WO2024106203A1 - Ｄｎａを植物細胞において増幅するためのシステム - Google Patents

Ｄｎａを植物細胞において増幅するためのシステム Download PDF

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WO2024106203A1
WO2024106203A1 PCT/JP2023/039320 JP2023039320W WO2024106203A1 WO 2024106203 A1 WO2024106203 A1 WO 2024106203A1 JP 2023039320 W JP2023039320 W JP 2023039320W WO 2024106203 A1 WO2024106203 A1 WO 2024106203A1
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WO
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dna
gene
target
plant cell
lirs
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PCT/JP2023/039320
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啓明 雑賀
聖 助川
精一 土岐
彩子 横井
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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Publication date
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention relates to a DNA construct and a system including the construct for amplifying a target DNA in a plant cell.
  • the present invention also relates to a method for amplifying a target DNA in a plant cell using the system.
  • Viral vectors are vectors that can efficiently amplify target sequences, such as foreign genes, in plant cells by genetically manipulating the viral genome. Viral vectors can be used to mass-produce useful targeted proteins, such as biopharmaceuticals. For example, development of a norovirus vaccine and its test reagents (https://www.denka.co.jp/storage/news/pdf/766/20200923_denka_icon.pdf) and a novel coronavirus vaccine (https://www.mt-pharma.co.jp/news/2022/MTPC220224.html) are underway.
  • a system In plants, a system has been developed that uses geminivirus vectors to mass-produce a useful target protein. For example, a method has been developed that combines a geminivirus vector with a double terminator that increases the translation activity of the target gene as a protein production method that surpasses conventional protein production systems using viral vectors (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2). This method has achieved mass expression of the target protein at approximately 4 mg/g FW, demonstrating the usefulness of using geminiviruses to produce useful proteins.
  • Genome editing technology is a gene modification technology that uses artificial nucleases such as CRISPR/Cas9 designed to cleave target sequences to modify target genes as desired.
  • Gene targeting is a genome editing technology that precisely rewrites target genes using foreign DNA as a template (donor), and is a versatile technology that can perform various modifications such as gene insertion (knock-in) in addition to the targeted base deletion, insertion, and substitution.
  • GT consists of three steps: supplying foreign DNA as a template, homologous recombination between the foreign DNA and the target sequence, and selecting GT cells (Figure 1), and research on increasing the efficiency of each step is being conducted worldwide.
  • the present invention was made in consideration of the problems with the prior art, and aims to provide a DNA construct that enables the amplification of a target DNA (such as the DNA encoding the above-mentioned useful protein, the template DNA for GT, etc.) in a plant cell.
  • a target DNA such as the DNA encoding the above-mentioned useful protein, the template DNA for GT, etc.
  • geminivirus vectors are used to replicate foreign DNA in plant cells.
  • Geminivirus which is the backbone of such vectors, is a plant virus whose genome is a circular single-stranded DNA.
  • the replication mechanism is thought to involve the following steps (see Ugaki, Masashi, Development of Plant/Bacteria Shuttle Vectors Using Geminiviruses, Plant Protection, 1992, Vol. 46, No. 1, pp. 31-36).
  • a primer binds to the short intergenic region (SIR) in the circular single-stranded DNA, and a complementary strand is synthesized from the SIR, forming a closed circular double-stranded replicative DNA.
  • transcription and translation occur with the replicative DNA as a template.
  • a replication initiator protein (Rep) synthesized by this transcription and translation creates a nick in the long intergenic region (LIR) in the replicative DNA.
  • Rep replication initiator protein synthesized by this transcription and translation creates a nick in the long intergenic region (LIR) in the replicative DNA.
  • a concatemer of genomic DNA is synthesized by the rolling circle mechanism using the 3' end generated there as a primer and the complementary strand as a template.
  • the LIR in the concatemer is cleaved by Rep to become a unit-length genomic DNA.
  • both ends are joined by the ligase of the plant cell to form a circular single-stranded DNA, which is then replicated.
  • geminiviruses are able to replicate (amplify) the region between the LIRs.
  • the SIR is thought to need to be located within this region because it serves as the starting point for complementary strand synthesis. Therefore, these LIRs and SIRs, as well as their relative positions (the SIR being located between (inside) the two LIRs) are thought to be extremely important in geminivirus replication and, ultimately, in the amplification of foreign DNA inserted into the geminivirus vector.
  • the inventors mistakenly constructed a geminivirus vector in which the SIR was located outside the LIR, and when they attempted to amplify foreign DNA, they were annoyed to find that the amplification efficiency was higher than that of a vector in which the SIR was located inside.
  • the present invention provides the following aspects:
  • a DNA construct for amplifying a target DNA in a plant cell having two geminivirus-derived long intergenic regions (LIRs), a site for inserting the target DNA between the two LIRs, and no geminivirus-derived short intergenic region (SIR) between the two LIRs.
  • LIRs geminivirus-derived long intergenic regions
  • SIR geminivirus-derived short intergenic region
  • a system for amplifying a target DNA in a plant cell comprising the DNA construct described in [4] and a DNA construct for expressing a replication initiator protein derived from a geminivirus.
  • a method for amplifying a target DNA in a plant cell comprising the step of introducing the system described in [5] into the plant cell.
  • a method for inserting foreign DNA into a target site in a plant cell comprising the steps of: introducing into the plant cell a genome editing system that recognizes and cuts the target site; and the system described in [5], wherein the target DNA is a sequence that includes two homologous sequences adjacent to the left and right of the target site, and foreign DNA that is located between the two homologous sequences; the target site is cut by the genome editing system, and homologous recombination occurs with the amplified target DNA, thereby inserting the foreign DNA into the target site.
  • the present invention makes it possible to amplify target DNA in plant cells. This in turn makes it possible to mass-produce target useful proteins, such as biopharmaceuticals. In addition, the present invention also makes it possible to increase GT efficiency by amplifying template DNA in GT using genome editing technology.
  • FIG. 1 shows an overview of GT using genome editing.
  • FIG. 1 shows an overview of a conventional geminivirus vector and an improved geminivirus vector developed in the present invention.
  • FIG. 1 shows an outline of the structure of a geminivirus vector used to examine the effect of the position and presence or absence of SIR on the replicon copy number.
  • FIG. 1 shows an outline of the structure of the geminivirus vector used for knock-in by genome editing.
  • FIG. 1 shows an outline of the structure of the Rep/RepA expression vector.
  • 4 is a graph showing the copy numbers of replicons amplified using the various vectors shown in FIG. 3.
  • 5 is a graph showing the copy numbers of the replicons knocked in using the various vectors shown in FIG. 4.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a specific embodiment of a two-gene co-GT vector according to the present invention.
  • LIR long intergenic region
  • SIR short intergenic region
  • the inventors have demonstrated that the replication efficiency of geminiviruses is improved when no SIR is placed between two LIRs, compared to when an SIR is placed between them.
  • the present invention therefore provides a DNA construct for amplifying a target DNA in a plant cell, which has two geminivirus-derived LIRs, a site for inserting the target DNA is located between the two LIRs, and no geminivirus-derived SIR is located between the two LIRs (hereinafter also referred to as the "first DNA construct").
  • geminivirus refers to a plant virus that has a circular single-stranded DNA genome that replicates via a closed circular double-stranded DNA intermediate (replicates via a rolling circle mechanism) and belongs to the family Geminiviridae.
  • geminiviruses include viruses belonging to the genus Mastrevirus, more specifically, Axonopus compressus streak virus, Bean yellow dwarf virus, Bromus catharticus striate mosaic virus, Chickpea chlorosis Australia virus, Chickpea chlorosis virus, Chickpea chlorotic dwarf virus, Chickpea redleaf virus, Chickpea redleaf virus 2, Chickpea yellow dwarf ...
  • the "geminivirus-derived LIR (long intergenic region)" is not particularly limited as long as it is a sequence derived from a geminivirus and is a DNA sequence that contains at least a nonanucleotide motif (TAATATTA ⁇ C) that can be involved in cleavage and replication by the replication initiator protein described below, and can be appropriately selected depending on the type of plant to be introduced.
  • Examples of the LIR according to the present invention include an LIR derived from Wheat dwarf virus (WDV) and an LIR derived from Bean yellow dwarf virus (BeYDV), and more specifically, a region consisting of the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (WDV-derived LIR).
  • the SIR (short intergenic region) of the present invention is not particularly limited as long as it is a sequence derived from a geminivirus, and examples thereof include SIR derived from WDV and SIR derived from BeYDV, and more specifically, a region consisting of the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (SIR derived from WDV).
  • sequences of these intergenic regions are not limited to the sequences defined by each SEQ ID NO: and also include naturally mutated sequences.
  • Such mutated sequences may be any DNA sequence that shows high identity to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, where "high identity" is, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more (96%, 97%, 98%, 99%).
  • the "first DNA construct" of the present invention has at least two of the above-mentioned LIRs.
  • it may have two, three, four or five, but is characterized in that the above-mentioned SIR is not located between two LIRs that have a site for inserting the target DNA described below on the inside (hereinafter, the two LIRs are also referred to as the "LIR located on the 5' side” and the "LIR located on the 3' side”).
  • “between two LIRs” means the sequence (inside) from the 3' end of the LIR located on the 5' side to the 5' end of the LIR located on the 3' side.
  • an SIR may be located outside the space between the two LIRs. At least one such SIR may be located outside one of the LIRs, or at least one each may be located outside both of the LIRs. There is no particular limit to the distance between the LIR and the SIR, and it may be adjusted as appropriate, as long as the target DNA can be amplified. In addition, in the first DNA construct, the SIR does not have to be located not only between the two LIRs, but also outside them.
  • the LIR may be shared between the multiple LIRs.
  • these LIRs may be composed of four LIRs. That is, the first LIR may be composed of an LIR located on the first 5' side and an LIR located on the first 3' side, and the second LIR may be composed of an LIR located on the second 5' side and an LIR located on the second 3' side.
  • the "site" for inserting the target DNA described below, which is located between the two LIRs, is not particularly limited as long as the insertion is possible, and examples thereof include a site for binding a DNA fragment introduced from the outside (cloning site). More specifically, examples thereof include a cloning site in an LR reaction, a cloning site in a BP reaction, a cloning site in TA cloning, a cloning site in In-Fusion, a restriction enzyme recognition site, and the like. Furthermore, multiple such sites may be located (multi-cloning site).
  • the distance between the LIR and the site is not particularly limited as long as the inserted target DNA can be amplified, and can be adjusted as appropriate.
  • the "target DNA” inserted into the first DNA construct is not particularly limited as long as it is DNA to be amplified in a plant cell as described below, and may be any gene (DNA encoding any protein, etc.) or non-coding DNA.
  • any gene includes enzymes such as cellulase (industrial enzymes, etc.); pharmaceutical active proteins such as antigens, antibodies, growth factors, and growth regulators; and genes encoding selection markers such as GFP.
  • the target DNA of the present invention may take the form of template DNA in knock-in.
  • the target DNAs may be a marker gene (e.g., a herbicide resistance gene, more specifically, a herbicide target gene (e.g., a template DNA for introducing a herbicide resistance mutation into a sulfonylurea resistance gene (ALS gene))) as described below) as shown in Figure 8.
  • a marker gene e.g., a herbicide resistance gene, more specifically, a herbicide target gene (e.g., a template DNA for introducing a herbicide resistance mutation into a sulfonylurea resistance gene (ALS gene)
  • ALS gene sulfonylurea resistance gene
  • the target DNA of the present invention may contain an expression control region for expressing any such gene.
  • expression control regions include promoters, terminators, and enhancers.
  • the “promoter” is not particularly limited as long as it is a sequence capable of inducing transcription of DNA operably linked downstream of it in a plant cell, but examples include the rice-derived G3P promoter, the maize-derived ubiquitin promoter, the cauliflower mosaic virus (CaMV)-derived 35S promoter, the Agrobacterium-derived NOS promoter, and the cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter.
  • the terminator is not particularly limited as long as it is a sequence capable of terminating the transcription, and examples thereof include the rice-derived G3P terminator, the CaMV-derived 35S terminator, the Agrobacterium-derived Nos terminator, the pea-derived RbcS-3A terminator, the heat shock protein (HSP) gene terminator (rice HSP17.3 terminator, Arabidopsis thaliana HSP18.2 terminator, etc.), the tobacco extensin gene terminator, and the Agrobacterium-derived NOS terminator. Two or more terminators may also be linked and arranged.
  • HSP heat shock protein
  • all may be the same type of terminator, or different types of terminators (for example, the 35S terminator and the Nos terminator may be linked and arranged, or the HSP gene terminator and the bacoextensin gene terminator may be linked and arranged).
  • Enhancers include, for example, those that can further improve the efficiency of translation from the target DNA, and more specifically, 5' untranslated regions (translation enhancers) such as the 5'UTR of the alcohol dehydrogenase (ADH) gene (e.g., the 5'UTR of the rice-derived ADH gene, the 5'UTR of the Arabidopsis-derived ADH gene), the 5'UTR of the Arabidopsis-derived elongation factor 1 ⁇ -A3 gene, and the 5'UTR of the tobacco mosaic virus.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • the expression control region is usually arranged in the following order from the 5' end: promoter, enhancer, optional gene, and terminator.
  • Second DNA Construct In geminiviruses, the replication initiator protein cleaves the above-mentioned LIR and mediates its replication. Therefore, in order to amplify the target DNA, it is necessary to introduce a DNA construct for expressing the replication initiator protein (hereinafter also referred to as "second DNA construct") together with the above-mentioned first DNA construct.
  • second DNA construct a DNA construct for expressing the replication initiator protein derived from geminivirus.
  • the "geminivirus-derived replication initiator protein” is not particularly limited as long as it is derived from a geminivirus and is capable of cleaving the above-mentioned LIR and amplifying the region containing the target DNA sandwiched between the LIRs, and can be appropriately selected depending on the type of plant to be introduced.
  • Examples of the replication initiator protein according to the present invention include the Rep/RepA protein derived from WDV and the Rep/RepA protein derived from BeYDV.
  • the second DNA construct contains expression control regions such as a promoter, terminator, and enhancer, just like the target DNA described above.
  • the DNA construct of the present invention has been described above, but it may contain other sequences, not limited to the above sequences.
  • Such "other sequences” include, for example, DNA sequences encoding gene silencing inhibitors. By including these, it is possible to further increase the expression amount (amount of transcription product, amount of translation product) of the target DNA. Examples of such factors include the gene silencing inhibitor p19 derived from tomato bushy stunt virus and the gene silencing inhibitor 16K derived from tobacco rattle virus.
  • “Other sequences” include marker genes to confirm whether or not the gene has been introduced into a plant cell.
  • Examples include fluorescent protein genes, luminescent enzyme genes, chromogenic enzyme genes, drug resistance genes, plant hormone biosynthesis genes, replication promoter genes, and cell death inhibitor genes.
  • Specific examples of fluorescent protein genes include red fluorescent protein genes such as the DsRed gene and the RFP gene, the GFP (green fluorescent protein) gene, the YFP (yellow fluorescent protein) gene, and the aequorin gene.
  • Specific examples of luminescent enzyme genes include the luciferase gene.
  • chromogenic enzyme genes include the ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, the ⁇ -galactosidase gene, the alkaline phosphatase gene, and the SEAP gene.
  • drug resistance genes include the kanamycin resistance (NPTII) gene, the hygromycin resistance (HPT) gene, the tetracycline resistance gene, the ampicillin resistance gene, the spectinomycin resistance gene, the chloramphenicol resistance gene, the neomycin resistance gene, the herbicide resistance gene (the bialaphos resistance gene, the glyphosate resistance gene (EPSPS), and the ALS gene.
  • plant hormone biosynthesis genes include the ipt gene, the iaaM gene, the iaaH gene, and the rol (ro1A, rolB, rolC) gene.
  • genes that promote somatic embryo formation include the WSU gene, the BBM gene, the AGL15 gene, and the Lec1 gene.
  • specific examples of replication promoter genes include the APS gene and the ct-ars1 gene.
  • specific examples of cell death suppressor genes include the ACCd gene, the Bax-I gene, and the NaGH gene.
  • sequences may also contain expression control regions such as promoters, terminators, enhancers, etc., in order to express the gene silencing inhibitors and marker proteins they encode, just like the above-mentioned target DNA.
  • the DNA construct of the present invention is not particularly limited as long as it can express the arranged sequence in the plant cell into which it is introduced, and may take the form of various vectors, such as pUC series (pUC57, pUC18, pUC19, pUC9, etc.), pAL series (pAL51, pAL156, etc.), pPZP series, pSMA series, and intermediate vector series (pLGV23Neo, pNCAT, etc.). Furthermore, when the DNA construct of the present invention is introduced into a plant cell by the Agrobacterium method, as shown in the examples below, it is desirable that the construct further contains a right border sequence (RB) and a left border sequence (LB) derived from the Agrobacterium T-DNA sequence.
  • RB right border sequence
  • LB left border sequence
  • the construct may take the form of a binary vector.
  • binary vectors include pBI series (pBI121, pBI101, pBI221, pBI2113, pBI101.2, pBIN19) and pPZP series (pZD202, etc.).
  • the first DNA construct and the second DNA construct are used as a system for amplifying a target DNA in a plant cell.
  • the first DNA construct and the second DNA construct may exist as independent individual DNA constructs (e.g., independent individual vectors), or the first and second DNA constructs may exist as one DNA construct (e.g., a single vector).
  • DNA encoding a geminivirus-derived replication initiator protein such as Rep/RepA may be linked and positioned immediately after the LIR.
  • the DNA construct of the present invention can be prepared by a person skilled in the art using a known method as appropriate. For example, it can be prepared by cutting purified DNA with an appropriate restriction enzyme and ligating it to a multicloning site of an appropriate backbone vector.
  • the DNA construct of the present invention can also be prepared using a method such as the LR method, in-fusion cloning, or TA cloning.
  • the sequences placed in the DNA construct of the present invention may be optimized to use codons that are compatible with the plant cells into which they are introduced, in order to efficiently express their translation products in the cells.
  • the present invention also provides a method for amplifying a target DNA in a plant cell, the method comprising the step of introducing into the plant cell a system comprising a first DNA construct into which the target DNA is inserted and a second DNA construct.
  • a geminivirus-derived replication initiator protein is expressed from the second DNA construct, and the LIR in the first DNA construct is cleaved by the protein, resulting in a high copy number of the target DNA between the LIRs.
  • the plants into which the DNA construct is introduced are not particularly limited, and examples thereof include angiosperms including monocotyledonous plants (e.g., Poaceae plants such as rice, barley, wheat, sorghum, and corn, and Amaryllidaceae plants such as onion and leek) and dicotyledonous plants (e.g., Brassicaceae plants such as Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, and rapeseed (rapeseed), Solanaceae plants such as tomato and potato, Euphorbiaceae plants such as cassava, Asteraceae plants such as lettuce and sunflower, legumes such as soybean, Cucurbitaceae plants such as cucumber, Apiaceae plants such as carrot, Rosaceae plants such as apple, and Musaceae plants such as banana). Furthermore, genetically modified or genome-edited versions of these plants may be used.
  • angiosperms including monocotyledonous plants (e.g., Poaceae plants such as rice, barley,
  • plant cells into which the system of the present invention is introduced include the cells in the plant body described above, as well as cultured cells derived from the plant.
  • plant cells of various forms such as leaf slices, seeds, shoot tips of seed embryos, shoot tips of tuber shoots, suspension culture cells, protoplasts, calli, immature embryos, pollen, etc. are also included.
  • the DNA construct of the present invention can be "introduced" into plant cells by a person skilled in the art using any suitable known method, such as the Agrobacterium method, electroporation, particle bombardment, PEG-calcium phosphate method, liposome method, microinjection method, whisker method, plasma method, and laser injection method.
  • Agrobacterium method electroporation, particle bombardment, PEG-calcium phosphate method, liposome method, microinjection method, whisker method, plasma method, and laser injection method.
  • this method makes it possible to regenerate plants from plant cells into which the system of the present invention has been introduced.
  • methods for producing transformed rice plants include a method in which genes are introduced via Agrobacterium and the plant is regenerated (Toki, S. Plant Molecular Biology Reporter. 15: 16-21, 1997, Toki, S. et al. Plant J. 47, 969-976, 1994), and a method in which genes are introduced into protoplasts using polyethylene glycol and the plant is regenerated (Datta, S.K. In Gene Transfer To Plants (Potr Several techniques have already been established and are widely used in the technical field of the present invention, such as a method of introducing genes into protoplasts using electric pulses to regenerate plants (Toki et al. Plant Physiol. 100, 1503-1507, 1992) and a method of directly introducing genes into cells using a particle gun method to regenerate plants (Christou et al. Bio/technology, 9:957-962, 1991).
  • Methods for producing transformed wheat plants include those described by Tingay et al. (Tingay S. et al. Plant J. 11: 1369-1376, 1997), Murray et al. (Murray F et al. Plant Cell Report 22: 397-402, 2004), and Travalla et al. (Travalla S et al. Plant Cell Report 23: 780-789, 2005).
  • the Agrobacterium method or the particle gun method are used to introduce genes into immature embryos or calli to regenerate plants, and pollination using pollen into which genes have been introduced using ultrasound is preferably used (J.A. Able et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 341-348, 2001; A.M. Casa ); s et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216,1993, V. Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24:513-522,2005, J. M. JEOUNG et al., Hereditas 137:20-28,2002, V.
  • examples include the method described by Shillito et al. (Bio/Technology, 7:581, 1989) and the method described by Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2:603, 1990).
  • transformation and regeneration into plants can be performed using the method described in Tabei et al. (Tabei Yutaka, ed., "Transformation Protocols [Plant Edition]", Kagaku Dojin Co., Ltd., published September 20, 2012).
  • the present invention provides a method for inserting foreign DNA into a target site in a plant cell, comprising the steps of:
  • the method includes introducing into a plant cell a genome editing system that recognizes and cuts a target site, and a system including a first DNA construct and a second DNA construct into which a DNA of interest is inserted,
  • the target DNA is a sequence including two homologous sequences flanking the target site on the left and right sides, and a foreign DNA located between the two homologous sequences;
  • the method also provides a method in which the genome editing system cleaves the target site and inserts the foreign DNA into the target site by homologous recombination with the amplified DNA of interest.
  • the method of the present invention allows the foreign DNA contained in the target DNA (template DNA for knock-in) to be amplified at high copy numbers, making it possible to insert the DNA into the target site by genome editing with high efficiency.
  • Gene editing is a method of modifying a target gene by cleaving a target site in the gene using a site-specific nuclease (e.g., a DNA double-strand cleavage enzyme such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR-Cas enzyme).
  • a site-specific nuclease e.g., a DNA double-strand cleavage enzyme such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), or CRISPR-Cas enzyme.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activator-like effector nucleases
  • CRISPR-Cas enzyme CRISPR-Cas enzyme
  • the CRISPR/Cas system uses the Cas protein, which is a nuclease (RGN; RNA-guided nuclease), and guide RNA (gRNA, Single-guide RNA (SgRNA)).
  • RGN nuclease
  • gRNA Single-guide RNA
  • the guide RNA binds to the target site, and the Cas protein guided to the binding site can cleave DNA (for example, CRISPR-Cas9 (U.S. Patent No. 8,697,359, International Publication No. 2013/176772), CRISPR-Cpf1 (Zetsche B. et al., Cell, 163(3):759-71, (2015))).
  • an artificial enzyme complex in which the nuclease activity has been removed from the CRISPR/Cas system and a deaminase, which is a deaminating enzyme, has been added can also be used as the genome editing system of the present invention (Target-AID (K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science, DOI: 10.1126/science.aaf8729, (2016))).
  • the TALENs system uses artificial nucleases (TALENs) that contain a DNA-binding domain of a transcription activator-like (TAL) effector in addition to a DNA-cleavage domain (e.g., FokI domain) (e.g., U.S. Patent No. 8,470,973, U.S. Patent No. 8,586,363).
  • TALENs transcription activator-like
  • FokI domain e.g., U.S. Patent No. 8,470,973, U.S. Patent No. 8,586,363
  • the DNA-binding domain that binds to the target site can be designed according to a known scheme (e.g., Zhang, Feng et. al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)).
  • the ZFNs system uses artificial nucleases (ZFNs) that contain a nucleic acid cleavage domain conjugated to a DNA binding domain that contains a zinc finger array (e.g., U.S. Patents 6,265,196, 8,524,500, 7,888,121, EP 1,720,995).
  • ZFNs artificial nucleases
  • a DNA binding domain that contains a zinc finger array
  • the ZFNs bind to a target site via the DNA binding domain and cleave the DNA there.
  • the DNA binding domain that binds to the target site can be designed according to known schemes.
  • PPR pentatricopeptiderepeat fused with a nuclease domain
  • PPR pentatricopeptiderepeat
  • the CRISPR/Cas system is preferred from the viewpoint that the target site can be selected more freely and its preparation is easy because a nucleic acid (guide RNA) is used to recognize the target site.
  • the length of the guide RNA used in the CRISPR/Cas system is at least 15, 16, 17, 18, 19, or 20 bases.
  • the upper limit of the base length is preferably 30 or less, more preferably 25 or less, even more preferably 22 or less, and most preferably 20 or less.
  • the Cas protein may contain one or more nuclear localization signals (NLS).
  • the Cas protein is preferably a type II CRISPR system enzyme, for example, the Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is an enzyme that is expressed by the enzymes of Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) Cas9, S. thermophilus Cas9, and may include mutant Cas9s derived from these organisms, and may be Cas9 homologs or orthologs.
  • the introduction of such a genome editing system into a plant cell can be carried out by preparing a DNA construct encoding the system, similar to the above-mentioned target DNA.
  • the DNA construct encoding the genome editing system for example, the DNA construct encoding the artificial enzyme and the DNA construct encoding the guide RNA may be separate and independent, or may be a single DNA construct.
  • the DNA construct encoding the genome editing system may exist as a single DNA construct together with the first DNA construct and/or the second DNA construct of the present invention (for example, it may take the form of an all-in-one vector).
  • the genome editing system may be introduced into a plant cell as a complex of the artificial enzyme and the guide RNA, without adopting such a DNA form.
  • the first DNA construct of the present invention used for such genome editing contains two homologous sequences adjacent to the left and right of the target site in the target DNA in order to insert foreign DNA into the target site cut by the above-mentioned genome editing system.
  • This causes homologous recombination between the target gene and the target DNA, and the foreign DNA is inserted into the target site cut in the target gene.
  • the "foreign DNA" placed between the two homologous sequences may be any gene (DNA that codes for any protein, etc.) like the above-mentioned target DNA, or may be non-coding DNA.
  • the foreign DNA may also contain an expression control region for expressing such any gene.
  • the ccdB gene (SacII/PacI portion) contained in this vector was replaced with LIR-ccdB-SIR-LIR (vector in which SIR is on the inside between LIRs), LIR-ccdB-LIR-SIR (improved vector in which SIR is on the outside between LIRs), or LIR-ccdB-LIR-SIR (improved vector without SIR).
  • a GFP expression cassette (a ubiquitin promoter derived from maize ubiquitin, a 5'UTR (translation enhancer) of the ADH gene derived from rice, a GFP gene, a 35S terminator derived from cauliflower mosaic virus, and a Nos terminator derived from Agrobacterium) was cloned into these vectors by LR reaction to construct the vectors shown in Figure 3.
  • the knock-in template DNA (0.6 kb upstream from the translation start point of the rice Glb33 gene, the GFP gene, and 0.6 kb downstream from the translation start point of the rice Glb33 gene) was cloned into these vectors by LR reaction to construct the vectors shown in Figure 4.
  • Rep/RepA expression vector The NOS promoter, WDV-derived Rep/RepA gene, and rice HSP17.3 terminator were introduced into the entry clone pE (L1-L2) cleaved with AscI/PacI.
  • Two guide RNA (sgRNA) expression cassettes targeting the rice Glb33 gene were introduced into the binary vector pZD202Hyg carrying the hygromycin resistance gene cleaved with AscI.
  • the Rep/RepA expression cassette was introduced into pZD202Hyg carrying the sgRNA expression cassette by LR reaction (FIG. 5 (A)).
  • a Rep/RepA expression vector was prepared by removing the sgRNA from the vector shown in FIG. 5 (A) by AscI treatment (FIG. 5 (B)).
  • Transformation The constructed vector was introduced into Agrobacterium (EHA105 strain (Hood et al., 1993)) by electroporation. Transformation of rice callus with Agrobacterium was performed according to a standard method (Toki, 1997; Toki et al., 2006). Ripe seeds of rice (variety Nipponbare) were placed on N6D medium and cultured at 30°C under constant light conditions for 7 days. The callus after culture was collected and infected with Agrobacterium having the vector shown in Figure 3 or 4, and co-cultured at 23°C under constant dark conditions for 3 days.
  • the co-cultured callus was sterilized with sterilized water containing 25 mg/L meropenem, and then placed on N6D medium containing 35 mg/L G418 and 25 mg/L meropenem. After culturing at 30°C under constant light conditions for 4 weeks, only the resistant calli were collected and, as described above, infected with Agrobacterium containing the vector shown in Figure 5. After removing the Agrobacterium from the infected calli, they were placed on N6D medium containing 50 mg/L hygromycin and 25 mg/L meropenem, and cultured at 30°C under constant light conditions for 5 to 6 weeks.
  • Quantification of replicon DNA was extracted from transformed rice callus using Agencourt Chloropure (Beckman Coulter). The extracted DNA was treated with restriction enzymes NcoI or PvuII and used as a PCR template. A PCR reaction solution was prepared according to the protocol to have the following composition.
  • Droplets of the prepared PCR reaction solution were produced using an Automated Droplet Generator, and a PCR reaction was carried out under the following conditions. 95° C. ⁇ 10 minutes ⁇ (94° C. ⁇ 30 seconds ⁇ 55° C. ⁇ 1 minute) for 40 cycles ⁇ 98° C. ⁇ 10 minutes ⁇ 4° C. The temperature change in the PCR reaction was set to 2° C./second. Droplets after the PCR reaction were measured using a QX200 Droplet Reader, and the data was analyzed using QuantaSoft software.
  • the PCR reaction was carried out under the following conditions. 98°C x 10 sec ⁇ 68°C x 6 sec (5' side) or 8 sec (3' side), 35 cycles ⁇ 4°C. Samples in which amplification was observed in both 5'-side PCR and 3'-side PCR were considered as samples in which targeted recombination was successful, and the targeted recombination efficiency was calculated.
  • Example 1 Increase in replicon copy number by improved vector
  • the copy number of the replicon was quantified for calli transformed with a geminivirus vector (FIG. 3) and Rep/RepA (FIG. 5(B)) that amplify a sequence including the GFP gene.
  • Digital PCR was used for quantification, and the GFP copy number per rice genome was calculated based on the copy number of the endogenous actin gene (OsAct1).
  • rice calli transformed with a control vector without a replicon contained an average of 3.5 copies of the GFP gene per genome
  • rice calli transformed with a geminivirus vector containing an SIR contained an average of 410 copies of the GFP gene.
  • rice calli transformed with an improved vector with SIR on the outside contained 903 and 789 copies of the GFP gene, respectively, which was found to be 2.2 and 1.9 times higher than the replicon vector with SIR on the inside.
  • Example 2 Improvement of the frequency of target recombination (knock-in of target gene) by improved vector Knock-in is very low in frequency, and there is a demand for high efficiency.
  • successful examples of knock-in using geminivirus vectors have been reported in tobacco (Baltes et al., 2014), potato (Butler et al., 2016), tomato (Cermak et al., 2015), cassava (Hummel et al., 2018), wheat (Gil-Humanes et al., 2017), rice (Kim et al., 2022; Wang et al., 2017), etc.
  • rice callus transformed with a control vector without a replicon contained an average of 2.6 copies of the GFP gene per genome
  • rice callus transformed with a geminivirus vector with an SIR on the inside contained an average of 2,600 copies of the GFP gene
  • rice callus transformed with an improved vector with an SIR on the outside contained nearly 10,000 copies of the GFP gene, which was found to be 3.8 times higher than the number of GFP copies in the geminivirus vector with an SIR on the inside.
  • NCBI Taxonomy a comprehensive update on curation, resources and tools.
  • Database the journal of biological databases and curation 2020. Toki, S. (1997) Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter 15, 16-21. Toki, S.
  • the present invention it is possible to amplify target DNA in plant cells. This in turn makes it possible to mass-produce useful proteins, such as biopharmaceuticals such as vaccines and antibodies, and industrial enzymes such as cellulase. Furthermore, according to the present invention, it is possible to increase the efficiency of gene targeting (GT) by amplifying template DNA in GT using genome editing technology, which makes it possible to efficiently develop, for example, crop varieties and bioreactors.
  • GT gene targeting
  • the first DNA construct of the present invention by arranging multiple LIRs and inserting different target DNAs between these LIRs, it becomes possible to amplify multiple types of target DNA simultaneously.
  • a GT vector using the present invention by arranging three LIRs and inserting two different types of target DNA between these LIRs, it becomes possible to amplify each of them as a GT template DNA, and thus simultaneous GT targeting two genes becomes possible.
  • GT cells can be directly selected using herbicides by introducing herbicide-resistant mutations into the ALS gene using GT (Masaki Endo et al. Plant J. 2007 Oct;52(1):157-66.). Therefore, in the GT vector using the present invention, when two different types of target DNA are inserted between three LIRs as described above, for example, as shown in FIG. 8, one DNA is used as a template for introducing a herbicide-resistant mutation into a herbicide target gene (e.g., ALS gene) and the other DNA is used as a template for knocking in the target gene (e.g., GFP gene), making it possible to enrich cells in which the GFP gene has been knocked in to the target gene by herbicide selection.
  • a herbicide target gene e.g., ALS gene
  • GFP gene target gene
  • the present invention is extremely useful in various bioindustry fields, such as medicine and agriculture.

Landscapes

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Abstract

２つのジェミニウイルス由来の長遺伝子間領域（ＬＩＲ）を保持し、前記２つのＬＩＲ間に、目的のＤＮＡを挿入するための部位が配置されており、前記２つのＬＩＲ間には、ジェミニウイルス由来の短遺伝子間領域（ＳＩＲ）が配置されていない、ＤＮＡ構築物。

Description

ＤＮＡを植物細胞において増幅するためのシステム
　本発明は、目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するための、ＤＮＡ構築物及び当該構築物を含むシステムに関する。本発明はまた、前記システムを用いて目的のＤＮＡを植物細胞において増幅する方法等に関する。
　ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを遺伝子操作することにより、外来遺伝子等の目的配列を効率的に植物細胞で増幅させることが可能なベクターである。ウイルスベクターを利用し、バイオ医薬品等、目的とする有用タンパク質を大量に生産することが可能である。例えば、ノロウイルスワクチンやその検査薬の開発（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｅｎｋａ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｔｏｒａｇｅ／ｎｅｗｓ／ｐｄｆ／７６６／２０２００９２３＿ｄｅｎｋａ＿ｉｃｏｎ．ｐｄｆ）、新型コロナウイルスワクチンの開発（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｔ－ｐｈａｒｍａ．ｃｏ．ｊｐ／ｎｅｗｓ／２０２２／ＭＴＰＣ２２０２２４．ｈｔｍｌ）が進められている。
　植物においては、ジェミニウイルスベクターを利用し、目的とする有用タンパク質を大量に生産するシステムが開発されている。例えば、従来のウイルスベクターによるタンパク質生産システムを凌ぐタンパク質生産方法として、ジェミニウイルスベクターと、目的遺伝子の翻訳活性を上げるダブルターミネーターを組み合わせた方法が開発されている（特許文献１、非特許文献１及び２）。この方法では、約４ｍｇ／ｇＦＷという目的タンパク質の大量発現を達成しており、ジェミニウイルスを用いた有用タンパク質生産の有用性が示されている。
　また、ジェミニウイルスは、ゲノム編集技術への利用も試みられている。ゲノム編集技術は、標的配列を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等の人工ヌクレアーゼを利用し、標的遺伝子を目的通りに改変する遺伝子改変技術である。ジーンターゲッティング（ＧＴ、標的組換え）は、外来ＤＮＡを鋳型（ドナー）として標的遺伝子を正確に書き換えるゲノム編集技術であり、目的の塩基欠失・挿入・置換に加え、遺伝子挿入（ノックイン）等の様々な改変が可能な汎用的技術である。しかしながら、ＧＴは効率が非常に低いため、その高効率化が課題である。ＧＴは、鋳型となる外来ＤＮＡの供給、外来ＤＮＡと標的配列との相同組換え、及びＧＴ細胞の選抜の３つのステップから成ることから(図１)、各ステップの高効率化に関する研究が世界中で行われている。
　この点に関し、ジェミニウイルスベクターのレプリコンを用いてＧＴの鋳型となる外来ＤＮＡを複製することで、タバコでのノックインに成功したことが報告されている。また同様の手法は、トマト、キャッサバ、ジャガイモ、イネ、コムギ等、様々な植物に適用されている（非特許文献３～９）。
　しかし、ジェミニウイルスベクターをレプリコンとして利用した場合でも、標的遺伝子をノックアウトするために広く利用されている標的変異導入効率に比べると、ＧＴ効率は低いのが現状であり、その高効率化が求められている。
国際公開第２０１８／２２０９２９号
Ｔｓｕｙｏｓｈｉ　Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１８年、８巻、４７５５号 三浦　謙治、植物における一過的タンパク質大量発現系「つくばシステム」について、植物の生長調節、２０１９年、５４巻、１号、７７～８１ページ Ｂａｌｔｅｓ，Ｎ．Ｊ．ら、ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、２０１４年、２６巻、１号、１５１～１６３ページ Ｂｕｔｌｅｒ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｏｔａｔｏ　（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ．）　Ｕｓｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年７月２１日 Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．ら、Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，　ｐｒｅｃｉｓｅ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｍａｔｏ　ｇｅｎｏｍｅ．、Ｇｅｎｏｍｅ　ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５年、１６号、２３２ Ｈｕｍｍｅｌ，Ａ．Ｗ．ら、（２０１８）　Ａｌｌｅｌｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ａｔ　ｔｈｅ　ＥＰＳＰＳ　ｌｏｃｕｓ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｃａｓｓａｖａ．、Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ、２０１８年、１６巻、７号、１２７５～１２８２ページ Ｇｉｌ－Ｈｕｍａｎｅｓ，Ｊ．ら、Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ　ｗｈｅａｔ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ　ａｎｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９．、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、２０１７年、８９巻、６号、１２５１～１２６２ページ Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｇｏｌｄｅｎ　ＳＮＰ－Ｃａｒｒｙｉｎｇ　Ｌｙｃｏｐｅｎｅ　Ｅｐｓｉｌｏｎ－Ｃｙｃｌａｓｅ　（ＬｃｙＥ）　Ｇｅｎｅ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／ＨＤＲ　ａｎｄ　Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｐｌｉｃｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｒｉｃｅ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０２２年、２３巻、１８号、１０３８３ Ｗａｎｇ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｂｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　Ｒｉｃｅ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍ．、Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ、２０１７年、１０巻、７号、１００７～１０１０ページ
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、植物細胞における目的のＤＮＡ（上記有用タンパク質をコードするＤＮＡ、ＧＴの鋳型ＤＮＡ等）の増幅を可能とするＤＮＡ構築物等を、提供することを目的とする。
　ジェミニウイルスベクターは、上述のとおり、植物細胞において外来ＤＮＡを複製するために利用される。かかるベクターの骨格となっているジェミニウイルスは、環状１本鎖ＤＮＡをゲノムとする植物ウイルスである。そして、その複製機構については、以下の工程が考えられている（宇垣　正志、ジェミニウイルスを利用した植物／細菌シャトルベクターの開発、植物防疫、１９９２年、４６巻、１号、３１～３６ページ　参照）。
（１）先ず、前記環状１本鎖ＤＮＡ中の短遺伝子間領域（ＳＩＲ）にプライマーが結合し、そこを起点として相補鎖が合成され、閉環状２本鎖の複製型ＤＮＡが形成される。次いで、複製型ＤＮＡを鋳型として、転写・翻訳が生じる。（２）この転写・翻訳により合成された複製開始タンパク質（Ｒｅｐ）によって、前記複製型ＤＮＡ中の長遺伝子間領域（ＬＩＲ）にニックが入る。（３）そこで生じた３’末端をプライマーとし、相補鎖を鋳型とするローリングサークル機構によって、ゲノムＤＮＡのコンカテマーが合成される。次いで、当該コンカテマーにおけるＬＩＲは、Ｒｅｐによって切断され、単位長のゲノムＤＮＡとなる。（４）そして、植物細胞のリガーゼによって両末端が結合され、環状１本鎖ＤＮＡとなり、複製されることとなる。
　このような工程を経て、ジェミニウイルスにおいては、ＬＩＲ間に挟まれた領域の複製（増幅）が可能となる。また、前記のとおり、相補鎖合成の起点となるため、ＳＩＲは当該領域内に配置される必要があると考えられている。よって、ジェミニウイルスにおける複製、ひいてはジェミニウイルスベクターに挿入された外来ＤＮＡを含めた増幅において、これらＬＩＲ及びＳＩＲ、並びにこれらの位置関係（２つのＬＩＲの間（内側）にＳＩＲが配置されていること）は、極めて重要であると考えられている。
　しかしながら、本発明者らが、誤って、ＬＩＲの外側にＳＩＲを配置したジェミニウイルスベクターを構築してしまい、外来ＤＮＡの増幅を行ったところ、驚くべきことに、その増幅効率は、ＳＩＲを内側に配置したものよりも向上した。
　そこで、この驚くべき知見に基づき、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、従来型のジェミニウイルスベクター（ＬＩＲ間にＳＩＲが配置）を用いた場合と比較して、前記ＬＩＲの外側にＳＩＲを配置したジェミニウイルスベクターのみならず、ＳＩＲを配置していないジェミニウイルスベクターを用いた場合も(図２)、外来ＤＮＡを約２倍も高く増幅出来ることが明らかになった。
　さらに、ＧＴによるノックインに、この改良型ジェミニウイルスベクター（ＬＩＲの外側にＳＩＲを配置）を用いた結果、そのノックイン頻度は、改良前のそれと比較して約２倍も向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
　［１］　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのＤＮＡ構築物であって、２つのジェミニウイルス由来の長遺伝子間領域（ＬＩＲ）を保持し、前記２つのＬＩＲ間に、目的のＤＮＡを挿入するための部位が配置されており、前記２つのＬＩＲ間には、ジェミニウイルス由来の短遺伝子間領域（ＳＩＲ）が配置されていない、ＤＮＡ構築物。
　［２］　前記２つのＬＩＲ間の外側にＳＩＲが配置されている、［１］に記載のＤＮＡ構築物。
　［３］　ＳＩＲを保持しない、［１］に記載のＤＮＡ構築物。
　［４］　前記部位に前記目的のＤＮＡが挿入されている、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
　［５］　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのシステムであって、［４］に記載のＤＮＡ構築物と、ジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物とを、備えたシステム。
　［６］　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅する方法であって、［５］に記載のシステムを、植物細胞に導入する工程を含む、方法。
　［７］　植物細胞の標的部位に外来ＤＮＡを挿入する方法であって、標的部位を認識して切断するゲノム編集システムと、［５］に記載のシステムとを、植物細胞に導入する工程を含み、前記目的のＤＮＡは、前記標的部位の左右に隣接する２つの相同配列と、前記２つの相同配列間に配置されている外来ＤＮＡとを、含む配列であり、前記ゲノム編集システムにより前記標的部位が切断され、増幅された前記目的のＤＮＡとの相同組換えが生じることによって、前記標的部位に前記外来ＤＮＡが挿入される、方法。
　本発明によれば、植物細胞において目的のＤＮＡを増幅することが可能となる。ひいては、バイオ医薬品等、目的とする有用タンパク質を大量に生産することが可能となる。また、本発明により、ゲノム編集技術を用いたＧＴにおける鋳型ＤＮＡを増幅することによって、ＧＴ効率を高めることも可能となる。
ゲノム編集を用いたＧＴの概要を示す、図である。 従来型のジェミニウイルスベクターと本発明で開発した改良型のジェミニウイルスベクターの概要を示す、図である。 ＳＩＲの位置、有無が、レプリコンコピー数に及ぼす影響を調べるために用いたジェミニウイルスベクターの構造の概要を示す、図である。 ゲノム編集によるノックインに用いたジェミニウイルスベクターの構造の概要を示す、図である。 Ｒｅｐ／ＲｅｐＡ発現ベクターの構造の概要を示す、図である。 図３に示す各種ベクターを用いて増幅したレプリコンのコピー数を示す、グラフである。 図４に示す各種ベクターを用いてノックインしたレプリコンのコピー数を示す、グラフである。 本発明における、２遺伝子同時ＧＴベクターの具体的な一態様を示す、概略図である。
　ジェミニウイルスの複製において、長遺伝子間領域（ＬＩＲ）及び短遺伝子間領域（ＳＩＲ）、並びにこれらの位置関係（２つのＬＩＲの間（内側）にＳＩＲが配置されていること）は、極めて重要であると考えられている。
　しかしながら、後述の実施例に示すとおり、２つのＬＩＲの間にＳＩＲを配置しない方が、配置している場合に比べ、ジェミニウイルスの複製効率が向上することが、本発明者らによって明らかになった。
　よって、本発明は、目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのＤＮＡ構築物であって、２つのジェミニウイルス由来のＬＩＲを保持し、前記２つのＬＩＲ間に、目的のＤＮＡを挿入するための部位が配置されており、前記２つのＬＩＲ間には、ジェミニウイルス由来のＳＩＲが配置されていない、ＤＮＡ構築物（以下、「第１のＤＮＡ構築物」とも称する）を、提供するものである。
　（第１のＤＮＡ構築物）
　本発明において、「ジェミニウイルス」は、閉環状２本鎖ＤＮＡの中間体を経て複製される（ローリングサークル機構を介して複製される）環状１本鎖ＤＮＡゲノムを有し、ジェミニウイルス科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する、植物ウイルスを意味する。かかるジェミニウイルスとしては、例えば、マストレウイルス属に属するウイルスが挙げられ、より具体的には、Ａｘｏｎｏｐｕｓ　ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｂｅａｎ　ｙｅｌｌｏｗ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｂｒｏｍｕｓ　ｃａｔｈａｒｔｉｃｕｓ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｒｅｄｌｅａｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｒｅｄｌｅａｆ　ｖｉｒｕｓ　２、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｙｅｌｌｏｗ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｙｅｌｌｏｗｓ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｌｏｒｉｓ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ　ｃｉｌｉａｒｉｓ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ　ｄｉｄａｃｔｙｌａ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｒｉａ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ　ｍｉｎｏｒ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｄｗａｒｆｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ、Ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　Ｒｅｕｎｉｏｎ　ｖｉｒｕｓ、Ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｍａｉｚｅ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｏａｔ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｐａｎｉｃｕｍ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｐａｓｐａｌｕｍ　ｄｉｌａｔａｔｕｍ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｐａｓｐａｌｕｍ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、Ｒｉｃｅ　ｌａｔｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ　１、Ｒｉｃｅ　ｌａｔｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ　２、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｏｒｇｈｕｍ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　１、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　２、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｓｔｒｅａｋ　Ｅｇｙｐｔ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｓｔｒｅａｋ　Ｒｅｕｎｉｏｎ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｓｔｒｉａｔｅ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｗｈｉｔｅ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ　ｖｉｒｕｓ　１、Ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ　ｍｏｓａｉｃ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ　ｙｅｌｌｏｗ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｕｒｏｃｈｌｏａ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｗｈｅａｔ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ　ｄｗａｒｆ　Ｓｕｄａｎ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｃｋｐｅａ　ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ　ｄｗａｒｆ　Ｓｙｒｉａ　ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｔｔｏｎ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ、Ｉｎｓｅｃｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ　１、Ｍｉｌｌｅｔ　ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｍａｉｚｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ、Ｎｙｍｐｈｏｉｄｅｓ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ　Ａ、Ｐｔｅｒｉｓ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ　Ａ、Ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ、Ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ　ＳＫ－１１、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ　ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ　Ａ等が挙げられる。
　「ジェミニウイルス由来のＬＩＲ（長遺伝子間領域）」としては、ジェミニウイルス由来の配列であって、後述の複製開始タンパク質による切断及び複製に関与し得るノナヌクレオチド（ｎｏｎａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）モチーフ（ＴＡＡＴＡＴＴＡ↓Ｃ）を少なくとも含むＤＮＡ配列である限り、特に制限はなく、導入する植物の種類等に応じて適宜選択することができる。本発明にかかるＬＩＲとしては、例えば、Ｗｈｅａｔ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ（ＷＤＶ、コムギ萎縮病ウイルス）由来のＬＩＲ、Ｂｅａｎ　ｙｅｌｌｏｗ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ（ＢｅＹＤＶ、インゲン黄斑萎縮ウイルス）由来のＬＩＲが挙げられ、より具体的には、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列からなる領域（ＷＤＶ由来のＬＩＲ）が挙げられる。また同様に、本発明にかかるＳＩＲ（短遺伝子間領域）は、ジェミニウイルス由来の配列であれば特に制限はなく、例えば、ＷＤＶ由来のＳＩＲ、ＢｅＹＤＶ由来のＳＩＲが挙げられ、より具体的には、配列番号：２に記載のＤＮＡ配列からなる領域（ＷＤＶ由来のＳＩＲ）が挙げられる。
　なお、ウイルスの配列は自然界において容易に変異し得る。したがって、これら遺伝子間領域の配列は、各配列番号によって規定される配列に特定されず、天然に変異した配列も含まれるものであることは理解されたい。かかる変異配列としては、配列番号：１又は２に記載の配列に対して高い同一性を示すＤＮＡ配列であればよく、「高い同一性」としては、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（９６％、９７％、９８％、９９％）である。
　本発明の「第１のＤＮＡ構築物」は、前述のＬＩＲを少なくとも２つ保持する。例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ有していてもよいが、これらＬＩＲにて、後述の目的のＤＮＡを挿入するための部位を内側に備えた２つのＬＩＲ間においては、前述のＳＩＲが配置されていないことを特徴とする（以下、当該２つのＬＩＲを「５’側に配置されるＬＩＲ」と「３’側に配置されるＬＩＲ」とも称する）。ここで「２つのＬＩＲ間」とは、５’側に配置されるＬＩＲの３’末から３’側に配置されるＬＩＲの５’末までの配列（内側）を意味する。一方、第１のＤＮＡ構築物において、前記２つのＬＩＲ間の外側にＳＩＲが配置されていてもよい。かかるＳＩＲは、どちらか一方のＬＩＲの外側に少なくとも１つ配置されていてもよく、また双方のＬＩＲの外側に少なくとも１つずつ配置されていてもよい。ＬＩＲとＳＩＲとの距離としては、目的のＤＮＡを増幅し得る限り、特に制限はなく、適宜調整され得る。また、第１のＤＮＡ構築物において、２つのＬＩＲ間のみならず、その外側においても、ＳＩＲが配置されていなくともよい。
　前記２つのＬＩＲ間は、第１のＤＮＡ構築物において少なくとも１つ存在することになるが、複数存在する場合、その複数のＬＩＲ間において、ＬＩＲは共有していてもよい。例えば、第１のＤＮＡ構築物において、前記２つのＬＩＲ間が２つ存在する場合（第１のＬＩＲ間と第２のＬＩＲ間）、これらＬＩＲ間は４つのＬＩＲによって構成されていてもよい。すなわち、第１のＬＩＲ間を構成する、第１の５’側に配置されるＬＩＲ及び第１の３’側に配置されるＬＩＲと、第２のＬＩＲ間を構成する、第２の５’側に配置されるＬＩＲ及び第２の３’側に配置されるＬＩＲとの、計４つのＬＩＲによって構成されていてもよい。しかしながら、前記第１の３’側に配置されるＬＩＲと第２の５’側に配置されるＬＩＲとを同一のＬＩＲとすること（すなわち、第１のＬＩＲ間と第２のＬＩＲ間とでＬＩＲを共有させること）で、３つのＬＩＲにより、第１のＤＮＡ構築物において、前記２つのＬＩＲ間を２つ存在させることも可能となる。
　本発明において、前記２つのＬＩＲ間に配置される、後述の目的のＤＮＡを挿入するための「部位」としては、前記挿入が可能な限り特に制限はなく、例えば、外部から導入するＤＮＡ断片を結合させるための部位（クローニングサイト）が挙げられる。より具体的には、ＬＲ反応におけるクローニングサイト、ＢＰ反応におけるクローニングサイト、ＴＡクローニングにおけるクローニングサイト、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎにおけるクローニングサイト、制限酵素認識部位等が挙げられる。また、かかる部位は複数配置されていてもよい（マルチクローニングサイト）。ＬＩＲと前記部位との距離としては、挿入した目的のＤＮＡを増幅し得る限り、特に制限はなく、適宜調整され得る。
　本発明において、第１のＤＮＡ構築物に挿入される「目的のＤＮＡ」としては、後述の植物細胞において増幅させたいＤＮＡであれば特に制限はなく、任意の遺伝子（任意のタンパク質等をコードするＤＮＡ）であってもよく、コードしないＤＮＡ（ノンコーディングＤＮＡ）であってもよい。「任意の遺伝子」としても、特に制限はなく、例えば、セルラーゼ等の酵素（工業用酵素等）；抗原、抗体、成長因子、生長調節物質等の薬剤活性タンパク質；ＧＦＰ等の選択マーカーをコードする遺伝子が挙げられる。また、後記（ゲノム編集方法）にて説明するように、本発明にかかる目的のＤＮＡは、ノックインにおける鋳型ＤＮＡの態様もとり得る。
　また、第１のＤＮＡ構築物において、前記２つのＬＩＲ間が複数存在する場合、複数種の目的のＤＮＡを挿入させることが可能となるが、そのうちの少なくとも１の目的のＤＮＡを、後述のマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子、より具体的には、図８に示すような、除草剤標的遺伝子（例えばスルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ遺伝子）に除草剤耐性変異を導入するための鋳型ＤＮＡ）)にしてもよい。かかる場合、このような第１のＤＮＡ構築物を細胞に導入し、前記マーカー遺伝子の発現を指標とする選抜によって、他の目的のＤＮＡが導入された細胞を濃縮することが可能となる。
　本発明にかかる目的のＤＮＡにおいては、かかる任意の遺伝子を発現させるための発現制御領域を含んでいてもよい。かかる「発現制御領域」としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーが挙げられる。
　「プロモーター」としては、植物細胞中でその下流に作動可能に連結されたＤＮＡの転写を誘導し得る配列であれば特に制限はないが、例えば、イネ由来Ｇ３Ｐプロモーター、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来３５Ｓプロモーター、アグロバクテリウム由来ＮＯＳプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターが挙げられる。
　「ターミネーター」としては、前記転写を終結し得る配列であれば特に制限はされないが、例えば、イネ由来Ｇ３Ｐターミネーター、ＣａＭＶ由来３５Ｓターミネーター、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーター、エンドウ由来ＲｂｃＳ－３Ａターミネーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）遺伝子ターミネーター（イネＨＳＰ１７．３ターミネーター、シロイヌナズナＨＳＰ１８．２ターミネーター等）、タバコエクステンシン遺伝子ターミネーター、アグロバクテリウム由来ＮＯＳターミネーターが挙げられる。ターミネーターはまた、２個以上連結されて配置されていてもよい。この場合、全て同種のターミネーターであってもよく、異なる種類のターミネーターであってもよい（例えば、３５Ｓターミネーター及びＮｏｓターミネーターが連結されて配列されていてもよく、またＨＳＰ遺伝子ターミネーター及びバコエクステンシン遺伝子ターミネーターが連結されて配列されていてもよい）。
　「エンハンサー」としては、例えば、目的のＤＮＡからの翻訳効率を更に向上し得るものが挙げられ、より具体的には、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子の５’ＵＴＲ（イネ由来ＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ、シロイヌナズナ由来ＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ等）、シロイヌナズナ由来伸長因子１α－Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、タバコモザイクウイルスの５’ＵＴＲといった、５’非翻訳領域（翻訳エンハンサー）が挙げられる。
　なお、発現制御領域としては、通常５’側から、プロモーター、エンハンサー、任意の遺伝子、ターミネーターの順に配置される。
　（第２のＤＮＡ構築物）
　ジェミニウイルスにおいては、その複製開始タンパク質が、上述のＬＩＲを切断し、その複製を媒介する。そのため、目的のＤＮＡを増幅させるためには、上記第１のＤＮＡ構築物と併せて、複製開始タンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物（以下「第２のＤＮＡ構築物」とも称する）を導入する必要がある。よって、本発明は、ジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物も、併せて提供し得る。
　「ジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質」としては、ジェミニウイルス由来であって、上述のＬＩＲを切断し、ＬＩＲ間に挟まれた目的のＤＮＡを含む領域を増幅し得るタンパク質であれば、特に制限はなく、導入する植物の種類等に応じて適宜選択することができる。本発明にかかる複製開始タンパク質としては、例えば、ＷＤＶ由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質、ＢｅＹＤＶ由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質が挙げられる。
　また、第２のＤＮＡ構築物において、前記複製開始タンパク質を発現させるためには、上記目的のＤＮＡ同様、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の発現制御領域が含まれる。
　以上、本発明のＤＮＡ構築物について説明したが、上記配列等に限らず、他の配列を含んでもよい。かかる「他の配列」としては、例えば、遺伝子サイレンシング阻害因子をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。これらを含むことにより、目的のＤＮＡの発現量（転写産物量、翻訳産物量）を更に増加させることが出来る。かかる因子としては、例えば、トマトブッシ－スタントウイルス由来の遺伝子サイレンシング阻害因子ｐ１９、タバコラットルウイルス由来の遺伝子サイレンシング阻害因子１６Ｋが挙げられる。
　また「他の配列」として、植物細胞への導入の有無を確認するために、マーカー遺伝子が挙げられる。例えば、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子、薬剤耐性遺伝子、植物ホルモン生合成遺伝子、複製促進因子遺伝子、細胞死抑制因子遺伝子が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、具体的には、ＤｓＲｅｄ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子等の赤色蛍光タンパク質遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）遺伝子、エクオリン遺伝子が挙げられる。発光酵素遺伝子としては、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。発色酵素遺伝子としては、具体的には、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ＳＥＡＰ遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、具体的には、カナマイシン耐性（ＮＰＴII）遺伝子、ハイグロマイシン耐性（ＨＰＴ）遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、ＡＬＳ遺伝子が挙げられる。植物ホルモン生合成遺伝子として、具体的には、ｉｐｔ遺伝子、ｉａａＭ遺伝子、ｉａａＨ遺伝子、ｒｏｌ（ｒｏ１Ａ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ）遺伝子等が挙げられる。不定胚の形成を促進する遺伝子として、ＷＳＵ遺伝子、ＢＢＭ遺伝子、ＡＧＬ１５遺伝子、Ｌｅｃ１遺伝子等が、具体的には挙げられる。複製促進因子遺伝子として、具体的には、ＡＰＳ遺伝子、ｃｔ－ａｒｓ１遺伝子等が挙げられる。細胞死抑制遺伝子としては、具体的に、ＡＣＣｄ遺伝子、Ｂａｘ－Ｉ遺伝子、ＮａＧＨ遺伝子等が挙げられる。
　なお、かかる「他の配列」においても、上記目的のＤＮＡ同様、コードする遺伝子サイレンシング阻害因子、マーカータンパク質を発現させるために、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の発現制御領域を含んでいてもよい。
　本発明のＤＮＡ構築物は、配置された配列を導入された植物細胞内で発現できるものであれば特に制限はなく、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等）、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６等）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等）といった各種ベクターの態様をとり得る。また、本発明のＤＮＡ構築物を、後述の実施例に示すように、アグロバクテリウム法により植物細胞に導入する場合には、当該構築物は、アグロバクテリウムＴ－ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）を更に含んでいることが望ましい。さらに、当該方法において、バイナリーベクターの態様をとってもよい。かかるバイナリーベクターとしては、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩＮ１９）、ｐＰＺＰ系（ｐＺＤ２０２等）が挙げられる。
　本発明において、第１のＤＮＡ構築物と、第２のＤＮＡ構築物とは、目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのシステムとして用いられるが、かかるシステムにおいて、第１のＤＮＡ構築物と第２のＤＮＡ構築物とは、独立した個々のＤＮＡ構築物（例えば、独立した個々のベクター）として存在していてもよく、また、第１及び第２のＤＮＡ構築物は、１のＤＮＡ構築物（例えば、単一のベクター）として存在していてもよい。かかる１のＤＮＡ構築物においては、例えば、ＬＩＲの直後にＲｅｐ／ＲｅｐＡ等のジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質をコードするＤＮＡを連結し配置してもよい。
　なお、本発明のＤＮＡ構築物は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて作製することができる。例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、骨格となる適当なベクターのマルチクローニングサイト等に連結することにより作製することができる。また、ＬＲ法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング、ＴＡクローニング等の手法を用いても、本発明のＤＮＡ構築物は作製できる。さらに、本発明のＤＮＡ構築物において配置される配列は、導入される植物細胞においてそれらの翻訳産物を効率良く発現させるため、当該細胞に合わせたコドンに最適化されていてもよい。
　（ＤＮＡの増幅方法）
　本発明においては、目的のＤＮＡを植物細胞において増幅する方法であって、目的のＤＮＡが挿入されている第１のＤＮＡ構築物と第２のＤＮＡ構築物とを備えたシステムを、植物細胞に導入する工程を含む、方法も、提供する。
　後述の実施例に示すとおり、前記システムが植物細胞に導入されると、第２のＤＮＡ構築物からジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質が発現し、当該タンパク質によって第１のＤＮＡ構築物中のＬＩＲが切断されることにより、ＬＩＲ間の目的のＤＮＡが高コピー数をもって増幅されることになる。
　本発明において、ＤＮＡ構築物の導入対象となる植物としては、特に制限はなく、例えば、単子葉植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ソルガム、トウモロコシ等のイネ科植物、タマネギ、ネギ等のヒガンバナ科植物）及び双子葉植物（例えば、シロイヌナズナ、ハクサイ、セイヨウアブラナ（ナタネ）等のアブラナ科植物、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャッサバ等のトウダイグサ科植物、レタス、ヒマワリ等のキク科植物、ダイズ等のマメ科植物、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン等のセリ科植物、リンゴ等のバラ科植物、バナナ等のバショウ科植物）を含む被子植物等が挙げられる。さらに、これら植物の遺伝子組み換え体やゲノム編集体であっても良い。
　本発明のシステムが導入される「植物細胞」には、前述の植物体中の細胞の他、当該植物由来の培養細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、葉の切片、種子、種子の胚の茎頂、塊茎の幼芽の茎頂、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
　本発明のＤＮＡ構築物の植物細胞への「導入」は、当業者であれば適宜公知の手法を用いて行なうことができ、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルボンバードメント法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法が挙げられる。
　また、かかる方法により本発明のシステムが導入された植物細胞から植物体を再生することができる。
　例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ，　Ｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ．１５：１６－２１，１９９７、Ｔｏｋｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．４７，９６９－９７６，１９９４）、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ　Ｅｄｓ．）ｐｐ６６－７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３－１５０７，１９９２）及びパーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７－９６２，１９９１）等、いくつかの技術が既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられている。
　シロイヌナズナであれば、フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ　ＳＪ　＆　Ｂｅｎｔ　ＡＦ，Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１６：７３５－７４３，１９９８）、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１２：７－１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
　また、ムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：１３６９－１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２２：３９７－４０２，２００４）、及びＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　２３：７８０－７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
　ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１－３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１２１２－１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４：５１３－５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ　１３７：２０－２８，２００２、Ｖ　Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２４（９）：５１３－５２２，２００５、Ｚｕｏ－ｙｕ　Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４４：７８９－７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２８（３）：４２９－４４４，２００９、ＺＹ　Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　３４３：２３３－２４４，２００６、ＡＫ　Ｓｈｒａｗａｔ　ａｎｄ　Ｈ　Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，４（６）：５７５－６０３，２００６、Ｄ　Ｓｙａｍａｌａ　ａｎｄ　Ｐ　Ｄｅｖｉ　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２－１４８６，２００３、Ｚ　Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｊ，３（６）：５９１－５９９，２００５）。
　トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７：５８１，１９８９）に記載された方法やＧｏｒｄｅｎ－Ｋａｍｍら（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：６０３，１９９０）に記載された方法が挙げられる。
　トマトであればＭａｔｓｕｋｕｒａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，４４：１８３７－１８４５，１９９３）に記載された方法が挙げられる。
　ダイズであれば、特許公報（米国特許第５，４１６，０１１号）に記載された方法が挙げられる。
　バレイショであればＶｉｓｓｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，７８：５９４，１９８９）に記載された方法が挙げられる。
　また、その他の植物であっても、Ｔａｂｅｉら（田部井豊　編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載の方法等を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
　（ゲノム編集方法）
　本発明においては、植物細胞の標的部位に外来ＤＮＡを挿入する方法であって、
　標的部位を認識して切断するゲノム編集システムと、目的のＤＮＡが挿入されている第１のＤＮＡ構築物及び第２のＤＮＡ構築物を備えたシステムとを、植物細胞に導入する工程を含み、
　前記目的のＤＮＡは、前記標的部位の左右に隣接する２つの相同配列と、前記２つの相同配列間に配置されている外来ＤＮＡとを、含む配列であり、
　前記ゲノム編集システムにより前記標的部位が切断され、増幅された前記目的のＤＮＡとの相同組換えが生じることによって、前記標的部位に前記外来ＤＮＡが挿入される、方法も、提供する。
　後述の実施例に示すとおり、本発明の方法によって目的のＤＮＡ（ノックインにおける鋳型ＤＮＡ）に含まれる外来ＤＮＡを高コピーにて増幅することによって、ゲノム編集による当該ＤＮＡの標的部位への挿入を高効率にて行うことが可能となる。
　「ゲノム編集」は、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用し、標的遺伝子における標的部位にて切断し、当該遺伝子を改変する方法である。それに用いられる「ゲノム編集システム」とは、標的部位を切断して改変を生じさせ得る人工制限酵素システムである限り特に制限されない。人工制限酵素システムとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮｓシステム、ＺＦＮｓシステム、ＰＰＲシステムが挙げられる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ（ＲＧＮ；ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（ＳｇＲＮＡ））を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドＲＮＡが標的部位に結合し、該結合部位に誘導されたＣａｓタンパク質によってＤＮＡを切断することができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５）））。
　また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体も、本発明に係るゲノム編集系として用いることができる（Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６）））。
　ＴＡＬＥＮｓシステムは、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）を使用する（例えば、米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＴＡＬＥＮｓがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキーム（例えば、Ｚｈａｎｇ，　Ｆｅｎｇ　ｅｔ．　ａｌ．　（２０１１）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２９　（２））に従って設計することができる。
　ＺＦＮｓシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）を使用する（例えば、米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）。該システムを細胞内に導入することにより、ＺＦＮｓがＤＮＡ結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでＤＮＡを切断する。標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
　ＰＰＲシステムとしては、例えば、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）を使用することができる（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　５３：１１７１－１１７９（２０１２））。
　これらゲノム編集系の中でも、標的部位の認識に核酸（ガイドＲＮＡ）を用いるため、標的部位をより自由に選択でき、その調製も簡便であるという観点から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが好ましい。なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるガイドＲＮＡの長さは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基である。好ましい塩基長の上限としては、３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２２以下、最も好ましくは２０以下である。Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。また、Ｃａｓタンパク質は、II型ＣＲＩＳＰＲ系酵素が好ましく、例えば、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得、また、Ｃａｓ９ホモログ又はオルソログであり得る。
　このようなゲノム編集システムの植物細胞の導入も、上記目的のＤＮＡ等と同様に、当該システムをコードするＤＮＡ構築物を調製して行うことが出来る。かかる場合、ゲノム編集システムをコードするＤＮＡ構築物において、例えば、人工酵素をコードするＤＮＡ構築物と、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物とは、別個独立したものであってもよく、単一のＤＮＡ構築物であってもよい。さらに、ゲノム編集システムをコードするＤＮＡ構築物は、本発明の第１のＤＮＡ構築物及び／又は第２のＤＮＡ構築物と単一のＤＮＡ構築物として存在してもよい（例えば、オールインワンベクターの形態をとってもよい）。また、ゲノム編集システムは、このようなＤＮＡの態様を採らずとも、人工酵素及びガイドＲＮＡの複合体として、植物細胞に導入してもよい。
　一方、かかるゲノム編集に用いられる本発明の第１のＤＮＡ構築物としては、前述のゲノム編集システムによって切断された標的部位に外来ＤＮＡを挿入するために、前記標的部位の左右に隣接する２つの相同配列を、目的のＤＮＡに含む。これにより、標的遺伝子と目的のＤＮＡとの間で相同組換えが生じ、外来ＤＮＡが標的遺伝子において切断された標的部位に挿入されることとなる。かかる相同配列の長さとしては、相同組換えが生じ得る限り特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得る。また、目的のＤＮＡにおいて、前記２つの相同配列間に配置される「外来ＤＮＡ」は、上記目的のＤＮＡ同様、任意の遺伝子（任意のタンパク質等をコードするＤＮＡ）であってもよく、コードしないＤＮＡ（ノンコーディングＤＮＡ）であってもよい。さらに、かかる任意の遺伝子を発現させるための発現制御領域を、上記目的のＤＮＡ同様、外来ＤＮＡも含んでいてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下に示す材料と方法とを用いて行った。
　材料と方法
　１．ベクター構築
　（ジェミニウイルスベクター）
　ＡｓｃＩ／ＰａｃＩで切断したバイナリーベクターｐＺＤ２０２Ｋｍに、ＤｓＲｅｄ発現カセット（イネ由来Ｇ３Ｐプロモーター、ＤｓＲｅｄ遺伝子、イネ由来Ｇ３Ｐターミネーター（Ｏｈｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０２０））をクローニングした。このベクターに含まれるｃｃｄＢ遺伝子（ＳａｃＩＩ／ＰａｃＩ部分）を、ＬＩＲ－ｃｃｄＢ－ＳＩＲ－ＬＩＲ（ＳＩＲがＬＩＲ間の内側にあるベクター）、ＬＩＲ－ｃｃｄＢ－ＬＩＲ－ＳＩＲ（ＳＩＲがＬＩＲ間の外側にある改良型ベクター）、ＬＩＲ－ｃｃｄＢ－ＬＩＲ－ＳＩＲ（ＳＩＲをもたない改良型ベクター）と置換した。これらのベクターに、ＬＲ反応により、ＧＦＰ発現カセット（トウモロコシユビキチン由来ユビキチンプロモーター、イネ由来ＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ（翻訳エンハンサー）、ＧＦＰ遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓターミネーター、アグロバクテリウム由来Ｎｏｓターミネーター）をクローニングし、図３に示すベクターを構築した。
　また、ＡｓｃＩ／ＰａｃＩで切断したバイナリーベクターｐＺＤ２０２Ｋｍに、Ｃａｓ９発現カセット（トウモロコシユビキチン由来ユビキチンプロモーター、イネ由来ＡＤＨ遺伝子の５’ＵＴＲ（翻訳エンハンサー）、ＮＬＳ付きＳｐＣａｓ９（イネコドンに最適化）、エンドウ由来ＲｂｃＳ－３Ａターミネーター、（Ｍｉｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１５））をクローニングした。このベクターに含まれるｃｃｄＢ遺伝子（ＳａｃＩＩ／ＰａｃＩ部分）を、ＬＩＲ－ｃｃｄＢ－ＳＩＲ－ＬＩＲ、ＬＩＲ－ｃｃｄＢ－ＬＩＲ－ＳＩＲと置換した。これらのベクターに、ＬＲ反応により、ノックインの鋳型ＤＮＡ（イネＧｌｂ３３遺伝子の翻訳開始点から上流０．６ｋｂ、ＧＦＰ遺伝子、イネＧｌｂ３３遺伝子の翻訳開始点から下流０．６ｋｂ）をクローニングし、図４に示すベクターを構築した。
　（Ｒｅｐ発現ベクター）
　ＡｓｃＩ／ＰａｃＩで切断したエントリークローンｐＥ（Ｌ１－Ｌ２）に、ＮＯＳプロモーター、ＷＤＶ由来Ｒｅｐ／ＲｅｐＡ遺伝子、イネＨＳＰ１７．３ターミネーターを導入した。ＡｓｃＩで切断したハイグロマイシン耐性遺伝子を持つバイナリーベクターｐＺＤ２０２Ｈｙｇに、イネＧｌｂ３３遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現カセットを導入した。ＬＲ反応により、ｓｇＲＮＡ発現カセットを有するｐＺＤ２０２ＨｙｇにＲｅｐ／ＲｅｐＡ発現カセットを導入した（図５の（Ａ））。また、ＡｓｃＩ処理により図５の（Ａ）で示すベクターからｓｇＲＮＡを除去したＲｅｐ／ＲｅｐＡ発現ベクターを作製した（図５の（Ｂ））。
　２．形質転換
　構築したベクターは、エレクトロポレーションを用いてアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０５株（Ｈｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３））に導入した。アグロバクテリウムによるイネカルスへの形質転換は定法に従った（Ｔｏｋｉ，　１９９７；　Ｔｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。イネ（品種日本晴）の完熟種子をＮ６Ｄ培地に置床し、３０℃、恒常的明条件下で７日間培養した。培養後のカルスを回収し、図３又は４に示すベクターを有するアグロバクテリウムを感染させ、２３℃、恒常的暗条件下で３日間共存培養した。共存培養したカルスは、２５ｍｇ／Ｌメロペンを含む滅菌水でアグロバクテリウムを除菌後、３５ｍｇ／Ｌ　Ｇ４１８と２５ｍｇ／Ｌ　メロペンを含むＮ６Ｄ培地に置床した。３０℃、恒常的明条件下で４週間培養した後、耐性カルスのみを回収し、上述のとおり、図５に示すベクターを含むアグロバクテリウムを感染した。感染後のカルスは、アグロバクテリウムを除菌した後、５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンと２５ｍｇ／Ｌメロペンを含むＮ６Ｄ培地に置床し、３０℃、恒常的明条件下で５～６週間培養を行った。
　３．レプリコンの定量
　形質転換したイネカルスからＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　Ｃｈｌｏｒｏｐｕｒｅ（ベックマンコールター）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ又はＰｖｕＩＩで処理を施し、ＰＣＲの鋳型として用いた。プロトコールに従い、以下の組成になるようＰＣＲ反応液を調製した。
　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて、調製したＰＣＲ反応液のドロップレットを作製し、次の条件でＰＣＲ反応を行った。
９５℃×１０分→（９４℃×３０秒→５５℃×１分）を４０サイクル→９８℃×１０分→４℃。ＰＣＲ反応の温度変化は２℃／秒に設定した。
ＰＣＲ反応後のドロップレットはＱＸ２００　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｒｅａｄｅｒを用いて測定し、データはＱｕａｎｔａＳｏｆｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
　４．ＧＴ頻度の確認
　形質転換したイネカルスから抽出したＤＮＡを鋳型にし、標的組換え領域の５’側あるいは３’側を増幅するプライマーを利用しＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いたプライマーのうち片側は、鋳型ＤＮＡに用いた領域の外側を認識するように設計した。
　次の条件でＰＣＲ反応を行った。
９８℃×１０秒→６８℃×６秒（５’側）または８秒（３’側）を３５サイクル→４℃。
５’側ＰＣＲ、３’側ＰＣＲ両方で増幅が見られたサンプルを標的組換えに成功したサンプルとして標的組換え効率を算出した。
　以下に、これら材料及び方法を用いて得られた結果を示す。
　（実施例１）　改良型ベクターによるレプリコンコピー数の増加
　ＧＦＰ遺伝子を含む配列を増幅させるジェミニウイルスベクター（図３）及びＲｅｐ／ＲｅｐＡ（図５の（Ｂ））を形質転換したカルスについて、レプリコンのコピー数を定量した。定量にはデジタルＰＣＲを用い、内在性遺伝子のアクチン遺伝子（ＯｓＡｃｔ１）のコピー数をもとに、イネゲノム当たりのＧＦＰコピー数を算出した。
　その結果、図６に示すとおり、レプリコンを持たないコントロールベクター（図３の（Ａ））を形質転換したイネカルスではゲノム当たり平均３．５コピーのＧＦＰ遺伝子が存在していたのに対し、ＳＩＲを内側に持つジェミニウイルスベクター（図３の（Ｂ））を形質転換したイネカルスでは平均４１０コピーのＧＦＰ遺伝子が存在していることが明らかになった。
　一方、ＳＩＲを外側に持つ改良型ベクター（図３の（Ｃ））又はＳＩＲを持たない改良型ベクター（図３の（Ｄ））を形質転換したイネカルスでは、それぞれ９０３コピー、７８９コピーのＧＦＰ遺伝子が存在しており、ＳＩＲを内側に持つレプリコンベクターに比べて、ＧＦＰコピー数が２．２倍、１．９倍多いことが分かった。
　（実施例２）　改良型ベクターによる標的組換え（目的遺伝子のノックイン）頻度の改善
　ノックインは非常に頻度が低く、その高効率化が求められている。これまでに、ジェミニウイルスベクターを用いたノックインの成功例が、タバコ（Ｂａｌｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，２０１４）、ジャガイモ（Ｂｕｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６）、トマト（Ｃｅｒｍａｋ　ｅｔ　ａｌ．，２０１５）、キャッサバ（Ｈｕｍｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８）、コムギ（Ｇｉｌ－Ｈｕｍａｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７）、イネ（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，２０２２；Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０１７）等で報告されている。
　そこで、改良型ジェミニウイルスベクターを用いることで、ノックイン効率が改善できるかを検証した。具体的には、イネＧｌｂ３３遺伝子にＧＦＰをノックインする実験を実施した。そして、鋳型ＤＮＡを増幅させるレプリコンとターゲット領域を切断するためのＣａｓ９を含むベクター（図４）とイネＧｌｂ３３をターゲットとするｓｇＲＮＡとＲｅｐ／ＲｅｐＡ発現カセットを含むベクター（図５の（Ａ））を形質転換したカルスについて、レプリコンのコピー数を定量した（図７）。
　その結果、図７に示すとおり、レプリコンを持たないコントロールベクター（図４の（Ａ））を形質転換したイネカルスではゲノム当たり平均２．６コピーのＧＦＰ遺伝子が存在していたのに対し、ＳＩＲを内側に持つジェミニウイルスベクター（図４の（Ｂ））を形質転換したイネカルスでは平均２６００コピーのＧＦＰ遺伝子が存在していた。一方、ＳＩＲを外側に持つ改良型ベクター（図４の（Ｃ））を形質転換したイネカルスでは、１００００コピー近いＧＦＰ遺伝子が存在しており、ＳＩＲを内側に持つジェミニウイルスベクターに比べて、ＧＦＰコピー数が３．８倍多いことが分かった。
　さらに、これらのカルスにおいて、ＰＣＲによりノックイン頻度を調べた。その結果、図には示していないが、レプリコンを持たないコントロールベクター（図４の（Ａ））を形質転換したイネカルスではノックインできていなかったのに対し、ＳＩＲを内側に持つジェミニウイルスベクター（図４の（Ｂ））を用いた場合は２７％、ＳＩＲを外側に持つ改良型ベクター（図４の（Ｃ））を用いた場合は４４％のカルスでＧＦＰのノックインが検出され、ノックイン頻度を１．６倍改善することに成功した。
　（引用文献）
　　Ｂａｌｔｅｓ，　Ｎ．Ｊ．，　Ｇｉｌ－Ｈｕｍａｎｅｓ，　Ｊ．，　Ｃｅｒｍａｋ，　Ｔ．，　Ａｔｋｉｎｓ，　Ｐ．Ａ．　ａｎｄ　Ｖｏｙｔａｓ，　Ｄ．Ｆ．　（２０１４）　ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２６，　１５１－１６３．
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　　Ｋｉｍ，　Ｊ．Ｈ．，　Ｙｕ，　Ｊ．，　Ｋｉｍ，　Ｈ．Ｋ．，　Ｋｉｍ，　Ｊ．Ｙ．，　Ｋｉｍ，　Ｍ．－Ｓ．，　Ｃｈｏ，　Ｙ．－Ｇ．，　Ｂａｅ，　Ｓ．，　Ｋａｎｇ，　Ｋ．Ｋ．　ａｎｄ　Ｊｕｎｇ，　Ｙ．Ｊ．　（２０２２）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｇｏｌｄｅｎ　ＳＮＰ－Ｃａｒｒｙｉｎｇ　Ｌｙｃｏｐｅｎｅ　Ｅｐｓｉｌｏｎ－Ｃｙｃｌａｓｅ　（ＬｃｙＥ）　Ｇｅｎｅ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／ＨＤＲ　ａｎｄ　Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｐｌｉｃｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｒｉｃｅ．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２３，　１０３８３．
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　　Ｏｈｔｓｕｋｉ，　Ｎ．，　Ｋｉｚａｗａ，　Ｋ．，　Ｍｏｒｉ，　Ａ．，　Ｎｉｓｈｉｚａｗａ－Ｙｏｋｏｉ，　Ａ．，　Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．，　Ｈａｙａｋａｗａ，　Ｋ．，　Ｔｏｋｉ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｓａｉｋａ，　Ｈ．　（２０２０）　Ｐｒｅｃｉｓｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｍｉＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｉｔｅ　ｖｉａ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ－ａｎｎｅａｌｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｆｒｏｎｔ．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄ．　２，　６１７７１３．
　　Ｓｃｈｏｃｈ，　Ｃ．Ｌ．，　Ｃｉｕｆｏ，　Ｓ．，　Ｄｏｍｒａｃｈｅｖ，　Ｍ．，　Ｈｏｔｔｏｎ，　Ｃ．Ｌ．，　Ｋａｎｎａｎ，　Ｓ．，　Ｋｈｏｖａｎｓｋａｙａ，　Ｒ．，　Ｌｅｉｐｅ，　Ｄ．，　ＭｃＶｅｉｇｈ，　Ｒ．，　Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，　Ｋ．，　Ｒｏｂｂｅｒｔｓｅ，　Ｂ．，　Ｓｈａｒｍａ，　Ｓ．，　Ｓｏｕｓｓｏｖ，　Ｖ．，　Ｓｕｌｌｉｖａｎ，　Ｊ．Ｐ．，　Ｓｕｎ，　Ｌ．，　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｋａｒｓｃｈ－Ｍｉｚｒａｃｈｉ，　Ｉ．　（２０２０）　ＮＣＢＩ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ：　ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｕｐｄａｔｅ　ｏｎ　ｃｕｒａｔｉｏｎ，　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　ｔｏｏｌｓ．　Ｄａｔａｂａｓｅ　：　ｔｈｅ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄａｔａｂａｓｅｓ　ａｎｄ　ｃｕｒａｔｉｏｎ　２０２０．
　　Ｔｏｋｉ，　Ｓ．　（１９９７）　Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１５，　１６－２１．
　　Ｔｏｋｉ，　Ｓ．，　Ｈａｒａ，　Ｎ．，　Ｏｎｏ，　Ｋ．，　Ｏｎｏｄｅｒａ，　Ｈ．，　Ｔａｇｉｒｉ，　Ａ．，　Ｏｋａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．　（２００６）　Ｅａｒｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｌｏｗｓ　ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　４７，　９６９－９７６．
　　Ｕｇａｋｉ，　Ｍ．，　（１９９２）　Ｐｌａｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ／Ｒｅｃｅｎｔ　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　４６（１），　３１－３６．
　　Ｗａｎｇ，　Ｍ．，　Ｌｕ，　Ｙ．，　Ｂｏｔｅｌｌａ，　Ｊ．Ｒ．，　Ｍａｏ，　Ｙ．，　Ｈｕａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｚｈｕ，　Ｊ．Ｋ．　（２０１７）　Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｂｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　Ｒｉｃｅ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｓｙｓｔｅｍ．　Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　１０，　１００７－１０１０．
　以上説明したように、本発明によれば、植物細胞において目的のＤＮＡを増幅することが可能となる。ひいては、ワクチンや抗体等のバイオ医薬品、セルラーゼ等の工業用酵素といった、有用タンパク質を、大量に生産することが可能となる。また、本発明により、ゲノム編集技術を用いたジーンターゲッティング（ＧＴ）における鋳型ＤＮＡを増幅することによって、ＧＴ効率を高めることもでき、例えば、農作物品種やバイオリアクターの開発を効率良く行うことも可能となる。
　また、本発明の第１のＤＮＡ構築物において、複数のＬＩＲを配置し、これらＬＩＲ間において各々異なる目的のＤＮＡを挿入することによって、複数種の目的のＤＮＡを同時に増幅することが可能となる。例えば、本発明を用いたＧＴベクターにおいて、ＬＩＲを３個配置し、これらＬＩＲの間に異なる２種類の目的のＤＮＡを挿入することによって、それぞれをＧＴ用鋳型ＤＮＡとして増幅することが可能となり、ひいては、２遺伝子を標的とする同時ＧＴが可能となる。
　また、ＧＴによって、ＡＬＳ遺伝子に除草剤耐性型変異を導入することにより、除草剤を用いてＧＴ細胞を直接選抜できることが報告されている（Ｍａｓａｋｉ　Ｅｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　２００７　Ｏｃｔ；５２（１）：１５７－６６．）。よって、本発明を用いたＧＴベクターにおいて、前記同様、３個のＬＩＲの間に異なる２種類の目的のＤＮＡを挿入する場合、例えば図８に示すように、一方のＤＮＡを、除草剤標的遺伝子（例えばＡＬＳ遺伝子）に除草剤耐性変異を導入するための鋳型とし、他方のＤＮＡを標的遺伝子にノックイン（例えばＧＦＰ遺伝子）するための鋳型とすることによって、ＧＦＰ遺伝子が標的遺伝子にノックインされた細胞を、除草剤選抜により濃縮することが可能となる。
　よって、本発明は、医薬、農業等、様々なバイオ産業分野において、極めて有用である。

Claims (7)

  1. 　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのＤＮＡ構築物であって、
    　２つのジェミニウイルス由来の長遺伝子間領域（ＬＩＲ）を保持し、前記２つのＬＩＲ間に、目的のＤＮＡを挿入するための部位が配置されており、
    　前記２つのＬＩＲ間には、ジェミニウイルス由来の短遺伝子間領域（ＳＩＲ）が配置されていない、ＤＮＡ構築物。
  2. 　前記２つのＬＩＲ間の外側にＳＩＲが配置されている、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 　ＳＩＲを保持しない、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  4. 　前記部位に前記目的のＤＮＡが挿入されている、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
  5. 　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅するためのシステムであって、
    　請求項４に記載のＤＮＡ構築物と、ジェミニウイルス由来の複製開始タンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物とを、備えたシステム。
  6. 　目的のＤＮＡを植物細胞において増幅する方法であって、
    請求項５に記載のシステムを、植物細胞に導入する工程を含む、方法。
  7. 　植物細胞の標的部位に外来ＤＮＡを挿入する方法であって、
    　標的部位を認識して切断するゲノム編集システムと、請求項５に記載のシステムとを、植物細胞に導入する工程を含み、
    　前記目的のＤＮＡは、前記標的部位の左右に隣接する２つの相同配列と、前記２つの相同配列間に配置されている外来ＤＮＡとを、含む配列であり、
    　前記ゲノム編集システムにより前記標的部位が切断され、増幅された前記目的のＤＮＡとの相同組換えが生じることによって、前記標的部位に前記外来ＤＮＡが挿入される、方法。
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