JP6850041B2 - 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用 - Google Patents
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Description
[1]ジェミニウイルス由来のLong Intergenic Region(LIR)と、ジェミニウイルス由来のSmall Intergenic Region(SIR)と、前記LIRと前記SIRとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第1の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のRep/RepAタンパク質の発現カセットを含む第2の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、2個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
[2]前記ターミネーターが2個連結されている、請求項1に記載の発現システム。
[3]前記ターミネーターの少なくとも1つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子由来のターミネーターである、請求項1又は2に記載の発現システム。
[4]遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第3の核酸断片を更に備える、[1]〜[3]のいずれかに記載の発現システム。
[5]前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子P19である、[4]に記載の発現システム。
[6]前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、[4]又は[5]に記載の発現システム。
[7]T−DNA右側ボーダー配列(RB)及びT−DNA左側ボーダー配列(LB)を更に備え、前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、前記RBと前記LBとの間に存在する、[6]に記載の発現システム。
[8]前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、[1]〜[7]のいずれかに記載の発現システム。
[9]目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に[1]〜[8]のいずれかに記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
[10]ジェミニウイルス由来のLIRと、ジェミニウイルス由来のSIRと、前記LIRと前記SIRとの間に連結された発現カセットとを含む第1の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、2個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクター。
[11]前記ターミネーターが2個連結されている、[10]に記載の発現ベクター。
[12]前記ターミネーターの少なくとも1つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子由来のターミネーターである、[10]又は[11]に記載の発現ベクター。
[13]ジェミニウイルス由来のRep/RepAタンパク質の発現カセットを含む第2の核酸断片を更に含む、[10]〜[12]のいずれかに記載の発現ベクター。
[14]遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第3の核酸断片を更に含む、[10]〜[13]のいずれかに記載の発現ベクター。
[15]前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子P19である、[14]に記載の発現ベクター。
[16]T−DNA右側ボーダー配列(RB)及びT−DNA左側ボーダー配列(LB)を更に備え、前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、前記RBと前記LBとの間に存在する、[10]〜[15]のいずれか一項に記載の発現ベクター。
[17]前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、[10]〜[16]のいずれかに記載の発現ベクター。
1実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のLIRと、ジェミニウイルス由来のSIRと、前記LIRと前記SIRとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第1の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のRep/RepAタンパク質の発現カセットを含む第2の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、2個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システムを提供する。
配列同一性(%)=一致した塩基数/対象塩基配列の総塩基数×100 (1)
1実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のLIRと、ジェミニウイルス由来のSIRと、前記LIRと前記SIRとの間に連結された発現カセットとを含む第1の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、2個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクターを提供する。
1実施形態において、本発明は、目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に上述した発現システムを導入する工程を備える、製造方法を提供する。ここで、発現システムは、上述したベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質をコードする遺伝子断片が導入されたものであってもよい。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、タバコ属植物及びタバコ属以外の植物を宿主として、高い発現量で目的タンパク質を製造することができる。
(レタスにおける一過性発現)
まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株を、抗生物質(100mg/Lカナマイシン、30mg/Lゲンタマイシン、30mg/Lリファンピシン)を添加したYEB培地(6g/Lイーストエキストラクト、5g/Lトリプトン、5g/Lスクロース、2mM硫酸マグネシウム)中、28℃で2日間培養した。
まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株を、10mM MES(pH5.6)、20μMアセトシリンゴン、100mg/Lカナマイシン、30mg/Lゲンタマイシン、30mg/Lリファンピシンを添加したL−ブロス培地中、28℃で静止期まで培養した。
《pBYR2fp−EGFPベクターの作製》
図2(a)はpBYR2fp−EGFPベクター(米国アリゾナ州立大学Mason博士より分与された。)のT−DNA領域の模式図である。既知のベクターであるpBYR2fpベクターは、インゲン黄斑萎縮ウイルス(BeYDV)由来の複製システムを有している。また、pBYR2fpベクターは、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子P19の発現カセットを有している。
図2(b)はpBYR2HS−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。pBYR2fpベクターに、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−UTR及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーターを有するEGFP遺伝子断片を導入した。
図2(c)はpBYR2EE−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。pBYR2HS−EGFPベクターを鋳型として、プライマー(pBYR2EE−Ext3−F、配列番号7)及びプライマー(pBYR2EE−Ext3−R、配列番号8)を用いて、タバコエクステンシン遺伝子ターミネーターをPCR増幅した。得られたPCR産物を、制限酵素SalI及びXbaIで切断したpBYR2HS−EGFPベクターにクローニングし、pBYR2EE−EGFPベクターを作製した。pBYR2EE−EGFPベクターのターミネーターは、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが2個連結したものであった。
図2(d)はpBYR2HH−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーターをプライマー(pBYR2H−HSPter−F、配列番号9)及びpBYR2H−HSPter−R、配列番号10)を用いて、pBYR2HS−EGFPベクターを鋳型としてPCR増幅した。PCR産物を、制限酵素XbaIで切断したpBYR2H−EGFPにクローニングし、pBYR2HH−EGFPベクターを作製した。pBYR2HH−EGFPベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーターが2個連結したものであった。
図2(e)はpBYR2H−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。pBYR2HS−EGFPからタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを除去するため、制限酵素XmaI及びClaIで切断した。SIR−C2をプライマー(HSPter−SIR−F、配列番号11)及びプライマー(C1−ClaI−C2−R、配列番号12)を用いて、pBYR2HS−EGFPベクターを鋳型として、PCR増幅した。上記XmaI及びClaIで切断したpBYR2HS−EGFPにクローニングし、pBYR2H−EGFPベクターを作製した。pBYR2H−EGFPベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーターを1個有するものであった。
図2(f)はpBYR2TN−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターはプライマー(pBYR2T−35Ster−F、配列番号13)及びプライマー(35Ster−NOSter−R、配列番号14)を用いて、pCambia1391Z(Marker Gene Technologies,Inc.社)を鋳型として、PCR増幅した。NOSターミネーターはプライマー(35Ster−NOSter−F、配列番号15)及びプライマー(pBYR2TN−NOSter−R、配列番号16)を用いて、pRI201−AN(タカラバイオ社)を鋳型として、PCR増幅した。PCR産物を、制限酵素SalI及びXbaIで切断したpBYR2H−EGFPベクターにクローニングし、pBYR2TN−EGFPを作製した。pBYR2TN−EGFPベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーター及びNOSターミネーターが、それぞれ1個ずつ連結したものであった。
図2(g)はpBYR2T−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターはプライマー(pBYR2T−35Ster−F、配列番号13)及びプライマー(pBYR2HS−35Ster−R、配列番号17)を用いて、pCambia1391Zを鋳型として、PCR増幅した。PCR産物を、制限酵素SalI及びXbaIで切断したpBYR2H−EGFPベクターにクローニングし、pBYR2T−EGFPベクターを作製した。pBYR2T−EGFPベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターを1個有するものであった。
図2(h)はpBYR2HT−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターはプライマー(pBYR2HS−35Ster−F、配列番号18)及びプライマー(pBYR2HS−35Ster−R、配列番号17)を用いて、pCambia1391Zを鋳型として、PCR増幅した。PCR産物を、制限酵素XbaIで切断したpBYR2H−EGFPベクターにクローニングし、pBYR2HT−EGFPベクターを作製した。pBYR2HT−EGFPベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーター及びカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターが、それぞれ1個ずつ連結したものであった。
図2(i)はpBYR2HTS−EGFPベクターのT−DNA領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーターはプライマー(pBYR2HS−35Ster−F、配列番号18)及びプライマー(pBYR2HS−35Ster−R、配列番号17)を用いて、pCambia1391Zを鋳型として、PCR増幅した。PCR産物を、制限酵素XbaIで切断したpBYR2HS−EGFPベクターにクローニングし、pBYR2HTS−EGFPベクターを作製した。pBYR2HTS−EGFPベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sターミネーター及び、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが、それぞれ1個ずつ連結したものであった。
(pBYR2HS−EGFPベクター及びpBYR2fp−EGFPベクターによるEGFPの発現レベルの比較1)
pBYR2HS−EGFPベクターは、pBYR2fp−EGFPベクターのTMVΩがシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’−UTRに置き換えられ、更にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子のターミネーターが挿入された、ターミネーターを2つ有するベクターであった。
(pBYR2HS−EGFPベクター及びpBYR2fp−EGFPベクターによるEGFPの発現レベルの比較2)
pBYR2HS−EGFPベクター及びpBYR2fp−EGFPベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉、レタスの葉、ナスの葉、トマトの葉、トウガラシの葉及びバラの花弁にそれぞれ導入した。続いて、各植物を3日間インキュベートしてEGFPを一過性に発現させた。
(様々なターミネーターを有するベクターによるEGFPの発現レベルの比較1)
ターミネーターを1個しか有していない、pBYR2fp−EGFPベクター、pBYR2H−EGFPベクター、pBYR2T−EGFPベクター、ターミネーターを2個有する、pBYR2HS−EGFPベクター、pBYR2EE−EGFPベクター、pBYR2HH−EGFPベクター、pBYR2TN−EGFPベクター、pBYR2HT−EGFPベクター、及び、ターミネーターを3個有する、pBYR2HTS−EGFPベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入し、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。
(様々なターミネーターを有するベクターによるEGFPの発現レベルの比較2)
ターミネーターを1個しか有していない、pBYR2fp−EGFPベクター、pBYR2H−EGFPベクター、及び、ターミネーターを2個有する、pBYR2HS−EGFPベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を3日間インキュベートしてEGFPを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。
(様々なターミネーターを有するベクターによるEGFPの発現レベルの比較3)
ターミネーターを2個有する、pBYR2HS−EGFPベクター、pBYR2HH−EGFPベクター、pBYR2EE−EGFPベクター、pBYR2TN−EGFPベクター、pBYR2HT−EGFPベクター、及び、ターミネーターを3個有するpBYR2HTS−EGFPベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を3日間インキュベートしてEGFPを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。
(pBYR2HS−EGFPベクター及びmagnICONシステムによるタンパク質の発現レベルの比較)
上述したように、magnICONシステムは、現在商用で用いられている発現システムであり、植物体1g新鮮重量あたり3mg程度以上の目的タンパク質を発現させることができることが知られている。そこで、上述したpBYR2HS−EGFPベクター及びmagnICONシステムによるタンパク質の発現レベルを比較した。
Claims (13)
- ジェミニウイルス由来のLong Intergenic Region(LIR)と、ジェミニウイルス由来のSmall Intergenic Region(SIR)と、前記LIRと前記SIRとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第1の核酸断片と、
ジェミニウイルス由来のRep/RepAタンパク質の発現カセットを含む第2の核酸断片と、を備え、
前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、2個連結されたターミネーターとをこの順に含み、
前記ターミネーターが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子由来のターミネーター又はタバコエクステンシン遺伝子由来のターミネーターである、発現システム。 - 遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第3の核酸断片を更に備える、請求項1に記載の発現システム。
- 前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子P19である、請求項2に記載の発現システム。
- 前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、請求項2又は3に記載の発現システム。
- T−DNA右側ボーダー配列(RB)及びT−DNA左側ボーダー配列(LB)を更に備え、前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、前記RBと前記LBとの間に存在する、請求項4に記載の発現システム。
- 前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の発現システム。
- 目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に請求項1〜6のいずれか一項に記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
- ジェミニウイルス由来のLIRと、ジェミニウイルス由来のSIRと、前記LIRと前記SIRとの間に連結された発現カセットとを含む第1の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、2個連結されたターミネーターとをこの順に含み、
前記ターミネーターが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2遺伝子由来のターミネーター又はタバコエクステンシン遺伝子由来のターミネーターである、発現ベクター。 - ジェミニウイルス由来のRep/RepAタンパク質の発現カセットを含む第2の核酸断片を更に含む、請求項8に記載の発現ベクター。
- 遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第3の核酸断片を更に含む、請求項9に記載の発現ベクター。
- 前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子P19である、請求項10に記載の発現ベクター。
- T−DNA右側ボーダー配列(RB)及びT−DNA左側ボーダー配列(LB)を更に備え、前記第1の核酸断片、前記第2の核酸断片及び前記第3の核酸断片が、前記RBと前記LBとの間に存在する、請求項10又は11に記載の発現ベクター。
- 前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項8〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。
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