CN105039388B - 重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒。在植物细胞中导入质粒载体的混合物，包括（i）一种转录载体，所述转录载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子中含有编码单链负义植物病毒反基因组的多核苷酸序列，（ii）至少一种表达载体，包括编码所述单链负义植物病毒衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白，和（iii）可以抑制植物体内基因沉默的沉默抑制子蛋白的多核苷酸序列的一种或多种分离的核酸分子。质粒载体组合物导入植物细胞后可以大量产生重组植物负链RNA病毒；侵染性克隆能高效侵染至少一种以上的植物，无需昂贵的仪器、操作简单、重复性好；利用侵染性克隆可有效用于植物负链RNA病毒的反向遗传学研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒。
背景技术
病毒反向遗传学（reverse genetics）技术是20世纪末发展起来的一门研究病毒基因组结构与功能的新兴学科，其核心技术是病毒侵染性克隆构建（在动物病毒领域称为感染性克隆，或病毒拯救技术）。利用侵染性克隆技术可在体外对病毒基因组进行各种修饰和改造，通过分析重组病毒的表型和特性变化研究病毒基因组的结构、明确其基因及产物的功能、理解病毒与宿主的相互作用以及改造和利用病毒载体（外源蛋白表达载体、基因沉默载体和动物病毒疫苗载体等），该技术是现代病毒学研究领域的最基本、最重要的技术手段。在RNA病毒中，由于RNA病毒的基因组RNA本身不能被直接操纵，cDNA克隆技术则提供了一种变通的方法，使RNA病毒的遗传信息通过cDNA克隆转变成可以操纵的DNA分子。
正链RNA病毒基因组具有信使RNA（mRNA）活性，其基因组RNA一旦导入敏感细胞后可直接作为翻译模版，合成病毒编码的复制酶等蛋白，起始病毒的侵染过程。负链RNA 病毒无论是其基因组（gRNA），或与之互补的反基因组RNA（agRNA），均不能直接充当mRNA进行病毒蛋白的翻译，因而单独导入细胞后不具有侵染活性。此类病毒的最小侵染单元是基因组RNA和核心蛋白（通常包括核衣壳蛋白、RNA 聚合酶及其辅助蛋白）所组成的核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein core complex, RNP）(Conzelmann等，Curr Top MicrobiolImmunol, 2004, 283:1-41)。因此，负链RNA病毒侵染性克隆构建需要在寄主细胞内同时表达病毒全部核心蛋白组份及全长基因组RNA。其次，导入细胞的RNA转录本两端需忠实于病毒原始序列时才具有侵染活性（Walpita等，FEMS Microbiol Lett, 2005, 244:9-18；Neumann等，Curr Top Microbiol Immunol, 2004, 283:43-60）。再次，负链病毒的gRNA为负链，而表达核心蛋白的mRNA为正链，当在细胞内同时表达时可形成双链RNA结构，从而干扰这些RNA的模版活性，并引发RNA沉默现象（Roberts等，Virology, 1998, 247:1-6）。最后，负链RNA病毒基因组较大（不分段病毒基因组 12 kb以上），或者数目较多（水稻草矮病毒为6条基因组），遗传操作困难，体内工作效率低。
为了解决这些技术障碍，动物病毒学家经多年探索，已形成了解决动物负链病毒侵染性克隆构建的成熟方案。其基本原理是，将可表达病毒核心蛋白和cRNA的质粒同时转染敏感细胞，其中cRNA表达质粒通常利用以下两类启动子进行转录：一类为噬菌体T7 RNA聚合酶启动子，利用这类启动子需要在细胞内通过重组牛痘病毒（Vaccinia virus）载体或转基因表达T7 RNA聚合酶，以弹状病毒科的狂犬病毒和水疱性口炎病毒的反向遗传学体系为代表 (Schnell等， EMBO J, 1994, 13:4195-4203; Lawson等，Proc Natl Acad Sci US A 1995, 92:4477-4481).；另一类为人类Pol I启动子（负责细胞内核糖体RNA转录），利用内源的Pol I聚合酶转录病毒cRNA，以流感病毒反向遗传学体系为代表 (Neumann等，Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96:9345-9350)。这两类启动子均可通过恰当的设计，使之在病毒5’端序列的第一个碱基起始转录，且不具有RNA加帽活性（负链RNA病毒基因组5’端无帽子结构），而3’端通过与丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列融合，经核酶自剪切加工后形成忠实于病毒序列的全长cRNA转录本。cRNA被共同表达的核衣壳蛋白所包装，并与病毒聚合酶形成有活性的cRNP，经基因组复制后形成vRNP，并以此为模版转录病毒mRNA，病毒蛋白翻译后即可包装形成具有侵染性的重组病毒颗粒。
尽管植物负链RNA病毒在基因组结构、复制和侵染过程与同类群的动物病毒存在高度的相似性，但是由于宿主（植物与动物）的显著差别，动物病毒拯救的方法不能直接应用于植物病毒侵染性克隆的构建。植物系统内在的技术困难，使得迄今为止国际上尚无植物负链RNA病毒侵染性cDNA克隆的成功报道。植物系统的主要技术困难包括：1）缺乏类似于动物细胞的体外培养系统。植物悬浮细胞具有细胞壁结构，难以在单个细胞内高效转化病毒重构所需的多个质粒，而植物原生质体细胞存活时间短（通常2-4天），因而植物病毒的侵染性测定只能在植株水平上进行，增加了工作难度；2）T7启动子的利用需要在细胞内同时表达T7 RNA聚合酶，而该酶在植物体内未有高效利用的报道；Pol I启动子序列变异大且具有种属特异性，目前该启动子仅在拟南芥等少数植株中被克隆鉴定，但不能在其它种植物中正确起始转录 (Heix等，Curr Opin Genet Dev, 1995, 5: 652–656)；3）植物细胞内较强的RNA沉默活性可降解外源核酸分子的入侵，并抑制外源蛋白的高效表达 (Ding 等，NatRev Immunol, 2010, 10:632-644)。由此可见，植物负链RNA病毒侵染性克隆构建需要采用与动物病毒不同且更为有效的策略。
植物负链RNA病毒包括不分段的弹状病毒科（Rhabdoviridae）、分段的布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）、蛇形病毒科（Ophioviridae）和纤细病毒属（Tenuivirus）等病毒，如弹状病毒科的苦苣菜黄网病毒、水稻黄矮病毒和小麦丛矮病毒、纤细病毒属的水稻条纹病毒和番茄斑萎病毒属的番茄斑萎病毒等 (Kormelink等，VirusRes， 2011，162:184-202)。苦苣菜黄网病毒 (Sonchus yellow net virus，SYNV) 属于弹状病毒科细胞核弹状病毒属 (Nucleorhabdovirus)成员。SYNV是植物弹状病毒的模型病毒，也是研究最为深入的植物负链RNA病毒之一 (Jackson等，Annu Rev Phytopathol,2005, 43:623-660)。SYNV基因组（公知序列，GenBank acc L32603）为单链负义RNA，长约13.7 kb。负义基因组RNA本身不编码任何蛋白，但反基因组RNA (即正义链RNA) 编码6个开放阅读框 (open reading frame, ORF)，在基因组RNA上的相对顺序依次为3'-N-P-sc4-M-G-L-5'，6个蛋白编码mRNA以负义链基因组RNA为模板依次从基因组RNA的3’端到5’端进行转录。这些mRNA能在侵染寄主植物细胞的过程中编码6种蛋白质，包括：核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、运动蛋白 (sc4)、基质蛋白 (matrixprotein, M)、糖蛋白(glycoprotein, G)和RNA聚合酶大亚基(Large subunit ofpolymerase, L)。与其它所有的植物负链RNA一样，SYNV的基因组为负链，病毒的粒子包括gRNA以及与之包裹的核心蛋白复合体。当SYNV侵入植物细胞后，在核心蛋白复合体的作用下，以gRNA为模版，转录病毒mRNA，翻译产生病毒蛋白，新合成的病毒核心蛋白与gRNA包装核糖核蛋白复合体，并催化合成agRNA，进而以agRNA为模版复制大量gRNA，并转配成病毒粒子(Jackson等，Annu Rev Phytopathol, 2005, 43:623-660)。随后对其它植物负链RNA病毒的进一步研究也发现，这类病毒的复制和侵染循环存在与SYNV共同的特点(Kormelink等，Virus Res， 2011，162:184-202)。可见，植物负链RNA病毒的结构和侵染过程存在共性，在模式病毒研究中取得的技术突破，可以应用于其它病毒。
发明内容
本发明提供一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒。
一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法，在植物细胞中导入质粒载体的混合物，所述混合物包括（i）一种转录载体，所述转录载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子中含有编码单链负义植物病毒反基因组的多核苷酸序列，（ii）至少一种表达载体，包括编码所述单链负义植物病毒衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白，和（iii）可以抑制植物体内基因沉默的沉默抑制子蛋白的多核苷酸序列的一种或多种分离的核酸分子；所述的质粒载体导入植物细胞的过程是在足以实现所述的所有质粒载体同时转录或共表达和产生重组病毒的条件下进行的。
所述的单链负义植物病毒是植物弹状病毒的苦苣菜黄网病毒（SYNV）。
所述的多核苷酸序列选自SYNV反基因组和衣壳包装、转录和复制所必需
的反式作用蛋白N、P和L。
所述的病毒RNA沉默抑制子多核苷酸序列可选择来源于任何病毒的RNA沉默抑制子。
所述编码SYNV的反基因组的分离核酸分子编码具有侵染活性的病毒。
所述的转录载体和表达载体利用RNA聚合酶II型启动子，包括但不限于花椰菜花叶病毒启动子，泛素启动子。
所述的载体导入植物细胞的途径包括农杆菌浸润和基因枪轰击；所述的植物细胞是指植株叶、茎、根和花器等器官的细胞，或离体培养细胞和原生质体。
进一步，还包括在植物细胞内获得所述重组病毒。
一种用于根据所述方法的质粒，包括反基因组的转录质粒载体、病毒衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白表达载体以及所述RNA沉默抑制子蛋白的表达质粒载体中的一种或多种。
一种根据所述的方法获得的重组病毒。
本发明的有益效果是：1）所述质粒载体组合物导入植物细胞后可以大量产生重组植物负链RNA病毒；2）利用本发明提供的侵染性克隆能高效侵染至少一种以上的植物，无需昂贵的仪器、操作简单、重复性好；3）利用本发明提供的侵染性克隆可有效用于植物负链RNA病毒的反向遗传学研究，如用于致病性分析、病毒基因功能研究以及表达载体构建等。
附图说明
图１. SYNV全长cDNA转录载体pSYNV（+）的构建； SYNVa gRNA的全长cDNA克隆至植物表达载体pCB301中，置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子精确转录起始位点的下游，且3’端与丁型肝炎病毒（HDV）核酶（Rz）融合，以便在体内转录产生完全忠实与病毒末端的SYNV agRNA全长cDNA。
图2. SYNV核心蛋白N、P和L以及病毒沉默抑制子表达载体的构建；分为A、B、C三部分，（A）核心蛋白N、P和L基因分别克隆至植物表达载体pGD，由CaMV 35S启动子转录；（B）核心蛋白N、P和L表达框串联克隆于单个植物表达载体pGD中，由CaMV 35S启动子转录；（C）病毒RNA沉默抑制子表达载体构建：翻译丛矮病毒p19，烟草蚀纹病毒HC-Pro以及大麦条纹花叶病毒gb基因分别克隆至pGD表达载体，由CaMV 35S启动子转录。
图3. 农杆菌浸润接种植物示意图。
图4. SYNV重组病毒的获得及其分子检测图；分为A、B、C三部分（A）SYNV侵染性克隆接种本氏烟诱导的症状，照片为接种后35天拍摄；（B）Western blot分析重组病毒（rSYNV）与父代野生型病毒（wtSYNV）结构蛋白表达；（C）限制性内切酶分析重组病毒遗传标记，M：分子量标记。
图5. SYNV重组后代病毒生物学特性图；分为A、B、C三部分，（A）重组病毒经摩擦接种在本氏烟上形成的系统侵染症状，Mock：缓冲液接种对照，rSYNV：重组病毒，wtSYNV：野生型病毒；（B）重组病毒后代变异位点的测序分析；（C）重组后代病毒粒子的电镜照片，V：病毒粒子；Nuc：细胞核；M：线粒体；Im：核内膜；Om：核外膜。
具体实施方式
本发明根据上述植物负链RNA病毒复制、包装和侵染的特点，用弹状病毒科SYNV为实施例构建了病毒侵染性克隆，成功获得了第一个重组植物负义RNA病毒，为其它植物负义RNA病毒的重组技术提供了范本和技术手段。
采用下面的非限制性实施例对本发明作进一步描述。实施例1-3描述了病毒全长克隆载体以及复制质粒的构建步骤和方法，实施例4-7描述了表达载体导入植物细胞以及获得重组病毒的步骤和方法，实施例8描述了重组病毒与野生型病毒的生物学特性比较，表明该方法获得了与野生型病毒无差异的重组病毒。以下的实例是用来描述本发明，而不是限制本发明。
SYNV侵染性克隆构建主要包括如下步骤：
1）提取包含SYNV基因组RNA的植物叶片总RNA；
2）设计病毒全长特异引物SYNV/1F: 5’-tttcatttggagaggAGAGACAGAAACTCAGAAAATACAAT-3’(SEQ ID NO: 1)和SYNV/1R: 5’-atgccatgccgacccAGAGACAAAAGCTCAGAACAATCCCTAT-3’(SEQ ID NO: 2)，并以提取的叶片总RNA为模板扩增SYNV全长基因组cDNA。
3）将扩增的SYNV全长基因组cDNA克隆至植物表达载体，得到SYNV cDNA转录载体质粒pSYNV；
4）构建SYNV 核糖核蛋白RNP核心蛋白N、P和L的植物表达载体；
5）构建来自其他病毒的RNA沉默抑制子蛋白的植物表达载体；
6）通过电击的方法将上述载体质粒分别导入农杆菌菌株GV3101；
7）接种前的菌液处理：包含上述载体质粒的农杆菌接种20 mL YEP液体培养基（含25 µg/mL 利福平+50 µg/mL 卡那霉素+25 µg/mL 庆大霉素），28℃ 220rpm摇菌培养至OD600为0.8-1.2；经12000 rpm 1分钟离心，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，200 mM乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2-3小时；
8）农杆菌组合：按照所需将特定农杆菌按所需浓度比例混合；
9）浸润接种：选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株，利用不带针头的1 ml注射器在3-4周的植物叶片背面进行浸润，一株植物一般接种3-4片叶子；
10）接种植株置于25℃隔离温室培养，20天后观察接种植株的症状，采集产生病毒症状和没有产生病毒症状的植株的系统心叶进行RT-PCR检测，鉴定是否有病毒侵染。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1. SYNV cDNA转录载体构建
SYNV基因组为单链负义RNA，长约13.7 kb。从感染了SYNV的本氏烟叶片提取总RNA，并以之为模板进行反转录PCR，得到全长基因组cDNA。将全长cDNA克隆到植物表达载体pCB301，即得到SYNV cDNA转录载体，命名为pSYNV，pSYNV通过电击导入农杆菌GV3101。
感染pSYNV转录载体的构建过程包括如下步骤：
1) 从感染SYNV的本氏烟叶片中提取总RNA：
取0.1 g叶片，加液氮研磨成粉末；将粉末快速转移至预冷的1.5 mL离心管，迅速加入预冷的1 mL TRIzol抽提液；上下混匀，充分裂解，室温放置5 min；加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈震荡15 sec，室温放置2 min；4℃，12,000 rpm离心15 min，取上清并加入等量体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min；4℃，12,000 rpm离心10 min；弃上清。加入1 mL 75%乙醇，涡旋清洗沉淀。4℃，7,500 rpm离心5 min；弃上清，剩余白色沉淀即为初提的叶片总RNA，让RNA沉淀物在室温下干燥。加入30 µL无RNA酶的水使RNA沉淀全部溶解。
1) 设计引物SYNV/1F: 5’-tttcatttggagaggAGAGACAGAAACTCAGAAAATA CAAT-3’(SEQ ID NO: 1)和SYNV/1R: 5’-atgccatgccgacccAGAGACAAAAGCTCA GAACAATCCCTAT-3’(SEQ ID NO: 2)，并以提取的叶片总RNA为模板扩增SYNV全长基因组cDNA。两条引物的5’端各带有15个碱基（小写字母），这些碱基分别可以与载体的35S启动子和HDV Rz核酶互补配对，相应扩增的cDNA产物两端分别带有这些碱基，带有这些额外碱基序列的cDNA可以通过In－Fusion克隆反应被插入到载体pCB301，插入的位置在35S启动子和HDV Rz核酶之间，得到的转录载体质粒命名为pSYNV(+)（图1）。
2) 筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定SYNV基因组全长的插入及正确装配；
实施例2. RNP核心蛋白表达载体构建
SYNV的核糖核蛋白RNP核心包括N、P和L三种蛋白，这三种蛋白被分别插入植物表达载体pGD中，得到pGD-N、pGD-P和pGD-L，pGD表达载体带有35S启动子和NOS转录终止子控制的表达框（图2.A）。或者将N、P和L同时插入同一个表达载体中，得到pGD-NPL，在这个表达载体中，三个蛋白由不同的35S启动子和NOS转录终止子控制，也就是说同一个表达载体上含有三个表达框，分别表达N、P和L（图2B）。
实施例3. 病毒RNA沉默抑制子蛋白表达载体构建
三个来自其他病毒所编码的RNA沉默抑制子：烟草蚀纹病毒(Tobacco etchvirus, TEV) Hc-Pro基因、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV) p19基因和大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV) γb基因。这三个沉默抑制子被分别插入pGD载体，得到三个表达载体：pGD-Hc-Pro、pGD-p19和pGD-γb（图2.C）。
实施例4.农杆菌转化、培养及接种前预处理
取实施例1-3所述的转录载体或表达载体质粒各1 µL，加入到200 µL农杆菌GV3101株系感受态细胞中，轻轻混匀，转入2 mm电击杯中；选择电击仪 (Bio-Rad)用于农杆菌电击转化的程序，电击杯厚度参数手动调成2 mm，电击；室温静置2 min后加入800 µLYEP恢复培养基，28℃静置1 h，然后在28℃，200 rpm振荡培养1.5 h；8,000 rpm离心2 min，弃上清，用200 µL去离子水悬浮后涂布于YEP平板培养基 (25 µg/mL Rif+50 µg/mL Kan+50µg/mL Gent)；在培养箱中28℃倒置培养2天。包含上述cDNA转录载体质粒或蛋白表达载体的农杆菌分别接种3 mL YEP液体培养基（含25 µg/mL 利福平+50 µg/mL 卡那霉素+25 µg/mL 庆大霉素），28℃ 220rpm摇菌培养过夜至OD600为0.8-1.2；经12000 rpm 1分钟离心，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，200 mM 乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2-3小时；
实施例5. 农杆菌浸润接种植物
将实施例4中农杆菌混合液分别浸润接种本氏烟，接种植株选用4-6叶期为宜。浸润接种使用不带针头的1 ml一次性注射器在4-6叶期植物叶片进行叶背浸润，每株植物浸润3-4片叶片（图3），接种后植株置于25℃隔离温室培养。
实施例6.病毒侵染性克隆的侵染性测定及重组病毒的获得
两组农杆菌接种的本氏烟均在20天左右表现出典型的病毒症状，症状包括心叶严重下卷，网状的叶脉黄化症状（图4A）。采集侵染性克隆接种并产生系统性病毒症状的本氏烟叶片，提取叶片总蛋白，用SYNV多克隆抗体进行Western Blot分析，结果两组农杆菌组合接种并产生症状的本氏烟叶片均可以检测到SYNV特导的结构蛋白条带（图4B）。
测序时发现pSYNV在第11,967 bp处存在一个点突变（A-G），使得在这个位置新形成一个酶切位点BsmBI，切割位点在11,961 bp处，而野生型病毒的序列（GenbankACCESSION: L32603）在此位置并没有BsmBI的识别位点，所以pSYNV上新形成的BsmBI可以作为侵染性克隆侵染本氏烟后恢复的新病毒粒子的分子标记（molecular marker）。
设计引物SYNV/2F: 5’-TCCTAATAAGTTTCTACC-3’ (SEQ ID NO: 3)和SYNV/2R:5’-CGGAGAGTTGTGAATGTT-3’ (SEQ ID NO: 4)扩增1,496 bp的片段（图4C上）。扩增的PCR产物用BsmBI酶切，若扩增产物包含BsmBI识别位点，则被切割成大小分别为954 bp和542 bp的酶切片段，否则仍然为1,496 bp。两个农杆菌组合接种并产生系统性病毒症状的本氏烟均可以从中扩增到1.5 kb大小的PCR片段（lane 1–3），并且可以被BsmBI切开，而从野生型病毒（lane wt）扩增到的片段由于在此位置没有BsmBI的识别位点，不能被BsmBI切开（图图4C中）。作为对照，pSYNV及野生型病毒序列在12,023 bp处均含有ApaI识别位点，ApaI可以同时切开来自pSYNV和野生型病毒的PCR产物，产生大小分别为1,016 bp和480 bp的酶切片段（图4C下）。
实施例7. 侵染效率的优化
取实施例4所获得的农杆菌，分别以下述组合一（表1）、二（表2）或三（表3）的浓度比例（OD600吸光值）混合。浸润接种本氏烟，接种后植株置于25℃隔离温室培养，观察接种植株症状。经3重复试验的统计结果发现，组合一接种的植物约5%（10/190）被侵染，而组合二约为12%（18/145），组合三约为26%（33/125），表明将N、P和L置于同一个表达载体表达，同时增加L的表达水平可显著提高侵染性克隆的侵染效率。
表1
表2
表3
实施例8.重组后代病毒特性分析
侵染性克隆接种的本氏烟发病后，取有症状的病叶1g，加入10 mL 0.5%的亚硫酸钠缓冲液研磨匀浆，摩擦接种4-5叶期的健康本氏烟，并置于光照培养箱内生长。接种13天后，本氏烟植株出现与野生型病毒类似的症状（图5A）。提取发病本氏烟组织总RNA，利用引物SYNV/2F: 5’-TCCTAATAAGTTTCTACC-3’ (SEQ ID NO: 3)和SYNV/2R: 5’-CGGAGAGTTGTGAATGTT-3’ (SEQ ID NO: 4)进行RT-PCR扩增，对获得PCR片段进行测序发现，重组病毒基因组第11,967 bp处存在一个点突变（A-G）在后代病毒中得以稳定维持（图5B）。另取系统侵染的本氏烟叶片，切成1 mm×3mm 小条，经戊二醛固定，乙醇脱水，Spurr树脂包埋后制备常温包埋样品，并在电子显微镜下观察是否有病毒粒子形成。如图5C所示，侵染性克隆接种的本氏烟在发病后可以在细胞核内形成弹状病毒粒子，与野生型病毒粒子没有差异，没接种的健康本氏烟中没有病毒粒子。
SEQUENCE LISTING
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNV/R
<400> 2
atgccatgcc gacccagaga caaaagctca gaacaatccc tat 43
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNV/2F
<400> 3
tcctaataag tttctacc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNV/2R
<400> 4
cggagagttg tgaatgtt 18
Claims (9)
1.一种重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法，其特征在于：在植物细胞中导入质粒载体的混合物，所述混合物包括（i）一种转录载体，所述转录载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子中含有编码属于植物弹状病毒的苦苣菜黄网病毒（SYNV）的多核苷酸序列，（ii）至少一种表达载体，包括编码所述SYNV衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的多核苷酸序列，和（iii）另一种表达载体，包含烟草蚀纹病毒Hc-Pro基因、番茄丛矮病毒的p19基因和大麦条纹花叶病毒gb基因的多核苷酸序列；所述的质粒载体导入植物细胞的过程是在足以实现所述的所有质粒载体同时转录或共表达和产生重组病毒的条件下进行的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，（i）中所述的多核苷酸序列为SYNV反基因组序列和（ii）中所述的SYNV衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白为SYNV病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的烟草蚀纹病毒的Hc-Pro 基因、番茄丛矮病毒的p19 基因和大麦条纹花叶病毒的gb 基因的多核苷酸序列编码植物RNA沉默抑制子蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述编码SYNV的反基因组的分离核酸分子编码具有侵染活性的病毒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转录载体和表达载体利用RNA聚合酶II型启动子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体导入植物细胞的途径包括农杆菌浸润和基因枪轰击；所述的植物细胞是指植株叶、茎、根和花器的细胞，或离体培养细胞和原生质体。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步，还包括在植物细胞内获得所述重组病毒。
8.用于如权利要求1所述方法的质粒，其特征在于，包括编码所述SYNV多核苷酸序列的转录载体，编码所述SYNV衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白的多核苷酸序列的表达载体，以及包含所述烟草蚀纹病毒Hc-Pro基因、番茄丛矮病毒的p19基因和大麦条纹花叶病毒gb基因的多核苷酸序列的表达载体。
9.一种如权利要求1所述的方法获得的重组病毒，其特征在于，所述的重组病毒反基因组第11961位碱基由野生型病毒的腺嘌呤核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸，形成了可被限制性内切酶Bsmb I识别的分子标记。
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