CN111849927B - 高效产生重组不分节段负义rna病毒的方法及重组病毒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法及重组病毒，所述的方法包括向敏感细胞内导入或表达含有一种不分节段负义RNA病毒基因组的核酸分子，病毒核心蛋白核酸分子、以及双链RNA拮抗因子核酸分子。利用本发明提供的方法，可明显提高不分节段负义RNA病毒拯救效率。本发明还提供了利用所述方法对重组不分节段负义RNA病毒进行核酸置换、缺失、插入等遗传操作，构建侵染性重组病毒。

Description

高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法及重组病毒

技术领域

本发明涉及负义RNA病毒遗传操作技术，具体的，本发明涉及一种重组不分节段负义RNA病毒及其产生方法。

背景技术

对病毒基因组序列进行操作和改造利用需借助病毒的反向遗传学体系，其技术关键是构建病毒侵染性克隆（infectious clone），该克隆导入合适的宿主细胞内可产生重组病毒，即实现病毒拯救（recovery）。通常情况下，正义RNA病毒基因组RNA（genomic RNA，gRNA）转录本一旦导入敏感细胞，或直接向细胞中转染cDNA克隆表达病毒gRNA，即可起始病毒蛋白翻译和基因组复制，产生重组病毒。与正义RNA病毒不同，负义RNA病毒的最小侵染单元为核心壳（nucleocapsid, NC），即病毒基因组被核心蛋白（弹状病毒为核衣壳蛋白N、磷蛋白P、RNA聚合酶大亚基L）包裹所形成的核糖核蛋白复合体（ribonucleoproteincomplex, RNP）。对负义RNA病毒而言，无论是其gRNA，还是互补的反基因组RNA（antigenomic RNA，agRNA），其单独导入敏感细胞后均不具有侵染性。因此，重组负义RNA病毒的拯救需要在寄主细胞内同时表达病毒核心蛋白和病毒基因组，包裹形成有生物学活性的核心壳，经病毒mRNA转录、基因组复制和包装后产生有侵染性的重组病毒。

重组负义病毒拯救过程存在一个特殊的反义RNA问题：当向宿主细胞内同时导入或表达病毒gRNA和病毒核心蛋白的mRNAs时，由于病毒gRNA为负义，而mRNA为正义，两者可杂交形成双链RNA。双链RNA的形成将干扰mRNA的翻译活性，同时影响gRNA被核心蛋白所包装（encapsidation），降低核衣壳形成的效率。更为重要是，双链RNA是重要的病原物相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，在真核生物中引发广泛的免疫反应，包括高等脊椎动物中I型干扰素抗病毒反应以及植物和线虫等低等动物的RNA干扰抗病毒反应，严重抑制重组病毒的拯救。

研究表明，在细胞内同时表达狂犬病毒（一种负义RNA弹状病毒科（Rhabdoviridae）病毒）gRNA和核心蛋白mRNA时，无法获得重组病毒；为了解决反义RNA问题，Schnell等人创造性地采用了表达狂犬病毒agRNA和核心蛋白mRNA，此时包装形成的反基因组核衣壳经复制产生基因组核衣壳，后者可起始病毒的侵染，从而实现了首个重组负义RNA病毒的拯救（Schnell等人，EMBO J, 1994, 13:4195-4203）。类似地，其他研究者发现，表达agRNA可用于拯救弹状病毒科水泡性口炎病毒，而表达gRNA则不能（Lawson等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:4477-4481；Whelan等人，Proc Natl Acad Sci USA,1995, 92:8388-8392）。随后，表达正义的agRNA的策略被广泛应用于其它负义RNA病毒的重组拯救，如副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒（Radecke等人，EMBO J. 1995, 14:5773-5784）、人呼吸道合胞病毒（Collins等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:11563-11567）、仙台病毒（Garcin等人，EMBO J. 1995, 14: 6087-6094）、分节段的布尼亚病毒科（Bunyaviridae）布尼亚韦拉病毒（Bridgen和Elliott，Proc Natl Acad Sci USA,1995, 93:15400-15404）、丝状病毒科（Filoviridae）埃博拉病毒（Volchkov等人，Science,2001, 291:1965-1969）、博纳病毒科（Bornaviridae）博纳病毒（Schneider等人，Proc NatlAcad Sci USA, 2005, 102:3441-3446）、沙粒病毒科（Arenaviridae）淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Sánchez和de la Torre，Virology, 2006, 350:370-380）。尽管有报道表明，表达gRNA也可成功拯救重组仙台病毒，但其效率较表达agRNA的方法低100倍以上（Kato等人，Genes Cells, 1996, 1:569-579）。

类似地，目前已报道成功拯救的植物负义RNA病毒所采用策略均为表达agRNA，包括弹状病毒科细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus）苦苣菜黄网病毒（Wang等人，PLoSPathog, 2015, 11:e1005223； CN 105039388 A）、细胞质弹状病毒属（Cytorhabdovirus）大麦黄条点花叶病毒（Gao等人，New Phytol, 2019, 223:2120-2133；CN 110511955 A）、布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒（Feng等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2020,117:1181-1190）、无花果花叶病毒科(Fimoviridae) 玫瑰丛矮病毒（Verchot等人，BioRxiv, 2020, 712000, https://doi.org/10.1101/712000）。

虽然采用反基因组（agRNA）策略成功实现了众多负义RNA病毒的拯救，但相比于自然的负义病毒侵染过程，该方法人为地增加了一个额外步骤，即细胞内组装形成的反基因组核衣壳必须经复制产生的基因组核衣壳后才可起始病毒的侵染过程，因而拯救周期较长且效率低下，因此本领域仍需要提供更为有效的重组病毒学拯救方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明第一目的在于提供一种高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法，即一种可显著提高负义RNA病毒拯救效率的方法，第二目的在于提供一种可高效获得的侵染性重组病毒。

一种高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法，在至少一个宿主细胞中导入实施病毒拯救所需混合物，该混合物包括（i）一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列；所述的不分节段负义RNA病毒包括弹状病毒科苦苣菜黄网病毒（SYNV）或茄子斑驳矮缩病毒（EMDV）；EMDV 基因组如SEQ ID NO：1所示；

（ii）至少一种表达载体，其包括编码所述病毒包裹、转录和复制所必需的反式作用蛋白的至少一种分离的核酸分子，和

（iii）另一种表达载体，其包括编码免疫反应拮抗因子的至少一种分离的核酸分子，所述的免疫反应拮抗因子为植物病毒编码的RNA沉默抑制子和/或者动物病毒编码的干扰素拮抗因子；

所述的导入是在足以实现所述混合物共表达和产生重组病毒的条件下进行的，进一步还包括获得所述的重组病毒。

所述的RNA沉默抑制子包括但不限于烟草蚀纹病毒的Hc-Pro 基因、番茄丛矮病毒的p19 基因、或大麦条纹花叶病毒的gb 基因的多核苷酸序列编码的植物RNA沉默抑制子蛋白。

所述的干扰素拮抗因子包括但不限于兽棚病毒B2基因（SEQ ID NO：2）、埃博拉病毒VP35基因（SEQ ID NO：3）、人流感病毒NS1核酸分子（SEQ ID NO：4）的多核苷酸序列编码的干扰素反应拮抗蛋白。

所述的方法，所述的转录载体和表达载体利用RNA聚合酶II型启动子。

所述的方法，所述的不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列连接了可自我加工的核酶分子，所述的核酶分子用于切割产生所述不分节段负义RNA病毒基因组核酸分子的精确拷贝。

所述的方法，通过在不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列中人为地引入一种或多种突变，重组修饰所述的不分节段负义RNA病毒。

所述的方法，通过在不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列中人为地插入异源序列，使其编码异源蛋白质。

所述的方法获得的侵染性重组病毒，通过引入一种或多种突变重组修饰所述的不分节段负义RNA病毒。

所述的方法获得的侵染性重组病毒，修饰所述的不分节段负义RNA病毒，使其编码异源蛋白质。

本发明的有益效果在于：

(1)与现有的负义RNA反基因组拯救策略相比，采用基因组策略可显著提高病毒的拯救效率，缩短病毒的拯救周期。

(2)提供了共表达多种病毒编码的免疫反应拮抗因子及其组合的技术方案，有效避免了负义RNA病毒拯救所具有的反义RNA问题。

(3)本发明提供的技术方案可拯救毒力严重下降的重组突变体病毒。

(4)本发明提供的技术方案操作简便，可适用于不同负义RNA病毒的拯救，原理上具有广谱性。

附图说明

图1A为SYNV反基因组全长侵染克隆ragSYNV-GFP和基因组全长侵染克隆rgSYNV-GFP的示意图；

其中，35S²为串联重复的花椰菜花叶病毒35S启动子；Nos为Nos终止子；Rz为丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列，可剪切去除转录产物中的3'非病毒序列，以获得完全忠实于病毒末端的SYNV gRNA转录产物；le为病毒基因组3'leader区域序列；tr为病毒基因组5'triler区域序列；6个基因（N, P, sc4, M, G, L）位于病毒3'leader区和5'triler区之间，此外，GFP表达框作为独立转录单元位于N和P基因之间；N/P J为N基因和P基因之间的间隔区；LB为T-DNA左臂序列；RB为T-DNA右臂序列。

图1B为重组病毒克隆载体ragSYNV-GFP或rgSYNV-GFP，同时与病毒核心蛋白N、P和L表达载体，以及病毒RNA沉默抑制子（P19、γb，Hc-Pro）农杆菌浸润本氏烟叶片，9天、12天、15天后浸润叶中GFP报告基因的表达图。

图1C为重组病毒载体ragSYNV-GFP和rgSYNV-GFP系统侵染后一周时的症状照片，以及紫外灯下GFP在系统叶中表达成像。

图1D为Western blot检测重组病毒载体ragSYNV-GFP和rgSYNV-GFP接种植株的系统叶中病毒结构蛋白的表达情况图。

图1E为重组病毒载体ragSYNV-GFP和rgSYNV-GFP接种本氏烟的侵染效率比较，侵染效率计算方式为三次重复试验中发病植株占接种植株总数的百分比。

图2A为ragSYNV-GFP与rgSYNV-GFP接种的本氏烟植株浸润叶中荧光细胞数目统计及系统侵染率比较分析，均为三次生物学重复计算平均值所得。

图2B为ragSYNV-GFP与按不同比例稀释的rgSYNV-GFP在植株浸润叶中荧光细胞表达图。

图3A为含有SYNV基因组克隆rgSYNV-GFP以及不同免疫拮抗因子的农杆菌浸润烟草叶片9天后浸润叶中荧光细胞数目观察；

这些免疫拮抗因子包括烟草蚀纹病毒Hc-Pro、番茄丛矮病毒p19、大麦条纹花叶病毒γb、兽棚病毒B2、埃博拉病毒VP35和人流感病毒NS1的单独表达，或两两组合表达，或三者组合表达等；“—”表示无免疫拮抗因子的表达。

图3B为荧光细胞数目统计，均为三次生物学重复计算平均值所得。

图3C为浸润植株的发病率。

图4A为利用SYNV基因组策略拯救M缺失突变体rgSYNV-GFP-M:RFP克隆构建示意图，

其中，GFP位于N和P基因之间，ragSYNV-GFP-M:RFP和rgSYNV-GFP-M:RFP为SYNV基因组M基因被RFP基因置换的突变体，前者为反基因组链克隆，后者为基因组链克隆。

图4B为上述克隆接种本氏烟后的症状观察及荧光报告基因表达观察，

其中，泳道WL为白光下的症状图，UV为手提紫外灯下的症状图，GFP和RFP分别代表在荧光显微镜下的GFP和RFP的表达。

图5A为重组病毒克隆构建示意图；

其中GFP荧光报告基因插入Leader与N之间，与Leader RNA之间为病毒原有的Ledaer/N之间的基因间隔区，与N之间为人工设计的N 3’UTR+GGG+N 5’UTR基因间隔区。

图5B 为重组病毒载体rgEMDV和rgEMDV-GFP接种30天左右在可见光和紫外灯下的症状。

图5C为Western blot检测重组病毒载体rgEMDV-GFP接种植株的系统叶中病毒结构蛋白的表达情况。

图6A为EMDV基因组侵染性克隆rgEMDV-X:RFP重组病毒克隆构建示意图；rgEMDV-X:RFP中RFP荧光报告基因替换原有X蛋白基因。

图6B为重组病毒载体rgEMDV和rgEMDV-GFP接种40天左右在可见光下的症状及系统叶在体视荧光显微镜下叶片红色荧光表达情况。

图6C为Western blot检测重组病毒载体rgEMDV-X:RFP接种植株的系统叶中病毒结构蛋白的表达情况。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。

本发明所用的术语 “病毒拯救”是将包含病毒序列的体外构建物导入合适细胞，产生具有侵染性或感染性的病毒的过程。“重组病毒”是指通过重组DNA技术产生的遗传工程化病毒，可人为地对病毒序列进行任意缺失、插入、颠倒、置换等遗传操作，以区别于天然存在的病毒。

在第一方面，本发明提供一种用于高效产生负义RNA病毒的方法，包括在充分允许载体共表达和产生重组病毒的条件下的在至少一个宿主细胞中导入实施病毒拯救所需混合物，该混合物包括（i）一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列；（ii）至少一种表达载体，其包括编码病毒包裹、转录和复制所必需的反式作用蛋白的至少一种分离的核酸分子，和（iii）至少一种表达载体，其包括编码免疫反应拮抗因子的至少一种分离的核酸分子。然后，在宿主细胞中获得侵染性重组病毒。

如上所述，分离的核酸分子编码至少一种负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列。所述的“负义RNA病毒”又称“负链RNA病毒”，是指病毒粒子中包裹的病毒基因组为负义（与mRNA极性相反）的一类侵染人、动物、植物和真菌等的病毒，包括基因组为不分节段的单股负链病毒目(Mononegavirale)，比如副粘病毒科（Paramyxoviridae）、丝状病毒科（Filoviridae）、肺病毒科（Nyamiviridae）、博纳病毒科（Bornaviridae）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）、Mymonaviridae、Nyamiviridae和Sunviridae等；基因组为分节段的布尼亚病毒目（Bunyavirales）的布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、费拉病毒科 (Feraviridae) 、无花果花叶病毒科 (Fimoviridae) 、汉坦病毒科 (Hantaviridae) 、米卡多病毒科(Jonviridae) 、内罗病毒科(Nairoviridae)、泛布尼亚病毒科 (Peribunyaviridae) 、幻影病毒科 (Phasmaviridae) 、白纤病毒科 (Phenuiviridae) 和番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)等；基因组为分节段、未归入目的沙粒病毒科（Arenaviridae）、蛇形病毒科(Aspiviridae)和正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。

在本发明的优选例中，所述的负义RNA病毒是单股负链的弹状病毒科病毒。优选的弹状病毒是苦苣菜黄网病毒（Sonchus yellow net virus，SYNV）。

在本发明的另一个优选例中，所述的负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列为弹状病毒科茄子斑驳皱缩病毒（Eggplant mottled dwarf virus，EMDV）基因组序列，如SEQ IDNO：1所示的序列，或在严谨条件下能与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的变体序列。

在本发明中，所述的病毒包裹、转录和复制所必需的反式作用蛋白为负义RNA病毒的核心蛋白，对于优选的弹状病毒而言，包括病毒核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）和RNA聚合酶大亚基（L）。N、P、L蛋白与病毒基因组紧密结合，组成病毒核衣壳，是负链RNA病毒转录和复制的最小单元。

在一种优选实施方案中，N、P和L蛋白是由一种表达载体表达的，在另一种优选方案中，N、P和L蛋白是由独立的表达载体表达的。

本发明所述的“免疫反应拮抗因子”特指可在真核生物中抑制双链RNA诱导的抗病毒免疫反应的蛋白因子，包括但不限于病毒编码的RNA沉默抑制子，以及病毒编码的干扰素拮抗因子。

在本发明的一个实施方案中，免疫拮抗因子表达载体含有编码一个或多个病毒RNA沉默抑制子的序列，优选烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）Hc-Pro核酸分子、或番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）p19核酸分子、或大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus, BSMV）的γb核酸分子。

在本发明的一个另一个实施方案中，免疫拮抗因子表达载体含有编码一个或多个病毒干扰素拮抗因子的序列，优选兽棚病毒（Flock house virus，FHV）B2核酸分子（SEQ IDNO：2）、或埃博拉病毒（Ebola virus）VP35核酸分子（SEQ ID NO：3）、或人流感病毒（Humaninfluenza virus H1N1）NS1核酸分子（SEQ ID NO：4）。

本发明的表达载体、转录载体或构建体可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒质粒载体，以及任何适于感兴趣的核苷酸序列在细胞内表达的载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

所述的表达载体、转录载体或构建体包括但不限于pGD、或pCB301载体，所述的载体含有合适的顺式作用元件，包括启动子和终止子，用于指导感兴趣的核酸序列在细胞内的转录和表达。

在本发明的优选方案中，所述的表达载体、转录载体或构建体包含的启动子为聚合酶II型启动子，优选地，来源于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。

进一步地，所述的编码负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列转录载体中，包含CaMV35S启动子和转录终止子，所述的RNA病毒基因组的多核苷酸序列3'端连接了一种来源于丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列，所述的核酶序列用于转录后加工产生病毒基因组转录本的精确拷贝。

本发明实施方案中混合物“导入”细胞是指将线性的核酸片段、环状质粒、病毒质粒载体，通过本领域已知的任何各种方法，包括农杆菌感染法、基因枪法、花粉导入法、病毒介导法、PEG介导法、点击诱导法、显微注射法、激光转化法、超声波转化法、或脂质体转化法等方法引入合适的真核生物细胞。在本发明的优选例中，采用了农杆菌浸润植物组织，将农杆菌携带的重组质粒载体内部转移DNA序列导入植物细胞，并进行转录和表达。

在本发明所提供的方法和混合物中，将病毒基因组转录载体、反式作用蛋白表达载体、以及免疫拮抗因子表达载体分别转化农杆菌细胞，再将农杆菌以合适比例混合，共同浸润植物叶片，使所有组份导入均可导入同一个植物细胞且获得表达。

用于本发明的合适的宿主细胞允许病毒拯救所需的载体的及其编码产物的表达，并支持负义RNA病毒的复制和重组病毒包装。这种宿主细胞可选自原核生物或真核生物。如本发明所用的RNA病毒为植物病毒，所以这种情况下常用植物细胞，如本氏烟细胞。

在本发明的优选实施方案中，含有病毒基因组cDNA克隆的转录载体导入细胞后，在转录调控元件的作用下产生病毒基因组RNA（gRNA），也称病毒链RNA（vRNA）。对于负链RNA病毒而言，该RNA转录本与mRNA极性相反。

根据本发明的实施方式，在共表达免疫反应拮抗因子的条件下，使用基因组cDNA克隆的转录载体可使负义RNA病毒拯救效率相比反基因组转录载体提升100倍以上，且重组病毒拯救所需的时间缩短。

在本发明的一种优选方案中，所述的转录载体编码经修饰的病毒基因组多核苷酸序列，所述的修饰是通过对野生型病毒基因组进行核苷酸插入、重组、缺失或取代。各种重组修饰方法是本领域所熟知的，例如，可通过缺失一个完整的基因、缺失基因的一部分、编码区或非编码点突变、用异源核酸序列取代部分或全部基因、基因顺序的重排等修饰。这些人为引入的修饰常常导致病毒突变体毒力下降，由于本发明提供的拯救系统足够高效，所以可对这些弱毒或减毒的重组突变体病毒进行成功拯救。通过本发明生产的弱毒重组病毒可用于诊断研究工具或治疗和预防性混合物。

在本发明的另一种优选方案中，除了上述的病毒基因组修饰外，所述的病毒基因组多核苷酸序列还可以编码一个或多个异源基因。异源表示被插入的基因或核苷酸序列不存在野生型病毒中。可以根据需要改变所述异源基因核苷酸序列，如荧光报告基因、免疫调节因子基因、具有生物活性的多肽编码序列、以及来源于不同微生物（例如真菌、细菌和病毒）的具有免疫原性的基因。

材料与方法

下列实施例中所使用的实验方法，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook J.，Fritsch E.F.和Maniatis, T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989。同时，本发明所使用的生化和分子生物学试剂、材料等如无特殊说明，均可从商业化试剂公司购买得到。

含GFP报告基因的SYNV反基因组全长cDNA载体ragSYNV-GFP、植物双元载体pGD和pCB301、SYNV核心蛋白表达载体pGD-NPL、病毒沉默抑制子表达载体pGD-HcPro、pGD-p19、pGD-γb 已在文献“Wang Q.等，Rescue of a plant negative-strand RN A virus fromcloned cDNA: Insights into enveloped plant virus movement and morphogenesis.PLoS Pathogens. 2015, 11:e1005223.”和“Ganesan U.等，Construction of a sonchusyellow net virus minireplicon: a step toward reverse genetic analysis ofplant negative-strand RNA viruses. Journal

of Virology. 2013, 87:10598-10611”中已公开。农杆菌酵母穿梭载体pCB301-2m-HDV在“Sun K.等，Rapid construction of complex plant RNA virus infectiouscDNA clones for agroinfection using a yeast-E. coli-Agrobacterium shuttlevector. Viruses. 2017, 9:pii: E332”一文中已公开。

表1. 实施方案中涉及的引物序列

引物名称	序列（5'→3'）
		SYNV/leader/F	AGAGACAAAAGCTCAGAACAATCCCTAT
SYNV/triler/R	AGAGACAGAAACTCAGAAAATACAATCACCGT
		pCB301/35s/F	TGAGCTTTTGTCTCTCCTCTCCAAATGAAATGAAC
pCB301/HDV/R	TGAGTTTCTGTCTCTGGGTCGGCATGGCAT
		M/DsRed/F1	GCAAGTACTTTGGTATACAAGAAAGG
M/DsRed/R1	CTCGGAGGAGGCCATTCTGAAATACAATAGAGATAACCTTG
		M/DsRed/F2	TCTTGAATACTGGTATACTTATTCC
M/DsRed/R2	CACCTGTTCCTGTAAACCAACCCACCAAAAGCAG
		DsRed/F	ATGGCCTCCTCCGAGAACGT
DsRed/R	TTACAGGAACAGGTGGTGG
		EMDV/N/BamHI/F	CGGGATCCATGAATGTCAATGATGCTTTGG
EMDV/N/XhoI/R	CCGCTCGAGTTACAAACCAGAGAGAAATCCCC
		EMDV/P/BamH I/F	CGGGATCCATGAATAGAAAATCATCCCGCTC
EMDV/P/Sal I/R	ACGCGTCGACTCAGGTCCTTCTCTTGCCAG
		EMDV1/L/15nt/F	ACTATTTACAATTACAATGGACGAGACCGATTGGGAAG
EMDV1/L/15nt/R	ACGATCGGGGAAATTTTAGGTTCCAACAATATTGAACCCTCTCC
		EMDV/A/F	ATGCCATGCCGACCCACACACCCCCACAAGGTG
EMDV/A/R	TGTCAGGTCCTTCTCTTGCCAG
		EMDV/B/F	CATGACCACACTGGGAGAAG
EMDV/B/R	CTGCGAATGGAGTTAGGATTGG
		EMDV/C/F	AGCCCTATTAAGTTCAACTTCTGG
EMDV/C/R	TTTCATTTGGAGAGGACACACCCACCGAAGCATTATAAC
		pCB301/35s/15nt/F	CTTCGGTGGGTGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
pCB301/HDV/15nt/R	CTTGTGGGGGTGTGTGGGTCGGCATGGCATCTC
		EMDV/GFP/AatII/F	CCCTTAGCCATCCGAGTGGAC
EMDV/GFP/R	AGTAATATTGTATGTTGTTGGGTTTTTATTAAAGGGAATAATACTTTATTACAATACAC
		EMDV/GFP/F	AATAAAAACCCAACAACATACAATATTACTTTAAATTTGAATTCATC
EMDV/GFP/AatII/R	TGGATCTGCCTGTTGGGGAG
		EMDV/SpeI/F	ATCTGCATGGCACTTTTGAG
EMDV/NX juc/R	CTCGGAGGAGGCCATGGTGTGTTGGGTTTTTATTAAAGG
		EMDV/RFP/F	ATGGCCTCCTCCGAGAACG
EMDV/RFP/R	TATGTGTTGTGGATGTTACAGGAACAGGTGGTGGCG
		EMDV/XP juc/F	CACCTGTTCCTGTAACATCCACAACACATAGCAAGAG
EMDV/SpeI/R	CAACATGAGAGTCATAGTTAGGAGAG

ragSYNV-GFP克隆构建

合成两对引物SYNV/leader/F和SYNV/triler/R、pCB301/35s/F和pCB301/HDV/R（表1），以带有GFP报告基因的SYNV反基因组侵染性克隆ragSYNV-GFP为模版，分别扩增得到SYNV-GFP全长片段及pCB301载体片段，经In-Fusion同源重组后，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定无误后即获得克隆rgSYNV-GFP。

病毒RNA沉默抑制子植物表达载体构建

所用的植物病毒RNA沉默抑制子包括烟草蚀纹病毒Hc-Pro、番茄丛矮病毒p19和大麦条纹花叶病毒γb，其植物表达载体pGD-HcPro、pGD-p19、pGD-γb已在Ganesan et al.,Journal of Virology. 2013, 87(19):10598-10611一文中公开。

病毒干扰素拮抗因子植物表达载体构建

所用的动物病毒RNA沉默抑制子或干扰素拮抗因子包括兽棚病毒B2（GenBank No.X77156；序列示于SEQ ID NO：2）、埃博拉病毒VP35（GenBank No. EU224440；序列示于SEQID NO：3）和人流感病毒H1N1 NS1（GenBank No. J02150；序列示于SEQ ID NO：4）基因于南京金斯瑞公司（Genescript）合成，亚克隆至植物双元表达载体pGD，产生pGD-B2、pGD-VP35和pGD-NS1载体。

rgSYNV-GFP-M:RFP突变体病毒克隆构建

在上述rgSYNV-GFP的基础上，将重组病毒的M基因替换为DsRed基因，构建M缺失突变体rgSYNV-GFP-M:RFP，具体构建过程如下：合成两个引物对M/DsRed/F1和M/DsRed/R1、M/DsRed/F2和M/DsRed/R2，以pSYNV-GFP(-)为模版，分别扩增PCR片段S1和S2，设计引物DsRed/F和DsRed/R扩增DsRed基因，三个PCR产物回收后与经Bst1107I酶切并与去磷磷酸化后的rgSYNV-GFP线性化载体进行In-Fusion连接，经菌落PCR筛选及酶切验证后获得阳性克隆rgSYNV-GFP-M:RFP。引物序列列于表1.

rgEMDV核心蛋白表达载体构建

EMDV全基因组序列示于SEQ ID NO：1。以EMDV侵染的茄子叶片总RNA经反转录所得的cDNA为模板，合成三对引物EMDV/N/BamHI/F和EMDV/N/XhoI/R、EMDV/P/BamH I/F和EMDV/P/Sal I/R、以及EMDV1/L/15nt/F和EMDV1/L/15nt/R，分别扩增得到EMDV N、P和L开放阅读框（ORF）。N基因片段克隆经BamHI和XhoI/酶切后连接至pGD载体，P基因片段克隆经BamHI和SaI酶切后连接至pGD载体，L基因片段通过In-Fusion克隆至pCB301载体。筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定无误后即获得表达EMDV核心蛋白的pGD-N、pGD-P和pCB-L载体。引物序列列于表1.

rgEMDV全长基因组cDNA克隆构建

以EMDV侵染的茄子叶片总RNA经反转录所得的cDNA为模板，合成三对引物 EMDV/A/F和EMDV/A/R、EMDV/B/F和EMDV/B/R、以及EMDV/C/F和EMDV/C/R，分别扩增得到EMDV A、B、C片段；以pCB301-2m-HDV载体为模板，合成引物pCB301/35s/15nt/F和pCB301/HDV/15nt/R获得载体片段D。A、B、C和D片段转化酵母后通过体内同源重组法装配全长克隆，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定无误后即获得EMDV全长基因组克隆rgEMDV。引物序列列于表1.

rgEMDV-GFP克隆构建

在已有EMDV野生型克隆载体rgEMDV的基础上，设计两对引物EMDV/GFP/AatII/F和EMDV/GFP/R、EMDV/GFP/F和EMDV/GFP/AatII/R，以rgEMDV侵染性克隆及GFP基因质粒为模板，经AatII酶切及In-Fusion克隆，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，即获得克隆rgEMDV-GFP。引物序列列于表1.

rgEMDV-X:RFP克隆构建

在rgEMDV侵染性克隆载体基础上，设计三对引物EMDV/SpeI/F和EMDV/NX juc/R、EMDV/RFP/F和EMDV/RFP/R、EMDV/XP juc/F和EMDV/SpeI/R，通过SpeI酶切及In-Fusion克隆，获得X置换为RFP的重组病毒克隆rgEMDV-X:RFP。引物序列列于表1.

In-Fusion克隆

根据实验需要，可选择单片段重组克隆或多片段重组克隆。方法参考clonexpressII或clonexpress multis onestep cloning kit。

1)单片段重组体系：

Vector 50-200 ng

Insert DNA 20-200 ng

5 x CEII buffer 4 µL

Exnase II 2 µL

补ddH2O至20µL

2)多片段重组体系：

Vector 50-200 ng

Insert DNA 20-200 ng

5 x CE Multis buffer 4 µL

Exnase Multis 2 µL

补ddH2O至20µL

3)37℃，反应30 min后取5 µL转化大肠杆菌

酵母同源重组克隆

1）取-80℃冻存的酵母Gold （Clonetech）菌株细胞在 YPDA 平板上划线，于30℃培养至菌落直径约为 1~2 mm；

2）从平板上挑取单菌落接种于 5 mL YPDA 液体培养基中， 30℃、230 rpm 振荡培养过夜；

3）按照1：20的比例将活化的菌接种到 50 mL YPDA 液体培养基中， 30℃、230rpm 继续振荡培养 4~5 h 直至 OD600=0.4～0.6；

4）将培养液转移到 50 mL 离心管中， 5,000 rpm 离心 5 min，回收细胞；

5）倒掉培养液，用 15 mL ddH2O 充分悬浮细菌沉淀，轻轻旋转混匀；

6）5,000 rpm 离心 5 min，弃上清，用 5 mL 100 mM LiAc 充分悬浮细菌沉淀，轻轻旋转混匀；

7）5,000 rpm 离心 1 min，弃上清，用 4 mL 100 mM LiAc 充分悬浮细菌沉淀，轻轻旋转混匀，室温静置 15 min；

8）5,000 rpm 离心 1 min，弃上清;

9）依次按下表所示的体积在离心管中加入试剂，彻底涡旋混匀；对于 10 个转化而言：

50% MW 3350 PEG 2.4 mL

1 M LiAc 0.36 mL

10 mg/mL ssDNA(用前煮沸 10 min 后置于冰上) 0.1 m

ddH2O 0.69 mL

总体积为 3.55 mL

10）将感受态细胞以每管 355 μL 的体积分装于灭菌的 1.5 mL 离心管中，用于后续实验。

11）将需要酵母体内重组的片段各1 μg DNA一起加入到同一管制备好的酵母感受态细胞中，涡旋混匀；

12）30℃水浴 10 min;

13）42℃水浴 20 min;

14）3,000 rpm 离心 2 min，弃尽上清， 加入 100 μL ddH2O 轻轻吹打混匀细胞沉淀，均匀涂布于 SD /-Trp固体平板上，30℃倒置培养 3~4 天。

农杆菌转化、培养及浸润植物

1)取重组植物表达载体质粒各1-2 μL，分别加入到200 μl农杆菌（EHA105菌株）感受态细胞中，吹打混匀；

2)将上述感受态细胞转入2 mm电击杯中，并于Bio-Rad电击仪中进行电击转化；

3)转化完成后加入YEP恢复培养基并转移至1.5 mL离心管，28°C，300 rpm振荡培养2 h；

4)8000 rpm离心2 min，弃上清，用200 μL去离子水悬浮沉淀并涂布于YEP平板培养基（50 μg/mL 卡那霉素 + 25 μg/mL 利福平），28°C恒温培养箱中倒置培养48 h。

5)将重组病毒cDNA克隆、病毒核心蛋白表达载体、RNA沉默抑制子或干扰素拮抗因子表达载体的农杆菌分别接种至4 mL YEP液体培养基中（50 μg/mL 卡那霉素 + 25 μg/mL利福平），28°C，220 rpm摇菌培养过夜至OD₆₀₀为0.8-1.2，经5500 rpm，10 min离心去上清，用浸润缓冲液（含10 mM MgCl₂，10 mM MES，200 mM ACS）重新悬浮菌体，调整OD₆₀₀为1.0左右，静置2-3 h。

6)将静置后的重组病毒载体、核心蛋白表达载体、沉默抑制子表达载体的农杆菌OD₆₀₀按照终浓度0.2:0.2:0.2的比例混合后，或按特定的比例混合，浸润接种4-6叶期本氏烟，每株植株浸润3-4片叶片，接种后的植株置于25°C温室中培养。

荧光细胞观察及统计

1） 浸润接种一定时间后，制作植物叶片玻片或植株活体观察荧光细胞；

2） 根据实验需要选择激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM 780）或体式荧光显微镜（Zeiss Lumar V12）拍照观察荧光蛋白表达情况；

3） 必要时进行荧光细胞数目统计，统计方法为计数单个视野内荧光细胞数量，通常选用三个视野取平均值。

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，该实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1 利用基因组RNA策略拯救重组弹状病毒SYNV

为了验证是否可以通过基因组RNA策略拯救重组病毒，分别构建了可表达SYNV基因组RNA和反基因组RNA的重组表达载体rgSYNV-GFP和ragSYNV-GFP（图1A），与核心蛋白（N、P、L）表达载体pGD-NPL及病毒沉默抑制子蛋白表达载体（pGD-HcPro、pGD-p19、pGD-γb）分别转化农杆菌，并浸润本氏烟叶片进行表达。

在接种后9天、12天、15天对接种叶进行荧光观察，结果发现，浸润rgSYNV-GFP的植株中GFP的荧光数目显著高于ragSYNV-GFP，且随着接种时间的增加，荧光逐渐扩散移动至周围细胞（图1B）。浸润后15天左右，rgSYNV-GFP接种的植株开始出现植株矮化、叶片卷曲等典型的SYNV侵染症状，而ragSYNV-GFP接种的植株则在25天左右出现该症状（图1B）。

在手提紫外灯下观察发病植株的系统叶，发现在系统叶的叶脉和叶肉细胞中均可见强烈的GFP荧光（图1C）。同时采集发病后一周左右的系统叶进行Western blot分析，结果发现，rgSYNV-GFP和ragSYNV-GFP接种植株的系统叶中均可检测到SYNV对应的结构蛋白条带（图1D）。

为比较重组病毒rgSYNV-GFP和ragSYNV-GFP的系统侵染效率，在浸润后30天左右，统计其发病率，三次重复接种实验结果发现，rgSYNV-GFP的发病率达到100%，而ragSYNV-GFP的发病率在13.3%左右（图1E）。

上述结果表明，SYNV基因组全长克隆rgSYNV-GFP具有系统侵染性，且侵染效率可达100%，显著高于SYNV反基因组全长克隆ragSYNV-GFP。

实施例2 基因组策略与反基因组策略对重组SYNV拯救效率比较

为进一步比较基因组策略与反基因组策略对重组SYNV的拯救效率，将ragSYNV-GFP的农杆菌，以及不同比例稀释的rgSYNV-GFP的农杆菌分别与表达核心蛋白和病毒RNA沉默抑制子的农杆菌混合后，浸润本氏烟叶片，进行重组病毒拯救效率分析。接种后30天左右，通过检测系统侵染的植株百分比，ragSYNV-GFP的拯救效率仅为6.7%，而rgSYNV-GFP的拯救效率可高达100%，即所有浸润植株均被重组病毒系统侵染。当rgSYNV-GFP菌液接种浓度稀释至100-200倍时，与系统侵染效率与ragSYNV-GFP相当（图2A）。

将表达ragSYNV-GFP的农杆菌，以及不同比例稀释的rgSYNV-GFP的农杆菌分别接种于同一叶片左右两侧，进行荧光细胞数目的统计与比较。浸润9天后， ragSYNV-GFP叶片单个视野内仅可见少数几个荧光细胞，而rgSYNV-GFP浸润的叶片区域荧光细胞数目显著增加，且随着接种菌液稀释倍数的增加，荧光细胞数目逐渐减少。当rgSYNV-GFP菌液接种浓度稀释至200倍时，荧光细胞数目与ragSYNV-GFP较为接近（图2B）。

上述荧光细胞数目及发病植株的统计结果表明，rgSYNV-GFP的效率约为ragSYNV-GFP的100-200倍，SYNV基因组拯救系统的效率显著高于SYNV反基因组拯救系统。

实施例3 基因组策略拯救重组病毒依赖于免疫拮抗因子的表达

由于基因组策略不可避免地导致双链RNA形成，将诱导RNA沉默抗病毒免疫反应。本实施例测定了不同病毒编码的免疫拮抗因子对重组病毒拯救的作用，包括植物病毒RNA沉默抑制子，如烟草蚀纹病毒Hc-Pro、番茄丛矮病毒p19和大麦条纹花叶病毒γb，以及动物病毒干扰素拮抗因子，如兽棚病毒B2、埃博拉病毒VP35和人流感病毒NS1。按实施例1中方法，将rgSYNV-GFP载体，核心蛋白表达载体pGD-NPL以及上述蛋白表达载体共同浸润本氏烟叶片，观察荧光细胞数目。如图3A、3B、3C所示，这些免疫拮抗因子的表达的组织内均可观察到数目不等的GFP荧光细胞；当两者、三者或四者混合共同表达时可显著增加荧光细胞数目；相反，当不表达任何免疫拮抗因子则没有出现含有GFP荧光的细胞（图3A和B）。

在浸润后30天左右，表达不同免疫拮抗因子的植株发病率为62-85%不等，四者混合共同表达时发病率为100%，而不表达任何免疫拮抗因子的植株均没有被侵染（图3C）。

以上结果表明，同时表达植物病毒编码的RNA沉默抑制子或动物病毒干扰素拮抗因子对于重组病毒拯救的是必需的。

实施例4 利用基因组策略拯救SYNV M缺失突变体病毒

弹状病毒的M蛋白是一个多功能蛋白，在病毒侵染循环中发挥多种重要作用，如参与病毒粒体装配、出芽、抑制病毒基因组转录等，缺失M蛋白后，突变体病毒通常难以成功拯救。动物弹状病毒的研究发现，M缺失突变体的拯救效率仅为野生型病毒的五十万分之一（Mebatsion等人，Journal of Virology, 1999, 73: 242-250）。

在实施例1所述ragSYNV-GFP和rgSYNV-GFP的基础上，将重组病毒的M基因替换为DsRed基因，分别构建M缺失突变体ragSYNV-GFP-M:RFP和rgSYNV-GFP-M:RFP（图4A）。利用实施例1所述的方法将rgSYNV-GFP-M:RFP及ragSYNV-GFP-M:RFP农杆菌并浸润接种本氏烟，同时接种rgSYNV-GFP作为对照，接种20天左右，对照植株出现心叶下卷、花萼弯曲等典型的病毒症状，接种40天左右，接种rgSYNV-GFP-M: RFP植株出现类似症状，而接种ragSYNV-GFP-M:RFP植株与健康对照植株类似，未表现出病毒侵染的症状。接种rgSYNV-GFP-M:RFP的植株系统叶中可见明显的GFP和RFP荧光，且荧光的分布主要集中在叶脉中，接种rgSYNV-GFP的植株系统叶的叶脉和叶肉细胞中仅可见GFP荧光，而接种ragSYNV-GFP-M:RFP的植株系统叶中未见GFP和RFP报告基因的表达（图4B）。

实施例5 EMDV病毒基因组拯救系统的建立

进一步测定了病毒基因组拯救策略是否适用于其它弹状病毒。构建了EMDV基因组链表达载体rgEMDV，同时构建了leader和N基因之间插入GFP包括基因的表达载体rgEMDV-GFP（图5A）。同时构建了EMDV核心蛋白N、P和L表达载体。以实施例1所述方法将rgEMDV及rgEMDV-GFP病毒克隆载体分别电击转化农杆菌，与含有核心蛋白表达载体以及病毒RNA沉默抑制子表达载体（pGD-HcPro、pGD-p19、pGD-γb）的农杆菌混合浸润本氏烟叶片。rgEMDV-GFP接种后8天即可在接种叶上观察到较多的绿色荧光细胞，并且部分已扩展到叶脉中。接种后20天左右，接种野生型与携带GFP重组型病毒克隆植株均出现系统叶下卷、植株矮化的症状（图5B）。接种35天后于手提紫外下可见rgEMDV-GFP发病植株系统叶叶脉及叶肉组织发出较强的绿色荧光（图5B），提取系统叶总蛋白进行Western Blot分析也可见清晰的EMDV结构蛋白及GFP条带（图5C）。

上述结果显示所得rgEMDV及rgEMDV-GFP病毒侵染性克隆载体均具有系统侵染性，侵染效率约为60%（表2）。

表2. EMDV基因组链克隆侵染效率

EMDV克隆	试验1	试验2	试验3	系统侵染率
					rgEMDV	14/24	7/12	30/50	51/86 (59.3%)
rgEMDV-GFP	10/15	19/30	22/40	51/85 (60%)
					rgEMDV-X:RFP	1/15	2/30	3/40	6/85 (7.1%)

实施例6 利用基因组策略救X缺陷型EMDV侵染性克隆

在实施例5所得rgEMDV侵染性克隆载体基础上，构建了EMDV X基因置换为RFP的重组病毒克隆rgEMDV-X:RFP（图6A）。利用实施例5所述方法将rgEMDV-X:RFP与rgEMDV对照克隆载体分别浸润接种本氏烟，30天后，接种rgEMDV植株出现明显矮化、叶片下卷的症状，接种rgEMDV-X:RFP植株虽然症状较轻，系统叶叶脉和叶肉中已出现明显的红色荧光（图6B），提取系统叶总蛋白进行Western Blot分析也可见清晰的EMDV结构蛋白条带（图6C）。rgEMDV-X:RFP的侵染效率为7.1%，显著低于野生型重组病毒（表2）。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法及重组病毒

<141> 2020-06-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13155

<212> DNA

<213> 茄子斑驳矮缩病毒(EDMV)

<400> 1

acacacccac cgaagcatta taaccataat ggatgtatta ggtgcaggca cctttttaag 60

acccagaaca cagactcagt accaggagag atgtcttcat catagcagcc ttgctgagga 120

atatacatta aactaaaccc tttaaattta gggtttttat taagtactat agctgccttg 180

attgatcaga gggggtatta ggttccaaca atattgaacc ctctcctctt ttgggtcttg 240

aagttgatag atataaagac atcttcccat gtggccccta tgttctgtaa tagggggtct 300

ctgtgcactt tgagatacat caacttgtag aatctcacca tggcattgtc cacactgcaa 360

gttctcagtc tcggggtgat tctccctctg atggagtcca ggtcggcaga tttaatcctc 420

cctatagtgt cagcatcaaa aggctctgca tgggcaagta cactgatgat cagtctcatt 480

aagatgtcct gtattctttt ggtctttctt ctcagtctgc agaatgagtc aatgcggtca 540

atctccttga gccttctgga gaagacatta atcatctcta gtctattctt gaaagtgtac 600

aggcgaatct gctgtctggt gctagagatg tgcgagaagt tatccccggg tctcgttggt 660

ctgggtgcct ccggtccgat gtgagctacc tcttcataca gatgatgaag cggggatagg 720

ttagtgatgt aattctgatt ggtgaattcc agaatcatca gcagcgccgg aactatcacc 780

ctggggaacg tgaatacaca gtcaattctt cgtctcatat cgtcacccat cgttgacagg 840

cgagagcctc ccatagcaca gtacactctc cctcggtcct caaggatctc agatgctatc 900

tcttgcctcc tggatataac caggcagtcc ccttctgtaa tgtcttcttc tgagtaggac 960

atgataactg cacactgtcc caatttatta tctctaaatt tctcaaatat attgcctgtc 1020

tcctcatctg acaatgagtc aatcattata tgaatgggtt tattgaagcc tgtcctcatt 1080

ctcacagcag cgtagataat ctctgctgac tcaatctcta ggtccatgac aatgcagtca 1140

atctccactt catgtacaaa tctctgaatg agatctgccc actcttgaac tgacgtttcc 1200

tcacccactg agaatatcgg gagaagggta ggaaggtcca gaagttctga ttcatgggat 1260

gtccttatcc tactgatggc gggcacatct tcataatgat acatgtcggg gatgttggga 1320

tctggtatct gaaccagctc ttttaataga ttatcaggat gggcacaaat aataggcact 1380

ctcacactga caaattggtg ggctgagcac atactcatgg acagagcatc tttagttctc 1440

atgttcataa tcttcttgag tatacccaga caatcaggac acccaaccaa catggggttc 1500

ttgcccagct tatgtaggat tatttgcaga ggcaaccaac ccagtacact attagggtag 1560

catagaatac ctatcggctt gtcctcctcc caagtgtcgg ttatcacaga ggtggatacc 1620

ccctcaagcc taccttctgt tgcccatccc agggcggaca tttttgcgga catgccttgt 1680

agtgtatcgc agagaacgtc taatgatctg caactctgaa tactcatcgt gggatcaatg 1740

taccgaagca atgtgatctt cttcctaaat gataacaagc atgcatctac atccactttc 1800

tctcgagcca gtagcataaa gcttttggac atgccatgtt ttcttcctag agcctcaatg 1860

accaatatgg tacttataca gtcaatgatt ctgtcccgag atgaccccaa gacagtgatg 1920

tcttcaagga tcatcggggc aatgctctgg ctgtcctcta ttgcaagtct tcgagtgtag 1980

tccatcttta tactctcact ttctacataa accagaagat tgttcgggag tgtaggaaaa 2040

gataccggca gtgtgggagc ggtggagtct ggtggaatgg gctcgatctc tgttatgcat 2100

gtcggacaac attcatgagc atgatactca gtgatagcgt cagatatcct cgatcccctc 2160

atgtacctca gcatgtatct tacacaagtt atcatacaag attgaaagtg aatgtattca 2220

tttttccccg atctcgaatg ctccacccac gtggaagtgc acatactcaa gtgtgtgctg 2280

gcagtattca agaaattggg tatccctcca tgcgtgttgg catctgtgtt cctcctgtga 2340

tcgtaactac ctcttatggt ctcctctctc acccagacag tctcaggatc aacattggag 2400

acagccaaca gagtagccgc gattatcctg ccaaatgtgg agtctgaagg gtatctccaa 2460

cctatcagct tctgaatact cacagccctc ttcagtacat cttcatcccc ataagctgat 2520

gctatgtcag ttgccttgaa tcgttcttta gtatatgatc cgaaataggg tttgcacggt 2580

cccttggttg ataggatgtc ttgtccgccc tgtctcccgt cttgtatggt gatgtaacct 2640

gacatgcaca ggtgaccatt tctcggcaca acattcaggt attcagccgg atgaggcaca 2700

gtcactccta gcacttgctt tttataagag agagacctca ttgaatctgc tgtaagtctt 2760

gagcaatcag agaactttag atcatgagga accttatctc ttacatgcag gtaccctata 2820

tactttttct cagactctgc cagctctgac acaaccgaca tggtctcatt cattctgcgt 2880

atggtccgcg tcttgtcaat tcgtgagatg aggctgttgg tcacgccata tagagaagct 2940

ttagcaatct catgtaacac ctttggatct agcttttctc cagagcatag tgcagaataa 3000

aacactcttt cattttcctt gcttgcaaca gaaacaagat tgacaaagtc aggattgtta 3060

tgtttcgcta ctgaaaggac ggcctcccgt gcattttctc tgagggttga tgtgctgtgg 3120

gatgggctgt catgagagat agcagcggga tcttcaacca gcttctcata attggggtgc 3180

tgactgaaag agattccctt cattgcaccc acagcaatac ctaaacctat gtctattttc 3240

atcaatctct catgcaactt gttaagaaac atcacacctt ctgtcacagg atcggggaac 3300

cccctctcag tcaggttaaa gcaattggat aagcccggcc ctccaaagat cgaagggagg 3360

taaagtattt tggcccagaa gtgaaccaga tccatctcct ctagtgatag actcctcttt 3420

gacccctgtc tcatcacatc aaaggtccct gaaacaagac ttccttccgt agcgtagaac 3480

aaaggattca ttgatcttga cagctcagca atatacagac cccacaaaca cttcattgtg 3540

atcacaccga caataaaatg ctccttctgc attgctgcct ttagaatagt actgacactg 3600

ttgcacataa gggcagtgga catcactgaa gaattggaga atgggaaaca cctgctgatt 3660

tgcttcatta cagtccgtag cggtctgcct ttatagtaca tgtgcttgtt atacatgaat 3720

agagaagtgc tagtccaagt ttcactagcc tttagtggaa gaccacgtct atcaaaatgc 3780

tgctgcaatt cggacaagaa agctttcatc ttatccctga tttttctctt cccttcttga 3840

cttatctccc ccccttctaa gatgtcagat gttctgatag tgacggtcaa cacctgatta 3900

tctcctcccc caaccagaga tgcatccatt cccaatcgat ccgcaacata ctttatatca 3960

cacactgtca tgattgtcca gcctttctgt ctcaatccct ccttgccaga cccatcccct 4020

gtccaggaat taataccgtc cactaccacc ccagtaatgg gatccgcggt tagaggtctc 4080

tcgccagaac tcagatagat tacacacttc cttaacatca aatgggtctg atcatacaat 4140

ccttcagacc caaatgttct ccctaacttg gagaagacag gatgacaaat ttcatatctc 4200

atttgctggt tccatttcat gaaatccata ttcacaacat atgtaaccga cctgctctga 4260

tcagactgat ggcctgaaag cttgctcatg atctttgtca tctcaagcaa attgatcgac 4320

atagttatct ctgggaaata tttgagtacc ttatcattca acaacccttc agtggaagtg 4380

acatacagcc tgaattcatg tgtcatcagt gagaagaatc ttggctttat ttttaactcc 4440

ctctctttcg ggtatatgcc gatcatgaga aatttatctt caaggccgtt agcaccaact 4500

ttctcaagga aatcacgcat ggggccaagt ggagtcataa ttgtcttcaa tataacccgt 4560

ctcatatctt gattgaacac gtgtcccctt gtgattaagt tgtgatagag ctcttctctg 4620

ttaggagaaa tggccttgtc ctttaccgtg tgtatgatgt tccaggaggt aggtatctca 4680

aagttctgac caaccaccac ccattcccaa tcctgcatgg aatagccaat attggatgtg 4740

gagaaaatgg tgttgccctt tagacaatta aggagatata tactgctctc cgctttggct 4800

atatctatgt ggtccggcct ctctatatgg tgcagaggat aaaccccatg tttcttcctg 4860

aaatttgaaa agaacaactc taaaaatttc ctgcctactt catctcctaa agcaagatct 4920

gtttccttct cctgtaagga cactgatctc atcttttcca tccccccatc tatgtctatg 4980

ataggatgac cccatatcct atacaaccca tgtatatccg ccagttgatc aacatcaaca 5040

ttcctcaaca actcatacat tctttggaca tagattctgc ctcgtggaga gacatctctc 5100

agcacctcat gaaggaaagc atctccattc aacttcagat catcatcatc tctggatata 5160

attataccaa caataagggc ttcaaaacct gacacatcag aataaccatc attccctaaa 5220

tcatgcagga gatcatcata gatcttgaag acattcgtga taaggtcagg agaaggacaa 5280

atatcctgca acaagggctg catcacacca gaatatagaa gtagattgta tctctcttgt 5340

atcttatcag ctgcacagat aaaataaggc ataggggtcc aaaggcgttt tgatcctatc 5400

tgaatatgaa taagatcagt gttcattgtt ataatgaact ccggctctac catcacctgt 5460

atatgttcct ggacaatatg cagatgatca agtccgctat aacccaagat gtctttgctc 5520

cttatcgtct tcagattatt tttcatcatc agaaggaaac acaatatccg cacagtgtca 5580

gacaaacaag gataagataa ttgattcatt agaagactgt tagatacatg attcttgatg 5640

gaagtattct gaaacaaccg accattgtac aaaacatcac actcagcctc cacaagagtt 5700

ccgattttct gagtgtcaat ggacataaga tccattcttt tcagatccct gataatacaa 5760

ttttgattga gtggcgtctt cagagtagct atcgcccaca aaaactgcat acagcttatg 5820

ttgtctagca ttgtccccat ttccccgatc aattttatca tcttattttc ctccttgaca 5880

aaaatatgag aagccctata atcatcgata cacttcaaag cagactgcag atgatagtcc 5940

cccccctcat gtatatcatc agagcaaact ccccagtcac tgtcatccct agcatcatac 6000

cagtcttctt gtcgatcttc ccaatcggtc tcgtccataa ttagttgggt ttttattaaa 6060

cattaatata ttacatgcat actccatact cacacacaag ctgacttgtg actacaccct 6120

atcactactc acatccatcc aggatcattg gttcttctaa agaatgaaat aaaaatccgt 6180

gtagcataca atactaggat ggtgaggacc agtatgtaca cccacttggt aaaacccgtc 6240

aggaatgacc aaatacctcc cgctatcatc tgtacatctg tccatatttt cgtgagtatc 6300

ttgacgattg ggctagtgac aacagtggag tagggagtgt tttgtgagac ttgagaggat 6360

gttttgttta cgttgaatac tatgtgatca ctgaacttgt ctattgtcat ccctatggag 6420

tcagatacat tctttatttg agggaaccat tttgagctgc gaatggagtt aggattggct 6480

ctgggagtcc actgtagagg tccggtgtac ggtggataga ggactgcttc acccctccag 6540

aagttgaact taatagggct cccttgatcc atcatctgct tgtaaggatt tatgctgctg 6600

atattgcaca tgtcactttt gtcaaagtag gagtatacag gattccacca attcgtgtcc 6660

cctgtatcta tgttcctgat catgaacata ttcttgttgg cgcaatagga taagggaatg 6720

gaaaaggtat gtctggtatc cactctgcag gggacaactc tcattattcc accattctga 6780

acaggcaacc atggtccatt tgccgtgtct acaacatctt cttcatatat catttgctgg 6840

aaagatctat cggccaggtc acacaatgtg ccacagtatg tatcctccag gatgcctatt 6900

gtgtctgaga tagttgtcag aagatcagtt attccagtgt aactaggatt ttgagaccct 6960

ataagggtgg acaccctccc agttatcgcc aatgatagtg acttatttcc ctcaacataa 7020

aatataccat ttgatgatat gttgacactg cctacacagg tgtctgattt ctctatcacc 7080

ccattggtgt tgataagtac tcctgaatca ggacagtggt aaacccctag cagtggatta 7140

agcaagcaat cttctacact tgccaataat agagggcaag ttcggggcat gtgagcatag 7200

gaggagttcc acagatgcca tgttgaccca tagaacactc cattatcaga taagctagaa 7260

tagttacctg tgtatgggtt cttgaccacc aggttccctt caagatcgga gcttaccccc 7320

caggcatccg gatatataat gaatttgtat ccggatactt ctatatcttc ccagtatgtg 7380

cattcagggt catccattgt ttggtactct atagctgtct ttcttggatc ctcacctagt 7440

tggatgattt gatcaagata cggggagaac tctgatatat taaggactgt tgggacagat 7500

gattcaacgt acaccataca ggtccctaat agactgacat gtgatttctt cgtgatggta 7560

aaagtttcaa cacccatgac tgggatgtaa tctatctttt gagaatattg aaagatgctg 7620

agtgctgtgt gtctcatatc tgatgaatat gaacattggg ccttacagat tccataccat 7680

tcagatacag agaaaccttc atctgttgta ttacaggagt ataccggtac catatcatat 7740

atggtatcag agtgagtgac actgtaagct tgcaatccgg gatcattgta gagattcttt 7800

gcagcgggat taggtataaa agtaggggca tattcatctt gaatatcatg tgatgaggaa 7860

gggctttgga tgacaggtcc tctgcctccc tcctggatca gcttcccgaa atcaaatgat 7920

tgggtagaca tggaagaatg taatagcact atacacaaca ctgataactt atccatcgca 7980

acagtcgtga tgatgtggtt gcagtaaatt ggagtgttgg gtttttatta aaagtaaaaa 8040

atacaatcaa tgccacgatt attctatcgg tctggtacac ttaacagcaa cattaccaca 8100

caacgataac ctaaactcta aatacgaaca catgacccag atacaattca gactatgggg 8160

tggtttgtca aagagcagca catagtggtg ccgttatgaa ggttttagga tctttgccac 8220

agcatccatg atcccggagg agtgtgtctt cctagaaatg tcgtctcctt tcctcttgat 8280

tgattttctg aacagcgaat taactttttg agatgcattc ctctggtatt tactggctaa 8340

tacccttatg ttgagccggg tcctggtggc ggcatgtccc ctaggtggag ctctcacata 8400

agtagcaaag gaaagatgtc ctacgatctt agagtctgaa gatatgtatg gtttttccaa 8460

tgtcagatgg tagctaccag acagaggatt atctcctgct tgattgacta tctcaacaac 8520

atgagagtca tagttaggag agactagtgt ttcgccctcc ttgatgacca atgtaggagt 8580

ctcattagaa tgatcagtgt tggtgttcgt gaacaccatt ttcgcattag tgtggatggc 8640

atgaatccta catatttgaa gtatattctt agcaacacgt gtggtcatag tgggaggaga 8700

ccgtttcact gcatctggtc gagttgaggg taattccaat gcagactcaa tcatatcaaa 8760

aatatcgtgg tagtgtagtt ctccttcttc aaaggctttc ttcatctcgg cttcgtacat 8820

gtgtatagtg ataatataat tgagagaaac tggttgcccg acaaccgtac tcaaaaggga 8880

caccttatct ttctcgacat cataaatccc ttgtacagat gcactggacc tcccgataac 8940

gttaatcatc ttgttgttgg gtttttatta aatagatata ttccttagaa attacacata 9000

taatgcatta tatagttata ttgatagata acataggtag acaatcaaaa tctagtagta 9060

gaagactgag tctctttgtt aagctcccca gttatttccg atgcaaatgg tctataagat 9120

gacatattga acctggtaaa caagttcatg agatacagga gatcatctga tgtcatattg 9180

tagcctggtc gtaacccctc ctccaagaat ttcagtttat ctgtttcatc atcattcagc 9240

atatacttca ataccatcat gtcgatgaca tccatgtcat ccttcttagt tatcttccga 9300

atgacattgg ggaatgattc cttaaagtca tctaatatcg gtataatgct ggtaatattg 9360

gaggagaact gatcaccttg agggttcaac tggtagaata tgctcggcat accgtgccat 9420

gtggggggct caacagatat attcacattg cggacaccat tctttgggta atcatctgga 9480

ccgttgacat acatttcaaa gacaatagac cccaatatct catcagaaac tgtcccaggc 9540

atgatatcga ctttataagg gcatctttgc agctgctctt tgttgatgta tatggatgta 9600

ttgattgtta ttttgactgc atgcccaatc atccctttac ccttgagtat gacatgcttt 9660

gagtttccac cctcatagaa gaactcaaat gcaaaggtcc cagggctctc agggggacag 9720

gtgggtttcc atattatact gaacttggtc agacgaacga aggatttggc atctcccccc 9780

attgtcccca tgactctctt cactacaccc aaacgccttg ttgccgcagt cttgacagga 9840

agggctatct ccatcccatc cttagttaat ttcctatctt tcatagtgaa gctcttgaga 9900

tcagccatcg tggttgttgg gtttttatta aacataacac cattaacaat aagaacaact 9960

atatataaga aatagatcaa tactttgcac acataaacaa ccatggatgt gatacactat 10020

agggacaata cggatgcggg gcgctgttat tcagaataca gtgggcgggg ttttcaaggc 10080

atgtcaggtc cttctcttgc cagtgtgcac cgagtatgcc tttttatcct tctccacccg 10140

gtcccctaca atcgccatcc cccgctcttc tcccagtgtg gtcatgacgg ccactgctat 10200

aggatcaatt gttctcatga agttgaatgt gctttcaact aatcgaggat tgctaacatc 10260

gttatagata ctagagtaac ctatataagc attcaggtac atcattatac tagaagcctt 10320

ttctttctga gatttcccct cataagagga taaacaaaaa gtaacaagct catccttgtt 10380

gagatcctgc acggatgttt tcttgttcat ttttctataa atctcgtcga atttttggac 10440

gatctctacc agggtgtttg tagatgacaa gagtcccgat gaaatgtctg gaagctgttt 10500

cttcgcaaaa ttagcatctt gaacctcact actcctagca gcatcattgt aaccggcaga 10560

ataccagagg atggcacggg attcataaga tccaacgttc tcagtattct ggagattaga 10620

tttctccaga gcacgagata ctgcctcata ggatggagac gcaccattgt tcttaagttg 10680

ttctaatatg tcatgtatga gtttctggtc aggagcaatt gggggcatgt cgtctttttg 10740

ctcggctata tcaggcaatg tggtaatgaa atcctgcaat gaacctgggt tgatatcgtc 10800

gtaactatct gagttgttga ttctgtcaga aatggattgt gctgatatag gtgatgattt 10860

agatgaaaca ggactgggtg acggagatga tgttttttga cgtttgtctg ctctagtata 10920

cggtttgctc cctaatcgtt cctctgagcg ggatgatttt ctattcatct ttcatccttg 10980

tgggggtgtt gggtttttat taaacatagc atcaaatact cttgctatgt gttgtggatg 11040

ctagttcccc cattcgccat gattacattc tgccatcagt tcatatatgt cagaatcatt 11100

gtcatcatga tagtagtccc ttccatcagt gaaatcataa tatgtccatg agtctgagct 11160

ctcagcatct gagttctctc cctctatagt gacaggtata gaatcttgat ttgcatcatg 11220

tttatttgtc tcagattgac taagtaagtt atctaccatg cggcacattt caacgaagac 11280

atcatcattg tcttcatctg gggtggtggg tctgtgtgtt gtctcattca tggtgtgttg 11340

ggtttttatt aaagggaata atactttatt acaatacacc gcatgcacca cacaccacaa 11400

acatagacta gatacacaca tgcaattgaa attagaaatc atcttacaaa ccagaaagga 11460

atcccccctt ctcgagggcg gctgcggcgg tccctggatc tgcctgttgg ggagggacgt 11520

ctgcagggga ggacccatca acctgcatct ctgcttccgg aggaggctgg ctggcgggtg 11580

cgggtctctt agctgttgat gttgttgctt ctggtgctgg cctcttcatg ggtcgatgag 11640

ggttgctcat cctcataacc acccctaccc cctctccaga tagactctcc aatccttcat 11700

ataccatatg gaaattatct gccattcttt cgaagtatgc agaggtggat gggttgttct 11760

tgatagattc tagaactttt atgttcttcg gattggcata tgcaggaccg gttattaacc 11820

cctccttctc cattatacat gcaatgaggt agatgaattt ggtattacga cttgcactga 11880

ggttaacaaa gtatgattgg tccacatact ttgcatactt ccaatgatgg tcaacaaccc 11940

tttcaggagg aagatcaagc ttcttaacta tatcaacaat cgtcttgatg gtggtgacag 12000

catctgggat ctctatggcc ctgagaaact tggcaggtgt tatggctggc agtccagcta 12060

aggtggtaag aagcatcttg tatacctgca tacctctcat ttcagcgtgc tggtaaatta 12120

ggtacctcat gaacccatga ttcttgtcag atcgagggat ggtggattcc gcctgtccca 12180

gcatccagga tagagtttgt gaagccgcag tgtaagtatc taggccttgg atgatctgga 12240

tcaacgatcg agttggagga gagaagctgt tgacggcctg tgattggaca ccgtaaaatc 12300

gtccaaagct tgatttgaga gtaggtaggg acctctggaa agattctaca gtcttggcca 12360

ctagtctcaa aagtgccatg cagatgtagg ggccagatac tgcaacatct gcactgctgg 12420

gagtaggctt gggttggggc gagactcccc cagccggtat ggttatacta gccgcagcag 12480

tctgctgctc ttctccagca agcttgacat catcaagagc agatttgacg atgttcgact 12540

tcccatcagg gtgctgtttg gcattagtga ggagcctctc tgaggacttt tctatattct 12600

ttatttggaa ggctattcta aagatcatag caatctcaac ctctgtcagt gtgctctttt 12660

ctatactatc catgagtttg atgaaagatg ctgctatgtc cgcattttcc atgggaccca 12720

gatcatacaa ggaagtgatt ttagatagat aatcatcgta tgagtattcg acttgaacgg 12780

gttttcctcc ggtggatgga atgtgctctc gtgaatccca ctcagcatac ttgacctcgt 12840

tacttaaaag agccaatgca tcattaacat tcatactgaa aataataaga gaaactttag 12900

actatcgtac tcagtaaaga tgaattcaaa tttaaagtaa tattgtatgt tgttgggttt 12960

tatttaaaca gtcatgtgga gactgtttgg tctctctttg tgtggtgggc ggaggggacg 13020

ggagtgcagc cgatgatcgg tgggccatgg atcggatgtg cgacgctcag tcccctatat 13080

tatattacat cttaatagcg tgcctcccag tctcacggtt gccacagtgg gtcgttacac 13140

cttgtggggg tgtgt 13155

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 兽棚病毒(FHV)

<400> 2

atgccaagca aactcgcgct aatccaggaa cttcccgacc gcattcaaac ggcggtggaa 60

gcagccatgg gaatgagcta ccaagacgca ccgaacaacg tgcgcaggga cctcgacaac 120

ctgcacgctt gcctaaacaa ggcaaaacta acggtaagtc ggatggtaac atcactgctg 180

gagaaaccca gcgtggtggc atacctagag ggaaaggccc ccgaggaggc aaaaccaaca 240

ctcgaagaac gcctccgaaa gctggagctc agccacagcc ttccaacaac cggaagtgac 300

cccccacccg caaaactgta g 321

<210> 3

<211> 1023

<212> DNA

<213> 埃博拉病毒(Ebola virus)

<400> 3

atgacaacta gaacaaaggg caggggccat actgcggcca cgactcaaaa cgacagaatg 60

ccaggccctg agctttcggg ctggatctct gagcagctaa tgaccggaag aattcctgta 120

agcgacatct tctgtgatat tgagaacaat ccaggattat gctacgcatc ccaaatgcaa 180

caaacgaagc caaacccgaa gacgcgcaac agtcaaaccc aaacggaccc aatttgcaat 240

catagttttg aggaggtagt acaaacattg gcttcattgg ctactgttgt gcaacaacaa 300

accatcgcat cagaatcatt agaacaacgc attacgagtc ttgagaatgg tctaaagcca 360

gtttatgata tggcaaaaac aatctcctca ttgaacaggg tttgtgctga gatggttgca 420

aaatatgatc ttctggtgat gacaaccggt cgggcaacag caaccgctgc ggcaactgag 480

gcttattggg ccgaacatgg tcaaccacca cctggaccat cactttatga agaaagtgcg 540

attcggggta agattgaatc tagagatgag accgtccctc aaagtgttag ggaggcattc 600

aacaatctaa acagtaccac ttcactaact gaggaaaatt ttgggaaacc tgacatttcg 660

gcaaaggatt tgagaaacat tatgtatgat cacttgcctg gttttggaac tgctttccac 720

caattagtac aagtgatttg taaattggga aaagatagca actcattgga catcattcat 780

gctgagttcc aggccagcct ggctgaagga gactctcctc aatgtgccct aattcaaatt 840

acaaaaagag ttccaatctt ccaagatgct gctccacctg tcatccacat ccgctctcga 900

ggtgacattc cccgagcttg ccagaaaagc ttgcgtccag tcccaccatc gcccaagatt 960

gatcgaggtt gggtatgtgt ttttcagctt caagatggta aaacacttgg actcaaaatt 1020

tga 1023

<210> 4

<211> 693

<212> DNA

<213> 人流感病毒(H1N1)

<400> 4

atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60

cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120

aaatccctaa gaggaagggg cagcactctt ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180

ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240

atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta accgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300

gaatggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360

caggcgatca tggataaaaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420

ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480

tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540

ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600

ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660

gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693

Claims (7)

1.一种高效产生重组不分节段负义RNA病毒的方法，其特征在于：

在至少一个宿主细胞中导入实施病毒拯救所需混合物，该混合物包括（i）一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列；所述的不分节段负义RNA病毒包括弹状病毒科苦苣菜黄网病毒（SYNV）或茄子斑驳矮缩病毒（EMDV）；EMDV 基因组如SEQ ID NO：1所示；

（ii）表达载体，其包括编码所述病毒包裹、转录和复制所必需的反式作用蛋白的分离的核酸分子，和

（iii）另一种表达载体，其包括编码免疫反应拮抗因子的至少一种分离的核酸分子，所述的免疫反应拮抗因子为植物病毒编码的RNA沉默抑制子和/或者动物病毒编码的干扰素拮抗因子；

所述的导入是在足以实现所述混合物共表达和产生重组病毒的条件下进行的，进一步还包括获得所述的重组病毒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的RNA沉默抑制子包括烟草蚀纹病毒的Hc-Pro、番茄丛矮病毒的p19、或大麦条纹花叶病毒的gb。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干扰素拮抗因子包括多核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码的兽棚病毒B2、序列如SEQ ID NO：3所示编码的埃博拉病毒VP35、序列如SEQ ID NO：4所示编码的人流感病毒NS1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转录载体和表达载体利用RNA聚合酶II型启动子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列连接了可自我加工的核酶分子，所述的核酶分子用于切割产生所述不分节段负义RNA病毒基因组核酸分子的精确拷贝。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过在不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列中人为地引入一种或多种突变，重组修饰所述的不分节段负义RNA病毒。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过在不分节段负义RNA病毒基因组的多核苷酸序列中人为地插入异源序列，使其编码异源蛋白质。

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