳鉴定为单个质粒，浓度为25ng/μl或更高。下列描述是利用NotI位点，将外源基因插入编码病毒基因组的DNA的一个例子。如果目标cDNA核苷酸序列中含有NotI识别位点，优选事先通过使用定点诱变等方法，在维持该cDNA所编码的氨基酸序列不变的同时修饰核苷酸序列，从而除去NotI位点。通过PCR从这种DNA样品中扩增出所需的基因片段，并回收该片段。为了使扩增的DNA片段两端都具有NotI位点，并在一个末端添加单拷贝的仙台病毒转录终止序列(E)，间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)，需将正向合成DNA序列(有义链)和反向合成DNA序列(反义链)制备成引物对，使其含有NotI限制性酶裂解位点序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)、转录起始序列(S)和目标基因的部分序列。
例如，为了确保能用NotI裂解，在正向合成DNA序列的5’方向含有任意两个或多个核苷酸(优选为除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列外的4个核苷酸；更优选为ACTT)，在该序列的3’-方向添加NotI识别位点“gcggccgc”，在更偏3’-方向添加合乎需要的任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔序列，在更偏3’-方向添加等同于ORF的、约为25个核苷酸的序列，该序列包括所需cDNA的起始密码子ATG。优选从所需cDNA选出约25个核苷酸用作正向合成DNA序列，以使其3’-末端的最后一个核苷酸是G或C。
反向合成DNA序列在其5’方向含有任意两个或多个核苷酸(优选为除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列外的4个核苷酸；更优选为ACTT)，在该序列的3’-方向添加NotI识别位点“gcggccgc”，再在其3’-方向添加寡DNA作为插入片段以调节长度。该寡DNA经设计，使得包括NotI识别位点“gcggccgc”，cDNA的互补序列，和在下述病毒中作为起点的仙台病毒基因组EIS核苷酸序列在内的核苷酸总数成为6的倍数(所谓的“6的法则”；Kolakofski D等，J.Virol.，1998，72，891-899；Calain P和Roux L，J.Virol，1993，67，4822-4830)。另外，在插入片段的3’-方向添加仙台病毒S序列的互补序列，优选为5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO：1)，I序列的互补序列，优选为5’-AAG-3’，和E序列的互补序列，优选为5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO：2)。再在其3’-方向选择并添加约25个核苷酸的等效互补序列作为反向合成DNA的3’-末端，该互补序列从所需cDNA序列的终止密码子起反向计数，其长度经调节使最后一个核苷酸为G或C。
PCR根据一般方法进行，例如使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)。优选使用Vent聚合酶(NEB)进行PCR，如此扩增的所需片段用NotI消化，然后插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用测序仪证实所得PCR产物的核苷酸序列，以选择具有正确序列的质粒。使用NotI从质粒上切下插入片段，克隆至携有基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，也可以无需质粒载体pBluescript的介导，直接将该片段插入NotI位点，从而获得重组仙台病毒cDNA。
例如，可根据文献中的方法(Kato A.等，EMBO J.，1997，16，578-598；Hasan M.K.等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820；Yu，D.等，Genes Cells，1997，2，457-466)，构建重组仙台病毒基因组cDNA。例如，将含有NotI位点(5’-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’；SEQ ID NO：3)的18bp间隔序列，插入克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))的前导序列和N蛋白编码序列5’-末端之间的相邻基因座，获得质粒pSeV18+b(+)，该质粒含有得自丁型肝炎病毒反基因组链的可自我裂解的核酶位点(Hasan M.K等，J.General Virol，1997，78，2813-2820)。将外源基因片段插入pSeV18+b(+)的NotI位点，得到一种重组仙台病毒cDNA，其中已插入所需外源基因。
在体外或细胞中转录重组副粘病毒载体DNA，在L，P和NP蛋白的存在下重建RNP以产生含有RNP的病毒载体。本发明提供了产生本发明的副粘病毒载体的方法，所述方法包括转录编码病毒载体基因组的DNA。本发明还提供了用于产生本发明的副粘病毒载体的DNA，所述DNA含有编码病毒载体基因组的DNA。本发明涉及编码载体基因组的DNA用于产生本发明的副粘病毒载体的用途。可根据已知方法(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P等，Virol，1997，235，323-332；Whelan S.P等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J等，EMBO J，1994，13，4195-4203；Radecke F等，EMBO J，1995，14，5773-5784；Lawson N.D等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；Garcin D等，EMBO J，1995，14，6087-6094；Kato A等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D和Barrett T，J.Virol，1997，71，1265-1271；Bridgen A和Elliott R.M，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)，由病毒载体DNA重建病毒。这些方法能由DNA重建所需的副粘病毒载体，包括副流感病毒，水泡性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和仙台病毒载体等。如果病毒载体DNA中缺失F，HN和/或M基因，用这种缺损载体将不会形成感染性的病毒颗粒。然而，可以通过将这些缺失的基因，编码其它的病毒包膜蛋白的基因等分开转移至宿主细胞，并在其中表达它们，来形成感染性的病毒颗粒。
将病毒载体DNA转移至细胞的方法包括如下：1)制备可掺入目标细胞的DNA沉淀物的方法；2)制备含有DNA的带正电复合物的方法，所述复合物适于掺入目标细胞，并且不具有过强细胞毒性，和3)使用电脉冲在目标细胞膜上瞬时打开一个孔的方法，该孔大到足以使DNA分子穿透。
在方法2)中，可以使用多种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法1)的一个例子是使用磷酸钙进行的转染方法，其中，进入细胞的DNA掺入吞噬体，还有足够量的DNA掺入核中(Graham F.L和van Der EB J，Virol，1973，52，456；Wigler M和Silverstein S，Cell，1977，11，223)。Chen和Okayama研究了转移技术的最优化，据他们报道，在以下条件下能获得最佳的DNA沉淀物：1)当在35℃，2至4％CO2中将细胞和DNA保温15至24小时时，2)使用比线状DNA具有更高的沉淀物-形成活性的环状DNA，和3)当沉淀混合物中的最适DNA浓度为20至30μg/ml时(Chen，C和Okayama H，Mol.Cell.Biol，1987，7，2745)。方法2)适于瞬时转染。本领域已知一种更老的方法，其中以所需的DNA浓度比例制备DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885，分子量为5×105)混合物以进行转染。由于大多数复合物在核内体中被降解，可以加入氯喹以提高转染效率(Calos M.P，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。方法3)被称为电穿孔，与方法1)和2)相比，它应用得更广泛，因为它不具有细胞选择性。据认为，在最适的脉冲电流持续时间，脉冲形式，电场强度(电极之间的间距，电压)，缓冲液的电导率，DNA浓度和细胞密度条件下，方法3)是有效的。
在上述三种方法中，转染试剂(方法2)适用于本发明，因为方法2)易于操作，而且便于使用大量细胞检测大量受试样品。优选使用SuperfectTransfection Reagent(QIAGEN，#301305)或DOSPER Liposomal TransfectionReagent(Boehringer Mannheim #1811169)，但转染试剂并不局限于此。
具体地说，由cDNA重建病毒载体的方法如下。
在24孔至6孔塑料板培养或100-mm直径的培养皿中，使用极限必需培养基(MEM)，将得自猴肾的细胞系LLC-MK2培养至70至80％铺满，其中所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100tg/ml链霉素)。然后例如以2pfu/细胞的量，用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3感染细胞，其中已在1μg/ml补骨脂素的存在下，通过20分钟UV照射处理，使所述病毒灭活(Fuerst T.R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126；Kato.A等，Genes Cells，1996，1，569-579)。可以适当调节所加补骨脂素的量和UV照射时间。感染1小时后，使用能表达产生全长仙台病毒基因组所必需的反式作用病毒蛋白质的质粒(24-0.5μg pGEM-N，12-0.25μg pGEM-P和24-0.5μg pGEM-L，更优选为1μg pGEM-N，0.5μgpGEM-P和1μg pGEM-L)(Kato.A等，Genes Cells，1996，1，569-579)以及Superfect(QIAGEN)，通过脂质转染法等，用2至60μg，更优选为3至5μg上述重组仙台病毒cDNA转染细胞。在无血清的MEM中培养经转染的细胞，必要时，MEM含有各为100μg/ml的利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，更优选MEM仅含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，将试剂浓度调节为最适值，使痘苗病毒的细胞毒性最小化而病毒的回收率最大化(Kato.A等，Genes Cells，1996，1，569-579)。转染后，将细胞培养48至72小时，然后收集细胞，通过三轮冷冻-解冻裂解细胞。将细胞裂解物转染至LLC-MK2细胞并进行培养。培养细胞3至7天后，收集培养溶液。为了重建缺乏编码包膜蛋白之基因的不能复制的病毒载体，可将此载体转染至表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞，或将此载体与包膜蛋白的表达质粒共转染至所述细胞。或者，在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞上覆盖和培养经转染的细胞，以增殖缺失型病毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。通过测定血凝素活性(HA)来检测培养物上清液中所含的病毒滴度，可通过“终点-稀释法”测定HA(Kato.A等，Genes Cells，1996，1，569-579；Yonemitsu Y和Kaneda Y，Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascularcells.，Molecular Biology of Vascular Diseases.Methods in Molecular Medicine，BakerA.H编，Humana出版社，1999，295-306)。为了消除可能会出现的痘苗病毒vTF7-3污染，可以适当地稀释所得的尿囊样品(例如稀释106倍)，并在鸡卵中进行再扩增。可将再扩增重复例如3次或更多次。将所得的病毒原种储存于-80℃。
对于用于病毒重建的宿主细胞类型没有特别的限制，只要能在细胞中重建病毒载体即可。例如，可以使用培养细胞，例如得自猴肾的CV-1细胞和LLC-MK2细胞，得自仓鼠肾的BHK细胞和得自人的细胞等。为了得到大量仙台病毒载体，可用得自上述宿主细胞的病毒载体感染鸡胚，籍此扩增载体。已经开发出使用鸡卵制备病毒液的方法(Nakanishi，等(编)，1993，“Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III(High TechnologyProtocol III of Neuroscience Research)，Molecular Neurocyte Physiology，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体地说，例如，在37至38℃的温箱中将受精卵孵育9至12天以长成胚胎。将仙台病毒载体接种于鸡卵的绒毛尿囊腔中，再将鸡卵培养几天以增殖病毒。诸如培养时间之类的条件可根据所用重组仙台病毒的类型而变化。然后，回收含有病毒的尿囊溶液。根据标准方法(Tashiro M，Protocols in virus experiments，Nagai和Ishihama编，MEDICAL VIEW，1995，68-73)，进行仙台病毒载体的分离和纯化。
例如，可按下述构建和制备缺乏F蛋白的仙台病毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。
(1)构建缺乏F基因的仙台病毒基因组cDNA和F基因表达质粒
用SphI和KpnI消化全长仙台病毒(SeV)基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan M.K等，J.General Virol，1997，78，2813-2820)(pSeV18+b(+)也被称为pSeV18+)，回收所得片段(14673bp)，将其克隆至pUC18，得到pUC18/KS。使用pUC18/KS构建缺乏F基因的区域。通过联合使用PCR和连接反应来缺失F基因，在所得的缺失F基因的SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)中，F基因的ORF(1698bp，从ATG到TGA)被序列5’-atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：4)所取代。使用引物(正向：5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO：5；反向：5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO：6)获得的PCR产物，和使用引物(正向：5’-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO：7；反向：5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO：8)获得的PCR产物用EcoT22I消化，并将它们分别克隆至F基因的上游和下游。用SacI和SalI消化所得质粒，回收含有F基因缺失位点的片段(4931bp)，将其克隆至pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化pUC18/dFSS，用pSeV18+中含有F基因的DraIII片段取代回收的片段，连接后获得pSeV18+/ΔF。
可将外源基因插入pUC18/dFSS的F基因缺失位点中的NsiI或NgoMIV位点。为此，可使用以NsiI结尾的引物或以NgoMIV结尾的引物扩增含有外源基因的片段。
(2)制备诱导型表达SeV-F蛋白的辅助细胞
按下述构建仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒。通过PCR扩增SeV-F基因，将其克隆至pCALNdLw质粒(Arai等，J.Virol，1998，72，1115-1121)唯一的SwaI位点，获得pCALNdLw/F，其中pCALNdLw质粒被设计用于通过Cre DNA重组酶的功能诱导型表达基因产物。
为了从缺失F基因的基因组中回收感染性病毒颗粒，建立了表达SeV-F蛋白的辅助细胞系。可以使用得自猴肾，并常用于SeV增殖的LLC-MK2细胞。于37℃，5％CO2中，在含有10％热-灭活并已固定的胎牛血清(FBS)，50U/ml青霉素G钠和50μg/ml链霉素的MEM中培养LLC-MK2细胞。由于SeV-F基因产物具有细胞毒性，将该基因克隆至pCALNdLw，其中克隆基因的表达可以被Cre DNA重组酶诱导。根据标准方法，通过磷酸钙法(哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))，使用上述pCALNdLw/F转染LLC-MK2细胞。
LLC-MK2细胞在10-cm板上生长至40％铺满，用10μg pCALNdLw/F转染，于37℃，5％CO2中，在10ml含有10％FBS的MEM中培养24小时。然后，分散细胞，重新悬浮于10ml培养基中，涂布于5个10-cm平皿上，其中1个平皿上涂布5ml，2个平皿上各涂布2ml，2个平皿上各涂布0.2ml细胞悬浮液。在10ml含有10％FBS加1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的MEM中培养细胞14天，每两天换一次培养基，选择稳定的转染子。使用克隆环回收在培养基中生长的，对G418具有抗性的细胞。在10-cm平皿中进一步培养每个克隆的细胞，直至它们长成100％铺满。
为了诱导F蛋白表达，在6cm平皿中使细胞长成100％铺满，根据Saito等的方法(Saito等，Nucleic Acids Res，1995，23，3816-3821；Arai T等，J.Virol，1998，72，1115-1121)，以moi＝3的AxCANCre腺病毒感染细胞。
(3)重建和增殖缺失F基因的SeV病毒
按下述将其中已插入外源基因的pSeV18+/ΔF转染至LLC-MK2细胞。将细胞以5×106个细胞/皿的密度铺于100-mm平皿上，培养24小时，然后在室温下用经补骨脂素和长UV(365nm)处理20分钟的，表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(Fuerst T.R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126)(moi＝2至3；优选moi＝2)感染1小时。用装有5个15瓦灯泡的UV Stratakinker 2400(目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)进行UV暴露。将细胞洗3次，然后分别以12μg/皿，4μg/皿，2μg/皿和4μg/皿的比例，用OptiMEM(GIBCO)重新悬浮质粒pSeV18+/ΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P和pGEM/L(Kato A等，Genes Cells，1996，1，569-579)，并与SuperFect转染试剂混合(1μg DNA用5μl SuperFect(QIAGEN))。室温下保温混合物10分钟，然后用3ml含有终浓度为3％的FBS的OptiMEM重新悬浮，并加入细胞中。在温箱中培养3小时之后，用无血清MEM洗涤细胞2次，再在含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM中培养细胞70小时。然后收集细胞，以107个细胞/ml的密度将细胞重新悬浮于OptiMEM中。将细胞冷冻-解冻3次，然后与脂质转染试剂DOSPER(Boehringer mannheim)混合(106个细胞/25μl DOSPER)，室温下保温15分钟，转染至按上述选择的表达F基因的辅助细胞克隆之一的LLC-MK2/F7细胞(12-孔板，106个细胞/孔)。在含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中培养细胞，收集培养物上清液。
在制备缺失病毒载体时，将两种从病毒基因组中缺失了不同包膜基因的载体转染至相同的细胞。在这种情况下，一种载体中缺失的包膜蛋白需通过另一载体的表达来提供，从而相互互补，籍此形成感染性病毒颗粒，并激活复制循环以扩增病毒载体。即当用两种或多种载体联合接种细胞，以互补彼此的包膜蛋白时，可以低成本大规模地生产分部缺失不同包膜基因的病毒载体混合物。由于缺乏包膜基因，这些病毒与完整的病毒相比具有较小的基因组，因而能插入长的外源基因。另外，由于这些原本无感染性的病毒在细胞外已被稀释，因此难以维持其共-感染的状态，它们是已被消毒的，这有利于控制它们向环境的释放。
如果将特定疾病的治疗基因用作外源基因来制备载体，可通过施用该载体进行基因治疗。通过直接施用或间接施用(回体)，本发明的病毒载体能表达有助于治愈疾病的外源基因，患者体内缺乏或量不足的内源性基因等。对外源基因没有限制，它可包括编码适宜分泌至心血管系统的分泌性蛋白质的基因。实例如多种细胞因子、激素、生长因子等体液因子。优选将抗炎细胞因子基因用作外源基因以治疗炎性疾病。
可以纯化回收的副粘病毒以使其基本上是纯的。通过包括过滤、离心、柱层析纯化等的已知纯化和分离方法或其组合可以进行纯化。本文所用术语“基本上纯的”指的是：病毒在包含其的样品中为占主要比例的组分。一般说来，通过证实得自病毒的蛋白质与样品中所含总蛋白质的比例为50％或更高，优选为70％或更高，更优选为80％或更高，甚至更优选为90％或更高时，即可检测到基本上纯的病毒载体。具体地说，可通过例如使用以硫酸纤维素酯或交联多糖硫酸酯进行的方法(已审公开的日本专利申请(JP-B)No.Sho 62-30752；JP-B Sho 62-33879；JP-B Sho 62-30753)，使用对含岩藻糖硫酸酯的多糖和/或其分解产物进行吸附的方法(WO97/32010)等，对副粘病毒进行纯化。
本发明的副粘病毒载体可与合乎需要的药物可接受载体一起被制成组合物。在本文中，“药物可接受载体”的定义是：可与载体一起施用，但不会抑制载体介导的基因转移的物质。例如，可用盐水，磷酸缓冲盐溶液(PBS)等适当稀释副粘病毒载体以制备组合物。如果本发明的副粘病毒载体是在鸡卵中增殖，组合物可含有尿囊液。含有本发明的副粘病毒载体的组合物可含有生理学可接受的介质，例如去离子水，5％葡萄糖水溶液之类，另外，组合物还可含有其它稳定剂和抗生素。本发明的组合物可用作药物组合物。因此，本发明还涉及载体或上述组合物用作药物的用途。
具体地说，本发明的组合物包括：
(1)用于向心血管系统转移基因的组合物，其含有本发明的副粘病毒载体，或含有所述载体的细胞，其中所述载体的基因产物通过血流被导入不同于注射位点的位点处；
(2)(1)中的用于向心血管系统转移基因的组合物，其中所述载体含有外源基因；
(3)(2)中的组合物，其中所述外源基因是细胞因子基因；
(4)(3)中的组合物，其中所述细胞因子是抗炎细胞因子；
(5)(4)中的组合物，其中所述抗炎细胞因子是IL-10；
(6)(4)或(5)中的组合物，其用于治疗炎性疾病；
(7)(6)中的组合物，其中所述炎性疾病是肺纤维变性；
(8)(1)至(7)中任一项的组合物，其为鼻内给药；
(9)(1)至(7)中任一项的组合物，其为肌内给药；和
(10)(1)至(9)中任一项的组合物，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
施用上述副粘病毒载体，或含有所述载体的组合物以转导载体中携有的外源基因。本发明提供了以下内容：
(1)经由血流将基因的表达产物转移至不同于给药位点的位点处的方法，所述方法包括施用含有所述基因的副粘病毒载体，或含有所述载体的细胞；
(2)(1)中的方法，其中所述基因是外源基因；
(3)(2)中的方法，其中所述外源基因是细胞因子基因；
(4)(3)中的方法，其中所述细胞因子是抗炎细胞因子；
(5)(4)中的方法，其中所述抗炎细胞因子是IL-10；
(6)(4)或(5)中的方法，其用于治疗炎性疾病；
(7)(6)中的方法，其中所述炎性疾病是肺纤维变性；
(8)(1)至(7)中任一项的方法，其为鼻内给药；
(9)(1)至(7)中任一项的方法，其为肌内给药；和
(10)(1)至(9)中任一项的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
对给药位点没有限制，其可包括鼻内给药(IN)(包括通过吸入和通过导管)，肺内给药，或肌内给药(IM)。可以体内或回体施用载体至单个位点或多个位点。另外，可以单次或多次施用载体。
对通过本发明的副粘病毒载体转移的基因没有限制，只要它编码分泌性蛋白质即可，但其可以是编码多种细胞因子或激素的基因。这些蛋白质可包括它们各自家族的成员以及同种型。副粘病毒载体对于在整个心血管系统表达在血液中具有短半寿期的生物活性物质(如细胞因子)的治疗性基因特别有用。天然细胞因子在心血管系统中的半寿期一般很短。例如，天然IL-10仅在给药后头30分钟内有效(Gerard等，J.Exp.Med.，1993，177(2)，547)。使用本发明的副粘病毒载体能够持续地给血液长期提供半寿期短的生物活性物质，包括细胞因子。
特别地，细胞因子具有宽泛的与细胞增殖和分化相关的功能。例如，IL-1具有多种功能，包括激活T细胞，表达IL-2受体，诱导细胞因子基因和其它基因，调节细胞增殖和调节激素分泌。IL-1刺激细胞生长和分化因子从骨髓和淋巴细胞系中释放。另外，IL-1诱导骨髓中的多能性祖细胞增殖，并促进血细胞生成。它可有效用于癌症治疗。另外，IL-1参与血管生成和激活成纤维细胞，也可用于创伤愈合。
IL-2参与激活T-、NK-和LAK细胞，促进特定类型的细胞生长，增强免疫球蛋白和IFN-γ的产生，诱导单核细胞产生IL-6等。IL-2可有效用于治疗肿瘤和免疫缺陷疾病，或在骨髓移植后激活NK细胞。IL-3参与肥大细胞增殖，由造血祖细胞产生血细胞等。它与其它细胞因子(例如IL-6)协同作用以调节多种血细胞的分化。IL-3可有效用于治疗例如再生障碍性贫血。
IL-4参与增加静息B细胞中MHC II类基因的表达，使活化的T细胞增殖，和促进效应细胞的功能。IL-4还参与增殖肥大细胞，促进胸腺中细胞的成熟，增殖血细胞等。在IL-1的存在下，IL-4能增强巨噬细胞的抗原呈递和吞噬作用。IL-4参与骨髓移植后的细胞和体液免疫系统的功能性重建，治愈IgM增加型免疫缺陷疾病，诱导急性淋巴母细胞白血病的终末分化，抑制实体肿瘤和B细胞淋巴瘤的生长，通过抑制IL-1、TNF和IL-6等的产生抑制炎症。另外，IL-4有望用于治疗T细胞依赖型自身免疫病，如自身免疫性糖尿病和变应性脑脊髓炎，以及其它与T细胞依赖型免疫功能有关的疾病(Rapoport等，J.Exp.Med.，1993，178，87-99；Racke等，J.Exp.Med.，1994，180，1961)。
IL-5能有效刺激IgA产生并促进嗜酸性白细胞生长，已知它可用于治疗血吸虫病(Sanderson，“International Conference on the Clinical Impact ofInterleukins”at the Royal College of Pysicians in London，1989 April)和肿瘤(Kolb等，Br.J.Cancer，1979，40，410；Pretlow等，Cancer Res.，1983，43，2997；Iwasaki等，Cancer，1986，58，1321)。另外，据报道，IL-6具有多种功能，包括诱导或抑制多种细胞的增殖。IL-7诱导特定类型的B细胞和T细胞增殖。IL-9参与红细胞分化，T细胞存活，由B淋巴细胞产生免疫球蛋白，和刺激肥大细胞产生IL-6。
IL-10由活化的Th2细胞，B细胞，角质形成细胞，单核细胞和巨噬细胞产生(Moore等，Annu.Rev.Immunol.，1993，11，165)。IL-10能有效刺激B细胞的增殖和分化。另外，IL-10抑制Th1-细胞，NK-细胞，单核细胞和巨噬细胞产生细胞因子(如IFN-γ，TNF-β和IL-2)(Fiorentino等，J.Exp.Med.，1989，170，2081-2095；Fiorentino等，J.Immunol.，1991，146，3444；Hsu等，Int.Immunol.，1992，4，563；D’Andrea等，J.Exp.Med.，1993，178，1041；de WaalMalefyt等，J.Exp.Med.，1991，174，915；Fiorentino等，Int.Immunol.，1991，147，3815)。因此，IL-10可通过抑制Th1-细胞反应，有效预防移植后排斥，以及T-细胞介导的自身免疫病，如I型糖尿病和多发性硬化。IL-10抑制促炎细胞因子(如IL-1，IL-6，IL-8和TNF-α)的分泌。因此，IL-10可用于治疗炎性疾病，包括类风湿性关节炎和牛皮癣。由于IL-10能抑制肿瘤坏死因子的分泌，并能抑制脓毒性休克，因此可用于治疗脓毒症。IL-10也可用于抑制因血吸虫和肝纤维变性导致的肉芽肿形成。干扰素-α和β具有针对乳头瘤病毒，肝炎病毒，疱疹病毒等的抗病毒作用，可用于治疗多毛细胞白血病，骨髓瘤和造血器官的其它肿瘤。
为了将上述细胞因子转移至心血管系统，可适当使用表达这些细胞因子的本发明的副粘病毒载体。在一个合乎需要的实施方案中，副粘病毒载体含有编码抗炎细胞因子的基因。抗炎细胞因子可包括例如IL-10，IL-4和IL-12。表达抗炎细胞因子的本发明的副粘病毒载体可以是有用的抗炎药物。
本发明的载体可应用于多种疾病的基因治疗。所述基因治疗包括治疗炎症并发疾病，包括肺纤维变性、致硬化的腹膜炎、前列腺肥大、多发性硬化、移植后排斥、I型糖尿病、类风湿性关节炎、炎性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、虹膜炎、肉芽肿病、慢性肾炎、硬皮病、子宫肌瘤、瘢痕瘤、肝硬化和其它炎症并发疾病。所述载体也可用于产生多种疾病的动物模型，还可用于开发或评价治疗这些疾病模型的方法。
例如，优选将本发明的载体用于肺纤维变性的基因治疗。肺纤维变性是伴有肺部纤维变性的疾病，包括慢性间质肺炎，其中该病的病因在很多情况下是不清楚的，但该病伴随有由慢性感染性疾病或异常的自身免疫系统所致的肺纤维变性。具体地说，该病包括肺炎和囊性纤维变性(CF)。
可以以充足的剂量施用本发明的副粘病毒载体，使得有效剂量的载体能被转移至靶组织的细胞。在本文中，“有效剂量”的定义是：能将基因导入靶组织的细胞，至少部分地导致所需治疗效果或预防效果的剂量。施用有效剂量的，含有所需基因的副粘病毒载体能使被转染的细胞产生基因产物。优选地，给予有效剂量的、含有所需基因的副粘病毒载体可以在给药组织或血液中检测到显著水平的转染基因表达。“显著水平”被定义为转染基因的表达(转录物或翻译产物的量)可被检测到的水平。例如，如果存在转染基因的内源性对应物，转染基因的最高水平必需显著高于内源性基因的表达水平。在给药位点或血液中，转染基因的表达相对于内源性基因的表达水平可以为约1.2倍或更高，优选约1.5倍或更高，更优选约2倍或更高，更优选约10倍或更高，最优选约20倍。然而，必须通过考虑其有效水平和毒性水平来测定转染基因的表达水平。
通过本领域技术人员已知的测定法即可测定转染至细胞中的基因的表达水平。通过Northern杂交，RT-PCR，RNA保护试验等可以测定和定量转录物。通过Northern杂交，RT-PCR等进行的检测可在原位进行。为了检测翻译的产物，可使用抗体采用Western印迹，免疫沉淀，RIA，ELISA，pulldown试验等。为了容易地检测转染基因的产物，可标记欲表达的蛋白质，或在载体中包含报道基因。报道基因可以是编码β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因，但并不局限于此。
根据疾病，体重，年龄，性别，症状，给药目的，所导入的基因等的不同，给药所用的载体剂量也有所不同，但本领域技术人员可以适当地确定该剂量。优选与药物可接受的载体一起施用病毒载体，载体剂量的优选范围约为105pfu/ml至1011pfu/ml，更优选约为107pfu/ml至109pfu/ml，最优选约为1×108pfu/ml至5×108pfu/ml。含有副粘病毒载体的组合物的接受者包括所有哺乳动物，如人，猴，小鼠，大鼠，兔，绵羊，牛，狗等。
附图说明
图1显示了24孔培养板中被SeV-IL10-转染的COS7细胞内的依赖于剂量的IL-10表达。以所示剂量用SeV-IL10感染COS7细胞，16小时之后，测定分泌至培养基中的IL-10浓度。用表达IL-10的质粒DNA转染细胞以作为对照。每组n＝6。
图2显示了鼻内给予SeV-IL10的小鼠肺中的IL-10表达。通过吸入鼻内给予SeV-IL10(6.8×107pfu/100μl)。给药2天后，处死小鼠，定量肺组织匀浆中的IL-10表达水平。给予IL-10表达质粒的对照小鼠中的IL-10表达为310±54pg/mg蛋白质(平均值±SEM)。
图3显示了IL-10分泌至小鼠的BALF中，所述小鼠鼻内给予了SeV-IL10。通过吸入而鼻内给予SeV-IL10(6.8×107pfu/100μl)。给药2天后，处死小鼠，测定BALF中的IL-10表达水平。给予IL-10表达质粒的对照小鼠中的IL-10表达为71±63pg/ml(平均值±SEM)。
图4显示了IL-10分泌至小鼠的血液中，所述小鼠鼻内给予了SeV-IL10。通过吸入而鼻内给予SeV-IL10(6.8×107pfu/100μl)。给药2天后，处死小鼠，测定血清中的IL-10水平。
图5显示了通过经吸入或灌流给予仙台病毒载体，鼻甲和肺中转染基因的表达。通过吸入或灌流给鼻上皮(鼻甲)来施用SeV-luc(7×107pfu/100μl)，48小时之后，处死小鼠，测定肺和鼻甲中萤光素酶的表达(n＝3)。
图6显示了通过经吸入或灌流给予SeV-IL10，鼻甲和肺中IL-10的表达。通过吸入或灌流给鼻上皮(鼻甲)来施用SeV-IL10(7×107pfu/100μl和7×108pfu/100μl)，48小时之后，处死小鼠，测定肺和鼻甲中IL-10的表达(n＝6)。
图7显示了通过经吸入或灌流给予SeV-IL10，血液中IL-10的分泌情况。通过吸入或灌流给鼻上皮(鼻甲)来施用SeV-IL10(7×107pfu/100μl和7×108pfu/100μl)，48小时之后，处死小鼠，测定血清中的IL-10水平(n＝6)。
图8显示了将SeV-βgal注射至前胫骨(TA)肌之后，β-半乳糖苷酶的依赖于剂量的表达。将剂量渐增的SeV-βgal，或表达β-半乳糖苷酶报道基因的质粒DNA或AAV注射至小鼠的每块TA肌，或者不进行注射(UT)。病毒剂量和DNA的量表示注射至每块TA的量。注射两天后，处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中β-半乳糖苷酶的表达水平。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6至12。与注射DNA和AAV的组相比，**p＜0.01。
图9显示了将SeV-βgal注射至前胫骨(TA)肌之后，β-半乳糖苷酶表达的时间进程。将SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)或用作对照的SeV-萤光素酶(3.5×107pfu/块肌肉)注射至小鼠的每块TA肌。注射后，在所示的时间点处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中β-半乳糖苷酶的表达水平。注射两天后，处死用对照病毒注射的小鼠。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6。与注射后4天的值相比，*p＜0.05。
图10显示了将仙台病毒载体重复注射至肌肉中的效果。将SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)注射至小鼠的每块TA肌，随后，在所示的时间点用SeV-萤光素酶(3.5×107pfu/块肌肉)注射小鼠。第二次注射的两天后，处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中萤光素酶的表达。将每只小鼠的萤光素酶表达水平与仅接受一次SeV-萤光素酶注射的小鼠或未经注射的小鼠相比较。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6至10。与未经处理的小鼠的值相比，*p＜0.05。
图11显示了肌内注射仙台病毒载体之后，全身性抗-SeV抗体存在的检测结果。将SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)注射至小鼠的每块TA肌。注射之后，在所示的时间点处死小鼠，检测血清中特异于SeV的抗体的存在。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6。
图12显示了肌内注射SeV-IL10之后，肌肉中的IL-10表达。以所示剂量将SeV-IL10注射至小鼠的每块TA肌。注射的两天后，处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中的IL-10水平。注射表达IL-10的质粒DNA(pCI-IL10)或SeV-βgal以用作对照。
图13显示了肌肉注射SeV-IL10之后，血液中的IL-10分泌情况。以所示剂量将SeV-IL10注射至小鼠的每块TA肌。注射的两天后，测定血清中的IL-10水平。注射表达IL-10的质粒DNA(pCI-IL10)或SeV-βgal以用作对照。用表达IL-10的质粒DNA注射的小鼠血清中的IL-10水平低于检测限。(n＝4至6)
图14显示了肌内注射SeV-IL10之后，肌肉中IL-10的过量表达。将SeV-IL10(3.5×107或3.5×108pfu/块肌肉)，或表达IL-10的质粒DNA或AAV(IL-10AAV)注射至小鼠的每块TA肌。同时检测未经处理的小鼠。注射的两天后，处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中的IL-10水平。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6。与所有其它组相比，*p＜0.05。
图15显示了肌内注射SeV-IL10之后，血液中IL-10的分泌情况。将SeV-IL10(3.5×107或3.5×108pfu/块肌肉)，或表达IL-10的质粒DNA或AAV(IL-10AAV)注射至小鼠的每块TA肌。同时检测未经处理的小鼠。注射的两天后，处死小鼠，测定血清中的IL-10水平。数据被表示为平均值±SEM。每组n＝6。与所有其它组相比，*p＜0.05。
图16显示了肺纤维变性模型小鼠中，肌内注射SeV-IL10的效果。用SeV-IL10注射小鼠的每块TA肌，或者用表达萤光素酶的SeV和表达β-半乳糖苷酶的SeV注射小鼠的每块TA肌以用作对照(各为7×108pfu/每只小鼠)。注射两天后，给小鼠气管内注射博来霉素(0.075U/100μl)或盐水。注射博来霉素的11天后，处死小鼠，通过羟脯氨酸试验检测肺中的胶原沉积。每组n＝15至21。与注射SeV-萤光素酶/β-gal的对照组相比，*p＜0.05。
实施本发明的最佳模式
下文将参照实施例详细阐述本发明，但本发明并不局限于此。本文所提及的所有参考文献都列入本文作为参考。
实施例1：体内施用仙台病毒载体
根据Kato A等，EMBO J.，1997，16，578-587和Yu D等，Genes Cells，1997，2，457-466中所述的方法，构建具有复制能力、并含有编码IL-10，β-半乳糖苷酶或萤光素酶的基因的重组仙台病毒载体(分别为SeV-IL10，SeV-βgal和SeV-萤光素酶)。在鸡卵中增殖载体，将含有病毒的尿囊液作为含有本发明的重组仙台病毒载体的组合物储存于-80℃备用。
在实施例中，按下述施用仙台病毒载体。
1.鼻内给药
通过吸入metophane麻醉小鼠，经吸入施用载体。除非另有说明，将总体积为100μl，剂量为7×106至7×108pfu的SeV-IL10或对照病毒SeV-βgal接种于小鼠的鼻部，并以大丸剂的形式在10至20秒内吸入。该方法导致病毒沉积于肺和鼻中。
2.灌流
用hipnom/hipnoval麻醉小鼠。除非另有说明，在10分钟内经细导管将总体积为100μl，剂量为7×107或7×108pfu的SeV-IL10或对照病毒SeV-βgal选择性地直接接种于鼻上皮(鼻甲)。在该过程中，小鼠保持头朝下的反向体位。因此，过量的病毒会从鼻中滴下来。该方法导致病毒主要在鼻中沉积，到达肺的病毒很少。
3.肌内给药
除非另有说明，将7×107或7×108pfu SeV-IL10或对照SeV-βgal注射至C57BL/6小鼠的两块前胫骨(TA)肌(每块肌肉50μl，n＝6至11)。在使用SeV-βgal(7×104至7×108pfu/只动物)进行的预实验中观察到依赖于剂量的反应。
实施例2.制备组织裂解液，血清和支气管-肺泡灌洗液(BALF)
给予病毒48小时之后处死小鼠。按下述制备组织裂解液，血清和BALF。
1.组织裂解液
切下TA肌，肺和鼻甲，在300μl0.25M Tris-HCl(pH8)溶液中匀浆。通过三轮冷冻-解冻以裂解细胞。以14,000rpm离心样品10分钟，将上清液储存于-80℃供随后的分析。通过经改良的Folin-Lowry蛋白质测定法测定每个样品中的蛋白质浓度。
2.血清
从心脏采集血样，37℃保温2小时以诱使血块形成。然后以4,000rpm离心样品10分钟，将所得血清转移至新管中，储存于-80℃供随后的分析。
3.BALF
将小鼠气管暴露，插入导管。将其肺用0.5ml PBS灌洗3次。收集BALF，在4,000rpm离心5分钟，于-80℃冻存备用。
实施例3：白细胞介素-10(IL-10)ELISA
使用购自R&D的试剂盒，根据厂商说明进行人IL-10的ELISA。使组织裂解液中IL-10的量统一为蛋白质浓度，数据被计算为每毫克胞质蛋白质中IL-10的皮克量。
实施例4：报道基因试验
使用购自Promega的试剂盒，根据厂商说明进行萤光素酶试验。使用购自Clontech的试剂盒，根据厂商说明进行β-半乳糖苷酶试验。使用组织裂解液进行这些试验，将数据统一为蛋白质浓度。
实施例5：统计学分析
所有数据被表示为平均值±标准误差(SEM)。通过Mann-Whitney检验分析方差，p＜0.05的数据被认为是有意义的。
实施例6：将表达IL-10的仙台病毒载体转染至COS7细胞
用不同剂量(104至106pfu/孔，24孔培养板)的SeV-IL10转染COS7细胞。转染的16小时后，检测培养物上清液中分泌的IL-10的量。(通过脂质转染法)瞬时转染IL-10表达质粒(pCI-IL10)(80μg/ml，100μl)，将IL-10表达与用SeV-IL10获得的结果相比。将SeV-βgal用作对照。
在用SeV-IL10转染的细胞中，所分泌的IL-10的量以依赖于剂量的形式增加(图1)。与经脂质转染法用编码IL-10的质粒转染的细胞所获得的结果相比，被最高滴度的SeV-IL10(106pfu/孔)感染的细胞所分泌的IL-10的量要高两个数量级(SeV-IL10：333±47 ng/ml/mg蛋白质；质粒：6.8±1.4ng/ml/mg蛋白质)。
实施例7：通过吸入方式给小鼠鼻内施用仙台病毒载体
经由鼻内滴注给小鼠呼吸道局部施用病毒载体(6.7×107pfu/100μl)之后，在转染的两天后，测定肺组织匀浆和BALF中IL-10的分泌，并与用质粒DNA经脂质体介导转染之后的IL-10分泌情况相比较。测定血清中IL-10的浓度。
在肺组织匀浆中，分泌的IL-10的量比通过质粒转染获得的结果高两个数量级(SeV-IL10：21457±5112pg/mg蛋白质；质粒：310±54pg/mg蛋白质)(图2)。另外，在BALF中，感染两天后所分泌的IL-10的量比通过质粒转染获得的结果高三个数量级(SeV-IL10：153366±41823pg/ml；质粒：71±63pg/ml)(图3)。给药两天后，与被对照病毒感染的小鼠相比，被SeV-IL10感染的小鼠血清中的IL-10水平显著较高(SeV-IL10：393±132pg/ml；SeV-βgal：0.31±0.26pg/ml)(图4)。
实施例8：通过吸入或灌流方式鼻内施用仙台病毒载体
如实施例7所述，通过鼻内滴注(吸入)方式施用病毒载体，或通过灌流方式将病毒载体直接施用于鼻上皮(鼻甲)，比较转染基因的表达。通过吸入或灌流方式用SeV-luc(7×107pfu/100μl)感染小鼠鼻上皮(鼻甲)，48小时后处死小鼠，测定肺和鼻甲中的萤光素酶表达(n＝3)。在经吸入而被感染的小鼠中，在肺和鼻甲中都观察到显著的萤光素酶基因表达。与之形成对照的是，在经灌流而被感染的小鼠中，萤光素酶的表达仅限于鼻甲中，在肺中几乎检测不到(图5)。
接着，通过吸入或灌流将SeV-IL10(7×107pfu/100μl和7×108pfu/100μl)施用于小鼠鼻上皮(鼻甲)，48小时后处死小鼠，测定肺和鼻甲中的IL-10表达(n＝6)。在经吸入施用病毒载体的小鼠肺中，检测到显著量的IL-10。尽管在经灌流而被感染的小鼠的鼻甲组织匀浆中也能检测到显著表达，但在其肺组织匀浆中仅能检测到痕量水平的IL-10表达(图6)。
检测上述施用SeV-IL10的小鼠的血清中分泌的IL-10水平。通过吸入或灌流将SeV-IL10(7×107pfu/100μl和7×108pfu/100μl)施用于小鼠鼻上皮(鼻甲)，48小时后处死小鼠，测定血清中的IL-10表达(n＝6)。在经吸入施用病毒载体的小鼠血清中，观察到高水平的IL-10分泌。在经灌流施用病毒载体的小鼠的血清中，尽管IL-10的分泌量低于经吸入施用病毒载体的小鼠的相应量，但仍能观察到显著的IL-10分泌水平(图7)。在被SeV-luc(7×107pfu/100μl)感染的对照小鼠中，没有显著的IL-10分泌。
实施例9：给小鼠肌内施用仙台病毒载体
将SeV-βgal注射至小鼠的TA肌，两天后通过β-半乳糖苷酶试验测定βgal的表达水平。βgal的表达以依赖于剂量的形式增加(图8)。通过施用最高滴度的SeV-βgal(3.5×108pfu)所获得的表达水平(61,672pg βgal/mg蛋白质)，比用最佳剂量的裸露DNA和AAV(βgal AAV)获得的结果分别要高300倍和7倍。
检测施用SeV-βgal之后，βgal表达的时间进程。将SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)或对照SeV-luc(3.5×107pfu/块肌肉)注射至TA肌，在不同的时间处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中的βgal表达。结果表明：在注射的两天后，转染基因的表达达到最高水平，然后在28天后降低至基础水平，即注射前的水平(图9)。
检测通过重复施用仙台病毒载体所获得的表达水平。用SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)感染小鼠的每块TA肌，再在所示的时间点用SeV-luc(3.5×107pfu/块肌肉)进行感染。第二次注射的两天后，处死小鼠，测定肌肉组织匀浆中萤光素酶的表达。将萤光素酶水平与仅接受一次SeV-luc注射的小鼠或未经SeV-luc注射的小鼠相比较。通过重复注射，表达水平有所降低，但在第二次注射后，仍能观察到表达水平的显著增加(图10)。在最初注射的28天后进行重复注射，仍可获得表达水平的显著增加(表达水平降低至单次给药所得结果的1/65)。
检测肌内施用SeV导致的全身性抗-SeV抗体的增加。用SeV-βgal(3.5×107pfu/块肌肉)感染小鼠的每块TA肌，在所示时间点处死小鼠，检测血清中的SeV-特异性抗体。如图11所示，已在全身清楚观察到依赖于剂量的抗体反应。另外，还观察到TA中的炎症，它也取决于SeV的剂量。施用SeV导致的抗体反应和TA中的炎症可能是重复注射后表达降低的原因。
实施例10：肌内施用表达IL-10的仙台病毒载体
将SeV-IL10施用于TA肌，检测IL-10的分泌效率(4×108pfu/块肌肉)。注射的两天后，制备肌肉组织匀浆，测定IL-10的表达。将结果与脂质体介导的质粒DNA转染所得结果相比较。另外，测定血清中的IL-10水平。
我们发现：注射两天后，与通过质粒DNA注射(50μg DNA/TA)所得结果相比，肌肉组织匀浆中的IL-10表达水平要高一或两个数量级(SeV-IL10：1067±32pg/mg蛋白质；质粒：50.9±11pg/mg蛋白质)(图12)。施用SeV-IL10两天后，血清中的IL-10水平增加，而在施用质粒DNA的小鼠血清中，未检测到IL-10(图13)。
在与上述实验类似进行的另一实验中，注射SeV-IL10两天后，肌肉组织匀浆中的IL-10水平比通过转染表达IL-10的裸露质粒DNA所得的结果要高160倍(图14)。与之形成对照的是，在施用表达IL-10的AAV(IL-10 AAV)的小鼠中，注射两天后在肌肉组织匀浆中未检测到IL-10。在用质粒DNA转染或用AAV感染的小鼠的血清中都未检测到IL-10，而用SeV-IL10感染的小鼠在注射两天后，血清中的IL-10水平增加至797±383pg/ml(图15)。这些数据表明重组SeV可通过其肌内给药有效地转移基因。
实施例11：在肺纤维变性模型小鼠中施用SeV-IL10的效果
检查用博来霉素诱导肺炎和纤维变性的模型小鼠中SeV-IL10的效应。将SeV-IL10，或作为对照的SeV-βgal和SeV-luc(每种7×108pfu/小鼠)给药TA小鼠。肌肉内给药的2天后，气管内注射博来霉素(0.075u/100μl；0.075个单位，包含在100μl盐水中)或盐水。注射博来霉素的11天后，将小鼠处死，按照文献(Pettipher E.R.，Br.J.Pharmacol.，1993，110，423-427)所述通过用羟脯氨酸试验测定6-羟脯氨酸的量而确定肺内胶原的沉积。
试验发现，给药SeV本身能增加呼吸道中胶原的沉积(图16；与从左开始数的第1栏(SeV-βgal+SeV-luc+博来霉素)和第3栏(博来霉素)相比)。但给药SeV-IL10显著减少胶原沉积(与从左开始数的第1栏(SeV-βgal+SeV-luc+博来霉素)和第2栏(SeV-IL10+博来霉素)相比)。故此证实，肌肉内给药SeV-IL10对肺纤维变性具有治疗效应。
工业实用性
本发明使得能在心血管系统中高水平表达外源基因。本发明还提供了针对多种表现为囊性纤维变性的炎症疾病包括肺纤维变性进行基因治疗的基本技术。
                              序列表
<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)
<120>用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体
<130>D3-A0008P
<140>
<141>
<150>JP 2000-339942
<151>2000-11-08
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>1
ctttcaccct                                                        10
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>2
tttttcttac tacgg                                                  15
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>3
cggccgcaga tcttcacg                                               18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的序列
<400>4
atgcatgccg gcagatga                                               l8
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>5
gttgagtact gcaagagc                                               18
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>6
tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc                    42
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>7
atgcatgccg gcagatga                                               18
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列
<400>8
tgggtgaatg agagaatcag c                                           21

Claims (21)

1.用于向心血管系统转移基因的副粘病毒载体，其中所述载体中所含基因的表达产物经由血流被转移至不同于给药位点的位点处。
2.权利要求1的载体，其中所述载体含有外源基因。
3.权利要求2的载体，其中所述外源基因是细胞因子基因。
4.权利要求3的载体，其中所述细胞因子是抗炎细胞因子。
5.权利要求4的载体，其中所述抗炎细胞因子是白细胞介素-10(IL-10)。
6.权利要求4或5的载体，其用于治疗炎性疾病。
7.权利要求6的载体，其中所述炎性疾病是肺纤维变性。
8.权利要求1-7中任一项的载体，其中载体用于鼻内给药。
9.权利要求1-7中任一项的载体，其中载体用于肌内给药。
10.权利要求1-9中任一项的载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
11.编码权利要求1-10中任一项的副粘病毒基因组的DNA。
12.一种组合物，其含有权利要求1-10中任一项的副粘病毒载体或一种细胞，该细胞含有所述载体。
13.将分泌性蛋白质转移至心血管系统的方法，所述方法包括给药含有编码所述蛋白质的外源基因的副粘病毒载体。
14.权利要求13的方法，其中所述分泌性蛋白质是抗炎细胞因子。
15.权利要求14的方法，其中所述抗炎细胞因子是IL-10。
16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述给药是鼻内给药。
17.权利要求16的方法，其中所述鼻内给药包括给药于鼻甲。
18.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述给药是肌内给药。
19.权利要求13-18中任一项的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
20.通过权利要求13-19中任一项的方法治疗炎性疾病的方法。
21.权利要求20的方法，其中所述炎性疾病是肺纤维变性。
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