JP2002517189A - Ｒｎａウイルスの新規レスキュー方法 - Google Patents

Ｒｎａウイルスの新規レスキュー方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、麻疹ウイルス（ＭＶ）およびＲＳウイルス（ＲＳＶ）のような弱毒化および／もしくは感染性ウイルスのようなウイルスの産生方法 に関する態様を包含する、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と呼称される目の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの産生のための改良方法に関する。モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）からの組換えウイルスの一産生方法は、（ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを；これらのベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞中で実施すること；（ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること；ならびに、場合によっては（ｃ）生じる組換えウイルスを収穫することを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスと
呼称される目の非分節の(nonsegmented)負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスを産生
するための改良方法に関する。好ましい態様は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ＲＳウ
イルス（ＲＳＶ）およびヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のような弱
毒化および／もしくは感染性ウイルスのようなウイルスの産生方法に関する。該
組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから製造することができ、こうして、定義さ
れた変化をゲノム中に有するウイルスを得ることができる。
【０００２】 （発明の背景） エンベロープをもつ(enveloped)負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスが独特に組
織化かつ発現されている。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレ
オキャプシドの情況で、２種の鋳型機能（すなわちメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）の合成のための鋳型、およびアンチゲノム（＋）鎖の合成のための鋳型と
して）を供給する。負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスは、それら自身のＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつパッケージングする。メッセンジャーＲ
ＮＡは、感染した細胞の細胞質にウイルスが侵入すると合成されるにすぎない。
ウイルスの複製はｍＲＮＡの合成後に起こり、そしてウイルスタンパク質の継続
的合成を必要とする。新たに合成されたアンチゲノム（＋）鎖は、（−）鎖のゲ
ノムＲＮＡのさらなるコピーの発生のための鋳型としてはたらく。
【０００３】 ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’端、とりわけプロモーター領域のシスに
作用するシグナルをかみあわせる(engaging)ことにより転写および複製を起動か
つ達成する。その後、ウイルス遺伝子が、その３’からその５’端まで一方向的
にゲノム鋳型から転写される。それらの上流の隣接物（すなわち核タンパク質遺
伝子（Ｎ））に関して常により少ない、下流の遺伝子（例えばポリメラーゼ遺伝
子（Ｌ））から作成されるｍＲＮＡが存在する。従って、該ゲノムの３’端に関
して遺伝子の位置に従ったｍＲＮＡの豊富の勾配が常に存在する。
【０００４】 こうした非分節ＲＮＡウイルスの分子遺伝学的分析は、最近まで困難と判明し
ていた。なぜなら、裸のゲノムＲＮＡもしくはトランスフェクションされたプラ
スミドから細胞内で産生されるＲＮＡは感染性でないからである（ボイヤー（Ｂ
ｏｙｅｒ）とヘンニ（Ｈａｅｎｎｉ）、１９９４）。この技術的問題は、組換え
の非分節の負鎖ＲＮＡウイルスの単離を可能にする便利なｃＤＮＡレスキュー技
術の開発により克服された（パットナイク（Ｐａｔｔｎａｉｋ）ら、１９９２；
シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼ
ルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４）。これらの多様な負鎖ウイルスの
レスキューのための技術は共通のテーマに従い、それぞれ首尾よくレスキューす
るための識別性の必須成分を有する（バロン（Ｂａｒｏｎ）とバレット（Ｂａｒ
ｒｅｔｔ）、１９９７；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９５；ガルシン（
Ｇａｒｃｉｎ）ら、１９９５；ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）とバネリエー（Ｂａ
ｎｅｒｊｅｅ）、１９９７；ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら、１９９５；ラデケ（
Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９
９７；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｕｎｅｌｌ）、メバトゥショ
ン（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４
；ホエラン（Ｗｈｅｌａｎ）ら、１９９５）。ゲノムｃＤＮＡプラスミドのトラ
ンスフェクション後に、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、およびベクターに
コードされるリボザイム配列［ＲＮＡを切断して３’末端を形成する］の組み合
わせられた作用により、ゲノムＲＮＡの正確な一コピーが産生される。このＲＮ
Ａは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより最初は供給されるウ
イルスタンパク質によりパッケージングおよび複製される。麻疹ウイルス（ＭＶ
）のレスキュー系（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の場合には、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼならびにＭＶのタンパク質Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパ
ク質）およびＰ（リンタンパク質ポリメラーゼサブユニット）を発現する安定な
細胞系が製造された。従って、適切に配置されたＴ７ポリメラーゼプロモーター
を含有するＭＶゲノムｃＤＮＡクローン、およびＭＶポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）
を含有する発現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションするこ
とにより、ＭＶのレスキューを達成し得る。
【０００５】 成功裏の麻疹ウイルスｃＤＮＡレスキューは、明らかに、１）Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼによるゲノムＲＮＡの正確な完全長の合成およびリボザイム配列によ
る３’端のプロセシング；２）複製を開始するのに適切なレベルでのウイルスの
Ｎ、ＰおよびＬタンパク質の合成；３）転写的に活性かつ複製応答能のあるヌク
レオキャプシド構造へのゲノムＲＮＡの新たなパッケージング；ならびに４）複
製が進行するのに十分なレベルでの新たに形成されたヌクレオキャプシドからの
ウイルス遺伝子の発現、を包含する多数の分子事象がトランスフェクション後に
起こることを必要とする。成功裏のレスキューでどの段階が律速であることがで
きるかは正確には決定されていないが、しかし、レスキューの効率は、潜在的に
、上に挙げられた段階のいずれか一を刺激することにより向上させることができ
る。
【０００６】 本発明は、ＭＶのような所望の組換えＲＮＡウイルスを回収する能力の向上を
探求する。所望のウイルスの本来のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリ
ヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレスキューから得
る能力が低下するかも知れないことが提起されている。従って、本発明は、こう
した障害物を克服することを探求する。なぜなら、これらの方法は、レスキュー
処置から所望の組換えウイルスを得る見込みを本質的に向上させ得るからである
。
【０００７】 （発明の要約） 本発明は、（ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒ
ｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡ
ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含
んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包
化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１
種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレス
キュー組成物のトランスフェクションを；これらのベクターの共発現および組換
えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞中で実施すること；
（ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収
を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること；ならび
に、場合によっては（ｃ）生じる組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る
、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）からの
組換えウイルスの生産方法を提供する。
【０００８】 付加的な一方法は、ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目
（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖
ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子
を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要な
トランスに作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る
最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成
るレスキュー組成物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組
換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；ｂ）トラン
スフェクションされたレスキュー組成物を最低一層のベロ細胞上に移すこと；な
らびに、場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る、組換え
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルス
を生産することに関する。
【０００９】 本発明のさらなる局面は、上の方法の重なり合わない段階を好ましい態様と一
緒に組み合わせてさらなる改良された方法を創製する方法に関する。
【００１０】 代替の態様において、本発明は、弱毒化、感染性、もしくは双方であるモノネ
ガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイル
スの作成方法を提供する。付加的な態様は、本発明の方法から産生されたウイル
ス、ならびにこうしたウイルスを含有するワクチンに関する。こうしたウイルス
はヒト、またはマウスもしくはウシのような非ヒトであることができることが注
目される。
【００１１】 上に同定された態様および本明細書で詳細に論考される付加的な態様は、本発
明の目的を表す。
【００１２】 （発明の詳細な記述） 上に簡潔に示されたとおり、本発明は組換えＲＮＡウイルスの新規製造方法に
関する。当該技術分野におけるこうした方法は「レスキュー」もしくは逆遺伝学
的方法と称される。多様な非分節の負鎖ウイルスのための例示的なレスキュー方
法は、以下の参考文献として引用される刊行物、すなわちバロン（Ｂａｒｏｎ）
とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、１９９７；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１
９９５；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）ら、１９９５；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７；ホ
フマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）とバネリェー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）、１９９７；ロー
ソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら、１９９５；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂ
ｉｌｌｅｔｅｒ）、１９９７；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５；シュナ
イダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メ
バトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）
、１９９４；ホエラン（Ｗｈｅｌａｎ）ら、１９９５に開示される。レスキュー
に関する付加的刊行物は、ＭＶおよびパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘ
ｏｖｉｒｉｎａｅ）の他のウイルスについての公開された国際特許出願第ＷＯ
９７／０６２７０号およびＲＳＶのレスキューについての公開された国際特許出
願第ＷＯ ９７／１２０３２号を包含し；これらの出願はこれにより引用により
組み込まれる。
【００１３】 ゲノムｃＤＮＡプラスミドのトランスフェクション後、ファージＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼ、およびベクターにコードされるリボザイム配列［ＲＮＡを切断し
て３’末端を形成する］の組み合わせられた作用により、ゲノムＲＮＡの正確な
一コピーが産生される。このＲＮＡは、コトランスフェクションされた発現プラ
スミドにより最初は供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングかつ複
製される。ＭＶのレスキュー系（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の場
合には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼならびにＭＶのタンパク質Ｎ（ヌクレオキャ
プシドタンパク質）およびＰ（リンタンパク質）を発現する安定な細胞系が製造
された。従って、適切に配置されたＴ７ポリメラーゼプロモーターを含有するＭ
ＶゲノムｃＤＮＡクローン、およびＭＶポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）を含有する発
現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションすることにより、Ｍ
Ｖのレスキューを達成し得る。
【００１４】 最初のいくつかのレスキュー方法の一は麻疹ウイルスについて開示された。麻
疹ウイルス（ＭＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａ
ｅ）のモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）の一メンバーであり
、そして、ＭＶは、この科の全メンバーと同様、非分節の負センスのＲＮＡゲノ
ムを含有するエンベロープをもつウイルスである（ラム（Ｌａｍｂ）とコラコフ
スキ（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ）、１９９６）。この科のウイルスの分子遺伝学的
分析は最近まで困難と判明していた。なぜなら、裸のゲノムＤＮＡ、もしくはト
ランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生されたＲＮＡは感染性で
ないからである（ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）とヘンニ（Ｈａｅｎｎｉ）、１９９４
）。この技術的問題は、組換えの負鎖ＲＮＡウイルスの単離を可能にする便利な
ｃＤＮＡレスキュー技術の開発により克服された（パットナイク（Ｐａｔｔｎａ
ｉｋ）ら、１９９２；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ
）、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉ
ｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４）。
【００１５】 これらのレスキュー方法の基本的一段階およびその中の組成物の簡潔な概要を
以下にさらに記述する。すなわち 負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク
質コア（ヌクレオキャプシド）に作用する多量体タンパク質の酵素的活性により
達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型として作用し得ない。代わりに、これらの
ゲノム配列は、それらがＮタンパク質によりヌクレオキャプシド構造中に完全に
被包化される場合にのみ認識される。ゲノムおよびアンチゲノム末端プロモータ
ー配列が認識されて転写もしくは複製経路を開始するのはその情況においてのみ
である。
【００１６】 全部のパラミクソウイルスは、これらのポリメラーゼ経路を進行させるために
３種のウイルスタンパク質、Ｎ、ＰおよびＬを必要とする。ＲＳＶを包含するニ
ューモウイルスもまた、転写経路を効率的に進行させるのに転写伸長因子Ｍ２を
必要とする。おそらくウイルスにコードされるＮＳ１およびＮＳ２タンパク質、
ならびにおそらく宿主細胞にコードされるタンパク質を包含する付加的な補助因
子もまたある役割を演じているかも知れない。
【００１７】 簡潔には、全部のモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の
レスキュー方法を以下のとおり要約し得る。すなわち、それぞれは、適するＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーター）と、適する転写ベクター（例えば、増殖可能な細菌プラスミド）中
に挿入される自己切断性リボザイム配列（例えばδ型肝炎リボザイム）との間に
置かれた所望のウイルスゲノムのクローン化されたＤＮＡ同等物を必要とする。
この転写ベクターは容易に操作可能なＤＮＡ鋳型を提供し、ＲＮＡポリメラーゼ
（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）は、正確なもしくはほぼ正確な５’および
３’末端をもつウイルスのアンチゲノム（もしくはゲノム）の一本鎖ＲＮＡの一
コピーをそれから忠実に転写し得る。ウイルスゲノムＤＮＡのコピー、ならびに
隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の向きが、アンチゲノムもしくはゲ
ノムＲＮＡ同等物が転写されるかどうかを決定する。裸の一本鎖ウイルスのアン
チゲノムもしくはゲノムＲＮＡ転写物の機能的ヌクレオキャプシド鋳型、すなわ
ち、ウイルスのヌクレオキャプシド（ＮもしくはＮＰ）タンパク質、ポリメラー
ゼ会合型リンタンパク質（Ｐ）ならびにポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質への被包
化に必要とされるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質が、新たなウ
イルスの子孫のレスキューにもまた必要とされる。これらのタンパク質は、この
ヌクレオキャプシドの鋳型を転写および複製の達成に従事させるに違いない、活
性のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含んで成る。レスキューに選択
されるある種のウイルスは、転写伸長因子のような付加的タンパク質を必要とす
ることができる。
【００１８】 従って、各方法においてレスキュー組成物を使用することができる。こうした
組成物は当該技術分野で公知である。以下の記述は、本発明の方法で使用し得る
レスキュー組成物の制限とならない。レスキュー組成物は、これらのベクターの
共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で、宿主細胞
中に；（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅ
ｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノム
をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成
る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに
作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最
低１種の発現ベクターを含んで成る。
【００１９】 該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇ
ａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの最低１種のゲ
ノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。ウイルスの分類学に
関する国際委員会（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ）による１９９３年
の改訂された再分類に基づき、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌ
ｅｓ）と呼称されるひとつの目が確立された。この目は、負の極性の（負センス
の）一本鎖の非分節ＲＮＡゲノムを含む、エンベロープをもつウイルスの３科を
含有する。これらの科は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄ
ａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）およびフィロウイル
ス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）である。パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙ
ｘｏｖｉｒｉｄａｅ）は２亜科、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖ
ｉｒｉｎａｅ）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に
さらに分割されている。パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎ
ａｅ）は、３属、レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（以前はパ
ラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）として知られていた）、ル
ブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）およびモルビリウイルス属（Ｍｏｒ
ｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）を含有する。ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉ
ｒｉｎａｅ）はニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）を含有する。
【００２０】 該新規分類は、形態学的基準、ウイルスゲノムの構成、生物学的活性、ならび
に遺伝子および遺伝子産物の配列の関連に基づく。パラミクソウイルス亜科（Ｐ
ａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のエンベロープをもつウイルスのあいだの形態
学的な識別する特徴は、ヌクレオキャプシドの大きさおよび形状（直径１８ｎｍ
、長さ１μｍ、５．５ｎｍのピッチ）であり、これは左旋性らせんの対称を有す
る。生物学的基準は、１）一属のメンバー間での抗原の交差反応性、ならびに２
）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス属（Ｒｕ
ｂｕｌａｖｉｒｕｓ）でのノイラミニダーゼ活性の存在、およびモルビリウイル
ス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）でのその非存在、である。加えて、ルブラ
ウイルス（Ｒｕｂｌａｖｉｒｕｓｅｓ）での余分な遺伝子（ＳＨ）の存在がそう
であるように、Ｐ遺伝子のコーディング能力の変動が考慮される。
【００２１】 ニューモウイルスは、それらが細いヌクレオキャプシドを含有するためにパラ
ミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）と形態学的に識別し得
る。加えて、ニューモウイルスは、タンパク質をコードするシストロンの数（ニ
ューモウイルスで１０個対パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉ
ｎａｅ）で６個）、およびパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉ
ｎａｅ）のものと非常に異なる接着タンパク質（Ｇ）に大きな差異を有する。パ
ラミクソウイルスおよびニューモウイルスは、機能が対応するようである６種の
タンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ／Ｈ／ＨＮ、ＦおよびＬ）を有するとは言え、後者
の２種のタンパク質のみが２亜科の間で有意な配列の関連を示す。いくつかのニ
ューモウイルスタンパク質、すなわち非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２、小
疎水性タンパク質ＳＨ、ならびに第二のタンパク質Ｍ２は、パラミクソウイルス
の大部分で対照物を欠く。若干のパラミクソウイルスのタンパク質、すなわちＣ
およびＶは、ニューモウイルスの対照物を欠く。しかしながら、ニューモウイル
スおよびパラミクソウイルスの基本的なゲノムの構成は同一である。同じことが
ラブドウイルスおよびフィロウイルスについてもまた真実である。表１は、各属
の例と一緒にこれらのウイルスの現在の分類学的分類を提示する。 表１ モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの
一本鎖ＲＮＡウイルスの分類 パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ） レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（以前はパラミクソウイ
ルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）として知られていた） センダイウイルス（マウスパラインフルエンザタイプ１） ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タイプ１および３ ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）タイプ３ ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ） ＳＶ５（ＳＶ５）（イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２） 流行性耳下腺炎ウイルス ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（トリパラミクソウイルス１） ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ−タイプ２、４ａおよび４ｂ） モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ） 麻疹ウイルス（ＭＶ） イルカモルビリウイルス イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ） 小反芻動物病ウイルス アザラシジステンパーウイルス 牛疫ウイルス ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ） ニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ） ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ） ウシＲＳウイルス マウス肺炎ウイルス シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ） リッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ） 狂犬病ウイルス ベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ） 水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ） エフェメロウイルス属（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ） ウシ流行熱ウイルス フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ） フィロウイルス属（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ） マールブルグウイルス 上に示されるとおり、該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目（Ｏｒｄ
ｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウ
イルスの最低１種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る
。単離された核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムもしくはそれらの改変されたバ
ージョン(version)をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一
態様において、該ポリヌクレオチドは、操作可能に連結されたプロモーター、所
望のゲノムもしくはアンチゲノム、および転写ターミネーターをコードする。
【００２２】 本発明の好ましい一態様において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの挿入
、再配列、欠失もしくは置換により野性型ＲＮＡウイルスから改変されているゲ
ノムもしくはアンチゲノムをコードする。本来のゲノムおよびアンチゲノムをコ
ードするポリヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレス
キューから得る能力が消失するかも知れないことが提起されている。こうした場
合、本発明はとりわけ価値がある。なぜなら、これらの方法は組換えウイルスの
レスキューの見込みを本質的に向上し得るからである。ゲノムもしくはアンチゲ
ノム配列は、ヒトもしくは非ヒトのウイルスのもの由来であり得る。ポリヌクレ
オチド配列は、２種もしくはそれ以上の供給源からのゲノムもしくはアンチゲノ
ムを組換え的に結合することから形成されたキメラゲノムをコードしてもまたよ
い。例えば、ＡグループのＲＳＶからの１種もしくはそれ以上の遺伝子が、Ｂグ
ループのＲＳＶの対応する遺伝子の代わりに挿入されるか；または、ウシＰＩＶ
（ＢＰＩＶ）、ＰＩＶ−１もしくはＰＩＶ−２からの１種もしくはそれ以上の遺
伝子が、ＰＩＶ−３の対応する遺伝子の代わりに挿入されるか；または、ＲＳＶ
がＰＩＶの遺伝子に取って代わることができる、などである。付加的な態様にお
いては、該ポリヌクレオチドは、ヒト、ウシもしくはマウスのウイルスであるモ
ノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウ
イルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。本発明の方法により形成さ
れる組換えウイルスは、診断的研究でのツールまたは治療的もしくは予防的ワク
チンとして使用し得るため、該ポリヌクレオチドは、野性型もしくは弱毒化され
た形態の選択されたＲＮＡウイルスをコードしてもまたよい。多くの態様におい
て、該ポリヌクレオチドは、弱毒化された感染性の形態のＲＮＡウイルスをコー
ドする。とりわけ好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは、これにより引
用により組み込まれる公開国際特許出願第ＷＯ ９８／１３５０１号により記述
されるような、３’のゲノムプロモーター領域に最低１個の弱毒化突然変異を有
しかつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中に最低１個の弱毒化突然変異を有するモノネ
ガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負セ
ンスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。
【００２３】 組換えウイルスを産生する多様な必要性は変動することができる。従って、い
ずれかの特定の科、すなわちパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉ
ｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）もしくはフィロウ
イルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）からもうひとつのウイルスを選択すること
ができる。
【００２４】 上述されたような、改変された形態の所望のゲノムおよびアンチゲノムをコー
ドするポリヌクレオチド配列に加え、ポリヌクレオチド配列は、１種もしくはそ
れ以上の異種遺伝子と一緒に所望のゲノムもしくはアンチゲノムをコードしても
またよい。異種遺伝子は所望されるように変動し得る。異種遺伝子は、所望の組
換えウイルスの応用に依存して、補助因子、（インターロイキンのような）サイ
トカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバントもしくは多様な
微生物病原体（例えばウイルス、細菌もしくは真菌）のタンパク質、とりわけ保
護的免疫応答を導き出すことが可能なタンパク質をコードしてよい。異種遺伝子
はまた、遺伝子治療に使用される作用物質を提供するのに使用してもよい。好ま
しい態様において、異種遺伝子は、組換えウイルスの予防的もしくは治療的特徴
を改良するのに選択される、インターロイキン−１２のようなサイトカインをコ
ードする。
【００２５】 ウイルス性病原体の治療における改良されたワクチンおよび増大された順応性
に対する現在の必要性のいくつかを考慮すれば、単離された核酸分子は、ＣＤＶ
、ＶＳＶ、ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ、流行性耳下腺炎ウイルスおよび狂犬病ウイル
スより成る群から選択されるＲＮＡウイルスをコードするポリヌクレオチドを含
んで成る。ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶおよびＢＰＶより成る群が、この組のＲＮＡウ
イルスのなかでさらに好ましい。
【００２６】 弱毒化ウイルスを使用する態様については、改変ウイルスを生じさせるための
弱毒化突然変異の基本的導入方法と一緒に、多数の形態のこうしたウイルスが当
該技術分野で公知である。化学的突然変異誘発物質が添加されている細胞培養物
中でのウイルスの成長の間の化学的突然変異誘発、次いで、温度感受性および／
もしくは低温適応突然変異を選択するための至適以下の(suboptimal)温度での継
代にかけられるウイルスの選択、細胞培養物中で小さなプラークを生じさせる突
然変異体ウイルスの同定、ならびに宿主域突然変異について選択するための異種
宿主による継代のような慣習的手段が使用される。弱毒化突然変異の代替の一導
入手段は、部位特異的突然変異誘発を使用して予め決められた突然変異を作成す
ることを含んで成る。１種もしくはそれ以上の突然変異を導入してよい。その後
、これらのウイルスの生物学的活性の減弱化についてそれらを動物モデルでスク
リーニングする。弱毒化ウイルスをヌクレオチド配列決定にかけて、弱毒化突然
変異の部位の位置を突き止める。
【００２７】 レスキューを実施するために必要とされる多様なトランスに作用するタンパク
質もまた当該技術分野で公知である。麻疹ウイルスのレスキューに必要とされる
トランスに作用するタンパク質は、被包化タンパク質Ｎ、ならびにポリメラーゼ
複合体タンパク質、ＰおよびＬである。ＰＩＶ−３については、被包化タンパク
質はＮＰと呼称され、また、ポリメラーゼ複合体タンパク質はまたＰおよびＬと
も称される。ＲＳＶについては、ウイルス特異的なトランスに作用するタンパク
質は、Ｎ、ＰおよびＬ、ならびにＲＳＶをコードする転写伸長因子である付加的
タンパク質Ｍ２を包含する。
【００２８】 ウイルスのトランスに作用するタンパク質は、必要とされるタンパク質をコー
ドする１種もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミド）から生じさせ
得るとは言え、必要とされるトランスに作用するタンパク質のいくつかもしくは
全部は、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および遺伝子産
物を含有かつ発現するよう工作された選択された宿主細胞内で産生させることが
できる。
【００２９】 発現ベクター、ならびに被包化、転写および複製に必要なトランスに作用する
タンパク質をコードする単離された核酸分子の選択は、所望のウイルスの選択に
依存して変動し得る。選択された条件下での宿主細胞における転写ベクター（１
種もしくは複数）とのそれらの共発現および組換えウイルスの産生を可能にする
ために、発現ベクターが調製される。
【００３０】 レスキューのための典型的な（とは言え必ずしも独占的でない）環境は、適切
な哺乳動物細胞の環境を包含し、ここで、ウイルスゲノムのｃＤＮＡを含有する
転写ベクターからアンチゲノム（もしくはゲノム）の一本鎖ＲＮＡの転写を駆動
するようにＴ７ポリメラーゼが存在する。このウイルスアンチゲノム（もしくは
ゲノム）のＲＮＡ転写物は、共転写的にもしくはその後すぐにのいずれかで、ヌ
クレオキャプシドタンパク質により機能的鋳型に被包化され、そして、必要とさ
れるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質をコードするコトランスフ
ェクションされた発現プラスミドから付随して産生される必要とされるポリメラ
ーゼ成分により束縛される。これらの事象および過程は、ウイルスｍＲＮＡの前
もって必要な転写、新たなゲノムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウ
イルス子孫の産生すなわちレスキューにつながる。
【００３１】 狂犬病、ＶＳＶ、ＳＶ５およびセンダイのレスキューのためには、Ｔ７ポリメ
ラーゼは組換えワクシニアウイルスＶＴＦ７−３により提供される。しかしなが
ら、この系は、物理的もしくは生化学的手段、またはポックスウイルスに対し良
好な宿主でない細胞もしくは組織中での反復する継代により、レスキューされる
ウイルスがワクシニアウイルスから分離されることを必要とする。ＭＶのｃＤＮ
Ａのレスキューに関しては、Ｔ７ポリメラーゼならびにウイルスのＮおよびＰタ
ンパク質を発現する細胞系を創製することにより、この要件が回避される。ゲノ
ム発現ベクターおよびＬ遺伝子発現ベクターをヘルパー細胞系中にトランスフェ
クションすることにより、レスキューが達成される。好ましくは、ヘルパー細胞
系は、哺乳動物細胞中で子孫のウイルスをほとんどもしくは全く産生せず、そし
て所望のＲＮＡウイルスもしくはウイルス類をレスキューするために活用し得る
。Ｔ７ポリメラーゼ、例えばＭＶＡ／Ｔ７（以下に記述される）の供給源として
ヘルパーウイルスを使用し得る。必要な被包化タンパク質の同時の発現後に、合
成の完全長のアンチゲノムウイルスＲＮＡが被包化され、複製され、そしてウイ
ルスのポリメラーゼタンパク質により転写され、そして複製されたゲノムが感染
性のビリオン中にパッケージングされる。こうしたアンチゲノムに加え、今や、
センダイおよびＰＩＶ−３についてゲノム類似物が成功裏にレスキューされてい
る（加藤（Ｋａｔｏ）ら、および公開された国際特許出願第ＷＯ ９８／５３７
０８号）。
【００３２】 上に示されたとおり、ＭＶＡ／Ｔ７（ワクシニアウイルスの弱毒化突然変異体
）は、ＲＮＡウイルスレスキューのレスキューで使用することができる改変ヘル
パーウイルスの一例である。一般に、改変ヘルパーウイルスは、非許容細胞系中
で減少されたウイルス活性を示すか、もしくはウイルス活性を示さないように野
性型ウイルスから変えられているウイルスである。ＭＶＡの特徴は、改変ヘルパ
ーウイルスで好ましい特徴を確立する。ワクシニアウイルスのＭＶＡ株は、より
細胞障害性の株に対する魅力的な一代替を提供する。ＭＶＡは、トルコおよびド
イツにおける天然痘根絶プログラムの間に、ニワトリ胚線維芽細胞での細胞障害
性ワクシニアアンカラウイルスの連続的継代（＞５７０）により開発された。そ
れは生物安全性レベル（Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ）−１病原体にまで格
下げされており、そして、ワクチン接種されていない実験室労働者により使用さ
れてよい。ＭＶＡは、３０，０００を越える塩基対の喪失をもたらす６個の大き
な欠失（ゲノムの＞１５％）を含有する（アントワヌ（Ａｎｔｏｉｎｅ）ら、１
９９８）。ＭＶＡは、制限された数の細胞系中で複製し（キャロル（Ｃａｒｒｏ
ｌｌ）とモス（Ｍｏｓｓ）、１９９７；ドレクスラー（Ｄｒｅｘｌｅｒ）ら、１
９９８）、そして、非許容細胞中でウイルスの形態形成の後期段階で封鎖されて
いる（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）とモス（Ｍｏｓｓ）、１９９２）。さらに、Ｍ
ＶＡは、野性型株で観察される重症の細胞障害性の影響（ＣＰＥ）を誘発しない
。他の宿主が制限されるポックスウイルス（例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣお
よび鶏痘）を上回るＭＶＡの主要な一利点は、ウイルスＤＮＡ複製、および従っ
てほとんど全部の遺伝子分類（初期、中期および後期）の転写が損なわれないこ
とである。全部の分類のプロモーター下で外来遺伝子を効率的に発現することが
できる。バクテリオファージＴ７−遺伝子１を発現する２種の組換えＭＶＡが報
告されている。ＭＶＡ／Ｔ７ハイブリッドウイルスは、７．５Ｋの弱い初期／後
期プロモーター（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ら、１９９５）もしくは１１Ｋの強
い後期プロモーター（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、１９９５）のいずれかの調
節下に、組込まれた一コピーのＴ７遺伝子−１を含有する。双方が、一過性発現
系で負鎖ＲＮＡウイルスを遺伝子的にレスキューするためのヘルパーウイルスと
して使用されている（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９５；レイラー（Ｌ
ｅｙｒｅｒ）ら、１９９８；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９９７
；バロン（Ｂａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．）とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．）Ｒｅ
ｓｃｕｅ ｏｆ ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｃｌｏｎ
ｅｄ ｃＤＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７１（２）：１２
６５−７１、１９９７年２月；ダーバン（Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．）、ホール（
Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｌ．）、シュー（Ｓｉｅｗ，Ｊ．Ｗ．）、ホワイトヘッド（Ｗｈ
ｉｔｅｈｅａｄ，Ｓ．Ｓ．）、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．）とマーフ
ィ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．）Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３ ｆｒ
ｏｍ ｃＤＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２３５（２）：３２３−３３２；ヘ（Ｈｅ
）ら、１９９７）。
【００３３】 ＭＶＡ／Ｔ７のような弱毒化ヘルパーウイルスのようなヘルパーウイルスの使
用の利益にもかかわらず、ＭＶＡ／Ｔ７もしくは別のヘルパーウイルスの同時発
生的複製周期は、異種組換えウイルスのレスキューに必要とされる遺伝的事象を
抑制するかも知れない。従って、本発明の好ましい態様においては、ヘルパーウ
イルスを使用する場合、ＤＮＡ合成阻害剤もまた使用する。本態様はレスキュー
系の改良をもたらす。ＤＮＡ合成阻害剤は、ヘルパーウイルスのＤＮＡ合成もま
た阻害（もしくは本質的に阻害）する一方でレスキューを生じさせる。ＡｒａＣ
（シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド）およびヒドロキシ尿素のような例示的
ＤＮＡ合成阻害剤は、ウイルスの生活環の決定的に重要な一点でヘルパーウイル
スの複製周期を封鎖する。中期および後期のウイルス遺伝子転写は発生期のウイ
ルスゲノムのみで開始するため、これら２種の遺伝子分類は、ＡｒａＣもしくは
ヒドロキシ尿素による封鎖の結果として表立ったものではない(silent)。Ａｒａ
ＣはＤＮＡへの取込みにより複製を封鎖する一方、ヒドロキシ尿素はデオキシリ
ボヌクレオチドの細胞のプールを還元するリボヌクレオチド還元酵素を阻害する
。利用可能な多くの付加的ＤＮＡ合成阻害剤が存在する。付加的ＤＮＡ合成阻害
剤は細胞のＤＮＡ合成を封鎖することが知られているが、しかし、それらはＭＶ
Ａ複製の封鎖での使用に推奨されない。これらは、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（
アフィジコリンのような）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシンのような
例はタイプＩトポイソメラーゼを封鎖し；ノボビオシンおよびナリジクス酸はタ
イプＩＩトポイソメラーゼを封鎖する）、ならびにＤＮＡジャイレース阻害剤（
ヘリキノマイシンのような）を包含する。細胞のＤＮＡ合成を封鎖するＤＮＡ合
成阻害剤は、複製機能を実施するため細胞の酵素に甚だしく依存するヘルパーウ
イルスにとってより効果的であるとみられる。
【００３４】 遺伝子レスキュー事象の間にＤＮＡ合成阻害剤を使用することの明白な一利点
は、改変ヘルパーウイルスでのレスキューされるＲＮＡウイルスの汚染が非常に
わずかであるかもしくは全くないはずであることである。ＭＶＡにおいては、被
許容細胞における複製周期が形態形成の非常に後期の段階で停止され、非感染性
であるウイルス粒子をもたらす。半許容細胞の感染は制限されたウイルス成長を
もたらし、これは、遺伝子レスキュー実験では禁忌を示される。ＡｒａＣもしく
はヒドロキシ尿素により封鎖されて、後期のタンパク質合成の付随する阻害はウ
イルス粒子の完全な非存在をもたらす。レスキューされたウイルスは、ヘルパー
ウイルスの成長に対し許容性である細胞系中で直接増幅される。トランスフェク
ションに使用されるＤＮＡ合成阻害剤の量は、ヘルパーウイルスの成長を分析す
るための試験実験により容易に決定される。
【００３５】 ウイルスｃＤＮＡの組換えＲＮＡウイルスへの転化に必要とされる分子事象は
、一般に、Ｔ７ポリメラーゼによる転写、および、３種もしくはそれ以上のウイ
ルスのトランスに作用する因子（ＭＶの場合、Ｎ、ＰおよびＬ）による負もしく
は正いずれかの鎖の完全長のゲノムの複製を必要とすることが理解されている。
同時発生的なＭＶＡ複製は、レスキュー事象全体での細胞内および細胞外の供給
源(resources)の枯渇をもたらし、おそらく若干の程度までそれを傷つける。中
期および後期遺伝子の発現の封鎖は、これらの供給源の保存をもたらし、そして
、おそらく、阻害剤の存在下での遺伝子のレスキューが高められる一理由である
。
【００３６】 ウイルス感染により誘導される細胞障害性の影響（ＣＰＥ）は、野性型ウイル
スに感染した細胞に比較してＭＶＡに感染した細胞で顕著に低下される。それは
、ＤＮＡ合成阻害剤で処理された、ＭＶＡに感染した細胞でさらに低下される。
感染した細胞の寿命の伸長はより広範な外来遺伝子の発現を可能にする。これは
、改良された遺伝子レスキューについての別の有利な成分かも知れない。
【００３７】 Ｔ７発現を駆動するための他のプロモーター（強い初期、初期／中期、中期も
しくは初期／後期）の使用は、好ましくはＤＮＡ複製阻害剤の存在下で、遺伝子
レスキューを高める可能性がある。ワクシニアウイルスのプロモーターは本発明
の方法に適する。
【００３８】 宿主細胞を、その後、最低２種の上述された発現ベクターで形質転換もしくは
トランスフェクションする。宿主細胞は、感染性の弱毒化ウイルスを生じるよう
にこれらのベクターの共発現を可能にする条件下で培養する。
【００３９】 その後、レスキューされた感染性ウイルスを、最初にインビトロ手段により、
その所望の表現系（温度感受性、低温適応、プラークの形態、ならびに転写およ
び複製の減弱）について試験する。シスに作用する３’のゲノムプロモーター領
域での突然変異もまた、ミニレプリコン系を使用して試験する。ミニレプリコン
系では、必要とされるトランスに作用する被包化およびポリメラーゼ活性が、野
性型もしくはワクチンのヘルパーウイルス、または、Ｎ、Ｐおよび遺伝子特異的
弱毒化突然変異をもつ多様なＬ遺伝子を発現するプラスミドにより提供される（
ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）およびシドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら（１９
９５））。
【００４０】 弱毒化された表現系のレスキューされたウイルスが存在する場合は、適切な動
物モデルを用いて攻撃実験を実施する。非ヒトの霊長類は、ヒト疾患の病状につ
いての好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を、最初に、弱毒化され
た組換え的に発生されたウイルスで免疫し、その後、野性型形態の該ウイルスで
攻撃する。
【００４１】 本発明のレスキュー方法で使用し得る宿主細胞は、所望の組換えウイルスの産
生に必要な必須の構成要素のベクターからの発現を許容するものである。こうし
た宿主細胞は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、および好ましくは脊椎動物
細胞から選択し得る。一般に、好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎細胞のようなヒト
細胞由来である。ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら １９９５は、２９３ ３−４６
と呼称されるヒト胚腎細胞系由来である宿主細胞の使用を開示する。ベロ細胞、
ならびに多くの他の型の細胞もまた宿主細胞として使用し得る。以下は、適する
宿主細胞の例である。すなわち、（１）ヒト二倍体一次細胞系：例えばＷＩ−３
８およびＭＲＣ５細胞；（２）サル二倍体細胞系：例えばＦＲｈＬ−胎児アカゲ
ザル肺細胞；（３）準一次連続(quasi-primary continues)細胞系：例えばＡＧ
ＭＫ−アフリカミドリザル腎細胞；（４）ヒト２９３細胞（制限された(qualifi
ed)）ならびに（５）ＣＨＯ、ＭＤＣＫ（メイディン−ダービイ（Ｍａｄｉｎ−
Ｄｅｒｂｙ）イヌ腎）、一次ニワトリ胚線維芽細胞のような他の潜在的細胞系。
二者択一的に好ましい態様においては、細胞によるＤＮＡの取込みを増大させる
ためにトランスフェクション促進試薬が添加される。これらの試薬の多くは当該
技術分野で既知である。リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（ライフ
テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲ
イタースバーグ）およびエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアジェン
（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州ヴァレンシア）が普遍的な例である。リポ
フェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ）およびエフェクティーン（Ｅｆｆｅｃ
ｔｅｎｅ）は双方とも陽イオン性脂質である。それら双方はＤＮＡをコートし、
かつ、細胞によるＤＮＡの取込みを高める。リポフェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｃｅ）はＤＮＡを取り巻くリポソームを形成する一方、エフェクティーン（
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）はＤＮＡをコートするがしかしリポソームを形成しない。
【００４２】 本発明で使用されるＲＮＡウイルスの多くはヒト病原体であるため、こうした
例では霊長類細胞が好ましく使用される。イヌジステンパーウイルスおよび非ヒ
トの哺乳動物を感染させる他のモルビリウイルスのような例外が存在する。これ
らのウイルスの全部は真核生物細胞のみを感染させる。麻疹ウイルスは主として
霊長類の細胞型に限定される。若干の真核生物細胞系はウイルスの増殖について
他者よりも良好にはたらき、また、若干の細胞系はいくつかのウイルスについて
全くはたらかない。生存可能なウイルスのレスキューを容易に検出することがで
きるために、検出可能な細胞障害性の影響を生じさせる細胞系が使用される。麻
疹、および潜在的に他のウイルスの場合には、該ウイルスがベロ細胞上で迅速に
広まりそして容易に検出可能なプラークを作成するため、トランスフェクション
された細胞をベロ細胞上で成長させる。これは本発明の別の重要な特徴である。
一般に、選択されたウイルスの成長に対し許容性である宿主細胞を使用する。若
干の例では、宿主細胞は「補完(complementing)細胞型」である。麻疹ウイルス
の場合には、２９３−３−４６細胞（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）
が、麻疹ウイルスのＮおよびＰ遺伝子、ならびにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を発現するため、それらを使用する。他の系は、全部の必要なウイルスタンパ
ク質が発現プラスミドおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウ
イルスにより提供されるため、この制限を有しない。
【００４３】 転写ベクターおよび発現ベクターは、宿主細胞中での発現のために設計された
プラスミドベクターであり得る。被包化、転写および複製に必要なトランスに作
用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る発現
ベクターは、同一の発現ベクターもしくは最低２種の異なるベクターからこれら
のタンパク質を発現することができる。これらのベクターは基本的なレスキュー
方法から公知であり、また、それらは本発明の改良された方法での使用のため変
えられる必要はない。
【００４４】 本発明の改良された一方法においては、有効な熱ショック温度を使用する。有
効な熱ショック温度は、組換えウイルスのレスキューの実施に示唆される標準温
度より上の温度である。多くの例において、有効な熱ショック温度は３７℃より
上である。あるレスキュー方法を有効な熱ショック温度で実施する場合、該レス
キュー方法は、温度の増大の非存在下でレスキューが実施される場合の組換えウ
イルスの回収のレベルを越えた所望の組換えウイルスの回収の増大を生じさせる
。有効な熱ショック温度および曝露時間は、使用されるレスキュー系に依存して
変動してよい。こうした温度および時間の変動は、選択されたウイルスゲノムも
しくは宿主細胞型の差異から生じる可能性がある。該温度は変動してよいとは言
え、有効な熱ショック温度は、特定の組換えウイルスを用いていくつかの試験レ
スキュー処置を実施すること、そして温度および曝露の時間を変動させる際の所
望の組換えウイルスの回収率のパーセントを確立することにより、容易に確かめ
得る。確実に、レスキューを実施するためのいずれの温度範囲の上端も、トラン
スフェクションの成分が破壊される、もしくはトランスフェクションで機能する
それらの能力が激減もしくは減少される温度である。
【００４５】 温度範囲の例示的一覧を下に示す。すなわち ３８℃から約５０℃まで、３９℃から約４９℃まで、３９℃から約４８℃まで
、約４０℃から約４７℃まで、約４１℃から約４７℃まで、約４１℃から約４６
℃まで、約４２℃から約４６℃までがより好ましい。あるいは、４３℃、４４℃
、４５℃および４６℃の熱ショック温度がとりわけ好ましいことが言及される。
【００４６】 以下により束縛されることなく、レスキューの間の熱ショック温度に上昇され
た温度を使用することは、熱ショックタンパク質（ｈｓｐと称される）に関連し
た細胞応答および合成を誘発することが、これにより理論づけられる。熱ショッ
クが、細胞のストレス応答、および熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）と呼ばれる
一群の多機能タンパク質の合成を誘導することが認識される（クレイグ（Ｃｒａ
ｉｇ）、１９８５；グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）とウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）
、１９９４；リンドクィスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、１９８６）。ｈｓｐの多
く（しかし全部ではない）は、高度に誘導可能な遺伝子によりコードされ、そし
て、これらのタンパク質はストレスからの細胞の回収を助けるために、上昇され
たレベルで合成される。誘導可能なｈｓｐは基礎レベルの細胞中にもまた存在し
、これらのタンパク質が正常の細胞機能で演じる多様な役割を示す。ｈｓｐのい
くつかは、それらが適正なタンパク質のフォールディングの補助で重要な役割を
演じるため、シャペロンともまた呼ばれる（ゲティング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）、１
９９６；マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）とハートル（Ｈａｒｔｌ）、１９９７）。
ｈｓｐに帰される他の機能は、細胞中でのタンパク質転送(trafficking)、酵素
およびタンパク質の機能の調節、ＤＮＡ複製への参画、ならびにウイルスの複製
および病因論での関与における役割を包含する（フランケ（Ｆｒａｎｋｅ）、ヤ
ウン（Ｙａｕｎ）とルバン（Ｌｕｂａｎ）、１９９４；フリードマン（Ｆｒｉｅ
ｄｍａｎ）ら、１９８４；ゲティング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）、１９９６；グリック
（Ｇｌｉｃｋ）、１９９５；フ（Ｈｕ）、トフト（Ｔｏｆｔ）とゼーガー（Ｓｅ
ｅｇｅｒ）、１９９７；ルント（Ｌｕｎｄ）、１９９５；マーティン（Ｍａｒｔ
ｉｎ）とハートル（Ｈａｒｔｌ）、１９９７；プラット（Ｐｒａｔｔ）、１９９
２；サントロ（Ｓａｎｔｏｒｏ）、１９９６）。
【００４７】 哺乳動物の熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）のファミリーは、大きさ
がおよそ７０ｋＤのタンパク質の関連する一群である。主要な誘導可能な形態の
ｈｓｐ７０（ｈｓｐ７２）は、７２ｋＤの見かけの分子量を有する。７３ｋＤの
ｈｓｐ７０タンパク質（ｈｓｐ７３）は構成的に細胞中で発現され、そして熱シ
ョックコグネイトタンパク質（ｈｓｃ７３、（グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）とウ
ォルター（Ｗａｌｔｅｒ）、１９９４））と命名されている。これらのタンパク
質は上に挙げられた機能のいくつかに参画し、また、熱ショックに応答して本来
の（レスキューされない）ＣＤＶ遺伝子発現を増大させる宿主細胞因子の一とし
て関係している。Ｈｓｐ７２のアイソフォームは、高められたウイルス転写活性
を含有するＣＤＶヌクレオキャプシドの画分とともに共精製する（オグルスビー
（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）ら、１９９６）。
【００４８】 本明細書に記述されるようなわれわれの例示的結果を考慮すれば、ＣＤＶ遺伝
子発現、および本明細書に記述される方法に従ってレスキューすることができる
他のウイルスについての遺伝子発現に対する熱ショック温度の影響は、少なくと
も部分的にＨｓｐ７０の誘導によることを推測し得る。従って、本発明の代替の
態様は、ｈｓｐ、とりわけＨｓｐ７２のようなＨｓｐ７０の誘導を達成すること
が可能である有効な熱ショック温度の使用に関する。
【００４９】 選択された熱ショック温度を確立するための試験の実施においては、熱ショッ
ク処置を実施するための所望の時間もまた選択し得る。有効な熱ショック温度を
適用するのに十分な時間は、レスキューを実施するために示唆される標準温度を
越える温度の増大の非存在下でレスキューを実施する場合の組換えウイルスの回
収のレベルを越える、所望の組換えウイルスの回収の増大がそれにわたって存在
する時間である。時間の適切な長さはレスキュー系に基づいて変動してよい。時
間のこうした変動は、選択されたウイルスゲノムもしくは宿主細胞型の差異から
もまた生じる可能性がある。時間が変動してよいとは言え、有効な熱ショック温
度を適用するための時間の量は、特定の組換えウイルスを用いて数回の試験レス
キュー処置を実施すること、そして、温度および時間を変動させた際の所望の組
換えウイルスの回収率もしくは回収パーセントを確立することにより容易に確か
めることが可能である。確実に、レスキューの実施で使用されるいずれかの時間
変数の上端は、トランスフェクションの成分が破壊される、またはトランスフェ
クションで機能するそれらの能力が激減もしくは減少される時間の量である。熱
ショック処置のための時間の量は、組換えウイルスの回収の所望の増大が得られ
る限りは、数分から数時間まで変動してよい。
【００５０】 有効な熱ショック温度へのトランスフェクションされた細胞の曝露の時間は各
レスキュー系とともに変動する可能性があるとは言え、曝露時間の範囲（分）の
例示的一覧を以下に示す。すなわち 約５から約３００まで、約１５から約３００まで、１５から約２４０まで、約
２０から約２００まで、約２０から約１５０まで、約３０から約１５０までが最
も好ましい範囲である。
【００５１】 所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルを決定するために多数の手段
を使用し得る。本明細書の実施例に示されるとおり、組換えウイルスのレスキュ
ーをモニターするのに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）レポーター遺伝子を使用し得る。レポーター遺伝子の対応する活性は、組
換えウイルスの発現の基礎および改良されたレベルを確立する。他の方法は、得
られた組換えウイルスのプラークの数を検出すること、そしてレスキューされた
ウイルスの産生を配列決定により確認することを包含する。改良された回収は、
最低約２５％もしくは最低約４０％の増大を示すはずである。好ましくは、回収
される組換えウイルスの増大は約２倍である。組換えウイルスの量の約５ないし
１０倍の増大が観察されている。
【００５２】 所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルの決定のために示唆される一
方法は、多数の同一にトランスフェクションされた細胞培養物を調製すること、
そしてそれらを多様な条件の熱ショック（時間および温度が変動する）に曝露す
ること、そしてその後３７℃の一定温度でトランスフェクションされかつ維持さ
れた対照細胞と比較することを必要とする。トランスフェクション後７２時間で
、トランスフェクションされた細胞を、約７５％コンフルエントなベロ細胞（も
しくは該組換えウイルスのプラーク形成の測定に選択すべき細胞型）の単層を含
有する１０ｃｍプレートに移し、そしてプラークが見えるまでインキュベーショ
ンを継続する。その後、プラークを計数し、そして対照細胞から得られた値と比
較する。至適の熱ショック条件はプラークの数を最大にするはずである。
【００５３】 本発明の別の態様において、宿主細胞（１個もしくは複数）中に存在するよう
なトランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大(plaque expa
nsion)段階もしくは増幅段階にさらす。本発明の本局面は、組換えモノネガウイ
ルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスを産生するための改良され
たレスキュー方法を提供し、この方法は、（ａ）１個の宿主細胞中で、（ｉ）モ
ノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の
負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単
離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写お
よび複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離さ
れた核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成
物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組換えウイルスの産
生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；（ｂ）トランスフェクション
されたレスキュー組成物を、最低一層のプラーク拡大細胞（ＰＥ細胞）上に移す
こと；ならびに、（ｃ）場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含ん
で成る。しばしば、トランスフェクションの実施で使用される宿主細胞は、所望
の組換えウイルスの成長に好都合でない。トランスフェクションされた細胞から
の組換えウイルスの回収は、天然のウイルスもしくは組換えウイルスが高められ
た成長を示すプラーク拡大細胞を選択することにより改良し得る。当該技術分野
で既知の多様なプレートもしくは容器のいずれかをプラーク拡大段階に使用し得
る。好ましくは、レスキュー組成物を含有するトランスフェクションされた細胞
をＰＥ細胞の単層上に移す。とりわけ、ＰＥ細胞の該層は最低約５０％コンフル
エントであるべきである。あるいは、ＰＥ細胞は最低約６０％コンフルエント、
もしくは最低約７５％コンフルエントでさえある。プラーク拡大を達成するため
には、ＰＥ細胞の表面積がトランスフェクションされたウイルスを調製するため
に使用される表面積よりも大きいようなＰＥ細胞の容器に、トランスフェクショ
ンされた細胞を移す。２：１から１００：１までの高められた表面積比を所望さ
れるとおり使用し得る。最低１０：１の高められた表面積が好ましい。プラーク
拡大細胞は、こうした細胞における天然のもしくは組換えウイルスの成功裏の成
長に基づいて選択する。ベロ細胞は、本明細書で論考される例示的実験で十分に
はたらき、そして、従って、それらはＰＥ細胞として好ましい。
【００５４】 付加的な改良されたレスキュー方法は、ベロ細胞でのプラーク拡大もしくは熱
ショック処理の前もしくはそれらと同時にトランスフェクション培地を置き換え
ることにより達成する。培地交換は、プラーク拡大もしくは熱ショック温度の前
の多様な時点で起こり得るが；しかしながら、トランスフェクションされた細胞
のインキュベーションの約４ないし約２０時間後の培地の交換を開始点として後
に続き得、そしてその後、その後に所望されるとおり、該レスキュー方法の試験
実験を実施することから補正し得る。 分節の一本鎖のＲＮＡウイルス 本発明の重要な局面の一は、非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの回収
でのこれらの改良された方法の応用であるとは言え、本発明の方法は、分節の負
センスの一本鎖ＲＮＡウイルスを包含する多くの型のＲＮＡウイルスのレスキュ
ーを高めるのに有用であり得る。ウイルスの分類学に関する国際委員会（ｔｈｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘｏ
ｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ）による１９９３年の改訂された再分類に基づ
けば、後者の群のウイルスは３科のウイルスに属し、それらは、オルトミクソウ
イルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙ
ａｖｉｒｉｄａｅ）およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）であ
る。 オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） インフルエンザ属（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）Ａ、Ｂ 脊椎動物、インフルエンザＡ型ウイルス インフルエンザ属（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）Ｃ 脊椎動物、インフルエンザＣ型ウイルス 「命名されていないトゴトウイルスグループ（ｕｎｎａｍｅｄ，Ｔｈｏｇｏｔ
ｏ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）」属 脊椎動物：トゴトウイルス ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ） ブニヤウイルス属（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ） 脊椎動物：ブニヤンベラウイルス ナイロウイルス属（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ） 脊椎動物：ナイロビヒツジ病ウイルス フレボウイルス属（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ） 脊椎動物：シシリアサチショウバエウイルス ハンタウイルス属（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ） 脊椎動物：ハンタンウイルス トスポウイルス属（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ） 植物：トマト黄化えそウイルス アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ） アレナウイルス属（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ） 脊椎動物：リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス テヌイウイルス属（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ） 植物：イネ縞葉枯ウイルス これらの分節ウイルスの科から、ヒトに対する潜在的な健康の危険を提示する
ウイルスがとりわけ興味深い。逆遺伝学（もしくはレスキュー）は、ビリオンＲ
ＮＡを活性の転写酵素複合体と集成してゲノムに複製を開始させることにより組
換えインフルエンザＡ型の産生経路を提供した（江波（Ｅｎａｍｉ）とパレイス
（Ｐａｌａｓｅ））。該方法は、ｃＤＮＡコピーのインビトロ転写、（天然のも
しくは突然変異された）所望のウイルス遺伝子分節をｖＲＮＡのコピーに創製す
ること、そしてウイルスを回収することを必要とする。ｖＲＮＡを、（精製され
たビリオンから得られた）ＲＮＰタンパク質と混合し、そしてその後ヘルパーウ
イルス（例えば、所望の組換えウイルスに対応する野性型ウイルス）とともに細
胞にトランスフェクションする。例えば、組換えインフルエンザＡ型の調製にお
いて、インフルエンザＡ型ウイルスを使用して、トランスフェクションされたＲ
ＮＡ遺伝子を複製するタンパク質を提供する。組換えウイルスおよびヘルパーウ
イルスの混合物を形成する。ヘルパーウイルスは大過剰で存在するため、抗体選
択系のような強い選択系を使用して子孫を選択的に分離する（江波（Ｅｎａｍｉ
）とパレイス（Ｐａｌａｓｅ）、１９９１）。本発明の熱ショック処置を使用し
て、生じる混合物の体積、ならびに、適切なレスキュー組成物にさらすことによ
り得られた組換えウイルス、ＲＮＡ、ＲＮＰ、およびヘルパーウイルスを用いて
共感染を実施する場合の活性の転写酵素複合体のようないずれかの付加的成分の
量を増大させ得る。
【００５５】 とりわけ、本発明の熱ショック処置は、１０種のインフルエンザＡ型ウイルス
にコードされるタンパク質のｃＤＮＡクローンを発現するワクシニア−Ｔ７ポリ
メラーゼによりＣＯＳ−細胞中で合成のインフルエンザ様のＣＡＴ：ＲＮＡミニ
ゲノムをパッケージングすることによりウイルス様粒子を製造するのに使用され
る処置の効率を向上させるのにもまた使用し得る（メナ（Ｍｅｎａ）ら、１９９
６）。付加的な一態様において、本発明の熱ショック処置は、ブニヤンベラブニ
ヤウイルスの分節の負鎖のＲＮＡゲノムのレスキューについてのヘルパーに依存
しない系の効率の向上で使用し得る（ブリジェン（Ｂｒｉｄｇｅｎ）とエリオッ
ト（Ｅｌｉｏｔｔ）、１９９６）。本系は、（分節のインフルエンザウイルスの
レスキューについて記述されるものよりもむしろ）非分節の負センスのＲＮＡウ
イルスのレスキュー実験に使用されるものに類似である。３種のブニヤンベラブ
ニヤウイルスのＲＮＡゲノムの分節の完全長のｃＤＮＡコピーを含有するプラス
ミドが構築され、そして、正確なゲノム末端をもつＲＮＡのゲノムのコピーを生
じさせるように、Ｔ７プロモーターおよびリボザイム配列により隣接された。Ｔ
７ポリメラーゼおよび組換えのブニヤンベラブニヤウイルスタンパク質を発現す
る細胞をこれらのプラスミドでトランスフェクションした場合、完全長のアンチ
ゲノムＲＮＡが転写されかつ細胞内で被包化され、そしてこれらは順に複製され
そして感染性のブニヤウイルス粒子にパッケージングされた。
【００５６】 ＣＤＶのＬポリメラーゼ活性がｈｓｐ７２により刺激される（オグルスビー（
Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）ら、１９９６）ことを示す結果と組み合わせられた、熱ショ
ックが組換えＭＶのレスキューを高めかつＭＶミニレプリコンからのＣＡＴレポ
ーター遺伝子の発現を増大させるという本明細書に記述される観察結果は、ｈｓ
ｐ７２の誘導が本明細書に記述される熱ショックの影響の本質的原因であるかも
知れないという確信を生じさせる。この可能性を、ＣＡＴミニレプリコン実験の
間に発現ベクターからｈｓｐ７２の遺伝子の一を発現させることにより検査した
。エピトープに標識をつけられたバージョンのｈｓｐタンパク質の発現がウェス
タンブロット分析により確認された（実施例６）。ｈｓｐ発現ベクターの存在は
、トランスフェクションされた細胞でのＣＡＴレベルを２０倍まで増加させた（
実施例６）。これらの結果は、ｈｓｐ７２の高レベル発現がウイルスレスキュー
の効率を増大させるかも知れないことを示唆する。さらに、これらの結果は、高
レベルのｈｓｐ７２を発現する安定な細胞系がレスキューに好都合かも知れない
ことを意味する。理想的には、安定な細胞系は、ｈｓｐ７２遺伝子の発現の量を
調節し得るような誘導可能なプロモーターからｈｓｐ７２を発現するとみられる
。これは、レスキューを最大限にしかつまたｈｓｐ遺伝子の構成的な高レベル発
現の細胞系に対するいかなる潜在的な毒性の影響も回避するとみられる、誘導時
間の持続期間および誘導レベルの選択を可能にするとみられる。
【００５７】 本発明の方法から産生される組換えウイルスを診断および治療の応答に使用し
得る。好ましくは、本発明の方法から産生される組換えウイルスは、単独で、ま
たは医薬、抗原、免疫剤もしくはアジュバントとともに、ウイルス性疾患の予防
もしくは改善におけるワクチンとして使用される。これらの有効成分は、慣習的
手段、すなわち、希釈剤もしくは製薬学的に許容できる担体を使用することによ
り処方かつ送達し得る。
【００５８】 以下の実施例は具体的説明として提供され、そして、上述されるような本発明
を制限するとして解釈されるべきでない。 実施例 方法および材料 細胞、ウイルスおよびトランスフェクション ２９３−３−４６細胞（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）および２９
３細胞（グレアム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７）を、１０％ウシ胎児血清（Ｆ
ＢＳ）で補充されたダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
２９３−３−４６細胞は、１ｍｌあたり１．５ｍｇのＧ４１８（ジェネティシン
、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）を含有する培地での選択を用いて成長させた
。ベロ細胞は５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で成長させ、また、ＨｅＬａ懸濁
細胞は１０％ＦＢＳで補充された最小必須培地（ＳＭＥＭ）中で成長させた。Ｍ
Ｖ（エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ型）は、以前に記述されたとおり
（ウデム（Ｕｄｅｍ）、１９８４）ＨｅＬａ懸濁培養物中で増殖させた。
【００５９】 トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法（アウスベル（Ａｕｓｕｂ
ｅｌ）ら、１９８７；グレアム（Ｇｒａｈａｍ）とファン・デル・エプ（ｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｂ）、１９７３）を使用して実施した。トランスフェクションに使
用された２９３−３−４６もしくは２９３細胞は、６穴プレートに植え付け、そ
して約５０〜７５％コンフルエントまで成長させた。細胞は、トランスフェクシ
ョンの１〜３時間前は、Ｇ４１８を欠く４．５ｍｌの新鮮な培地で養った。水中
２２５μｌの最終体積中で適切なＤＮＡを組み合わせること、次いで２５μｌの
２．５Ｍ ＣａＣｌ2を添加することにより、トランスフェクション混合物を調
製した。２５０μｌの２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水（２８０ｍＭ ＮａＣｌ
、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）をゆっく
りと添加しつつ、ＤＮＡ−カルシウム混合物を穏やかにボルテックス攪拌した。
沈殿を室温で２０分間そのままにさせ、その後細胞に添加した。細胞を一夜（１
４〜１６時間）インキュベーションし、その後トランスフェクション培地を除去
し、そして細胞をすすぎかつＧ４１８を欠く新鮮な培地で養った。トランスフェ
クション培地を除去した後に、細胞あたり５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で、ト
ランスフェクションされた細胞の感染を実施した。感染は、培地を交換する前に
２時間インキュベーションした。この時点で、熱ショックされるはずであった細
胞を含有する皿をパラフィルムで覆い、そして４４℃の水浴に移し、そして３７
℃のインキュベーターに移す前に３時間インキュベーションした。細胞は、一過
性の遺伝子発現の分析のためにトランスフェクションの開始４８時間後に収穫し
たか、またはレスキュー実験のために７２時間（もしくは別に本明細書に示され
るとおり）で収穫した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）アッセイを、既に記述されたとおり（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５
、およびパークス（Ｐａｒｋｓ）とシェンク（Ｓｈｅｎｋ）、１９９６）実施し
た。
【００６０】 単層の上で培地を反復してピペットで出し入れして細胞をはがしかつ単層を小
さな凝集塊に砕くことにより、ウイルスのレスキューのため収穫された細胞をウ
ェルから取り出した。細胞解離剤は使用しなかった。１０ｃｍ皿上の１０ｍｌの
培地中で成長するベロ細胞のコンフルエント近くの単層上に、細胞および５ｍｌ
の培地を直ちに分配した。４ないし５日後にプラークが見え、そして単層をプラ
ーク計数のため染色したか、もしくは収穫して組換えウイルスストックを調製し
た。
【００６１】 ＲＮＡトランスフェクションは、以下の改変を伴い、ＤＮＡについて上述され
たとおり実施した。メガスクリプト（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ）キット（アンビオ
ン（Ａｍｂｉｏｎ））のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ試薬を使用して、トランスフ
ェクションのためのＲＮＡをインビトロで調製した。ＲＮＡ−リン酸カルシウム
沈殿を２９３細胞とともに５〜６時間インキュベーションし、そしてその後除去
した。トランスフェクションおよび感染は、トランスフェクション培地へのウイ
ルスの添加により同時に実施した。トランスフェクション−感染培地を交換した
後に、適切な細胞サンプルを４３〜４４℃で熱ショックした。トランスフェクシ
ョン／感染の開始後２４〜４８時間で細胞を収穫した。 組換えＤＮＡ 完全長のＭＶのｃＤＮＡプラスミド（ｐ（＋）ＭＶ）およびＭＶのＬ遺伝子発
現プラスミド（ｐＥＭＣ−Ｌａ）は、ビレター（Ｍａｒｔｉｎ Ｂｉｌｌｅｔｅ
ｒ）およびラデケ（Ｆｒａｎｋ Ｒａｄｅｃｋｅ）（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）
ら、１９９５）により恵与された。ＣＡＴミニレプリコンの調製法は記述されて
いる（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５）。熱ショックされた２９３−３−４
６細胞から抽出されたＲＮＡからのｃＤＮＡを増幅することにより、ｈｓｐ７０
発現プラスミドをクローン化した（ハント（Ｈｕｎｔ）と森本（Ｍｏｒｉｍｏｔ
ｏ）、１９８５）。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、およびタイタン（Ｔｉｔａｎ）キット試薬（ベーリンガー マン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で見出されるＰｗｏ ＤＮ
Ａポリメラーゼを含有する高忠実度酵素混合物を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ／
ＰＣＲ）反応を実施した。ｈｓｐ７０のｃＤＮＡを発現プラスミドｐＣＧＮ（田
中（Ｔａｎａｋａ）とヘル（Ｈｅｒｒ）、１９９０）にクローン化して、アミノ
末端のコーディング領域にインフルエンザＨＡエピトープ標識(tag)を含有する
発現構築物を生じさせた。 ＤＮＡ配列決定 ＲＴ／ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを配列決定することにより、ＭＶの配列
を決定した。グアニジウム−イソチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽
出法（コムチンスキ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッキ（Ｓａｃｃｈｉ）、１
９８７）により、ＭＶに感染した細胞からのＲＮＡを調製し、そして、タイタン
（Ｔｉｔａｎ）キット（ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ））中の試薬を使用してＲＴ／ＰＣＲを実施した。増幅されたＤ
ＮＡは低融点アガロースゲルでゲル精製した。色素ターミネーター反応（アプラ
イド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用し
てＰＣＲフラグメントを配列決定し、そしてＡＢＩ プリズム［Ｐｒｉｓｍ］（
商標）自動シークェンサー（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
）で分析した。プラスミドＤＮＡの配列の確認もまた自動シークェンサーで実施
した。 実施例１ ｃＤＮＡレスキュープロトコル 本プロトコルを図１に要約する。
【００６２】 トランスフェクションを開始する前日に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およ
び１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８抗生物質で補充されたＤＭＥＭを使用して、２９
３−３−４６細胞を６穴プレートに分割する。翌日の使用が期待される場合は、
１個のコンフルエントの１０ｃｍプレートを６穴皿で分割する。組換えウイルス
の回収の見込みを増大させるため、レスキュー実験あたり１２個のウェルをトラ
ンスフェクションする。
【００６３】 トランスフェクションの約１ないし３時間前に、１０％ＦＢＳ（Ｇ４１８なし
）で補充された４．５ｍｌのＤＭＥＭで各ウェル中の培地を置き換え、そしてそ
の後トランスフェクションを開始する。 リン酸カルシウム沈殿： ２２５μｌの体積中の水およびＤＮＡを滅菌の５ｍｌポリプロピレンチューブ
中で組み合わせる。１トランスフェクションあたりに５μｇのｐ（＋）ＭＶおよ
び１００ｎｇのＬ発現プラスミド（ｐＥＭＣ−Ｌａ）を使用する。２５μｌの２
．５Ｍ ＣａＣｌ2を添加しかつ混合する。チューブを穏やかにボルテックス攪
拌しながら２５０μｌの２×ＨＢＳを一滴ずつ添加する。ＨＢＳを添加した後、
チューブを室温で１５〜２０分間そのままにする（ＨＢＳは、２×ＨＥＰＥＳ緩
衝生理的食塩水、すなわち２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら
、１９８７））。大量の母型(master)トランスフェクション混合物を作成するよ
りもむしろ各ウェルについて個々のトランスフェクションを設定することが役立
つ。沈殿を一滴ずつ培地に添加し、そして細胞を約１２ないし１６時間、一夜イ
ンキュベーションする。
【００６４】 その後、培地を除去しかつ細胞を洗浄する。細胞はＨＥＰＥＳ／生理的食塩水
溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐ
Ｈ７．２）で２回すすぐ。細胞をインキュベーションする前に、５ｍｌの培地（
ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、Ｇ４１８なし）を添加する。
【００６５】 熱ショック：上述されたとおり新鮮な培地を添加した後に、６穴プレートをパ
ラフィルムで封止し、そして蓋のついたタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ
）容器に移す。該容器を４３〜４４℃の水浴に沈めそして３時間インキュベーシ
ョンする。この熱ショック段階の後にパラフィルムをプレートから除去し、そし
て細胞を３７℃のインキュベーターに移す。細胞はトランスフェクションの開始
後合計で約７２時間インキュベーションする。
【００６６】 インキュベーションが完了した後、ベロ細胞を用いてプラーク拡大段階を実施
する。ベロ細胞は、１枚の１０ｃｍプレートを４もしくは５枚の１０ｃｍプレー
トに分割することにより、使用前日に調製する。一夜インキュベーションの後の
細胞は約７５％コンフルエントである。トランスフェクションされたウェル１個
あたり１枚のベロ細胞のプレートが存在するように十分なプレートを準備する。
トランスフェクションの開始後約７２時間で、トランスフェクションされた２９
３−３−４６細胞の各ウェルを、ベロ細胞を含有する１０ｃｍプレートに移す。
５ｍｌの培養培地を細胞上で反復してピペットで出し入れしてそれらをウェルか
ら移動させかつ単層を小さな細胞凝集塊に砕くことにより、２９３−３−４６細
胞を移動させる。細胞の溶解を回避するがしかし細胞を移動させるのに十分力強
くピペットで出し入れせよ。その後、トランスフェクションされた細胞凝集塊を
含有する５ｍｌの培養培地を、既に１０ｍｌの培養培地を含有するベロ細胞の１
０ｃｍプレートに分配する。レスキュー系に依存して、プラークを可視化するの
に十分な時間（約４〜５日）を与えるべきである。細胞を掻き取りかつそれらを
遠心分離により収集することにより、組換えウイルスを収穫する。細胞を、血清
を欠く１ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）に再
懸濁し、そして１回凍結融解してウイルスを遊離させる。 実施例２ 本実施例では、実施例１に記述されたレスキュー方法を、熱ショックを適用し
なかった対照と一緒に６回反復した。６回の独立したレスキュー実験からの結果
を図５に示す。全部の実験で使用されたＭＶのｃＤＮＡはエドモンストン（Ｅｄ
ｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ型配列（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）を含有し
た。上述されたとおりトランスフェクションを実施し、そして熱ショックインキ
ュベーションは４４℃で３時間であった。実験１でプラスもしくはマイナスのプ
ラークを評価し(scored)、そして残存する実験でプラークを計数した。本実施例
で実施された実験は以下を示した。すなわち 慣習的レスキュー技術（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の２点の改
変、すなわち１回の熱ショック段階および１回のプラーク拡大段階は、それぞれ
、組換えウイルスを産生したトランスフェクションされた培養物の数の大きな増
大で有効であった。これらの改変を使用する前には、トランスフェクションされ
た培養物の約２〜３％のみが組換えウイルスを産生した。上の処置において、ト
ランスフェクションされた培養物の５０から約９０％までが組換えウイルスを産
生した。 実施例３ プラーク拡大の改変 実施例１のレスキュープロトコルのプラーク拡大段階は、以下の型の実験から
確立した。それらは熱ショック処理の非存在下で実施する。
【００６７】 ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）により概説された手順に従いつつ、
実施例２のプラーク拡大段階を伴わずに実験を実施した。これらの実験では、ト
ランスフェクションされた細胞を、６穴皿中の１個のウェルから１枚の１０ｃｍ
プレートに移して、４〜５日の付加的な細胞成長およびプラークが発生するため
の追加の時間を可能にした。この処置を使用してはプラークが検出されなかった
。第二の型の実験においては、トランスフェクションされた細胞を掻き取りおよ
び遠心分離により収穫し、そして血清を含まないＯＰＴＩＭＥＭ（ライフ テク
ノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイター
スバーグ）培地に再懸濁した。細胞を１回の凍結融解周期にさらしてウイルスを
遊離させ、そして、この細胞ライセートを、約７５％コンフルエントであったベ
ロ細胞を含有する１枚の１０ｃｍ皿に適用した。４ないし５日後、ベロ細胞をプ
ラークについて検査した。培養物の約２〜３％が麻疹ウイルスプラークについて
陽性であった。実施例２に概説されたプラーク拡大プロトコルに従い、記述され
たとおりの２％の成功率を上回る１０〜２０倍の向上が達成された。細胞が、実
施例２に示されたようなプラーク拡大段階に先立ち凍結融解周期にさらされてい
ないことが重要なようである。 実施例４ 熱ショックはミニレプリコンからの発現を増大させる 熱ショック後の向上されたレスキューの結果の潜在的なメカニズムを検査する
ため、ＭＶミニレプリコンからの遺伝子発現に対する熱ショックの影響を試験し
た（結果については図２を参照されたい）。ミニレプリコンのプラスミド（ｐＭ
Ｖ１０７ＣＡＴ）は、ＭＶの末端により隣接されるＣＡＴ遺伝子の負センスのＲ
ＮＡのコピーの、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ媒介性の合成を指図するように設計
した（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５）。本プラスミドを使用して、ミニレ
プリコンＲＮＡの細胞内合成のために２９３−３−４６細胞をトランスフェクシ
ョンした。２９３−３−４６細胞におけるミニレプリコンＲＮＡの複製および発
現は、感染により提供されるＭＶタンパク質での補完(complementation)により
実施したか、もしくは、（該細胞がＮおよびＰタンパク質双方を提供するため）
Ｌ発現プラスミドで補完した。２９３−３−４６細胞をＭＶ−ＣＡＴミニレプリ
コンプラスミドＤＮＡ（１μｇ）で一夜トランスフェクションした。若干のトラ
ンスフェクション（レーン３および７）はＬの補完を提供するためにＭＶのＬ遺
伝子発現プラスミド（１００ｎｇ）もまた受領した。トランスフェクションの約
１４時間後に培地を交換し、そして、該細胞を、細胞あたり５ｐｆｕ（プラーク
形成単位）でＭＶに２時間感染させた（レーン４および８）。感染後、培地を交
換し、そして適切な細胞培養物（レーン５〜８）を４４℃で３時間熱ショックし
た。トランスフェクションの開始４８時間後に細胞を収穫し、そしてＣＡＴアッ
セイを上の方法に記述されるとおり実施した。
【００６８】 該ミニレプリコンの発現に対する熱ショックの影響を検査する場合、熱ショッ
クを使用するレスキューはＣＡＴ遺伝子活性の強い増大を生じさせた（図２）。
図２に示される実験はミニレプリコンＤＮＡを用いて実施し、また、細胞をトラ
ンスフェクション４８時間後に収穫したことを除いてレスキュー実験に類似に実
施した。トランスフェクション培地の除去後、トランスフェクションされた細胞
を細胞あたり５ｐｆｕで感染させることにより、ウイルスによる補完を実施した
。Ｌ発現プラスミドでの補完はミニレプリコンＤＮＡでのコトランスフェクショ
ンにより単純に行った。この結果は、いずれの形態の補完を使用した場合にも熱
ショックが発現を刺激することを示す。複数の実験において、Ｌ発現プラスミド
での補完により生じられたＣＡＴ発現は、熱ショックにより２から１０まで倍増
大した（レーン３および７を比較せよ）。同様に、ＣＡＴ活性は、ウイルス補完
を使用した場合にもまた増大し、そして約５倍の増強をもたらした（レーン４お
よび８）。期待されたとおり、ＣＡＴプラスミド（レーン１および５）もしくは
Ｌ補完の供給源（レーン２および６）を受領しなかった陰性対照のトランスフェ
クションは、非常に低レベルの背景ＣＡＴ活性を生じた。 実施例５ ミニレプリコンの増大された発現が熱ショック後により高レベルのＴ７ポリメ
ラーゼ活性に関連づけ得た可能性が存在した。より高いＴ７ポリメラーゼ活性は
、熱ショック後の２９３−３−４６細胞での該遺伝子の増大された発現から生じ
るかも知れなかった。Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は２９３−３−４６細胞中でＣＭ
Ｖの前初期プロモーター／エンハンサーから発現され（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ
）ら、１９９５）、また、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーは熱ショックに応
答することが示されている（アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）、ニューバウン
ド（Ｎｅｗｂｏｕｎｄ）とレアモア（Ｌａｉｒｍｏｒｅ）、１９９７）。この可
能性を排除するために、細胞をミニレプリコンＲＮＡでトランスフェクションし
、そして実施例４で使用されたような熱ショック処理にかけた。加えて、本実施
例では、熱ショックの影響が２９３−３−４６細胞系中に存在するＭＶ遺伝子の
増大された発現に関連付けられた可能性を排除するために、ＲＮＡトランスフェ
クションを２９３細胞で実施した（グレアム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７）。
２９３−３−４６細胞はいかなるＭＶ遺伝子も安定に発現しない。本実験で使用
されたトランスフェクションプロトコルは、ＲＮＡトランスフェクションを適応
させるように改変した（上の方法のセクションを参照されたい）。５μｇのＲＮ
Ａをリン酸カルシウム処置によりトランスフェクションした。培地にトランスフ
ェクション混合物を添加した直後にウイルスを添加することにより、適切な細胞
のＭＶ感染を実施した。細胞に沈殿を添加した後に、ＭＶ（細胞あたり５ｆｐｕ
、図３のレーン３および６）を培養培地に添加して直ちに感染を開始し、それが
ヌクレオキャプシド中にパッケージングされ得る前に細胞内のＲＮＡ分解の機会
を小さくした。５〜６時間のトランスフェクション−感染のインキュベーション
後に培地を交換し、そして、適切な細胞サンプルを、３７℃に戻す前に４４℃で
２時間熱ショックした。ＣＡＴアッセイのため、トランスフェクション−感染の
開始２４〜４８時間後に細胞抽出物を調製した。
【００６９】 ＲＮＡトランスフェクションからの結果はＤＮＡトランスフェクションの結果
に類似であった。熱ショックは、感染した細胞でのＣＡＴの発現を本質的に増大
させた（図３、レーン３および６を比較せよ）。ミニレプリコンＲＮＡ（レーン
１および４）もしくはウイルス補完（レーン２および５）を受領しなかった細胞
ではＣＡＴ活性は観察されなかった。ＲＮＡトランスフェクションの結果は、増
大されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ活性が、図２に示されるＤＮＡトランスフェ
クション実験での熱ショックの影響の原因であった可能性もまた排除する。 実施例６ ミニレプリコン発現のＨｓｐ７０による刺激 オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）らは、誘導可能なｈｓｐ７０のアイソフォ
ームｈｓｐ７２がＣＤＶヌクレオキャプシドとともに共精製すること、および、
これらのヌクレオキャプシドは高められたインビトロ転写活性を示すことを決定
した（オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）、リングラー（Ｒｉｎｇｌｅｒ）とク
ラコウカ（Ｋｒａｋｏｗｋａ）、１９９０；オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）
ら、１９９６）。ｈｓｐ７２が上の実施例で観察された熱ショックの影響に関与
したかどうかを評価するため、実施例１の熱ショック処理の代わりにｈｓｐ７０
遺伝子の過剰発現を本質的に用いた実験を実施した（結果を図４に示す）。誘導
可能なｈｓｐ７０のｃＤＮＡ（ハント（Ｈｕｎｔ）と森本（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）
、１９８５、ウ（Ｗｕ）ら、１９８５）を、実施例２に従った熱ショックされた
細胞から調製されたＲＮＡからクローン化した。該ｃＤＮＡを、ｆｌｕエピトー
プ標識と一緒にＣＭＶ発現ベクター、プラスミドｐＣＧＮ（田中（Ｔａｎａｋａ
）、１９９０）にクローン化した。ｈｓｐ７０遺伝子のアミノ末端コーディング
領域を、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを有するインフルエンザＨＡエピトープ標識に
融合した（田中（Ｔａｎａｋａ）および３７５−３８６．、１９９０）。ＨＡエ
ピトープを含有するアミノ末端をもつｈｓｐ７０タンパク質を発現するようにｈ
ｓｐ７０のｃＤＮＡをクローン化した。このプラスミドの使用は、内在性のｈｓ
ｐ７０アイソフォームの背景の存在下でさえ、インフルエンザ標識に対する抗体
を使用してｈｓｐ７０のｃＤＮＡの発現をたどることを可能にする。トランスフ
ェクションされた細胞から調製された全細胞抽出物を、エピトープ標識に特異的
な抗体を使用するウェスタンブロッティング（パークス（Ｐａｒｋｓ）とシェン
ク（Ｓｈｅｎｋ）、１９９６）により分析した（図４Ａ）。トランスフェクショ
ンされた細胞からの抽出物のウェスタン分析は、発現プラスミド（図４Ａ）が、
わずかにより大きい７０ｋＤの標識されたポリペプチドを生じさせることを示し
た。
【００７０】 Ｌ発現プラスミドおよびミニレプリコンＤＮＡと一緒のｈｓｐ７０発現ベクタ
ーでの２９３−３−４６細胞のコトランスフェクションは、ＣＡＴの増大された
発現をもたらした（図４Ｂを参照されたい）。この一過性アッセイ系においては
、ｈｓｐ７０の過剰発現は低レベルのＬ補完を２０倍程度増大させた。ｈｓｐ７
０発現ベクターにより誘導されたＣＡＴ発現のこの増大は明白に特異的であった
。なぜなら、それはＬポリメラーゼプラスミドの存在を必要とし、かつ、Ｌが非
存在であるかもしくはＣＡＴプラスミドがトランスフェクションから省かれる場
合に観察された背景のＣＡＴ活性を増大しないからである。これらの結果は、ｈ
ｓｐ７０がミニゲノム発現に対する熱ショックの影響の少なくとも部分的原因で
あることを強く示唆する。 実施例７ ベロ細胞におけるミニレプリコン発現の熱ショックレスキュー 実施例４に対する追跡として、２９３−３−４６細胞をベロ細胞により置き換
えた。 材料：ベロ細胞のトランスフェクション実験のため、麻疹タンパク質Ｎ、Ｐおよ
びＬをプラスミドＤＮＡにより提供し、また、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをＭＶ
Ａ／Ｔ７（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら）感染により提供する。トランスフェク
ションは、１００ｎｇのミニレプリコン、４００ｎｇのＮプラスミド、３００ｎ
ｇのＰプラスミド、および以下の表２に示されたとおりのＬプラスミドの量を包
含した。陰性対照トランスフェクションはＬプラスミドの支持を欠いた。加えて
、トランスフェクション試薬としてリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ
）（ライフ テクノロジーズ インク（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）、メリーランド州ゲイタースバーグから購入された）を用いてベロ細
胞をトランスフェクションした。各試験について、トランスフェクション反応あ
たり２プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＭＶＡ／Ｔ７（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）
ら）を使用する。２体積のリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）を試験
して、効率的なベロ細胞トランスフェクションに対する至適の量を決定した。ト
ランスフェクションは、２種の異なる量のＬタンパク質発現プラスミドを用いて
実施する。熱ショックのためには、細胞を４４℃の水浴に３時間移す。対照細胞
は熱ショックしない。 ＭＶＡ／Ｔ７：ＭＶＡ／Ｔ７は、１１Ｋの強い後期プロモーターの調節下に、組
込まれた一コピーのＴ７遺伝子−１を含有するハイブリッドウイルスである（ワ
イアット（Ｗｙａｔｔ）ら １９９５）。 実験プラスミド： Ｌプラスミドはラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）に
より提供された。基本的に、ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）により開
示されたクローニング方法により、麻疹Ｌ遺伝子をｐＥＭＣプラスミドベクター
（モス（Ｍｏｓｓ）ら、１９９０）にクローン化してプラスミドｐＥＭＣ−Ｌａ
を生じさせた。このベクターは、クローン化された遺伝子の真核生物細胞中での
発現を助長するための内部リボソーム侵入部位および３’端のポリ−Ａ配列を包
含する。同一のベクターを使用して、ＮおよびＰ遺伝子のそれぞれのついてのベ
クターを調製した。ＮおよびＰタンパク質のコーディング領域は、麻疹ウイルス
ゲノムのｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９
９５）、その後、ベクターｐＥＭＣのＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にク
ローン化してｐＴ７−ＮおよびｐＴ７−Ｐを生じさせた。 熱ショックのためのベロ細胞のプロトコル： リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）およびエフェクティーン（ＥＦＦ
ＥＣＴＥＮＥ）について リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）： ベロ細胞がおよそ５０〜８０％コンフルエントになるまでそれらを６穴培養皿
で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、よ
り高い細胞密度はトランスフェクション、ＭＶＡ／Ｔ７感染および熱ショックの
間に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、約７５％コンフルエントの細胞
が望ましい。トランスフェクションのためのＤＮＡ−脂質混合物は、微小遠沈管
中でＤＮＡ（Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭＶミニレプリコン）ならびに２００μｌの血清
を含まないＤＭＥＭを組み合わせることにより調製する。ＤＮＡ−培地混合物に
リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（実験に依存して１２もしくは１
５μｌ）を添加し、そして穏やかに混合し、次いで室温で２０分インキュベーシ
ョンする。インキュベーションの終了時に、ＤＮＡ−リポフェクテース（ＬＩＰ
ＯＦＥＣＴＡＣＥ）混合物を、適切な量のＭＶＡ／Ｔ７を含有する８００μｌの
血清を含まないＤＭＥＭと組み合わせて、細胞あたりおよそ２ＰＦＵの最終量を
生じさせる。ベロ細胞培養物から培地を除去し、そしてＤＮＡ、リポフェクテー
ス（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）およびＭＶＡ／Ｔ７を含有するトランスフェクシ
ョン混合物で置き換える。５％ＣＯ2に設定された３７℃のインキュベーター中
で細胞を２〜６時間インキュベーションする。ベロ細胞については、このインキ
ュベーションは２〜３時間で至適であると思われる。このインキュベーション期
間の終了時に、１０％ウシ胎児血清で補充された１ｍｌのＤＭＥＭを細胞に添加
し、そして適切な細胞培養物を４４℃で２〜３時間熱ショックにかける（３時間
がベロ細胞に至適なようである）。熱ショックを実施するために、６穴プレート
をジップロック（Ｚｉｐｌｏｃｋ）プラスチック袋に移し、そしてその後４４℃
の水浴に沈める。２〜３時間の熱ショック期間の終了時に、細胞をプラスチック
袋から取り出し、そして一夜インキュベーションのため３７℃のインキュベータ
ーに戻す。翌日、培地を、１０％ウシ胎児血清を含有する２ｍｌの新鮮なＤＭＥ
Ｍで置き換える。トランスフェクション後およそ４８時間で、細胞を収穫してＣ
ＡＴアッセイのための抽出物を調製するか、もしくは、細胞を収穫し、そしてベ
ロ細胞の単層を含有する１０ｃｍ皿に移してプラーク拡大を可能にする。
【００７１】 細胞をその後ＣＡＴ活性について分析した。１２μｌのリポフェクテース（Ｌ
ＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）および１００ｎｇのＬプラスミドの条件下で使用された
場合、ＣＡＴ活性は熱ショックにより約７倍刺激された。１５μｌのリポフェク
テース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）および１００ｎｇのＬプラスミドの条件下で
使用された場合は、ＣＡＴ活性が熱ショックにより約２倍刺激された。以下の表
２を参照されたい。
【００７２】
【表１】
【００７３】 実施例８ ベロ細胞における熱ショックレスキューのためのトランスフェクション促進試薬
の比較 上の実験を、リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）もしくはエフェク
ティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアジェン インク（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ
．）、カリフォルニア州ヴァレンシア）のいずれかを使用して反復した。
【００７４】 エフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）についてのプロトコルは、ＤＮＡ−
脂質混合物の調製を除き本質的に同一である。ＤＮＡは、エフェクティーン（Ｅ
ＦＦＥＣＴＥＮＥ）試薬とともに供給される緩衝生理的食塩水１００μｌと混合
する。その後、８μｌのエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）濃縮試薬を添
加し、そして該混合物を室温で５分間インキュベーションする。次に、２５μｌ
（もしくは図で指定された量）のエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）を添
加し、そして該混合物を追加の１５分間インキュベーションする。１５分のイン
キュベーション後に、ＤＮＡ−エフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）複合体
を、細胞あたりおよそ２ＰＦＵを提供するように、十分なＭＶＡ／Ｔ７を含有す
る９００μｌの血清を含まない培地と混合する。この段階で、細胞へのＤＮＡ−
ＭＶＡ／Ｔ７混合物の適用および全部のその後の段階は、リポフェクテース（Ｌ
ＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）についてたどられた段階に同一である。
【００７５】 結果を以下の表３ａおよび３ｂに示す。（Ｌｉｐｏ＝リポフェクテース（ＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＡＣＥ））。トランスフェクション後２時間で熱ショックを実施し
た場合は、ミニレプリコン活性が増大した。
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
【００７８】 実施例９ 改変緩衝液技術を用いるベロ細胞のトランスフェクション 材料：ＢＥＳは：｛Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタン
スルホン酸｝である。 ＢＥＳ／リン酸カルシウム処置を使用するレスキューのためのベロ細胞のトラン
スフェクション ベロ細胞は、それらがおよそ５０〜８０％コンフルエントになるまで６穴培養
皿で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、
より高い細胞密度は、トランスフェクション、ＭＶＡ感染および熱ショックの間
に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、細胞は約７５％コンフルエントで
ある。トランスフェクションの日、細胞をウェルあたり４．５ｍｌの培地で養い
、そして３７℃（もしくは、温度感受性のウイルスをレスキューする場合は、温
度についてより低い）および３％ＣＯ2に設定されたインキュベーターに移す。
われわれにより慣例に使用される培地は、１０％ウシ胎児血清で補充されたＤＭ
ＥＭである（他の培地が役に立つことができる）。細胞を養ったおよそ２ないし
４時間後にトランスフェクションを開始する。トランスフェクションのためのＤ
ＮＡ−リン酸カルシウム沈殿を５ｍｌのポリプロピレンチューブ中で調製する。
Ｎ、ＰおよびＬのための発現プラスミドならびにＭＶレプリコンを包含するレス
キューのためのＤＮＡを、２２５μｌの最終体積まで水と組み合わせる。次に、
２５μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ2を添加し、そしてチューブを穏やかに混合する
。ＤＮＡ−ＣａＣｌ2混合物の全部を調製した後に、２５０μｌの２×ＢＥＳ緩
衝生理的食塩水（２×ＢＢＳ：２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4、５０ｍＭ ＢＥＳ、ｐＨ６．９５−６．９８）を添加することにより沈殿
を調製する。２×ＢＢＳは、ＢＢＳ添加の間継続的に穏やかにボルテックス攪拌
しつつ、各チューブに１滴ずつ添加する。２×ＢＢＳを添加した後に、チューブ
を室温で２０分インキュベーションする。室温インキュベーションの終了時に、
５００μｌの沈殿を細胞に１滴ずつ添加し、そしてプレートを穏やかに揺すって
培地との沈殿の混合を確実にする。沈殿を添加した後に、およそ２プラーク形成
単位（ｐｆｕ）のＭＶＡ／Ｔ７もしくはＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６を培地に直接添
加し、そしてプレートを穏やかに揺すって混合する。ＧＫ１６を使用する場合は
、ＤＮＡ合成阻害剤をこの段階で培地に添加する。シトシンアラビノシド（ａｒ
ａＣ）もしくはヒドロキシ尿素（ＨＵ）のいずれかを、それぞれ１ｍｌあたり２
０μｇもしくは１０ｍＭ培地に添加する。トランスフェクション後３時間で、細
胞をプラスチックのジップロック袋に移し、そして熱ショックのため４４℃に設
定された水浴に沈める。細胞を４４℃で２〜３時間（より持続される３時間が最
良に作用するとみられる）インキュベーションし、その後、一夜インキュベーシ
ョンのため、３％ＣＯ2に設定されたインキュベーターに戻す。翌日、培地およ
びトランスフェクション成分を細胞から除去し、そしてｈｅｐｅｓ緩衝生理的食
塩水（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）で
細胞を２回洗浄し、その後新鮮な培地を添加する。ＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６に感
染した培養物にＡｒａＣもしくはＨＵを補給する。細胞を、標準的な３７℃およ
び５％ＣＯ2に設定されたインキュベーター中で追加の１日インキュベーション
する（温度感受性ウイルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に
、細胞を適切なより低温で２日インキュベーションし得る）。その後、トランス
フェクションされた細胞をウイルスのレスキューのプラーク拡大段階のために収
穫するか、もしくは、収穫してＣＡＴアッセイのため細胞抽出物を調製する。ト
ランスフェクションされた細胞を培地中に掻き取り、そして、５０％コンフルエ
ントのベロ細胞の単層（もしくは選択すべき他の許容細胞型）を含有する１０ｃ
ｍプレートもしくはＴ２５フラスコのいずれかに移す。共培養される細胞を３７
℃（もしくは上に示されたような適切な温度）で４ないし６時間インキュベーシ
ョンし、その後培地を交換する。この段階での培地の交換は、トランスフェクシ
ョンされた細胞がＤＮＡ合成阻害剤を含有した場合に、プラーク拡大段階の間の
共培養物中での細胞の成長の阻害を回避するために不可欠である。プラーク拡大
段階を開始した後およそ４ないし５日にプラークが見え、そして細胞を収穫して
レスキューされたウイルスの凍結融解ライセートストックを生じさせ得る。ＣＡ
Ｔアッセイの結果を以下の表４ａおよび４ｂに示す。ＢＥＳ／リン酸カルシウム
処置は活性を高めた。
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】 上のトランスフェクション技術については、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９８７
およびトグノン（Ｔｏｇｎｏｎ）ら、１９９６を参照されたい。 実施例１０ ＤＮＡ合成阻害剤、および強い初期／後期プロモーターの制御下にバクテリオフ
ァージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを合成する組換え改変ワクシニアウイルスアン
カラ（ＭＶＡ）の使用に基づく改良されたレスキュー 前述に基づき、ヘルパーＭＶＡ／Ｔ７のウイルスＤＮＡ複製を特異的に阻害す
ることにより、われわれは、１．全部のＭＶＡ／Ｔ７の成長を封鎖する、２．感
染した細胞でのＣＰＥをさらに低下させる、そして３．ＲＮＡウイルスの遺伝子
レスキューの効率を高めることが可能であることが提案された。阻害剤（シトシ
ンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、ＡｒａＣおよび／もしくはヒドロキシ尿素）は
、ウイルスのＤＮＡ合成、そしてその後ウイルスの中期および後期の遺伝子発現
を封鎖する。強い合成の初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御
下に単一コピーのＴ７遺伝子−１を含有する組換えＭＶＡ／Ｔ７（ＭＶＧＫ１６
）を工作した。予備研究［ここでは、麻疹ミニゲノムおよび完全長の麻疹のｃＤ
ＮＡの遺伝子レスキューのためのヘルパーウイルスとしてＭＶＧＫ１６を使用し
た］は、ＡｒａＣもしくはヒドロキシ尿素での感染した細胞の処理が異種ウイル
スの遺伝子レスキューの増強をもたらすことを示した（データは示されない）。
プラスミドおよびウイルス。われわれは、この研究に、ワクシニアウイルスのｐ
ＳＣ６５発現／組換えプラスミドを選んだ。このプラスミドは、遺伝子的に工作
されたウイルスの初期／後期プロモーターの調節下の外来遺伝子の発現を見込み
；それは、ウイルスの７．５Ｋプロモーターの調節下にｌａｃＺ選択マーカーも
また提供する。Ｔ７遺伝子−１（モファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）ら、１９８４）
を、ｐＴ７−ｎｅｏ（リー（Ｓａｌｌｙ Ｌｅｅ）博士、ワイス−レダリー ヴ
ァクシンズ（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）により提供され
た）からＢａｍＨＩフラグメントとして摘出し、そしてｐＳＣ６５（シャクラバ
ルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、１９９７）のＢｇｌＩＩ部位にサブクロ
ーニングしてｐＧＫ１６．２を生じさせた（図６）。色素ターミネーター循環配
列決定および３７７ＡＢＩ ＤＮＡシークェンサー（アプライド バイオシステ
ムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、組換えプラスミ
ドを配列決定した。
【００８２】 細胞あたり０．５プラーク形成単位（ＰＦＵ）に等しい感染多重度（ＭＯＩ）
で、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ；スパファス（Ｓｐａｆａｓ））をＭＶＡに
感染させ、そしてドタップ（ＤＯＴＡＰ）トランスフェクション促進試薬（ベー
リンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用し
てｐＧＫ１６．２でトランスフェクションした。ＭＶＡのＤＮＡでの相同的組換
えは、ウイルスのｔｋ遺伝子の中断、ならびにＴ７遺伝子−１およびｌａｃＺの
挿入をもたらす。Ｘ−ｇａｌ比色プラークアッセイを使用して、組換えウイルス
（ＭＶＧＫ１６）をＣＥＦ細胞上で連続して３回プラーク精製した。組換えＭＶ
ＧＫ１６は、Ｔ７ポリメラーゼおよびワクシニアウイルスに対するウサギポリク
ローナル抗血清での免疫染色により明示されるとおり、３回の連続するプラーク
精製および４回のＣＥＦでの増幅を通じて安定であった（データは示されない）
。 遺伝子レスキュー。Ｔ７転写のための初期／後期プロモーターを含有する発現系
ＭＶＡ／ＧＫ１６で、上のＢＥＳ／リン酸カルシウム処置を反復した。ＢＥＳ／
リン酸カルシウムのための上のレスキュープロトコルに対する改変を本明細書に
示す。ＧＫ１６を使用する場合、ＤＮＡ合成阻害剤をこの段階で培地に添加する
。シトシンアラビノシド（ａｒａＣ）もしくはヒドロキシ尿素（ＨＵ）のいずれ
かを、それぞれ１ｍｌあたり２０μｇもしくは１０ｍＭで培地に添加する。３％
ＣＯ2に設定されたインキュベーター中で細胞を一夜インキュベーションする。
ＢＥＳの実施例についての上のプロトコルに従うことにより、トランスフェクシ
ョンおよび熱ショックを完了する。ＡｒａＣもしくはＨＵは、ＭＶＡ／ＧＫ１６
に感染した培養物に補給する。標準的な３７℃および５％ＣＯ2に設定されたイ
ンキュベーター中で、細胞を追加の１日インキュベーションする（温度感受性ウ
イルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に、細胞を適切なより
低温で２日インキュベーションし得る）。その後、トランスフェクションされた
細胞をプラーク拡大段階のために収穫する。トランスフェクションされた細胞を
培地中に掻き取り、そして、５０％コンフルエントのベロ細胞の単層（もしくは
選択すべき他の許容細胞型）を含有する１０ｃｍプレートもしくはＴ２５フラス
コのいずれかに移す。共培養される細胞を３７℃（もしくは適切な温度）で４な
いし６時間インキュベーションし、その後培地を交換する。トランスフェクショ
ンされた細胞がＤＮＡ合成阻害剤を含有した場合にこの段階で培地を交換するこ
とはとりわけ重要である。プラーク拡大段階の間の共培養物での細胞の成長の阻
害は望ましくない。プラーク拡大段階を開始した後およそ４ないし５日でプラー
クが見えるはずであり、そして細胞を収穫してレスキューされたウイルスの凍結
融解ライセートストックを生じさせ得る。 遺伝子レスキュー実験。上のプロトコルは、レスキューの陽性の表示を伴うウェ
ルの数の一貫した向上をもたらした。以下の表５を参照されたい。実験は、ベロ
細胞での組換えウイルスの第一継代後にプラス（＋）もしくはマイナス（−）を
評価する。陽性ウェル中のプラーク数は１から５０までの範囲にわたった。全部
の実験は、一夜トランスフェクション、およびＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６を使用し
た場合はその後２４時間インキュベーション期間の間に、培地中に２０μｇ／ｍ
ｌのＡｒａＣを含有した。第９日の実験については、ａｒａＣ ＤＮＡ合成阻害
剤の代わりに１０ｍＭのヒドロキシ尿素を用いた。
【００８３】
【表６】
【００８４】 以下に、本明細書に組み込まれた参考文献の一覧を提供する。
【００８５】
【表７】
【００８６】
【表８】
【００８７】
【表９】
【００８８】
【表１０】
【００８９】
【表１１】
【００９０】
【表１２】
【００９１】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 発明にかかる、改変レスキュー処置の流れ図を描く。本処置は、熱ショック段
階の使用、およびベロ細胞の単層へトランスフェクションされた細胞を移すこと
を包含する。
【図２】 発明にかかる、ＣＡＴアッセイの使用による実施例４からのミニレプリコン遺
伝子発現に対する熱ショックの影響を示すオートラジオグラムである。
【図３】 発明にかかる、実施例５のミニレプリコンＲＮＡトランスフェクション実験の
ＣＡＴアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図４Ａ】 発明にかかる、ｈｓｐ７０によるミニレプリコン遺伝子発現の刺激に関する、
実施例６の実験でのＣＭＶ発現ベクターから発現されるエピトープ標識に特異的
な抗体を使用するウェスタンブロットである。
【図４Ｂ】 発明にかかる、ｈｓｐ７０発現ベクター、ミニレプリコンＤＮＡおよびＬ発現
プラスミドでの２９３−３−４６細胞のコトランスフェクションからのＣＡＴア
ッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図５】 発明にかかる、実施例２に記述されるような熱ショックの影響を試験するため
実施した６回の独立したレスキュー実験からのプラークカウントを描く表（表１
）である。熱ショック処置の利点が明確に示される。
【図６】 発明にかかる、実施例１０からのＴ７遺伝子−１を含有するプラスミドｐＧＫ
１６．２の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シドウ，モヒンダージト・エス アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07076 スコツチプレインズ・コンコードロード 2349 (72)発明者 ユデム，スチーブン・エイ アメリカ合衆国ニユーヨーク州10023ニユ ーヨーク・ウエストセブンテイースストリ ート155・アパートメント６ (72)発明者 コバクス，ジエラルド・アール アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07960 モリスタウン・ドラドドライブ６ケイ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA32 CA03 DA03 DA06 EA02 FA02 GA11 4B065 AA26X AA93X AA95X AB01 BA02 CA24 CA45 【要約の続き】 こと；（ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組 成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な 条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること；ならび に、場合によっては（ｃ）生じる組換えウイルスを収穫 することを含んで成る。

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（
    Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖Ｒ
    ＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列
    を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）
    被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードするも
    う１種の単離された核酸分子（１種もしくは複数）を含んで成る最低１種の発現
    ベクターを含んで成るレスキュー組成物の培地中でのトランスフェクションを；
    前記ベクター類の共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条
    件下で実施すること；ならびに、 ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を
    増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること、 を含んで成る、組換えモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）
    ウイルスの産生方法。
  2. 【請求項２】 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項
    １の方法。
  3. 【請求項３】 有効な熱ショック温度が３７℃より上である、請求項１の方
    法。
  4. 【請求項４】 有効な熱ショック温度が、３７℃から約５０℃までの範囲に
    ある、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 有効な熱ショック温度が、３８℃から約４９℃までの範囲に
    ある、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 有効な熱ショック温度が、３９℃から約４８℃までの範囲に
    ある、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 有効な熱ショック温度が、４１℃から約４７℃までの範囲に
    ある、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度
    に約５ないし約３００分間さらされる、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度
    に約１５ないし約２４０分間さらされる、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温
    度に約１５ないし約２００分間さらされる、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 段階（ｂ）の後に、トランスフェクションされたレスキュ
    ー組成物がベロ細胞の最低一層上に移される、請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 ベロ細胞の層が単層である、請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスがヒト、ウシもしくはマウスのウイルスである、
    請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアン
    チゲノムをコードする単離された核酸分子が、１種以上のゲノムもしくはアンチ
    ゲノムの供給源のキメラである、請求項１の方法。
  15. 【請求項１５】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアン
    チゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスもしくは感染性の
    形態の該ウイルスをコードする、請求項１の方法。
  16. 【請求項１６】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアン
    チゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の形態の該ウイルスをコー
    ドする、請求項１の方法。
  17. 【請求項１７】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアン
    チゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスをコードする、請
    求項１の方法。
  18. 【請求項１８】 モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ
    ｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアン
    チゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の弱毒化ウイルスをコード
    する、請求項１の方法。
  19. 【請求項１９】 ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘ
    ｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである、請求項１の方法。
  20. 【請求項２０】 ＲＮＡウイルスがラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒ
    ｉｄａｅ）のウイルスである、請求項１の方法。
  21. 【請求項２１】 ＲＮＡウイルスがフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄ
    ａｅ）のウイルスである、請求項１の方法。
  22. 【請求項２２】 ＲＮＡウイルスが、ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶおよびＢＰＶよ
    り成る群から選択されるウイルスである、請求項１の方法。
  23. 【請求項２３】 ＲＮＡウイルスがＭＶウイルスである、請求項１の方法。
  24. 【請求項２４】 ポリヌクレオチドが、ＲＳＶウイルスより成る群から選択
    されるＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化
    、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がＮ、Ｐ、ＬおよびＭ
    ２である、請求項１の方法。
  25. 【請求項２５】 ポリヌクレオチドがＭＶのゲノムもしくはアンチゲノムを
    コードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク
    質がＮ、ＰおよびＬである、請求項１の方法。
  26. 【請求項２６】 ポリヌクレオチドがＰＩＶ−３のゲノムもしくはアンチゲ
    ノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタ
    ンパク質がＮＰ、ＰおよびＬである、請求項１の方法。
  27. 【請求項２７】 宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１の方法。
  28. 【請求項２８】 宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１の方法。
  29. 【請求項２９】 宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項１の方法。
  30. 【請求項３０】 宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１の方
    法。
  31. 【請求項３１】 宿主細胞がヒト細胞由来である、請求項１の方法。
  32. 【請求項３２】 宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項１の方法。
  33. 【請求項３３】 宿主細胞がヒト胚腎細胞由来である、請求項１の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項１の方法から製造される組換えウイルス。
  35. 【請求項３５】 （ｉ）請求項１の方法から製造される組換えウイルスおよ
    び（ｉｉ）製薬学的に許容できる担体を含んで成る組成物。
  36. 【請求項３６】 ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目
    （Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖
    ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドを
    含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被
    包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低
    １種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレ
    スキュー組成物のトランスフェクションを；前記ベクターの共発現および組換え
    ウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；ならびに、 ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大細胞の最低
    一層上に移すこと、 を含んで成る、組換えモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）
    ウイルスの産生方法。
  37. 【請求項３７】 プラーク拡大細胞の層が単層である、請求項３６の方法。
  38. 【請求項３８】 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求
    項３６の方法。
  39. 【請求項３９】 プラーク拡大細胞が最低約５０％コンフルエントである、
    請求項３６の方法。
  40. 【請求項４０】 プラーク拡大細胞が最低約６０％コンフルエントである、
    請求項３６の方法。
  41. 【請求項４１】 プラーク拡大細胞が最低約７５％コンフルエントである、
    請求項３６の方法。
  42. 【請求項４２】 トランスフェクションされた細胞が、トランスフェクショ
    ンされたウイルスの発生で使用された表面積よりもベロ細胞の表面積がより大き
    いような、プラーク拡大細胞の１個もしくはそれ以上の容器上に置かれる、請求
    項３６の方法。
  43. 【請求項４３】 プラーク拡大細胞がベロ細胞である、請求項３６の方法。
  44. 【請求項４４】 転写ベクターがＴ７ポリメラーゼ遺伝子をさらに含んで成
    る、請求項１の方法。
  45. 【請求項４５】 レスキュー組成物が、未改変もしくは改変ヘルパーウイル
    スをさらに含んで成る、請求項１の方法。
  46. 【請求項４６】 ヘルパーウイルスが、非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウ
    イルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の転写
    にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を提供し、ここで、該レスキュー組成物が改変ヘルパ
    ーウイルスをさらに含んで成る、請求項４５の方法。
  47. 【請求項４７】 Ｔ７遺伝子が後期プロモーターもしくは初期／後期プロモ
    ーターの調節制御下にある、請求項４５の方法。
  48. 【請求項４８】 Ｔ７遺伝子が初期／後期プロモーターの調節下にある、請
    求項４７の方法。
  49. 【請求項４９】 トランスフェクションがＤＮＡ合成阻害剤の存在下で実施
    される、請求項４４の方法。
  50. 【請求項５０】 トランスフェクションのための宿主細胞がベロ細胞である
    、請求項１の方法。
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