CN1196780C - Rna病毒拯救的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生命名为单链负义RNA病毒目(Mononegaviral)的无节段、负义、单链RNA病毒的改良方法，包括关于产生减毒和/或传染病毒的这些病毒，如麻疹病毒(MV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的方法的实施例。用于产生单链负义病毒目的重组病毒的一种方法包含(a)在至少一个宿主细胞中，进行拯救组合物的转染，该组合物中包含在能充分允许载体共表达和产生重组病毒条件下的宿主细胞中；(i)一个含有分离的核酸分子的转录载体，该核酸分子中含有编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一个表达载体，该表达载体含有编码衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一种以上的分离的核酸分子；(b)在能充分增加重组病毒挽救的条件下，加热转染的拯救组合物至有效热休克温度；和可任选的，(c)收集得到的重组病毒。

Description

RNA病毒拯救的方法
                         发明领域
本发明涉及产生命名为单链负义病毒目(Mononegavirales)的无节段、负义单链RNA病毒的改良方法。优选例涉及产生作为减毒和/或感染性病毒，如麻疹病毒(MV)，呼吸道合胞病毒(RSV)和人副流感病毒(PIV)的这些病毒的方法。可从cDNA克隆中制备重组病毒，因此可获得基因组中具有确定改变的病毒。
                         发明背景
有包膜、负义单链RNA病毒是独特组成和表达的。负义单链病毒的基因组RNA对核衣壳起着两种模板作用：作为信使RNA(mRNA)的合成模板和作为反基因组(+)链的合成模板。负义单链RNA病毒编码和包装其自身的RNA依赖性RNA聚合酶。信使RNA只是在病毒进入感染细胞的细胞质后方才合成。病毒复制在mRNA合成后发生，而且需要病毒蛋白质的不断合成。新合成的反基因组(+)链作为产生(-)链基因组RNA其余拷贝的模板。
聚合酶复合物通过结合基因组3’末端的顺式激活信号，特别是启动子区促使并实现转录和复制。然后病毒基因从基因组模板从其3’到其5’末端单向转录。相对于其上游的邻居(即核蛋白基因(N))，从下游基因得到的mRNA总是较少(如聚合酶基因(L))。因此，根据基因相对于基因组3’末端的位置，总是存在mRNA丰度梯度。
由于裸露的基因组RNA或从转染质粒胞内产生的RNA是非感染性的(Boyer和Haenni，1994)，证明对这些无节段RNA病毒的分子遗传学分析直到最近都是困难的。通过允许分离重组无节段、负链RNA病毒(Pattnaik等，1992；Schnell，Mebatsion，和Conzelmann，1994)的巧妙cDNA拯救技术的发展，已克服了这个技术问题。拯救这些不同负链病毒的技术遵循一个共同主题，各具成功拯救必需的可鉴别成分(Baron和Barrett，1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；Hoffman和Banerjee，1997；Lawson等，1995；Radecke等，1995；Schneider等，1997；He等，1997；Schnell，Mebatsion和Conzelmann，1994；Whelan等，1995)。基因组cDNA质粒转染后，通过噬菌体T7 RNA聚合酶与能切割RNA形成3’末端的载体编码的核酶序列联合作用，产生了基因组RNA的精确拷贝。由共转染表达质粒提供的病毒蛋白包装并复制该RNA。就麻疹病毒(MV)拯救系统而言(Radecke等，1995)，制备了表达T7 RNA聚合酶和MV蛋白N(核衣壳蛋白)和P(磷蛋白聚合酶亚基)的稳定细胞系。因此，MV拯救可通过共转染该细胞系和含有合适定位的T7聚合酶启动子的MV基因组cDNA克隆，以及含有MV聚合酶基因(L)的表达质粒来实现。
成功的麻疹病毒cDNA拯救显然需要在转染后发生许多分子活动，包括：1)T7RNA聚合酶对基因组RNA的准确、全长合成和核酶序列对3’末端的加工；2)以适于引发复制的水平合成病毒N、P和L蛋白；3)基因组RNA从头包装入转录活性和有复制能力的核衣壳结构中；和4)新形成的核衣壳以足够使复制进展的水平表达病毒基因。尚未精确确定哪个步骤是成功拯救的限速步骤，但拯救的效率可能通过刺激上述任一步骤来改进。
本发明寻求改进挽救所需重组RNA病毒，如MV的能力。己提出通过拯救获得病毒复制的能力可能减弱，因为编码所需病毒的天然基因组和反基因组的多核苷酸的变化正在增加。因此，本发明试图克服这种障碍，因为这些方法能大大提高通过拯救程序获得所需重组病毒的可能性。
                         发明简述
本发明提供了一种产生单链负义病毒目的重组病毒的方法，包括：(a)在至少一个宿主细胞中，进行拯救组合物的转染，该组合物中包含在能充分允许这些载体共表达和产生重组病毒条件下的宿主细胞中；(i)一个含有分离的核酸分子的转录载体，该核酸分子中含有编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一个表达载体，该表达载体含有编码衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一种以上的分离的核酸分子；(b)在能充分增加重组病毒挽救的条件下，加热转染的拯救组合物至有效热休克温度；和可任选的，(c)收获得到的重组病毒。
一种涉及产生重组单链负义病毒目的额外方法，包括：a)在至少一个宿主细胞中，进行拯救组合物的转染，该组合物中包含，在能充分允许载体共表达和产生重组病毒条件下的宿主细胞中；(i)一个含分离的核酸分子的转录载体，该分子编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组，和(ii)至少一个表达载体，该载体含有至少一个分离的核酸分子，该分子含有一条编码衣壳包装、转录和复制所需的反式作用蛋白的多核苷酸序列；b)将该转染的拯救组合物转移到至少一层Vero细胞上；和可任选的，收获重组病毒。
本发明的另一方面涉及联合上述方法的非重叠步骤，以及优选例，来建立进一步改进的方法。
在另一个实施例中，本发明提供一种产生减毒、感染性或两者都有的单链负义病毒目RNA病毒的方法。附加的实施例涉及本发明方法所产生的病毒，和含有这些病毒的疫苗。注意，这些病毒可以是人或非人的，如小鼠或牛的。
在本文中详细讨论的上文指出的实施例和附加实施例，代表了本发明的目的。
                         附图简述
图1描述了改良拯救程序的流程图。该程序包括使用热休克步骤和将转染的细胞转移到单层Vero细胞上。
图2是通过使用CAT试验显示热休克对实施例4的小复制子基因表达的影响的放射性自显影图。
图3是显示实施例5的小复制子RNA转染实验的CAT试验结果的放射性自显影图。
图4A是用对一表位标记(在实施例6涉及hsp70刺激小复制子基因表达的实验中由CMV表达载体表达)的特异性抗体的蛋白质印迹。
图4B是放射性自显影图，显示2933-46细胞和hsp70表达载体，小复制子DNA和L表达质粒共转染得到的CAT试验结果。
图5是表格(表1)，描述了6个独立拯救实验(用来测试实施例2描述的热休克的效果)的噬斑计数。清楚显示了热休克程序的优点。
图6是含实施例10的T7基因-1的质粒pGK16.2的图。
                         发明详述
如上简述，本发明涉及产生重组RNA病毒的一种新颖方法。本领域的这些方法称为“拯救”或反向遗传学方法。在下列参考出版物中公开了示范性的用于不同的无节段、负链病毒的拯救方法：Baron和Barrett，1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；He等，1997；Hoffman和Banerjee，1997；Lawson等，1995；Radecke和Billeter，1997；Radecke等，1995；Schneider等，1997；Schnell，Mebatsion，和Conzelmann，1994；Whelan等，1995。关于拯救的其它出版物包括已出版的国际专利申请WO 97/06270，关于MV和其它副粘病毒亚族病毒，和关于RSV拯救，已出版国际专利申请WO 97/12032；这些出版物纳入本文作参考。
基因组cDNA质粒转染后，由噬菌体T7 RNA聚合酶与能切割RNA形成3’末端的载体编码的核酶序列联合作用，产生了基因组RNA的精确拷贝。由共转染表达质粒初步提供的病毒蛋白包装并复制该RNA。就麻疹病毒(MV)拯救系统而言(Radecke等，1995)，制备了表达T7 RNA聚合酶和MV蛋白N(核衣壳蛋白)和P(磷蛋白)的稳定细胞系。因此，MV拯救可通过共转染该细胞系和含有合适定位的T7聚合酶启动子的MV基因组cDNA克隆，以及含有MV聚合酶基因(L)的表达质粒来实现。
公开了对于麻疹病毒的最初几种拯救方法之一。麻疹病毒(MV)是副粘病毒科麻疹病毒属的成员，而且与该科所有成员一样，MV是一种含有无节段、负义RNA基因组的有包膜病毒(Lamb和Kolakofsky，1996)。由于裸露的基因组RNA或从转染质粒胞内产生的RNA是非感染性的(Boyer和Haenni，1994)，表明对这些无节段RNA病毒的分子遗传学分析直到最近都是困难的。通过允许分离重组无节段、负链RNA病毒(Pattnaik等，1992；Schnell，Mebatsion，和Conzelmann，1994)的巧妙cDNA拯救技术的发展，已克服了这个技术问题。
本文中的这些拯救方法的基本步骤和组合物的简要概述进一步描述如下：
通过多聚体蛋白对核糖核蛋白核心(核衣壳)的酶促作用实现了负义、单链RNA病毒基因组的转录和复制。裸露的基因组RNA不能作为模板。但是，这些基因组序列仅当它们完全被N蛋白包装入核衣壳结构时，才被识别。仅在这一点上，基因组和反基因组末端启动子序列才被识别而引发转录或复制途径。所有副粘病毒都需要三个病毒蛋白N、P和L，来进行聚合酶途径。肺病毒包括RSV，也需要转录延伸因子，M2，来充分进行转录途径。附加的辅因子也起作用，可能包括病毒编码的NS1和NS2蛋白，以及可能包括宿主细胞编码的蛋白质。
简单说，所有单链负义病毒目的拯救方法可总结如下：每个都需要与所需病毒基因组等价的、置于合适的DNA依赖性RNA聚合酶启动子(如T7 RNA聚合酶启动子)和自身切割核酶序列(如丁型肝炎核酶)之间的克隆的DNA，将其插入合适的转录载体(如可增殖细菌质粒)中。该转录载体提供易于操纵的DNA模板，使RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)能从该模板如实转录出具有精确或接近精确的5’和3’末端的病毒反基因组(或基因组)的单链RNA拷贝。病毒基因组DNA拷贝的方向和侧翼启动子以及核酶序列决定了转录反基因组还是基因组RNA的等价物。新病毒子代拯救还需要将裸露的单链病毒反基因组或基因组RNA转录物包装入功能性核衣壳模板时所需的病毒特异性反式作用蛋白：病毒核衣壳(N或NP)蛋白，聚合酶结合的磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。这些蛋白包含活性病毒RNA依赖性RNA聚合酶，它必须与该核衣壳模板结合来实施转录和复制。选来用于拯救的某些病毒可能需要额外蛋白质，如转录延伸因子。
因此，在各方法中将使用拯救组合物。这些组合物是本领域熟知的。下列描述不限于本发明的方法中可使用的拯救组合物。拯救组合物包含：在充分允许载体共表达和重组病毒产生的条件下的宿主细胞中(i)一个含有分离的核酸分子(其含有编码单链负义病毒目的无节段、负义、单链RNA病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列)的转录载体，和(ii)至少一个表达载体，该载体含有至少一个分离的核酸分子(它编码衣壳包装、转录和复制所需的反式作用蛋白)。
分离的核酸分子包含一个编码至少一条单链负义病毒目的无节段、负义、单链RNA病毒的基因组或反基因组的序列。基于病毒分类学国际委员会1993年修订的重分类，已建立了一个被称为单链负义病毒目的目。该目含有三个具有负极性(负义)的单链、无节段RNA基因组包膜病毒科。这些科是副粘病毒科、弹状病毒科和纤丝病毒科。副粘病毒科进一步分成两个亚科，副粘病毒和肺病毒。副粘病毒亚科含有三个属，呼吸道病毒属(以前称为副粘病毒属)，雅司病毒属(Rubulavirus)和麻疹病毒属。肺病毒亚科含有肺病毒属。
新分类根据形态学标准，病毒基因组的组成，生物学活性和基因和基因产物的序列相关性。副粘病毒亚科的包膜病毒中的形态学区别特征是核衣壳的大小和形状(直径18纳米，长1微米，螺距5.5纳米)，具有左手螺旋对称。生物学标准是：1)属成员之间的抗原交叉反应性，和2)呼吸道病毒属、雅司病毒属中存在神经氨酸酶活性，麻疹病毒属中不存在。另外，考虑到P基因编码能力的变化，如在雅司病毒中存在一个额外基因(SH)。
肺病毒可从形态学上与副粘病毒科相区别，因为它们含有狭窄的核衣壳。另外，肺病毒在编码蛋白的顺反子数目中有重要区别(肺病毒中10个，而副粘病毒科中6个)，以及与副粘病毒科的非常不同的是只有一个附着蛋白(G)。虽然副粘病毒和肺病毒具有6个看似功能相应的蛋白(N、P、M、G/H/HN、F和L)，只有最后的两个蛋白在这两个亚科之间显示出显著的序列相关性。几个肺病毒蛋白质缺乏大多数副粘病毒中的配对部分，即非结构蛋白NS1和NS2，小疏水蛋白SH，和第二蛋白M2。一些副粘病毒蛋白，即C和V，在肺病毒中缺少配对物。然而，肺病毒和副粘病毒的基本基因组组成是相同的。对于弹状病毒和纤丝病毒来说也是相同的。表1代表了这些病毒现在的分类学分类，以及每个属的例子。
                        表1
          单链负义病毒目的无节段、负义、单链RNA病毒分类
副粘病毒科(Familv Paramyxoviridae)
副粘病毒亚科(Subfamily Paramyxoviridae)
呼吸道病毒属(Genus Rispirovirus)(以前称为副粘病毒属)
仙台病毒Sendai virus(鼠副流感病毒I型mouse parainfluenza virus type1)
人副流感病毒(PIV)1和3型Human parainfluenza virus type 1 and 3
牛副流感病毒(BPV)3型Bovine parainfluenza virus type 3
雅司病毒属Genus Rubulavirus
猴病毒5(SV5)Simian virus 5(犬副流感病毒2型Canine parainfluenzavirus type 2)
腮腺炎病毒Mumps virus
新城疫病毒Newcatle disease virus(NDV)(禽副粘病毒lavianParomyxovirus 1)
人副流感病毒Human parainfluenza virus(PIV 2、4a和4b型)
麻疹病毒属Genus Morbillivirus
麻疹病毒(MV)Measles virus
海豚麻疹病毒Dolphin Morbillivirus
犬瘟病毒(CDV)Canine distemper virus
Peste-des petits-ruminants病毒
猪瘟病毒Phocine distemper virus
牛瘟病毒Rinderpest virus
肺病毒亚科Subfamily Pneumovirinae
肺病毒属Genus Pneumovirus
人呼吸道合胞病毒(RSV)Human respiratory syncytical virus
牛呼吸道合胞病毒Bovine respiratory syncytial virus
小鼠肺病毒Pneumonia virus of mice
火鸡鼻气管炎病毒Turkey rhinotracheitis virus
弹状病毒科Family Rhabdoviridae
狂犬病毒属Genus Lyssavirus
狂犬病毒Rabies virus
水泡病毒属Genus Vesiculovirus
水泡性口炎病毒(VSV)Vesicular stomatitis virus
三日病毒属Genus Ephemerovirus
牛三日热病毒Bovine ephemeral fever virus
纤丝病毒科Family Filoviridae
纤丝病毒属Genus Filovirus
马堡病毒Marburg virus
如上所述，分离的核酸分子包含编码至少一条单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的序列。分离的核酸分子可包含编码基因组、反基因组或其修饰形式的多核苷酸序列。在一个实施例中，多核苷酸编码可操作性连接的启动子，所需基因组或反基因组和转录终止子。
在本发明的一个优选例中，该多核苷酸编码通过核苷酸插入、重排、缺失或取代从野生型RNA病毒修饰而得的基因组或反基因组。已提出通过拯救获得病毒复制的能力可能减弱，因为编码所需病毒的天然基因组和反基因组的多核苷酸的变化正在增加。在这种情况下，本发明特别有价值，因为这些方法能大大提高通过拯救程序获得所需重组病毒的可能性。基因组或反基因组序列可能衍生自人或非人病毒。多核苷酸序列还可编码两个或多个来源的基因组或反基因组重组性结合形成的嵌合基因组。例如，将RSV A组的一个或多个基因插入到RSV B组的相应基因位置中；或将牛PIV(BPIV)、PIV-1或PIV-2的一个或多个基因插入到PIV-3的相应基因位置中；或RSV可以代替PIV的基因等。在额外的实施例中，该多核苷酸编码单链负义病毒目的人、牛、或小鼠RNA病毒的基因组或反基因组。由于本发明方法形成的重组病毒可用作诊断性研究的工具或治疗性或预防性疫苗，所以该多核苷酸还可编码所选RNA病毒的野生型或减毒形式。在许多实施例中，该多核苷酸编码RNA病毒的减毒、感染性形式。在具体优选例中，该多核苷酸编码在3’基因组启动子区有至少一个减毒突变，和在RNA聚合酶基因中有至少一个减毒突变的单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组，如出版的国际专利申请WO 98/13501描述的，此专利纳入本文以供参考。
产生重组病毒的各种需要可能不同。因此，可选择来自任一具体科的一种以上病毒：副粘病毒科、弹状病毒科或纤丝病毒科。
除了编码上述所需基因组和反基因组的修饰形式的多核苷酸序列外，该多核苷酸序列还可编码所需的基因组或反基因组，以及一种或多种异源基因。异源基因可按需要变化，由所需重组病毒的应用而定，异源基因可编码辅因子、细胞因子(如白细胞介素)，T-辅助性表位、限制性标记、佐剂、或不同微生物病原体(如病毒、细菌或真菌)的蛋白，尤其是能诱导保护性免疫应答的蛋白。也可用异源基因来提供用于基因治疗的药剂。在优选例中，异源基因编码的细胞因子，如白细胞介素-12，被选来改进重组病毒的预防性或治疗性特性。
鉴于目前对改进的疫苗和提高治疗病毒病原体可行性的需求，该分离的核酸分子包含编码选自CDV、VSV、MV、RSV、PIV、腮腺炎病毒和狂犬病毒的RNA病毒。在这组RNA病毒中的进一步优选是选自MV、RSV、PIV和BPV。
对于使用减毒病毒的实施例，本领域对这些病毒的多种形式，以及引入减毒突变来产生修饰病毒的基本方法是熟知的。使用常规方法，如当病毒在细胞培养中生长时，加入化学诱变剂来进行化学诱变，然后选择亚适温度下传代的病毒来选择温度敏感型和/或冷适应型突变体，鉴定在细胞培养物中产生小噬斑的突变病毒，在异源宿主中传代，来选择宿主范围突变体。引入减毒突变的另一种方法包括用定点诱变产生预定的突变体。可引入一个或多个突变。然后筛选这些病毒在动物模型中生物活性的减弱。对减毒病毒进行核苷酸测序来对减毒突变的位点进行定位。
进行拯救所需的各种反式作用蛋白在本领域中是熟知的。麻疹病毒拯救所需的反式作用蛋白是衣壳包装蛋白N，和聚合酶复合物蛋白P和L。对于PIV-3，衣壳包装蛋白称为NP，而聚合酶复合物蛋白也称为P和L。对于RSV，病毒特异性反式作用蛋白包括N、P和L，加上一个额外的蛋白M2，RSV编码的转录延伸因子。
可从一种或多种编码所需蛋白的表达载体(如质粒)产生病毒反式作用蛋白，虽然在经基因工程改造，作为稳定转化子，含有并表达这些病毒特异性基因和基因产物的所选宿主细胞中可产生一些或全部所需的反式作用蛋白。
对表达载体和编码衣壳包装、转录和复制必需的反式作用蛋白的分离核酸分子的选择，可以根据所需病毒的选择而变化。制备了表达载体，用来在宿主细胞中与转录载体一起共表达，并在选定的条件下产生重组病毒。
用于拯救的典型(虽然不是必需唯一的)环境包括：合适的哺乳动物细胞环境，其中存在T7，来驱动含病毒基因组cDNA的转录载体的反基因组(或基因组)单链RNA转录。共转录或其后不久，核衣壳蛋白将病毒反基因组(或基因组)RNA转录物衣壳包装入功能性模板中，与同时由编码所需病毒特异性反式作用蛋白的共转染表达质粒产生的所需聚合酶组分结合。这些事件和过程导致病毒mRNA的首先必要的转录，新基因组的复制和扩增，从而产生新病毒子代，即拯救。
对于狂犬病毒、VSV、SV5和仙台病毒的拯救，重组痘苗病毒VTF7-3提供了T7聚合酶。然而，该系统要求将拯救系统从痘病毒中通过物理或生物化学方法，或通过在痘病毒非良好宿主的细胞或组织中重复传代来分离出来。对于MV cDNA拯救，通过建立表达T7聚合酶和病毒N和P蛋白的细胞系可避免该要求。通过将基因组表达载体和L基因表达载体转染入辅助细胞系来实现拯救。优选的，辅助细胞系在哺乳动物细胞中几乎不或不产生子代病毒，并可被利用来拯救所需RNA病毒或病毒。辅助细胞可用作T7聚合酶的来源，如MVA/T7(如下所述)。同时表达了必需的衣壳包装蛋白后，病毒聚合酶蛋白包装、复制并转录合成的全长反基因组病毒RNA，而复制的基因组被包装入感染性病毒。除了这些反基因组，现在也已成功拯救了仙台病毒和PIV-3的基因组类似物(Kato等，和出版的国际专利申请WO 98/53708)。
如上所述，MVA/T7(痘苗病毒的减毒突变体)是可用来拯救RNA病毒的改良辅助病毒。一般，改良辅助病毒是从野生型病毒改变而来，在非允许细胞中显示减弱的，或无病毒活性的病毒。MVA的特征确定了改良辅助病毒中优选的特征。痘病毒的MVA株向更多致细胞病变株提供了引人注目的另一种选择。在土耳其和德国的天花根除计划中，通过在鸡胚成纤维细胞中系列传代(＞570)致细胞病变疫苗Ankara病毒开发出MVA，它已下降到生物安全1级病源，可被未接种过疫苗的实验室人员使用。MVA含有6个主要缺失(＞基因组15％)，导致失去30,000以上的碱基对(Antoine，等，1998)。MVA可在有限数目的细胞系中复制(Carroll和Moss，1997；Drexler等，1998)并在非允许细胞中病毒成形的晚期复制被阻断(Sutter和Moss，1992)。另外，MVA不诱导用野生型株观察到的严重细胞病变作用(CPE)。MVA优于其它宿主限制性痘病毒(如NYVAC，ALVAC和禽痘)的主要优点是病毒的DNA复制，和因此几乎所有基因类型的转录(早，中和晚)未受损伤。异源基因可在所有类型的启动子作用下有效表达。已报道了表达噬菌体T7基因的两种重组MVA。MVA/T7杂交病毒含有在7.5弱早/晚启动子(Sutter等，1995)或11K强晚启动子(Wyatt等，1995)调控下的T7基因-1的一个整合拷贝。已用两者作为瞬时表达系统中的辅助病毒来遗传性拯救负链RNA病毒(Collins等，1995；Leyrer等，1998；Schneider等，1997；Barron，M.D.和Barrett，T.从克隆的cDNA拯救牛瘟病毒，病毒学杂志，71(2)：1265-71 1997年二月；Durbin，A.P.，Hall，S.L.，Siew，J.W.，Whitehead，S.S.，Collins，P.L.，和Murphy，B.R.，从cDNA挽救感染性人副流感病毒3型，病毒学，235(2)：323-332，1997.；He等，1997)。
尽管使用辅助性病毒，如减毒辅助病毒MVA/T7是有益的，MVA/T7或其它辅助病毒的同时复制周期可能抑制拯救异源重组病毒所需的遗传学活动。因此，在本发明的优选例中，当使用辅助病毒时，还使用DNA合成抑制剂。该实施例导致拯救系统的改进。DNA合成抑制剂允许拯救发生，同时还抑制(或基本抑制)辅助病毒的DNA合成。示范性的DNA合成抑制剂，如AraC(胞苷β-D-阿拉伯呋喃糖)和羟基脲，在病毒生命周期的某关键点阻断了辅助病毒的复制周期。因为中晚期病毒基因转录只在新生病毒基因组上引发这两种类型基因由于AraC或羟基脲的阻断而沉默。AraC通过掺入DNA来阻断复制，而羟基脲抑制减少脱氧核糖核苷胞内储蓄池的核糖核苷还原酶。有许多可得到的其它DNA合成抑制剂。其它DNA合成抑制剂在阻断细胞DNA合成上是已知的，但是它们未被推荐用于阻断MVA复制。这些包括：DNA聚合酶抑制剂(如Aphidicolin)，拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱等阻断I型拓扑异构酶；新生霉素和萘啶酸阻断II型拓扑异构酶)，和DNA回旋酶抑制剂(如HeliQuinomycin)。阻断细胞DNA合成的DNA合成抑制剂对严重依赖于细胞酶起复制功能的辅助病毒来说更有效。
在基因拯救工作中，使用DNA合成抑制剂的清晰优点是被拯救的RNA病毒几乎没有或无修饰的辅助病毒污染。对于MVA，非允许细胞中的复制周期中止于成型的极晚期，得到无感染性的病毒颗粒。半允许细胞的感染导致有限的病毒生长，这在基因拯救实验中是禁忌的。在AraC或羟基脲的阻断下，伴随的晚期蛋白合成的抑制导致完全缺乏病毒颗粒。可在允许辅助病毒生长的细胞系中直接扩增拯救病毒。用于转染的DNA合成抑制剂用量可根据分析辅助病毒生长的实验轻易的确定。
一般理解，病毒cDNA转换成重组RNA病毒所需的分子活动涉及通过T7聚合酶的转录和三个或多个病毒反式作用因子(N、P和L，对MV而言)复制负或正链的全长基因组。同时的MVA复制导致在整个拯救活动中消耗了胞内和胞外资源，可能将其折衷到一定程度。阻断中期和晚期基因表达导致这些资源的储存，而且可能是抑制剂存在下增强了基因拯救的一个原因。病毒感染诱导的细胞病变作用(CPE)在MVA-感染的细胞中，与野生型病毒感染的细胞比较，显著降低了。在用DNA合成抑制剂处理的MVA感染细胞中，它被进一步降低。延长感染细胞的寿命可使更广泛的各种异源基因表达。这可能是改进基因拯救的另一个有利部分。
用其它启动子(强早期，早/中期，中期或早/晚期)来驱动T7表达，能增强基因拯救，优选在DNA复制抑制剂的存在下。痘病毒的启动子适合本发明的方法。
然后用至少两个上述表达载体来转化宿主细胞。将宿主细胞在允许这些载体共表达的条件下培养，从而产生感染性减毒病毒。
然后首先用体外实验测试被拯救的感染性病毒是否有所需表型(温度敏感型、冷适应型、噬斑形态和转录和复制弱化)。还用小复制子系统(其中所需反式作用衣壳包装和聚合酶活性由野生型或痘苗辅助病毒，或由表达携带有基因特异性减毒突变的N、P和不同L基因提供)测试了顺式激活3’基因组启动子区的突变(Radecke等(1995)和Sidhu等，(1995))。
如果存在被拯救病毒的减毒表型，用合适的动物模型进行攻击实验。非人灵长类提供了人疾病病理的优选动物模型。首先用减毒、重组产生的病毒免疫这些灵长类，然后用病毒的野生型形式攻击。
在本发明的拯救方法中可使用的宿主细胞是那些允许产生所需重组病毒必需组分的载体表达的细胞。这些宿主细胞可选自原核细胞或真核细胞，优选是脊椎动物细胞。一般说，优选的宿主细胞衍生自人细胞，例如人胚肾细胞。Radecke等，1995公开了衍生自人胚肾细胞系(命名为293 3-46)的使用。Vero细胞和许多其它细胞类型都可用作宿主细胞。下面是合适的细胞例子：(1)人二倍体原代细胞系：如WI-38和MRC5细胞；(2)猴二倍体细胞系：如FRhL-胎恒河猴肺细胞；(3)准原代连续传代细胞系：如AGMK-非洲绿猴肾细胞；(4)人293细胞(合格)和(5)其它可能的细胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬肾)，原代鸡胚成纤维细胞。在其它优选例中，加入转染促进剂来提高细胞对DNA的摄入。许多这些药剂都是本领域已知的。LIPOFECTACE(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和EFFECTENE(Qiagen，Valencia，CA)是常见的例子。Lipofectace和Effectene都是阳离子脂。它们都包裹DNA，并增强细胞对DNA的摄入。Lipofectace形成包围DNA的脂质体，而Effectene包裹DNA但不形成脂质体。
由于本发明使用的许多RNA病毒是人病原体，在这样的情况下优选使用灵长类细胞。例外是犬瘟病毒和其它感染非人哺乳动物的麻疹病毒属。所有这些病毒仅感染真核细胞。麻疹病毒主要限于灵长动物细胞类。一些真核细胞系比其它细胞能更好的增殖病毒，而一些细胞系对某些病毒完全不增殖。用能产生可检测细胞病变效果的细胞系可轻易的检测出活病毒的拯救。就麻疹和其它可能的病毒而言，在Vero细胞上培养转染的细胞，因为病毒在Vero细胞上可迅速传播，并产生可轻易检测的噬斑。这是本发明的另一个重要特征。一般说，使用允许所选病毒生长的宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是“互补细胞型”。就麻疹病毒而言，采用293-3-46细胞(Radecke等，1995)，因为它们表达麻疹病毒的N和P基因，和T7 RNA聚合酶的基因。其它系统没有这个限制，因为由表达质粒和表达T7 RNA聚合酶的痘病毒提供了所有必需的病毒蛋白质。
转录载体和表达载体可以设计成在宿主细胞中表达的质粒载体。含有编码衣壳包装、转录和复制必需的反式作用蛋白的至少一个分离的核酸分子的表达载体可从相同的表达载体或至少两个不同载体表达这些蛋白。一般都知道基本拯救方法的这些载体，并不需要在用于本发明的改进方法中改变它们。
在本发明的一个改进方法中，使用了有效的热休克温度。有效热休克温度是进行重组病毒拯救建议的标准温度以上的温度。在许多情况下，有效热休克温度在37℃以上。当在有效热休克温度下进行拯救方法时，拯救方法增加了所需重组病毒的回收，高于当在温度不提高时进行拯救所回收的重组病毒水平。该有效热休克温度和暴露时间可根据所用的拯救系统而变化。这些温度和时间变化可由所选病毒基因组或宿主细胞类型的不同而定。虽然温度可变，但有效热休克温度可通过用具体重组病毒进行几个试验拯救过程，并随温度和暴露时间改变而确定所需重组病毒的回收百分比来确定。当然，进行拯救的任何温度范围上限是在该温度下，转染成分受到破坏，或其在转染中起作用的能力丧失或减弱的温度。
下文显示了示范性的温度范围表：
从38℃到大约50℃，从39℃到大约49℃，从39℃到大约48℃，从大约40℃到大约47℃，从大约41℃到大约47℃，从大约41℃到大约46℃，而更优选是从大约42℃到大约46℃。另外，注意到特别优选的热休克温度是43℃、44℃、45℃和46℃。
不受下文所束缚，本文推论在拯救中使用作为热休克温度的提高温度触发了细胞反应和与热休克蛋白(称为hsp)有关的合成。认识到，热休克诱导细胞应激反应和称为热休克蛋白(hsp)的一组多功能蛋白的合成(Craig，1985；Grunther和Walter，1994；Lindquist，1986)。许多(但不是全部)hsp是由可高度诱导基因编码的，而这些蛋白以提高的水平合成，来帮助细胞从应激中恢复。在细胞中还存在基线水平的可诱导hsp，表明这些蛋白在正常细胞功能中起各种作用。一些hsp也被称为侣伴蛋白，因为它们在帮助蛋白正确折叠中起重要作用(Gething，1996；Martin和Hartl，1997)。其它hsp的功能包括在胞内蛋白运输、酶调节和蛋白功能、参与DNA复制和病毒复制和病理中的作用(Franke，Yaun，和Luban，1994；Friedman等，1984；Gething，1996；Glick，1995；Hu，Toft和Seeger，1997；Lund，1995；Martin和Hart1，1997；Pratt，1992；Santoro，1996)。
哺乳动物热休克蛋白70(hsp70)家族是大小在大约70kD的一组相关蛋白。hsp70的主要可诱导形式(hsp72)具有表观分子量72kD。73kDhsp70蛋白(hsp73)在细胞中连续表达，并被称为热休克关联蛋白(hsc73，(Gunther和Walter，1994))。这些蛋白参与上述的某些功能，并被当成增强对热休克反应中增加天然(非拯救)CDV基因表达的宿主细胞因子之一。Hsp72同种型与含有增强病毒转录活性的CDV核衣壳组分共纯化(Oglesbee等，1996)。
鉴于我们上文所述范例的结果，可推断热休克温度对CDV基因表达的作用和对其它可根据本文方法拯救的病毒的基因表达的作用，是由于(至少部分由于)Hsp70的诱导。因此，本发明的其它实施例涉及使用能影响hsp，特别是Hsp70(如Hsp72)的效果的有效热休克温度。
在进行为确定所选热休克温度的试验时，还可选择进行热休克程序的所需时间。提供有效热休克温度的充足时间，是使所需重组病毒的回收增加，高于在进行拯救时不使温度超过进行拯救所建议的标准温度重组病毒回收水平的时间。时间的合适长度可根据拯救系统而变化。这些时间的变化还可能随所选病毒基因组或宿主类型的不同而定。虽然时间可变，但用于有效热休克温度的时间量可通过用具体重组病毒进行几次试验拯救程序，并随温度和时间的变化而确定所需重组病毒的回收率或百分比来确定。当然，进行拯救所用时间的上限是在该时间内，转染成分受到破坏，或其在转染中起作用的能力丧失或减弱的时间。热休克程序的时间量变化可从数分钟到数小时，只要能获得重组病毒回收所需要的增加。
虽然转染细胞暴露在有效热休克温度下的时间可随各拯救系统而变化，下面显示了一张暴露时间范围(分钟)的示范表：
从大约5到大约300，从大约15到大约300，从15到大约240，从大约20到大约200，从大约20到大约150，而最优选范围是从大约30到大约150。
可使用许多方法来测定所需重组病毒回收的改进水平。如本文实施例中注意到的，可用氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道子基因来监测重组病毒的拯救。该报道子基因的相应活力确定了重组病毒表达的基线和提高水平。其它方法包括检测获得的重组病毒噬斑数，并通过测序证实拯救病毒的产生。提高的回收率应当显示至少约25％或至少约40％的增加。优选的，回收的重组病毒增加大约2倍。已观察到重组病毒量大约5到10倍的增加。
测定所需重组病毒回收水平提高的一种建议的方法，涉及制备许多确定转染的细胞培养物，并使其暴露在不同热休克条件(时间和温度可变)下，然后与对照的经转染并维持在37℃恒温下的细胞比较。转染72小时后，将转染细胞转移到含有大约75％汇合的Vero细胞(或测定重组病毒噬斑形成所选的细胞类型)单层的10厘米板中，继续培养直到可见噬斑。然后，对噬斑进行计数，并与对照细胞获得的值比较。最佳热休克条件应有最多噬斑数。
在本发明的另一个实施例中，使转染的拯救组合物，如存在于宿主细胞中的，进行噬斑扩展步骤或扩增步骤。本发明的这个方面提供了产生重组单链负义病毒目病毒的改良拯救方法，该方法包括：(a)在宿主细胞中，进行拯救组合物的转染，该组合物包含在足够使载体共表达和重组病毒产生的条件下，(i)含有编码单链负义病毒目的无节段、负义、单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子的一个转录载体，和(ii)至少一个表达载体，它含有编码衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一个分离的核酸分子；(b)将转染的拯救组合物转移到至少一层噬斑扩展细胞(PE细胞)上；和(c)可任选的，收获重组病毒。通常，在进行转染中使用的宿主细胞是不利于所需重组病毒生长的。可通过选择噬斑扩展细胞(其中天然病毒或重组病毒显示提高的增长)来提高重组病毒从转染细胞的回收。可在噬斑扩展步骤中使用任何本领域已知的各种板或容器。优选的，将含有拯救组合物的转染细胞转移到PE细胞单层上。具体的，PE细胞单层必须是至少汇合了50％的。另外，PE细胞是至少大约60％汇合或甚至至少75％汇合的。为了实现噬斑扩展，将转染细胞转移到PE细胞容器中，其中PE细胞表面积比用来制备转染病毒的表面积大。可按需使用2∶1到100∶1的扩大表面积比。优选是至少10∶1的扩大表面积。根据这些细胞中天然或重组病毒的成功生长选出噬斑扩展细胞。Vero细胞在本文讨论的示范性实验中性能良好，因此它们和PE细胞一样是优选的。
另外，在Vero细胞进行噬斑扩展或热休克程序之前，或同时替换转染培养基来实现拯救方法的改进。在噬斑扩展或热休克温度之前的不同时间可进行培养基替换；然而，可在培育转染细胞大约4到20小时后替换培养基，作为起始点，然后按照拯救方法的测试运行所需，进行调节。
无节段、单链RNA病毒
虽然本发明的重要方面之一是这些改进方法在无节段、负义、单链RNA病毒挽救中的应用，本发明的方法也可用于提高许多类RNA病毒，包括节段、负义、单链RNA病毒的拯救。根据国际病毒分类学委员会1993年的修订重分类，病毒的下列组属于正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科的三个病毒科。
正粘病毒科 Family Orthomyxoviridae
流感病毒A，B属 Genus Influenza A，B
脊椎动物，流感A病毒 influenza A virus
流感病毒C属 Genus Influenzavirus C
脊椎动物，流感C病毒 influenza C virus
“未命名，索戈托样病毒”属 Genus″unnamed，Thogoto-like viruses″
脊椎动物：索戈托病毒 Thogoto virus
布尼亚病毒科 Family Bunyaviridae
布尼亚病毒属 Genus Bunyavirus
脊椎动物：布尼奥罗病毒 Bunyamwera virus
内罗病毒属 Genus Nairovirus
脊椎动物：内罗毕绵羊病 Nairobi sheep disease
白蛉病毒属 Genus Phlebovirus
脊椎动物：白蛉热西西里病毒 sandfly fever Sicilian virus
汉坦病毒属 Genus Hantavirus
脊椎动物：汉坦病毒 Hantaan virus
Tospovirus属 Genus Tospovirus
植物：番茄斑萎病毒 tomato spotted wilt virus
沙粒病毒科 Family Arenaviridae
沙粒病毒属 Genus Arenavirus
脊椎动物：淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 lymphocytic choriomeningitis virus
细病毒属 Genus Tenuivirus
植物：水稻条叶枯病毒 rice stripe virus
在这些节段病毒科中，对人有潜在健康威胁是特别令人感兴趣的。反向遗传学(或拯救)提供了通过装配病毒子RNA和活化的基因组转录酶复合物来引发复制，从而产生重组流感A的途径(Enami和Palase)。该方法涉及cDNA拷贝的体外转录，将所需天然或突变的病毒基因节段建立在vRNA拷贝中，并回收该病毒。使vRNA与RNP蛋白(从纯化的病毒颗粒获得)混合，然后和辅助病毒(如对应于所需重组病毒的野生型病毒)一起转染入细胞。例如，在制备重组流感A时，使用流感A病毒来提供复制转染的RNA基因所需的蛋白。形成了重组病毒和辅助病毒的混合物。由于大量过量存在辅助病毒，使用强选择系统，如抗体选择系统，来选择性分离子代(Enami和Palase，1991)。可用本发明的热休克程序来提高所得混合物的体积，以及通过在与辅助病毒一起共转染时加入合适的RNA、RNP拯救组合物，和活性转录酶复合物等其它组分增加了获得的重组病毒量。
具体的，还可用本发明的热休克程序来提高用于在COS-1细胞中包装合成的流感样CAT：RNA小基因组，通过表达10个流感A病毒-编码蛋白的cDNA克隆的痘病毒-T7聚合酶来产生病毒样颗粒的程序的效率(Mena等，1996)。在另一个实施例中，可用本发明的热休克程序来提高辅助独立系统拯救布尼奥罗布尼亚病毒的节段、负链RNA基因组(Bridgen和Eliott，1996)的效率。该系统类似于无节段、负义RNA病毒拯救实验(而不是节段流感病毒拯救所述的那样)所用的系统。构建了含有三个布尼奥罗布尼亚病毒RNA基因组节段的全长cDNA拷贝的质粒，侧接T7启动子和核酶序列，来产生具有精确基因组末端的RNA的基因组拷贝。当用这些质粒转染了表达T7聚合酶和重组布尼奥罗布尼亚病毒蛋白的细胞时，在胞内转录并衣壳包装了全长反基因组RNA，然后这些又被复制，并包装入感染性布尼亚病毒颗粒中。
本文描述的对热休克提高了重组MV的拯救，并提高MV小复制子的CAT报道基因表达的观察，联合hsp72刺激了CDV L聚合酶活性(Oglesbee等，1996)的结果，产生了一种观点：hsp72的诱导可能是导致本文所述的热休克作用的实质原因。通过在CAT小复制子实验中，从表达载体表达hsp72基因之一检测了该可能性。用蛋白质印迹分析(实施例6)肯定了hsp蛋白的表位-尾形式的表达。hsp表达载体的存在增加了转染细胞的CAT水平20倍(实施例6)。这些结果提示，hsp72的高水平表达可提高病毒拯救效率。另外，这些结果暗示表达高水平hsp72的稳定细胞系可能是有利于拯救的。理想的，稳定细胞系将从可诱导启动子表达hsp72，从而可调节hsp72基因的表达量。这可允许选择诱导时间期和诱导水平(它能使拯救最大化，还避免了对连续高水平表达hsp基因的细胞系的可能毒性作用)。
本发明方法制备的重组病毒可用于诊断和治疗用途。优选的，用本发明的方法制备的重组病毒单独或与药物、抗原、免疫制剂或佐剂联用，在预防或改善病毒疾病中作为疫苗。这些活性制剂能通过常规方法，即，用稀释剂或药物学上可接受的载体配制和传递。
提供下列实施例用来说明，而不是用来限制上文所述的本发明。
                           实施例
方法和材料
细胞、病毒和转染
将293-3-46细胞(Radecke等，1995)和293细胞(Graham等，1977)维持于补充了10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良极限必需培养基(DMEM)中。使293-3-46细胞在含有1.5mg/ml的G418(Geneticin，Gibco-BRL)的培养基中与选择剂一起生长。使Vero细胞在含有5％FBS的DMEM中生长，而HeLa悬浮细胞在补充了10％FBS的极限必需培养基(SMEM)中生长。MV(Edmonston B)如早先所述(Udem，1984)在HeLa悬浮培养物中增殖。
用磷酸钙沉淀法(Ausbel等，1987；Graham和van der Eb，1973)进行转染。将用于转染的293-3-46或293细胞接种在6孔板上，生长到约50-75％汇合。转染1-3小时前，用无G418的4.5ml新鲜培养液喂养细胞。将合适DNA组合在最终体积为225微升的水中，然后加入25微升的2.5M CaCl2来制备转染混合物。温和旋转DNA-钙混合物，同时缓慢加入250微升2X HEPES缓冲盐水(280mM NaCl，1.5mM NaH2PO4，50mM HEPES，pH7.05)。将沉淀在室温下放置20分钟，然后加到细胞中。培养细胞过夜(14-16小时)，然后除去转染培养液，淋洗细胞，用无G418的新鲜培养液喂养细胞。除去转染培养液后，以每细胞5噬斑形成单位(5pfu)进行转染细胞的感染。在替换培养液之前，培育感染物2小时。此时，将含有待热休克细胞的培养皿用石蜡膜包裹，转移到44℃水浴中，培育3小时，然后转移到37℃培养箱中。转染开始48小时后，收集细胞，分析瞬时基因表达或在72小时后(或其它本文描述的时间)收集，以进行拯救实验。如前述进行氯霉素乙酰转移酶(CAT)试验(Sidhu等，1995，和Parks和Shenk，1996)。
反复吹吸单层上方的培养液，使细胞脱落并将单层打碎成小团，从诸孔中取出用于病毒拯救的收集的细胞。不采用细胞解离剂。立即将细胞和5ml培养液分散到在10厘米培养皿中的10毫升培养液中长成几乎汇合的Vero细胞单层上。4到5天后，可见噬斑，染色单层，用于噬斑计数或收集单层来制备重组病毒原种。
如上关于DNA所述，用下列修改进行RNA转染。在体外，用Megascript试剂盒(Ambion)的T7 RNA聚合酶试剂制备了用于转染的RNA。将RNA-磷酸钙沉淀物与293细胞一起培育5-6小时，然后除去。在转染培养液中加入病毒，同时进行转染和感染。替换转染-感染培养液后，在43-44℃热休克合适的细胞样品。转染/感染起始24-28小时后收集细胞。
重组DNA
Martin Billeter和Frank Radecke慷慨提供了全长MV cDNA质粒(p(+)MV)和MV L基因表达质粒(pEMC-La)(Radecke等，1995)。已描述了CAT小复制子的制备(Sidhu等，1995)。扩增从热休克293-3-46细胞抽提的RNA的cDNA(Hunt和Morimoto，1985)克隆了hsp70表达质粒。用Titan试剂盒试剂(BoehringerMannheim)中含有的Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶、Taq DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶高保真酶混合物进行反转录PCR(RT/PCR)反应。将hsp70 cDNA克隆入表达质粒pCGN(Tanaka和Herr，1990)中，产生在氨基末端编码区中含有流感HA表位-尾的表达构建物。
DNA测序
通过RT/PCR扩增的DNA测序确定了MV序列。用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(Chomczynski和Sacchi.，1987)制备了MV感染细胞的RNA，而用Titan试剂盒(Boehringer Mannheim)中的试剂进行RT/PCR。在低熔点琼脂糖凝胶中凝胶纯化扩增的DNA。用染料终止剂反应(Applied Biosystems)对PCR片段进行测序，并在ABI PrismTM自动测序仪(Perkin-Elmer)上分析。还用自动测序仪进行了质粒DNA的序列确认。
实施例1
cDNA拯救方案
该方案总结于图1。
开始转染前一天，将293-3-46细胞用补充了10％胎牛血清(FBS)和1.5mg/mlG418抗生素的DMEM分置到6孔培养板上。如果希望次日使用，将一块汇合细胞的10厘米板分割成6孔培养板。每次拯救实验转染12孔，来提高回收重组病毒的可能性。
转染前大约1到3小时，用补充了10％FBS(无G418)的4.5ml DMEM替换培养液，然后开始转染。
磷酸钙沉淀：
在无菌的5毫升聚丙烯试管中联合加入体积为225微升的水和DNA。每次转染用5微克p(+)MV和100ng的L表达质粒(pEMC-La)。加入25微升2.5M的CaCl2并混合。滴加250微升的2X HBS，同时温和旋转试管。加入HBS后，将试管置于室温下15-20分钟(HBS是2X HEPES缓冲盐水：280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，50mMHEPES，pH7.05(Ausubel等，1987))。各孔分别建立转染比制备一个大量转染混合物要有利。将沉淀滴加到培养液中，培育细胞过夜，大约12-16小时。
然后除去培养液并洗涤细胞。用HEPES/盐水溶液(150mM NaCl，50mMHEPES，1mM MgCl2，pH7.2)淋洗细胞2次。在培育细胞前，加入5毫升培养液(DMEM，10％FBS，无G418)。
热休克：加入上述新鲜培养液后，用石蜡膜密封6孔板，转移到有盖的Tupperware容器中。将该容器浸在43-44℃水浴中，培育3小时。在该热休克步骤后，除去板上的石蜡膜，将细胞转移到37℃培养箱中。在转染开始后，总共培育细胞大约72小时。
培育完成后，用Vero细胞进行噬斑扩展步骤。在使用前一天，将一块10厘米培养板分割成4或5块10厘米培养板，制备了Vero细胞。过夜培育后，细胞大约75％汇合。制备了足够板，从而每转染孔有一块Vero细胞板。转染开始约72小时后，将各孔转染的293-3-46细胞转移到含有Vero细胞的10厘米板上。用在单层上方反复吹吸5毫升培养液，使细胞从孔中脱离下来，并将单层打碎成小团，来转移293-3-46细胞。吹吸要温和，以避免细胞裂解，但要足够有力，使细胞分离。然后将5毫升含有转染细胞块的培养液分散到已含有10毫升培养液的Vero细胞10厘米板上。根据拯救系统，应有足够时间，大约4-5天，来使噬斑可见。刮下细胞收获重组病毒，并通过离心收集。将细胞重悬浮在1毫升无血清的DMEM(Gibco/BRL)中，冻融一次，来释放病毒。
实施例2
在该实施例中，实施例1中描述的拯救方法重复了6次，还用了末用热休克的对照。图5显示了6次独立拯救实验的结果。所有实验中使用的MV cDNA含有Edmonston B序列(Radecke等，1995)。如上所述进行转染，而热休克培育是44℃3小时。实施例1评估了阳性或阴性噬斑，而在其余实验中对噬斑进行了计数。该实施例中进行的实验揭示了下列结果：
常规拯救技术的两种改进(Radecke等，1995)，热休克步骤和噬斑扩展步骤，在极大提高转染培养物产生重组病毒数目中都是有效的。在使用这些修饰方法前，仅大约2-3％转染细胞产生重组病毒。在上文程序中，50％-约90％的转染培养物产生重组病毒。
实施例3
噬斑扩展改良方法
实施例1拯救方案中的噬斑扩展步骤是从下列不用热休克处理类型的实验中建立的。
进行了不用实施例2噬斑扩展步骤的实验，而根据Radecke等(1995)略述的程序。在这些实验中，将6孔培养皿孔中转染的细胞转移到10厘米培养板上，使细胞再生长4-5天，并增加时间使噬斑发展。用该程序未检测到噬斑。在第二类实验中，刮下收集转染细胞，离心，并在无血清OPTIMEM(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)培养液中重悬浮。使细胞经历一轮冻融而释放病毒，并将细胞裂解物加到含有大约75％汇合的Vero细胞的10厘米培养皿上。4到5天后，检测Vero细胞的噬斑。约2％-3％的培养物为麻疹病毒噬斑阳性。按照实施例2中简述的噬斑扩展方案，实现了超过刚才所述的2％成功率的10-20倍的提高。看来在噬斑扩展步骤前不进行冻融循环很重要，如实施例2中所述。
实施例4
热休克提高小复制子的表达
为了检验热休克后提高拯救效果的可能机制，测试了热休克对MV小复制子基因表达的影响(见图2的结果)。将质粒小复制子(pMV107CAT)设计成能指导CAT基因(侧接MV末端)的负义RNA拷贝的T7 RNA聚合酶-介导的合成(Sidhu等，1995)。用该质粒来转染293-3-46细胞以胞内合成小复制子RNA。通过补充感染所提供的MV蛋白，或通过补充L表达质粒(因为细胞提供N和P蛋白)进行了293-3-46细胞中小复制子RNA的复制和表达。用MV-CAT小复制子质粒DNA(1微克)转染293-3-46细胞过夜。一些转染物(泳道3和7)也接受MV L基因表达质粒(100ng)来提供L补给。转染大约14小时后，替换培养液，并用MV以每细胞5pfu(噬斑形成单位)感染细胞2小时(泳道4和8)。感染后，替换培养液并在44℃热休克合适的细胞培养物(泳道5-8)3小时。转染开始48小时后收集细胞，并如上文方法所述进行CAT试验。
当测定热休克对小复制子表达的影响时，使用热休克的拯救方案产生了CAT基因活性的强烈增加(图2)。用小复制子DNA进行图2所示实验，并进行类似拯救实验，除了在转染48小时后收集细胞外。在除去转染培养液后，用每细胞5pfu感染转染的细胞进行病毒补给。简单的通过用小复制子DNA共转染进行了L表达质粒的补给。结果表明，当使用两种补给形式的任何一种时，热休克都刺激了表达。在多个实验中，补给L表达质粒诱导的CAT表达被热休克提高了2-10倍(比较泳道3和7)。类似的，当用病毒补给时，CAT活性也提高了，并导致5倍的提高(泳道4和8)。如预计的那样，未接受CAT质粒(泳道1和5)或L补给(泳道2和6)的阴性对照转染产生非常低水平的背景CAT活性。
实施例5
热休克后小复制子的表达提高可能与T7聚合酶活性的较高水平相关。较高的T7聚合酶活性可能是由于293-3-46细胞在热休克后基因表达的提高引起的。已显示293-3-46细胞中CMV立即早期启动子/增强子表达T7聚合酶基因(Radecke等，1995)，和CMV启动子/增强子对热休克蛋白反应(Andrews，Newbound，和Lairmore，1997)。为了排除这种可能性，用小复制子RNA转染细胞，并进行实施例4中所用的热休克处理。除此之外，在本实施例中，为了排除热休克作用涉及到293-3-46细胞系中存在的MV基因表达提高有关的可能性，在293细胞中进行了RNA转染(Graham等，1977)。293-3-46细胞不稳定表达任何MV基因。修改该实验中使用的转染方案，来配合RNA转染(见上文方法部分)。用磷酸钙程序转染了5微克RNA。在转染混合物加到培养液后立即加入病毒，进行了合适细胞的MV感染。将沉淀加到细胞后，将MV(每细胞5pfu，图3的泳道3和6)加到培养液中，立即引发感染，以在RNA可能被包装入核衣壳前减少其胞内降解的机会。在5-6小时转染-感染培育后，替换培养液，44℃热休克合适的细胞样品2小时，然后回到37℃。开始转染-感染24-48小时后，制备细胞抽提物，用于CAT试验。
RNA转染的结果与DNA转染的结果相似。热休克大大提高了CAT在转染细胞中的表达(图3，比较泳道3和6)。在未接受小复制子RNA(泳道1和4)或无病毒补给(泳道2和5)的细胞中观察不到CAT活性。RNA转染的结果还排除了图2所示的DNA转染实验中，提高的T7 RNA聚合酶活性引起热休克作用的可能性。
实施例6
Hsp70刺激小复制子表达
0glesbee等已确定了可诱导hsp70同种型，hsp72，与CDV核衣壳一起共纯化，而且这些核衣壳显示体外转录活性的提高(Oglesbee，Ringler，和Krakowka，1990；Oglesbee等，1996)。为了评估hsp72是否与上文实施例中观察到的热休克作用有关，进行了基本取代实施例1的热休克处理的hsp70的过度表达实验(图4中显示了结果)。从实施例2热休克细胞制备的RNA，克隆了可诱导的hsp70 cDNA(Hunt和Morimoto，1985，Wu等，1985)。将cDNA和flu表位尾一起克隆入CMV表达载体，质粒pCGN(Tanaka，1990)，将hsp70基因的氨基末端编码区与具有序列Y P Y D V P D Y A的流感HA表位尾融合(Tanaka和375-386，1990)。克隆了hsp70 cDNA来表达具有HA表位的氨基末端的hsp70蛋白。该质粒的使用使得我们能在即使存在内源性hsp70同种型背景的情况下，用抗流感尾的抗体跟踪hsp70cDNA的表达。用蛋白质印迹，使用表位尾特异性的抗体分析了转染细胞制备的全细胞抽提物(Parks和Shenk，1996)(图4A)。转染细胞抽提物的蛋白印迹分析显示，表达质粒产生了一个比70kD稍大的带尾多肽。
用hsp70表达载体和L表达质粒，以及小复制子DNA共转染293-3-46细胞导致CAT表达的提高(见图4B)。在该瞬时试验系统中，hsp70的过度表达提高了L补给的低水平多达20倍。hsp70表达载体诱导的CAT表达的增加是明显特异性的，因为它需要L聚合酶质粒的存在，而且当L不存在，或从转染物中删去CAT质粒时，不提高观察到的背景CAT活力。这些结果强烈提示，hsp70至少部分引起热休克对小基因组表达的作用。
实施例7
在Vero细胞中热休克拯救小复制子表达
如实施例4的后续试验，用Vero细胞替换了293-3-46细胞。
材料：对于Vero细胞转染实验，由质粒DNA提供麻疹蛋白N、P和L，而由MVA/T7(Wyatt等)感染提供T7 RNA聚合酶。转染物包括100ng小复制子、400ng N质粒，300ng P质粒和下文表2所示的L质粒量。阴性对照转染物缺少L质粒的支持。另外，用LIPOFECTACE(购自Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)作为转染试剂转染Vero细胞。对于各试验，每次转染反应使用2噬斑形成单位(PFU)的MVA/T7(Wyatt等)。测试了两体积LIPOFECTACE，来确定Vero细胞有效转染的最适量。用两种不同量的L蛋白表达质粒进行转染。对于热休克，将细胞转移到44℃水浴中3小时。对照细胞不经热休克。
MVA/T7：MVA/T7是含有一个在11K强晚期启动子(Wyatt等，1995)调控下的T7基因-1的整合拷贝的杂交病毒。
表达质粒：
Radecke和Billeter提供了L质粒。基本上，将麻疹L基因通过Radecke等(1995)公开的克隆方法克隆入pEMC质粒载体(Moss等，1990)，产生质粒pEMC-La。该载体包括内部核糖体进入位点和3’末端聚腺苷酸序列，来促使克隆基因在真核细胞中表达。用同样的载体来制备N和P基因的各个载体。用PCR从麻疹病毒基因组cDNA(Radecke等，1995)中扩增N和P蛋白编码区，然后克隆入载体pEMC的NcoI和BamHI位点之间，产生pT7-N和pT7-P。
Vero细胞热休克方案：
对于LIPOFECTACE和EFFECTENE
LIPOFECTACE：
Vero细胞在6孔培养皿中生长，直到它们约50-80％汇合。理想的是细胞大约75％汇合，因为在该阶段，它们仍迅速分裂，而且是健康的，而较高细胞密度有助于补偿因转染、MVA/T7感染和热休克而致的细胞死亡。通过在微量离心管中混合DNA(N、P、L和MV小复制子)和200微升无血清DMEM制备用于转染的DNA-脂混合物。在DNA-培养液混合物中加入LIPOFECTACE(12或15微升，由实验而定)，温和混合，然后室温培育20分钟。在培育末，将DNA-LIPOFECTACE混合物与800微升含有适量MVA/T7的无血清DMEM混合，得到大约每细胞2PFU的最终量。从Vero细胞培养物除去培养液，并用含DNA、LIPOFECTACE和MVA/T7的转染混合物替换。在37℃，含5％CO2的培养箱中培育细胞5-6小时。对于Vero细胞，该培育似乎最适是2-3小时。在培育期末，在细胞中加入1毫升补充了10％胎牛血清的DMEM，44℃热休克合适的细胞培养物2-3小时(3小时对Vero细胞是最适的)。为了进行热休克，将6孔板转移到Ziplock塑料袋中，然后浸入44℃水浴中。在2-3小时热休克期介素时，从塑料袋中取出细胞，放回37℃培养箱中，过夜培育。翌日，用2毫升含有10％胎牛血清的新鲜DMEM替换培养液。大约转染48小时后，收集细胞制备用于CAT试验的抽提物，或收集细胞，并将其转移到含Vero细胞单层的10厘米培养皿中，使噬斑扩展。
然后分析了细胞的CAT活性。当在12微升LIPOFECTACE和100ng L质粒条件下使用时，热休克刺激了大约7倍的CAT活性。当在15微升LIPOFECTACE和100ng L质粒条件下使用时，热休克刺激大约2倍的CAT活性。见下列表2。
                                            表2
泳道 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
L ng 0 100 200 0 100 200 0 100 200 0 100 200
相对活力 - 1.0 0.2 - 4.7 0.1 - 7.0 5.4 - 10.3 4.1
Lipofectace(μl) 12 12 12 15 15 15 12 12 12 15 15 15
热休克 无热休克 热休克3小时
实施例8
在Vero细胞中比较热休克拯救的转染促进剂
用LIPOFECTACE或EFFECTENE(Qiagen Inc.，Valencia，CA)重复上述实验。
对于EFFECTENE，方案基本相同，除了DNA-脂混合物的制备。用EFFECTENE试剂提供的100微升缓冲盐水混合DNA。然后加入8微升EFFECTENE凝聚剂，将混合物室温培育5分钟。加入另25微升(或图中特别指出的量)的EFFECTENE，将混合物再培育15分钟。15分钟培育后，将DNA-EFFECTENE复合物与900微升含足够MVA/T7的无血清培养液混合以提供每细胞大约2PFU。在该阶段，向细胞施加DNA-MVA/T7混合物和所有的后续步骤与LIPOFECTACE的步骤相同。
表3a和3b中显示了结果(Lipo＝LIPOFECTACE)。当转染2小时后进行热休克时，提高了小复制子的活性。
表3a
  泳道   1    2  3     4     5   6    7    8   9     10    11   12
  相对活力   -    1.0  -     0.2    0.9   0.2    -    7.2   -     5.4    5.2   5.0
  试剂(μl)   15    15  8     8    25   6    15    15   8     8    25   6
  L质粒   -    +  -     +    +   +    -    +   -     +    +   +
  试剂   Lipo     Effectene        Lipo              Effectene
  处理                        无热休克                          热休克2小时
表3b
   泳道    3     4   5     6    7    8
   相对活力    -     8   -     9    0    2
   试剂微升    5     5   -     -    5    -
   试剂      Lipo                Effectene
   处理                      热休克6小时
实施例9
用改良缓冲技术转染Vero细胞
材料：BES是：{N，N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸}
用BES/磷酸钙程序转染Vero细胞用于拯救
在6孔培养皿中培养Vero细胞，直到它们大约50-80％汇合。细胞大约75％汇合，因为在该阶段，它们仍迅速分裂，而且是健康的，而较高细胞密度有助于补偿因转染、MVA/T7感染和热休克所致的细胞死亡。转染日，每孔用4.5ml新鲜培养液喂养细胞，并转移到37℃(或如果拯救温度敏感病毒，用更低的温度)和3％CO2的培养箱中。我们常规使用的培养液是补充了10％胎牛血清的DMEM(其它的也行)。喂养细胞约2到4小时后，开始转染。在5毫升聚丙烯试管中制备用于转染的DNA-磷酸钙沉淀。将用于拯救的DNA(包括N、P和L以及MV小复制子的表达质粒)与水混合至最终体积225微升。然后加入25微升2.5M的CaCl2，温和混合试管。在制备了所有DNA-CaCl2混合物后，加入250微升2X BES-缓冲盐水(2XBBS：280mM NaCl，1.5mMNa2HPO4，50mM BES，pH6.95-6.98)来制备沉淀。在各试管中滴加2XBBS，同时温和的不停旋转。加入2XBBS后，室温下培育试管20分钟。室温培育终止时，在细胞中滴加500微升沉淀物，并温和摇动培养板，以确保沉淀物和培养液混合。在加入沉淀物后，直接在培养液中加入大约2噬斑形成单位(pfu)的MVA/T7或MVA/T7-GK16，温和摇动培养板以混合。当使用GK16时，在该阶段加入一种DNA合成抑制剂到培养液中。分别以每毫升20微克或10mM将阿糖胞苷(araC)或羟基脲(HU)加到培养液中。转染3小时后，将细胞转移到塑料拉链袋中，浸入44℃水浴进行热休克。44℃培育细胞2-3小时(更长的3小时看来最好)，然后移回3％CO2的培养箱中，培育过夜。翌日，从细胞中除去培养液和转染组分，用hepes缓冲盐水(20mM Hepes，150mM Nacl，1mMMgCl2)洗涤细胞2次，然后加入新鲜培养液。在被MVA/T7-GK16感染的培养物中补充AraC或HU。在设定为标准的37℃和5％CO2(如果是拯救温度敏感型病毒，细胞可在加入新鲜培养液后在合适的较低温度培育2天)的培养箱内再培育细胞1天。然后收集转染的细胞，用于病毒拯救的噬斑扩展步骤，或收集细胞用于制备CAT试验的细胞抽提物。将转染细胞刮到培养液中，转移到含有50％汇合的Vero细胞(或选择的其它允许细胞)单层的10厘米培养皿或T25瓶中。37℃(或上文提到的适合温度)培育共培养细胞4到6小时，然后替换培养液。当转染细胞含有DNA合成抑制剂时，在该阶段替换培养液是必需的，以避免噬斑扩展步骤时抑制共培养中的细胞生长。噬斑扩展步骤开始后大约4到5天，可见噬斑，可收集细胞，来产生被拯救病毒的冻融裂解原种。CAT试验的结果显示于下文表4a和4b。BES/磷酸钙程序增强了活力。
                                    表4a
   泳道     1     2     3     4     5     6
 相对活力     0.11     1.0     0.16     1.76     0.16     2.93
   DNA质量     100ngMVCAT400ng N300ng P100ng L     200ngMVCAT800ng N600ng P200ng L     400ngMVCAT1600ng N1200ng P400ng L
   L质粒      -     +     -     +      -     +
   试剂                              LIPOEFECTACE
   处理                                热休克
                                      表4b
  泳道      7      8      9     10     11     12
相对活力     0.22     4.50     0.18    7.24    0.28     2.50
   DNA质量     100ngMVCAT400ng N300ng P100ng L     200ngMVCAT800ng N600ng P200ng L     400ngMVCAT1600ng N1200ng P400ng L
L质粒 - + - + - +
   试剂                                  BES/磷酸钙
   处理                                    热休克
对于上文的转染技术，见Chen等，1987和Tognon等，1996。
实施例10
基于使用DNA合成抑制剂和在强早/晚启动子控制下合成噬菌体T7 RNA 聚合酶的重组修饰的痘病毒Ankara(MVA)的改进拯救方法
基于前述内容，假定通过特异性抑制辅助MVA/T7的病毒DNA复制，我们能够：1.阻断所有的MVA/T7生长，2.进一步降低感染细胞中的CPE，和3.增强RNA病毒基因拯救的效率。抑制剂(胞苷β-D-阿拉伯呋喃糖苷，AraC和/或羟基脲)阻断了病毒的DNA合成和随后的病毒中期和晚期基因表达。工程改造了含有一个在合成早/晚痘苗病毒强启动子转录控制下的T7基因-1拷贝的重组MVA/T7(MVGK16)。先前的研究(其中MVGK16被用作麻疹小基因组和全长麻疹cDNA基因拯救的辅助病毒)已表明用AraC或羟基脲处理感染细胞导致异源病毒基因拯救的提高(数据未列出)。
质粒和病毒。对该研究我们选择了痘病毒pSC65表达/重组质粒。该质粒可在基因工程改造的病毒早/晚启动子的调控下表达异源基因；它也提供了在病毒7.5K启动子调控下的lacZ选择标记。从pT7-neo(Dr.Sally Lee提供，Wyeth-Lederle Vaccines)切下T7基因-1作为BamHI片段，并将其亚克隆入pSC65(Chakrabarti等，1997)的BgIII位点，来产生pGK16.2(图6)。用染色终止剂循环测序和377 ABI DNA测序仪(Applied Biosystems)对重组质粒进行测序。
用MVA以等于每细胞0.5噬斑形成单位(PFU)的感染复数(MOI)感染鸡胚成纤维细胞(CEF；Spafas)，并用pGK16.2使用DOTAP转染促进剂(Boehringer Mannheim)转染。与MVA DNA的同源重组导致病毒tk基因的中断，并插入T7基因-1和lacZ。用X-gal比色噬斑试验在CEF细胞上连续噬斑纯化重组病毒(MVGK16)三次。通过在CEF上连续三轮噬斑纯化和四轮扩增，使重组MVGK16稳定，如用抗T7聚合酶和痘病毒的兔多克隆抗血清免疫染色证明的那样(数据未列出)。
基因拯救。用含有T7转录的早/晚启动子的表达系统MVA/GK16重复上文的BES/磷酸钙程序。本文列出了对上文BES/磷酸钙拯救方案的修改。当使用GK16时，在该阶段加入DNA合成抑制剂到培养液中。在培养液中分别以每毫升20微克或10mM加入阿糖胞苷(araC)或羟基脲(HU)。在设定为3％CO2的培养箱中培育细胞过夜。按照上文BES实施例的方案完成了转染和热休克。在用MVA/GK16感染的培养物中补充AraC或HU。在设定为标准的37℃和5％CO2(如果是拯救温度敏感型病毒，可在加入新鲜培养液后将细胞在合适的较低温度下培养2日)的培养箱中再培育细胞1天。然后收集转染的细胞用于噬斑扩展步骤。将转染细胞刮到培养液中，或转移到含有50％汇合的Vero细胞(或选择的其它允许细胞)单层的10厘米培养板或T25瓶中。37℃(或合适的温度下)培育共培养细胞4到6小时，然后替换培养液。当转染细胞含有DNA合成抑制剂时，在该阶段替换培养液特别重要。噬斑扩展步骤中，不需要抑制共培养中的细胞生长。噬斑扩展步骤开始大约4到5天后，可见噬斑，可收集细胞，来产生被拯救病毒的冻融裂解原种。
基因拯救实验。上文方案导致具有拯救阳性指标的孔数的持续增加。见下文表5。重组病毒在Vero细胞上第一次传代后，用正(+)或负(-)评估实验。阳性孔的噬斑数范围是1到50。过夜转染和随后24小时培养中，当使用MVA/T7-GK16时，所有实验在培养液中含有20微克/ml AraC。对于第9日的实验，用10mM羟基脲替代了araC DNA合成抑制剂。
表5
 样品  第1日  第9日  第10日  第16日  第23日  第30日  T7来源
1 + + - - - + MVA/T7
 2 - + - + + + MVA/T7
 3 + - - - - + MVA/T7
 4 - - - - - + MVA/T7
 5 + + - - - + MVA/T7
 6 - + - - - - MVA/T7
 7 + + + - + + MVAGK16
 8 + + + + + + MVAGK16
 9 + - + - + - MVAGK16
 10 + + + - + + MVAGK16
 11 + + + + + + MVAGK16
 12 + + - - + + MVAGK16
下文提供了在本文中引入的参考文献表。
参考文献
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Claims (40)

1.一种产生重组单链负义病毒目病毒的方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在至少一个宿主细胞中，进行拯救组合物的转染，该组合物中包含(i)一个含有分离的核酸分子的转录载体，该核酸分子中含有编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一个表达载体，该表达载体含有编码衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一种以上分离的核酸分子；
(b)在能充分增加重组病毒挽救的条件下，加热转染的拯救组合物至有效热休克温度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括收集所述重组病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效热休克温度是37℃以上。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效热休克温度范围从37℃到50℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效热休克温度范围从38℃到49℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效热休克温度范围从39℃到48℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效热休克温度范围从41℃到47℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在有效热休克温度下5分钟到300分钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在有效热休克温度下15分钟到240分钟。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染细胞在有效热休克温度下15分钟到200分钟。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)后将转染的拯救组合物转移到至少一层Vero细胞上。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述Vero细胞层是单层。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链负义病毒目的RNA病毒是人、牛或小鼠病毒。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离的核酸分子是一个以上基因组或反基因组源的嵌合体。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离的核酸分子编码减毒病毒或所述病毒的感染性形式。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离的核酸分子编码所述病毒的感染性形式。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离的核酸分子编码减毒病毒。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码单链负义病毒目的无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子编码感染性减毒病毒。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是副粘病毒科的病毒。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是弹状病毒科的病毒。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是纤丝病毒科的病毒。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是选自MV、RSV、PIV和BPV的病毒。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是病毒MV。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸编码RSV病毒的RNA病毒基因组或反基因组，和衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白是N、P、L和M2。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸编码MV的基因组或反基因组，和衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白是N、P和L。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸编码PIV-3的基因组或反基因组，和衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白是NP、P和L。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是原核细胞。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是脊椎动物细胞。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人细胞。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人胚细胞。
33.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人胚肾细胞。
34.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录载体还包含T7聚合酶基因。
35.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拯救组合物还包含未修饰或修饰的辅助病毒。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述辅助病毒提供用于转录编码无节段、负义单链RNA病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列的T7聚合酶基因，而所述拯救组合物还包含修饰的辅助病毒。
37.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述T7聚合酶基因在晚期启动子或早/晚启动子的调节性控制下。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述T7聚合酶基因在早/晚启动子的调控下。
39.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述转染在DNA合成抑制剂的存在下进行。
40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于转染的宿主细胞是Vero细胞。
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