WO2018220929A1 - 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用 - Google Patents

植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用 Download PDF

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謙治 三浦
浩 江面
健 星川
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    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to an expression system and use thereof. More specifically, the present invention relates to an expression system, a method for producing a target protein, and an expression vector.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2017-107965 filed in Japan on May 31, 2017, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Transgenic plants may be used for the purpose of producing recombinant proteins and analyzing protein localization in plants. However, it takes a long time to produce a transgenic plant. Moreover, the expression level of the protein by the transgenic plant tends to be relatively low.
  • a transient expression system using a virus-based vector may be able to obtain high expression of the recombinant protein in a short time.
  • an expression system called the magnICON system is a viral system based on tobacco mosaic virus, which was developed to achieve a high level of accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves (eg, non-patent literature). 1).
  • geminivirus has a single-stranded circular DNA genome and replicates the genome with a very high copy number by a rolling circle type DNA replication mechanism. This mechanism has been used to increase the expression of a protein in a transgenic plant or increase the expression level of a recombinant protein in a transient expression system (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • Marillonnet S., et al. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants., Nat. Biotechnol., 23 (6), 718-723, 2005.
  • Moon K. B., et al. Overexpression and self-assembly of virus-like particles in Nicotiana benthamiana by a single-vector DNA replicon system., Appl. Microbiol. Biotechnol., 98 (19), 8281-8290, 2014 .
  • Non-Patent Document 1 is limited to plants belonging to the genus Tobacco, and may be difficult to apply to other plants.
  • the system described in Non-Patent Document 2 may not have a sufficient protein expression level. Therefore, the present invention can be applied to plants other than the genus Tobacco, and an object thereof is to provide an expression system having a high protein expression level.
  • a first comprising a Long Intelligent Region (LIR) derived from a geminivirus, a Small Intelligent Region (SIR) derived from a geminivirus, and an expression cassette of a target protein linked between the LIR and the SIR.
  • LIR Long Intelligent Region
  • SIR Small Intelligent Region
  • An expression system comprising terminators linked in this order.
  • the gene silencing inhibitor is gene silencing inhibitor P19 derived from tomato bushy stunt virus.
  • the expression system according to [4] or [5], wherein the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment are contained in a single vector.
  • a T-DNA right border sequence (RB) and a T-DNA left border sequence (LB) are further included, and the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment are the RB And the LB, the expression system according to [6].
  • a method for producing a target protein comprising the step of introducing the expression system according to any one of [1] to [8] into a plant cell.
  • a first nucleic acid fragment comprising a geminivirus-derived LIR, a geminivirus-derived SIR, and an expression cassette linked between the LIR and the SIR, wherein the expression cassette comprises a promoter, An expression vector comprising a multicloning site and two or more terminators linked in this order.
  • a T-DNA right border sequence (RB) and a T-DNA left border sequence (LB) are further provided, and the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment are the RB
  • an expression system that can be applied to plants other than the genus Tobacco and has a high protein expression level can be provided.
  • A It is a photograph which shows the state which put about 1.2L Agrobacterium suspension in a 2L glass beaker, and installed in the vacuum desiccator in performing Agroinfiltration.
  • B A photograph showing a state in which lettuce is immersed in an Agrobacterium suspension and set to a pressure of 736 mmHg.
  • C It is the photograph which shows the state which put the lettuce after agroinfiltration in the bowl.
  • D It is a photograph which shows the state which is incubating the lettuce after agroinfiltration.
  • A is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2fp-EGFP vector.
  • (B) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HS-EGFP vector.
  • C is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2EE-EGFP vector.
  • (D) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HH-EGFP vector.
  • E is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2H-EGFP vector.
  • (F) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2TN-EGFP vector.
  • G is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2T-EGFP vector.
  • (H) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HT-EGFP vector.
  • (I) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HTS-EGFP vector.
  • (A) to (i) are photographs showing the results of observation of fluorescence of expressed EGFP in Experimental Example 1.
  • (A) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco in Experimental Example 2 to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • (B) is a photograph showing the result of transferring the gel of (a) onto a PVDF membrane and performing immunoblot analysis using an anti-GFP antibody.
  • (C) is a graph in which the expression level of EGFP in (a) is quantified.
  • (A) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from lettuce leaves to SDS-PAGE and CBB staining in Experimental Example 2.
  • (B) is a photograph showing the result of transferring the gel of (a) onto a PVDF membrane and performing immunoblot analysis using an anti-GFP antibody.
  • (C) is a graph in which the expression level of EGFP in (a) is quantified.
  • (A) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from eggplant leaves to SDS-PAGE and CBB staining in Experimental Example 2.
  • (B) is a photograph showing the result of transferring the gel of (a) onto a PVDF membrane and performing immunoblot analysis using an anti-GFP antibody.
  • (C) is a graph in which the expression level of EGFP in (a) is quantified.
  • (A) is a photograph showing the result of immunoblotting analysis using anti-GFP antibody after transferring all soluble proteins prepared from tomato leaves in Experimental Example 2 to a PVDF membrane after subjecting them to SDS-PAGE.
  • (B) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from capsicum leaves and rose petals to SDS-PAGE, transferring them to a PVDF membrane, and immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody.
  • (A) to (e) are photographs showing the results of observation of fluorescence of expressed EGFP in Experimental Example 3.
  • (A) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco in Experimental Example 4 to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • (B) is a graph in which the expression level of EGFP in (a) is quantified.
  • (A) is a photograph showing the result of subjecting total soluble protein prepared from the leaf of Bensamiana tobacco in Example 5 to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • (B) is a graph in which the expression level of EGFP in (a) is quantified. It is a schematic diagram which shows the structure of GFP_pICH18711 vector.
  • (A) And (b) is a photograph which shows the result of having observed the fluorescence of expressed EGFP or GFP in Experimental example 6.
  • FIG. (A) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco in Experimental Example 6 to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • (B) is a graph obtained by quantifying the expression level of EGFP or GFP in (a).
  • the present invention provides a first nucleic acid fragment comprising a geminivirus-derived LIR, a geminivirus-derived SIR, and an expression cassette for a target protein linked between the LIR and the SIR; A second nucleic acid fragment containing a Geminivirus-derived Rep / RepA protein expression cassette, wherein the expression cassette for the target protein is linked to a promoter and two or more nucleic acid fragments encoding the target protein.
  • An expression system comprising a terminator in this order is provided.
  • Rep / RepA protein which is a replication initiation protein of geminivirus
  • Rep / RepA protein which is a replication initiation protein of geminivirus
  • the expression cassette of the target protein linked between the LIR and SIR on the first nucleic acid fragment is replicated with a high copy number by the rolling circle type DNA replication mechanism of Geminivirus.
  • the target protein is expressed at a high expression level from the expression cassette of the target protein replicated at a high copy number.
  • the expression system of this embodiment can achieve a very high expression level of the target protein by including two or more terminators linked to the expression cassette of the target protein. it can.
  • the terminator is a base sequence that terminates transcription of DNA into mRNA. Although it does not specifically limit as a terminator, for example, the terminator derived from Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene, the terminator of tobacco extensin gene, the 35S terminator of a cauliflower mosaic virus (CaMV), the NOS terminator of CaMV, etc. are mentioned. In the expression system of the present embodiment, two or more terminators linked to each other may be terminators having the same base sequence, or may be terminators having different base sequences.
  • SEQ ID NO: 19 shows the base sequence of the terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene.
  • SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of the terminator of the tobacco extensin gene.
  • SEQ ID NO: 21 shows the base sequence of the CaMV 35S terminator.
  • SEQ ID NO: 22 shows the base sequence of the CaMV NOS terminator.
  • the base sequences of these terminators may have mutations relative to the base sequences of SEQ ID NOs: 19 to 22 as long as they have a function of terminating transcription of DNA into mRNA. A part of the base sequence may be deleted.
  • each base sequence is, for example, 70 with respect to the base sequences of SEQ ID NOs: 19 to 22, respectively.
  • % Sequence identity preferably 80% or more sequence identity, more preferably 90% or more sequence identity, and 95% or more sequence identity. Is particularly preferred.
  • the expression cassette of the target protein preferably includes two terminators.
  • the expression level of the target protein tends to be higher when the expression cassette of the target protein includes two or more terminators than when the expression cassette of the target protein includes three or more terminators.
  • At least one of the terminators included in the expression cassette of the target protein is a terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene.
  • an expression system including a terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene as a terminator tends to have a high expression level of the target protein.
  • the expression system of this embodiment can express about 3 mg or more of the target protein per 1 g of fresh weight of the plant body. This expression level is equivalent to the MAGNICICON system currently used commercially.
  • magnICON system is limited to plants belonging to the genus Tobacco
  • expression system of the present embodiment is applicable not only to plants belonging to the genus Tobacco but also to plants other than the genus Tobacco. Can also achieve a high expression level of the target protein.
  • plants other than the genus Tobacco include solanaceous plants such as tomato, eggplant, and pepper, asteraceae plants such as lettuce, cucurbitaceae plants such as melon, orchidaceae plants such as moth orchids, and the like. It is not limited to.
  • the first nucleic acid fragment includes a promoter, a nucleic acid fragment encoding the target protein, and two or more terminators linked in this order.
  • any promoter can be used as long as it exhibits the transcriptional activity of DNA linked downstream in plant cells of the host.
  • cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter ubiquitin promoter
  • cassava bean mosaic virus (CsVMV) promoter and the like can be mentioned.
  • the target protein is not particularly limited, and any protein can be expressed. According to the expression system of the present embodiment, the protein can be expressed at a lower cost than protein expression using animal cells. Moreover, the expression system of this embodiment can be used for the expression of pollen allergens and the like that are difficult to express in an expression system such as Escherichia coli. For this reason, the target protein may be, for example, a pollen allergen.
  • the terminator consists of a base sequence involved in specific termination of RNA transcription by RNA polymerase.
  • the terminator two or more of one kind of terminator may be connected and used, or two or more kinds of terminators may be used in combination.
  • the expression system of this embodiment can achieve a high expression level of the target protein by having two or more terminators linked together.
  • the expression level of the target protein tends to be further increased.
  • the first nucleic acid fragment may have, for example, a 5'-untranslated region (UTR), a polyadenylation signal, and the like in addition to the promoter, the nucleic acid fragment encoding the target protein, and the terminator.
  • UTR 5'-untranslated region
  • polyadenylation signal and the like in addition to the promoter, the nucleic acid fragment encoding the target protein, and the terminator.
  • 5′-UTR By having 5'-UTR, the expression efficiency of the target protein may further increase.
  • 5′-UTR include 5′-UTR of tobacco mosaic virus, 5′-UTR of Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene, 5′-UTR of Arabidopsis elongation factor 1 ⁇ -A3 gene, 5′-UTR of rice alcohol dehydrogenase gene, etc. Is mentioned.
  • the second nucleic acid fragment contains an expression cassette for Rep / RepA protein derived from geminivirus.
  • the Rep / RepA protein expression cassette is not particularly limited as long as the Rep / RepA protein can be expressed in the host plant cell, and includes a promoter, a nucleic acid fragment encoding the Rep / RepA protein, a terminator, 5′-UTR, and polyadenyl. It may have an activating signal or the like.
  • a promoter of the Rep / RepA protein in addition to those described above as those that can be used for the first nucleic acid fragment, for example, LIR derived from Geminivirus may also be used because it has promoter activity.
  • the “expression system” means a system capable of expressing a target protein by introducing a combination of a first nucleic acid fragment and a second nucleic acid fragment into a plant cell.
  • the expression system may be composed of one nucleic acid fragment or a combination of two or more nucleic acid fragments as long as the effect of the present invention is obtained.
  • the nucleic acid fragment may be a vector.
  • the first nucleic acid fragment and the second nucleic acid fragment may exist separately as independent nucleic acid fragments, or are linked to form one nucleic acid fragment. It may be.
  • first nucleic acid fragment and the second nucleic acid fragment are linked, the order of the linkage is not particularly limited, and the first nucleic acid fragment may exist on the 5 ′ side, or the 5 ′ A second nucleic acid fragment may be present on the side.
  • LIR, SIR, and Rep / RepA are derived from Geminivirus.
  • the geminivirus is not particularly limited as long as it has a rolling circle type DNA replication mechanism.
  • geminaviidae mastrevirus genus macular atrophy virus BeYDV
  • tomato golden mosaic virus TGMV
  • African cassava mosaic A virus ACMV
  • RLCV rose cigar virus
  • SEQ ID NO: 23 shows the base sequence of LIR derived from Geminivirus.
  • SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of SIR derived from geminivirus.
  • SEQ ID NO: 25 shows the base sequence of Geminivirus-derived Rep / RepA protein (open reading frames C1 and C2 encoding Rep / RepA protein which is a replication initiator protein of BeYDV).
  • the LIR base sequence, the SIR base sequence, and the base sequence encoding Rep / RepA protein are expressed by the Rep / RepA protein encoded by the base sequence so that the expression cassette of the target protein linked between LIR and SIR is obtained.
  • it may have mutations in the base sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively. It may be deleted.
  • each base sequence is
  • each base sequence is
  • Each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25 preferably has, for example, 70% or more sequence identity, more preferably 80% or more sequence identity, and more than 90% sequence. It is more preferable to have identity, and it is particularly preferable to have 95% or more sequence identity.
  • sequence identity of the target base sequence with respect to the reference base sequence can be determined, for example, according to the above-described formula (1).
  • the expression system of the present embodiment may further include a third nucleic acid fragment containing an expression cassette for a gene silencing inhibitor.
  • a gene silencing inhibitor include gene silencing inhibitor P19 derived from tomato bushy stunt virus, gene silencing inhibitor 16K derived from tobacco rattle virus, and the like.
  • the third nucleic acid fragment may exist separately as a nucleic acid fragment independent of the first nucleic acid fragment and the second nucleic acid fragment described above, or may be arbitrarily combined with the first nucleic acid fragment or the second nucleic acid fragment.
  • the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment and the third nucleic acid fragment may be linked in any order. That is, the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment may be contained in a single vector.
  • the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment are contained in a single vector, and the vector further comprises T-DNA RB and LB.
  • the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment may exist between RB and LB of T-DNA.
  • T-DNA is a specific region possessed by a Ti plasmid or Ri plasmid found in a pathogenic strain of Agrobacterium, a pathogenic bacterium of crown gall, which is a dicotyledonous tumor.
  • Agrobacterium having T-DNA coexists with a plant cell, a nucleic acid fragment existing between RB and LB is transferred into the host plant cell.
  • the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment and the third nucleic acid fragment can be easily introduced into the host plant cell.
  • the vector in which the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment, and the third nucleic acid fragment are present between RB and LB is preferably a vector that can be used in the binary vector method.
  • the binary vector method is a gene introduction method into a plant using a vir helper Ti plasmid from which the original T-DNA of the Ti plasmid has been removed and a small shuttle vector having an artificial T-DNA.
  • the shuttle vector is preferably one that can be maintained by both E. coli and Agrobacterium.
  • the vir helper Ti plasmid does not have the original T-DNA, it cannot form a crown gall on the plant. However, the vir helper Ti plasmid has the vir region necessary for introducing T-DNA into the host plant cell.
  • T-DNA having a desired nucleic acid fragment into Agrobacterium having a vir helper Ti plasmid and introducing the Agrobacterium into the host plant, the desired nucleic acid fragment can be easily transferred to the host plant cell. Can be introduced in.
  • a vector in which the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment and the third nucleic acid fragment are present between RB and LB has an origin of replication for E. coli and an origin of replication for Agrobacterium. It may be a shuttle vector that can be maintained by both E. coli and Agrobacterium.
  • SEQ ID NO: 26 shows the RB base sequence of T-DNA.
  • SEQ ID NO: 27 shows the LB base sequence of T-DNA.
  • the base sequences of RB and LB have mutations with respect to the base sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively, as long as they have a function of transferring a nucleic acid fragment existing between RB and LB into a host plant cell.
  • a part of the base sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27 may be deleted.
  • the base sequences of RB and LB have mutations and deletions with respect to the base sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively, the base sequences are respectively compared with the base sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively.
  • it preferably has 70% or more sequence identity, more preferably 80% or more sequence identity, more preferably 90% or more sequence identity, and 95% or more sequence identity. It is particularly preferable to have it.
  • sequence identity of the target base sequence with respect to the reference base sequence can be determined, for example, according to the above-described formula (1).
  • the present invention comprises a first nucleic acid fragment comprising a geminivirus-derived LIR, a geminivirus-derived SIR, and an expression cassette linked between the LIR and the SIR.
  • An expression vector is provided in which a cassette comprises a promoter, a multicloning site, and two or more terminators linked in this order.
  • the expression vector of this embodiment can be suitably used for the production of the expression system described above. As will be described later in Examples, the expression vector of this embodiment can achieve a very high expression level of the target protein by introducing a gene fragment encoding the target protein into the multicloning site of the expression cassette. . This is due to the fact that two or more expression cassettes are connected to each other.
  • the expression cassette preferably contains two terminators.
  • the expression level of the target protein tends to be higher when the expression cassette contains two or more terminators than when the expression cassette contains three or more terminators.
  • At least one of the terminators included in the expression cassette is a terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene.
  • an expression vector containing a terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene as a terminator tends to have a high expression level of the target protein.
  • LIR, SIR, promoter, and terminator are the same as those described above. That is, in the expression vector of the present embodiment, the geminivirus may be kidney macular atrophy virus (BeYDV).
  • BeYDV kidney macular atrophy virus
  • the multi-cloning site is a region in which one or more base sequences recognized by restriction enzymes are arranged. That is, in the multicloning site of the expression vector of the present embodiment, there may be one restriction enzyme site or a plurality of restriction enzyme sites. Since the vector of this embodiment has a multiple cloning site, a nucleic acid fragment encoding the target protein can be easily cloned.
  • the expression vector of this embodiment may not contain a nucleic acid fragment encoding the target protein, or a nucleic acid fragment encoding the target protein may be introduced. That is, a vector into which a nucleic acid fragment encoding the target protein has been introduced is also included in the expression vector of this embodiment.
  • the vector of the present embodiment may further include a second nucleic acid fragment containing an expression cassette of Rep / RepA protein derived from geminivirus.
  • the Rep / RepA protein is the same as described above.
  • the vector of the present embodiment may further include a third nucleic acid fragment containing an expression cassette for a gene silencing inhibitor.
  • the gene silencing inhibitor is the same as described above, and may be, for example, the gene silencing inhibitor P19 derived from tomato bushy stunt virus.
  • the vector of this embodiment further comprises RB and LB of T-DNA, and the first nucleic acid fragment, the second nucleic acid fragment and the third nucleic acid fragment are located between RB and LB of T-DNA. May be present.
  • RB and LB are the same as those described above.
  • the vector of the present embodiment is preferably a vector that can be used in the binary vector method.
  • the present invention provides a method for producing a target protein, the method comprising the step of introducing the expression system described above into a plant cell.
  • the expression system may be one in which a gene fragment encoding the target protein is introduced into the multicloning site of the vector described above.
  • the production method of the present embodiment can produce a target protein with a high expression level using tobacco plants and plants other than tobacco as hosts.
  • Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 having a binary vector was added to a YEB medium (6 g / L yeast extract, 5 g / L tryptone) supplemented with antibiotics (100 mg / L kanamycin, 30 mg / L gentamicin, 30 mg / L rifampicin). 5 g / L sucrose, 2 mM magnesium sulfate) and cultured at 28 ° C. for 2 days.
  • the culture cultured for 2 days was diluted 100-fold with the same medium as above, MES was added to a final concentration of 10 mM to adjust the pH to 5.6, and acetosyringone was further adjusted to a final concentration of 20 ⁇ M. And then scaled up by culturing at 28 ° C. for 18-24 hours using a rotary shaker set at 140 rpm.
  • sucrose is added to a final concentration of 55 g / L
  • acetosyringone is further added to a final concentration of 200 ⁇ M, and incubated at 22 ° C. for 1 hour. did.
  • red leaf lettuce was washed with distilled water, and water was removed with a paper towel. Subsequently, the base of the washed lettuce was placed on a wet paper towel. Subsequently, the lettuce was covered with a plastic wrap and allowed to stand at 24 degrees for one day. Subsequently, the lettuce was irradiated with blue LED light for 30 minutes or more before vacuum infiltration.
  • FIG. 1 (a) about 1.2 L of Agrobacterium suspension was placed in a 2 L glass beaker and placed in a vacuum desiccator. Then, as shown in FIG.1 (b), lettuce was immersed in the Agrobacterium suspension, set to the pressure of 736 mmHg, and left still for 20 minutes. Subsequently, the pressure was returned to atmospheric pressure and the lettuce was washed with water.
  • Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 having a binary vector was added to L-broth medium supplemented with 10 mM MES (pH 5.6), 20 ⁇ M acetosyringone, 100 mg / L kanamycin, 30 mg / L gentamicin, and 30 mg / L rifampicin.
  • the cells were cultured at 28 ° C. until the stationary phase.
  • the suspension of Agrobacterium tumefaciens was infiltrated on the back side of a 4-week-old benthamiana tobacco leaf using a 1 mL syringe without a needle.
  • N. benthamiana tobacco was immersed in an Agrobacterium suspension, allowed to stand for 20 minutes under a pressure of 736 mmHg, and then infiltrated by returning the pressure to atmospheric pressure.
  • the same suspension was also infiltrated into tomato fruits using a 1 mL syringe with a needle.
  • FIG. 2 (a) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2fp-EGFP vector (provided by Dr. Mason, Arizona State University, USA).
  • the pBYR2fp vector which is a known vector, has a replication system derived from bean macular dwarf virus (BeYDV).
  • the pBYR2fp vector has an expression cassette of a gene silencing inhibitory factor P19 derived from tomato bushy stunt virus.
  • an enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene fragment was PCR amplified using a primer (pBYR2fp-EGFP-F, SEQ ID NO: 1) and a primer (EGFP-pBYR2fp-R, SEQ ID NO: 2). Subsequently, the obtained PCR product was cloned into a pBYR2fp vector cleaved with a restriction enzyme XbaI to prepare a pBYR2fp-EGFP vector.
  • FIG. 2 (b) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HS-EGFP vector.
  • An EGFP gene fragment having a 5′-UTR of the alcohol dehydrogenase gene and a terminator of the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene was introduced into the pBYR2fp vector.
  • the EGFP gene fragment was PCR amplified using a primer (pRI201-EGFP-F, SEQ ID NO: 3) and a primer (EGFP-pRI201-R, SEQ ID NO: 4).
  • PCR product was cloned into pRI201-AN (Takara Bio Inc.) cut with restriction enzymes NdeI and SalI to prepare a pRI201-EGFP vector.
  • the primer pBYR2fp-AtADH-F, SEQ ID NO: 5
  • the primer pBYR2fp-HSPter-R, SEQ ID NO: 6
  • the alcohol dehydrogenase gene 5′-UTR and Arabidopsis thaliana were used.
  • the EGFP gene fragment having the heat shock protein 18.2 gene terminator was PCR amplified.
  • SEQ ID NO: 28 shows the full-length base sequence of the pBYR2HS-EGFP vector.
  • FIG. 2 (c) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2EE-EGFP vector.
  • a tobacco extensin gene terminator was PCR amplified using a primer (pBYR2EE-Ext3-F, SEQ ID NO: 7) and a primer (pBYR2EE-Ext3-R, SEQ ID NO: 8).
  • the obtained PCR product was cloned into a pBYR2HS-EGFP vector cleaved with restriction enzymes SalI and XbaI to prepare a pBYR2EE-EGFP vector.
  • the terminator of the pBYR2EE-EGFP vector was a combination of two tobacco extensin gene terminators.
  • FIG. 2 (d) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HH-EGFP vector.
  • PCR amplification was performed using the pBYR2HS-EGFP vector as a template, using the terminator of the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene as a primer (pBYR2H-HSPter-F, SEQ ID NO: 9) and pBYR2H-HSPter-R (SEQ ID NO: 10).
  • the PCR product was cloned into pBYR2H-EGFP cut with a restriction enzyme XbaI to prepare a pBYR2HH-EGFP vector.
  • the terminator of the pBYR2HH-EGFP vector was a combination of two terminators of the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene.
  • FIG. 2 (e) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2H-EGFP vector.
  • PCR amplification of SIR-C2 was performed using a primer (HSPter-SIR-F, SEQ ID NO: 11) and a primer (C1-ClaI-C2-R, SEQ ID NO: 12) using the pBYR2HS-EGFP vector as a template.
  • FIG. 2 (f) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2TN-EGFP vector.
  • pCambia1391Z Marker Gene Technologies, Inc.
  • PCR amplification was performed as a template.
  • the NOS terminator was PCR-amplified using pRI201-AN (Takara Bio Inc.) as a template using a primer (35Ster-NOSter-F, SEQ ID NO: 15) and a primer (pBYR2TN-NOSter-R, SEQ ID NO: 16).
  • the PCR product was cloned into the pBYR2H-EGFP vector cut with restriction enzymes SalI and XbaI to prepare pBYR2TN-EGFP.
  • the terminator of the pBYR2TN-EGFP vector was a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator and one NOS terminator linked together.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • FIG. 2 (g) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2T-EGFP vector.
  • the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator was PCR-amplified using pCambia1391Z as a template using a primer (pBYR2T-35Ster-F, SEQ ID NO: 13) and a primer (pBYR2HS-35Ster-R, SEQ ID NO: 17).
  • the PCR product was cloned into a pBYR2H-EGFP vector cut with restriction enzymes SalI and XbaI to prepare a pBYR2T-EGFP vector.
  • the terminator of the pBYR2T-EGFP vector had one 35S terminator of cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • FIG. 2 (h) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HT-EGFP vector.
  • the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator was PCR-amplified using pCambia1391Z as a template, using a primer (pBYR2HS-35Ster-F, SEQ ID NO: 18) and a primer (pBYR2HS-35Ster-R, SEQ ID NO: 17).
  • the PCR product was cloned into the pBYR2H-EGFP vector cleaved with the restriction enzyme XbaI to prepare a pBYR2HT-EGFP vector.
  • the terminator of the pBYR2HT-EGFP vector was an Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene terminator and a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator, one by one.
  • FIG. 2 (i) is a schematic diagram of the T-DNA region of the pBYR2HTS-EGFP vector.
  • the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator was PCR-amplified using pCambia1391Z as a template, using a primer (pBYR2HS-35Ster-F, SEQ ID NO: 18) and a primer (pBYR2HS-35Ster-R, SEQ ID NO: 17).
  • the PCR product was cloned into the pBYR2HS-EGFP vector cleaved with the restriction enzyme XbaI to prepare a pBYR2HTS-EGFP vector.
  • the terminator of the pBYR2HTS-EGFP vector was an Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene terminator, a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator, and a tobacco extensin gene terminator.
  • 35S-p ⁇ 2 means the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) having two enhancement elements
  • TMV ⁇ is the 5′-UTR of tobacco mosaic virus.
  • AtADH5 ′ means 5′-UTR of the Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene
  • EGFP means enhanced green fluorescence protein
  • Ext3 ′ means the terminator of the tobacco extensin gene
  • HSPter means the terminator of the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene
  • 35Ster means the 35S terminator of cauliflower mosaic virus (CaMV)
  • Nos-t means the NOS terminator.
  • LIR Long Intelligent Region of the kidney bean dwarf virus (BeYDV) genome
  • SIR Short Intelligent Region of the BeYDV genome
  • C1 and C2 are replicas of BeYDV. It means open reading frames C1 and C2 encoding Rep / RepA protein which is the starting protein
  • LB and “RB” mean the left border sequence and the right border sequence of T-DNA, respectively
  • Nos-p Means the NOS promoter
  • p19 means the gene encoding the gene silencing inhibitor P19 derived from tomato bushy stunt virus.
  • Table 1 below shows an outline of the pBYR2HS-EGFP vector and the pBYR2fp-EGFP vector.
  • HSPter means the terminator of the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene
  • Ext3 ′ means the terminator of the tobacco extensin gene.
  • pBYR2HS-EGFP vector and pBYR2fp-EGFP vector were introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain, respectively, benthamiana tobacco leaf, lettuce leaf, eggplant leaf, tomato fruit, tomato leaf, capsicum leaf, It was introduced into melon leaves, rose petals and moth orchids, respectively.
  • each plant was incubated for 3 days to express EGFP transiently. Subsequently, each plant was irradiated with a blue LED, and EGFP fluorescence was observed using an ultraviolet absorption filter (model “SC-52”, Fujifilm).
  • FIGS. 3A to 3I are photographs showing the results of observation of the fluorescence of the expressed EGFP.
  • the scale bar indicates 1 cm.
  • FIG. 3 (a) shows the results for Bensamiana tobacco leaves
  • FIG. 3 (b) shows the results for lettuce leaves
  • FIG. 3 (c) shows the results for eggplant leaves
  • FIG. 3 (d) Is the result of tomato fruit
  • FIG. 3 (e) is the result of tomato leaf
  • FIG. 3 (f) is the result of pepper leaf
  • FIG. 3 (g) is the result of melon leaf
  • FIG. 3 (h) shows the result of rose petals
  • FIG. 3 (i) shows the result of petals of moth orchid.
  • the left side shows the result of introducing the pBYR2HS-EGFP vector
  • the right side shows the result of introducing the pBYR2fp-EGFP vector.
  • the pBYR2HS-EGFP vector having two terminators, the terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene and the terminator derived from the Arabidopsis heat shock protein, rather than the pBYR2fp-EGFP vector having one terminator of the tobacco extensin gene. It was revealed that the expression level of EGFP was significantly higher.
  • the prepared protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the total soluble protein was detected by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • SDS-PAGE gel was transferred to a PVDF membrane, and EGFP protein was detected by immunoblot analysis using an anti-GFP antibody.
  • FIG. 4 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • the arrowhead indicates the EGFP protein.
  • NT means total soluble protein prepared from the leaves of Bensamiana tobacco into which no vector has been introduced.
  • GFP means a commercially available purified GFP protein (Vector Laboratories, Inc.).
  • FIG. 4 (b) is a photograph showing the result of immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody after transferring the gel of FIG. 4 (a) to a PVDF membrane.
  • FIG. 4C is a graph in which the expression level of EGFP in FIG. The numerical value of the graph of FIG.4 (c) is shown by the average value +/- standard deviation.
  • FIG. 5 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from lettuce leaves to SDS-PAGE and CBB staining.
  • the arrowhead indicates the EGFP protein.
  • “NT” means total soluble protein prepared from lettuce leaves into which no vector has been introduced.
  • FIG. 5 (b) is a photograph showing the result of immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody after transferring the gel of FIG. 5 (a) to a PVDF membrane.
  • FIG. 5C is a graph in which the expression level of EGFP in FIG. The numerical value of the graph of FIG.5 (c) is shown by the average value +/- standard deviation.
  • FIG. 6 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from eggplant leaves to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • the arrowhead indicates the EGFP protein.
  • “NT” means total soluble protein prepared from eggplant leaves into which no vector has been introduced.
  • FIG. 6B is a photograph showing the result of immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody after transferring the gel of FIG. 6A to a PVDF membrane.
  • FIG.6 (c) is the graph which digitized the expression level of EGFP in Fig.6 (a). The numerical value of the graph of FIG.6 (c) is shown by the average value +/- standard deviation.
  • FIG. 7 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from tomato leaves to SDS-PAGE, transferring them to a PVDF membrane, and immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody.
  • “NT” means the total soluble protein prepared from tomato leaves into which no vector has been introduced.
  • FIG. 7 (b) is a photograph showing the result of immunoblotting analysis using an anti-GFP antibody after transferring all soluble proteins prepared from capsicum leaves and rose petals to SDS-PAGE and then transferring them to a PVDF membrane. is there.
  • “NT” means the total soluble protein prepared from the pepper leaf into which no vector has been introduced.
  • pBYR2HS-EGFP having two terminators, that is, a tobacco extensin gene terminator and an Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene terminator, rather than a pBYR2fp-EGFP vector having one tobacco extensin gene terminator. It was revealed that the expression level of EGFP was significantly higher in the vector. It was also revealed that this expression system functions not only in tobacco but also in a plurality of species of plants other than the genus Tobacco.
  • Example 2 The outline of each vector is shown in Table 2 below.
  • Example 3 ′ means the terminator of tobacco extensin gene
  • HSPter means the terminator of Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene
  • 35Ster is the 35S terminator of cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • Nos-t means NOS terminator.
  • each plant was incubated for 3 days to express EGFP transiently. Subsequently, each plant was irradiated with excitation light, and the fluorescence of EGFP was observed using an ultraviolet absorption filter (type “SC-52”, Fujifilm).
  • FIGS. 8 (a) to (e) are photographs showing the results of observing the fluorescence of the expressed EGFP.
  • the introduced vectors are shown in the upper part of FIGS. 8 (a) to (e), respectively.
  • the vector, pBYR2TN-EGFP vector, pBYR2HT-EGFP vector, and pBYR2HTS-EGFP vector tended to have a higher expression level of EGFP.
  • the prepared protein corresponding to 0.2 mg fresh weight (FW) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the total soluble protein was detected by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • FIG. 9 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco to SDS-PAGE and CBB staining.
  • the arrowhead indicates the EGFP protein.
  • “NT” means total soluble protein prepared from the leaves of Bensamiana tobacco into which no vector has been introduced.
  • FIG. 9B is a graph in which the expression level of EGFP in FIG. The numerical values in the graph of FIG. 9B are shown as an average value ⁇ standard deviation.
  • the prepared protein corresponding to 0.2 mg fresh weight (FW) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the total soluble protein was detected by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • FIG. 10 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of Bensamiana tobacco to SDS-PAGE and CBB staining.
  • the arrowhead indicates the EGFP protein.
  • “NT” means total soluble protein prepared from the leaves of Bensamiana tobacco into which no vector has been introduced.
  • FIG. 10B is a graph in which the expression level of EGFP in FIG. The numerical value of the graph of FIG.10 (b) is shown by the average value +/- standard deviation.
  • Table 3 shows the outline of each vector used in this experimental example and the expression level of EGFP.
  • “Ext3 ′” means the terminator of tobacco extensin gene
  • “HSPter” means the terminator of Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene
  • “35Ster” is the 35S terminator of cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • “Nos-t” means NOS terminator.
  • the expression level of EGFP is expressed as an average value ⁇ standard deviation.
  • EGFP high expression of EGFP was observed in any of the vectors. Specifically, in any of the vectors, about 3 mg or more of EGFP was expressed per 1 g of fresh weight of the plant body. In addition, it was recognized that the expression level of EGFP was higher in the vector having 2 terminators than in the vector having 3 terminators. Moreover, the vector which contains the terminator of Arabidopsis heat shock protein 18.2 gene in the terminator tended to have a particularly high expression level of EGFP. In particular, in the pBYR2HS-EGFP vector, about 4 mg of EGFP was expressed per 1 g of fresh weight of the plant body.
  • magnICON system is an expression system currently used commercially, and it is known that about 3 mg or more of a target protein can be expressed per 1 g fresh weight of a plant body. Therefore, the expression levels of the proteins by the above-mentioned pBYR2HS-EGFP vector and the magnICON system were compared.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a structure of a GFP_pICH18711 vector (provided by Dr. Klimyuuk of Icon Genetics), which is an expression vector using the magnICON system.
  • RB and “LB” mean the right and left border sequences of T-DNA
  • Act2 means the Act2 promoter derived from Arabidopsis thaliana
  • ⁇ is derived from tobacco mosaic virus.
  • RdRp means RNA-dependent RNA polymerase derived from tobamovirus (Turnip bain clearing virus)
  • MP means movement protein
  • GFP green Fluorescence protein
  • NTR means 3′-UTR derived from cr-TMV (Cruciferae infectious tobamovirus)
  • Nos-t means NOS terminator.
  • a region indicated by a box with “RdRp” and “MP” dots means an intron.
  • the pBYR2HS-EGFP vector and the GFP_pICH18711 vector were introduced into the Agrobacterium tumefaciens GV3101 strain, respectively, and introduced into the leaves of 4-week-old or 5-week-old benthamiana tobacco.
  • each plant was incubated for 3 days to express EGFP or GFP transiently. Subsequently, each plant was irradiated with a blue LED, and fluorescence of EGFP or GFP was observed using an ultraviolet absorption filter (model “SC-52”, Fujifilm).
  • FIGS. 12 (a) and 12 (b) are photographs showing the results of observing the fluorescence of expressed EGFP or GFP. 12A and 12B, the scale bar indicates 1 cm.
  • FIG. 12 (a) shows the results for 4-week-old benthamiana tobacco
  • FIG. 12 (b) shows the results for 5-week-old benthamiana tobacco leaves.
  • the introduced vectors are shown in the upper part of FIGS. 12 (a) and 12 (b), respectively.
  • “4wo” indicates that the result is 4 weeks old
  • “5wo” indicates that the result is 5 weeks old.
  • the expression level of EGFP or GFP is greater when the pBYR2HS-EGFP vector is introduced than when the GFP_pICH18711 vector is introduced, regardless of whether 4-week-old or 5-week-old benthamiana tobacco leaves are used. A high tendency was observed.
  • FIG. 13 (a) is a photograph showing the result of subjecting all soluble proteins prepared from the leaves of each Bensamiana tobacco to SDS-PAGE and staining with CBB.
  • the introduced vectors are shown in the upper part of FIG.
  • the arrowhead indicates EGFP or GFP protein
  • “4wo” indicates a result of 4 weeks of age
  • “5wo” indicates a result of 5 weeks of age.
  • “NT” means total soluble protein prepared from the leaves of Bensamiana tobacco into which no vector has been introduced.
  • FIG. 13 (b) is a graph in which the expression level of EGFP or GFP in FIG. 13 (a) is quantified.
  • the numerical values in the graph of FIG. 13 (b) are shown as an average value ⁇ standard deviation of the expression level of EGFP or GFP in 4-week-old and 5-week-old benthamiana tobacco.
  • “*” indicates that there is a significant difference at P ⁇ 0.05 as a result of Student's t-test.
  • an expression system that can be applied to plants other than the genus Tobacco and has a high protein expression level can be provided.

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Abstract

ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。

Description

植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用
　本発明は、発現システム及びその使用に関する。より具体的には、発現システム、目的タンパク質の製造方法及び発現ベクターに関する。本願は、２０１７年５月３１日に、日本に出願された特願２０１７－１０７９６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　組換えタンパク質の製造や、植物におけるタンパク質の局在の解析を目的として、トランスジェニック植物が用いられる場合がある。しかしながら、トランスジェニック植物を作出するためには長期間を要する。また、トランスジェニック植物によるタンパク質の発現量は比較的低い傾向にある。
　一方、ウイルスベースのベクターを用いた一過性の発現システムでは、短時間に組換えタンパク質の高い発現を得ることができる場合がある。例えば、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムと呼ばれる発現システムは、タバコモザイクウイルスをベースとしたウイルスシステムであり、タバコの葉における組換えタンパク質の高レベルの蓄積を達成するために開発されたものである（例えば非特許文献１を参照。）。
　また、ジェミニウイルスは、一本鎖の環状ＤＮＡゲノムを有しており、ローリングサークル型ＤＮＡ複製機構によりそのゲノムを非常に高いコピー数で複製することが知られている。この機構は、トランスジェニック植物におけるタンパク質の発現を増加させたり、一過性の発現システムにおける組換えタンパク質の発現量を増加させるために利用されてきた（例えば非特許文献２を参照。）。
Marillonnet S., et al., Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants., Nat. Biotechnol., 23 (6), 718-723, 2005. Moon K. B., et al., Overexpression and self-assembly of virus-like particles in Nicotiana benthamiana by a single-vector DNA replicon system., Appl. Microbiol. Biotechnol., 98 (19), 8281-8290, 2014.
　しかしながら、非特許文献１に記載されたシステムは、宿主がタバコ属の植物に限られており、他の植物に適用することが困難な場合がある。一方、非特許文献２に記載されたシステムは、タンパク質の発現量が十分でない場合がある。そこで、本発明は、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
［２］前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１に記載の発現システム。
［３］前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１又は２に記載の発現システム。
［４］遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備える、［１］～［３］のいずれかに記載の発現システム。
［５］前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、［４］に記載の発現システム。
［６］前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、［４］又は［５］に記載の発現システム。
［７］Ｔ－ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ－ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、［６］に記載の発現システム。
［８］前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、［１］～［７］のいずれかに記載の発現システム。
［９］目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に［１］～［８］のいずれかに記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
［１０］ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクター。
［１１］前記ターミネーターが２個連結されている、［１０］に記載の発現ベクター。
［１２］前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、［１０］又は［１１］に記載の発現ベクター。
［１３］ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含む、［１０］～［１２］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１４］遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含む、［１０］～［１３］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１５］前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、［１４］に記載の発現ベクター。
［１６］Ｔ－ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ－ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、［１０］～［１５］のいずれか一項に記載の発現ベクター。
［１７］前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、［１０］～［１６］のいずれかに記載の発現ベクター。
　本発明によれば、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することができる。
（ａ）アグロインフィルトレーションを行うにあたり、約１．２Ｌのアグロバクテリウム懸濁液を２Ｌのグラスビーカーに入れ、バキュームデシケーター内に設置した状態を示す写真である。（ｂ）レタスをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力に設定した状態を示す写真である。（ｃ）アグロインフィルトレーション後のレタスをボウルに入れた状態を示す写真である。（ｄ）アグロインフィルトレーション後のレタスをインキュベートしている状態を示す写真である。 （ａ）はｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｂ）はｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｃ）はｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｄ）はｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｅ）はｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｆ）はｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｇ）はｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｈ）はｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。（ｉ）はｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。 （ａ）～（ｉ）は、実験例１において、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例２において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例２において、レタスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例２において、ナスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例２において、トマトの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｂ）はトウガラシの葉及びバラの花弁から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。 （ａ）～（ｅ）は、実験例３において、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例４において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。 （ａ）は、実験例５において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。 ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターの構造を示す模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、発現したＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例６において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
［発現システム］
　１実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システムを提供する。
　本実施形態の発現システムが植物に導入されると、第２の核酸断片から、ジェミニウイルスの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質が発現される。すると、ジェミニウイルスのローリングサークル型ＤＮＡ複製機構により、第１の核酸断片上のＬＩＲとＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットが高いコピー数で複製される。続いて、高いコピー数で複製された目的タンパク質の発現カセットから、高い発現量で目的タンパク質が発現される。
　実施例において後述するように、本実施形態の発現システムは、目的タンパク質の発現カセットが、２個以上連結されたターミネーターを含んでいることにより、非常に高い目的タンパク質の発現量を達成することができる。
　ターミネーターとは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を終結する塩基配列である。ターミネーターとしては、特に限定されないが、例えば、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーター、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター、ＣａＭＶのＮＯＳターミネーター等が挙げられる。本実施形態の発現システムにおいて、２個以上連結されたターミネーターは、それぞれ同じ塩基配列のターミネーターであってもよいし、異なる塩基配列のターミネーターであってもよい。
　配列番号１９にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２０にタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２１にＣａＭＶの３５Ｓターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２２にＣａＭＶのＮＯＳターミネーターの塩基配列を示す。
　これらのターミネーターの塩基配列は、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を終結させる機能を有する限り、それぞれ、配列番号１９～２２の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号１９～２２の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
　ターミネーターの塩基配列が、それぞれ配列番号１９～２２の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号１９～２２の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
　ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
　配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００　（１）
　本実施形態の発現システムは、目的タンパク質の発現カセットが、２個のターミネーターを含んでいることが好ましい。実施例において後述するように、目的タンパク質の発現カセットが３個以上のターミネーターを含んでいる場合よりも、２個のターミネーターを含んでいる場合のほうが、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
　また、本実施形態の発現システムにおいて、目的タンパク質の発現カセットが含むターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであることが好ましい。
　実施例において後述するように、ターミネーターとしてシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターを含む発現システムは、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
　実施例において後述するように、本実施形態の発現システムにより、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上の目的タンパク質を発現させることができる。この発現量は、現在商用で用いられているｍａｇｎＩＣＯＮシステムと同等である。
　また、実施例において後述するように、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムは宿主がタバコ属の植物に限られているのに対し、本実施形態の発現システムは、タバコ属の植物だけでなく、タバコ属以外の植物においても目的タンパク質の高い発現量を達成することができる。ここで、タバコ属以外の植物としては、例えば、トマト、ナス、トウガラシ等のナス科植物、レタス等のキク科植物、メロン等のウリ科植物、コチョウラン等のラン科植物等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片は、プロモーターと、目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む。
　プロモーターとしては、宿主の植物細胞中でその下流に連結されたＤＮＡの転写活性を示すものであれば特に制限されず用いることができる。具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター等が挙げられる。
　目的タンパク質としては、特に制限されず、任意のタンパク質を発現することができる。本実施形態の発現システムによれば、動物細胞を用いたタンパク質発現と比較して低コストでタンパク質を発現させることができる。また、本実施形態の発現システムは、大腸菌等の発現系で発現させることが難しい花粉アレルゲン等の発現に利用することができる。このため、目的タンパク質は、例えば花粉アレルゲン等であってもよい。
　ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与する塩基配列からなる。ターミネーターとしては、１種のターミネーターを２個以上連結して用いてもよいし、２種以上のターミネーターを組み合わせて用いてもよい。実施例において後述するように、本実施形態の発現システムは、２個以上連結されたターミネーターを有することにより、目的タンパク質の高い発現量を達成することができる。
　また、ターミネーターのうち少なくとも１つがシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであると、目的タンパク質の発現量を更に増加させることができる傾向にある。
　第１の核酸断片は、プロモーター、目的タンパク質をコードする核酸断片、ターミネーターのほかにも、例えば５’－ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ）、ポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。
　５’－ＵＴＲを有することにより、目的タンパク質の発現効率がさらに上昇する場合がある。５’－ＵＴＲとしては、例えばタバコモザイクウイルスの５’－ＵＴＲ、シロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ、シロイヌナズナ伸長因子１α－Ａ３遺伝子の５’－ＵＴＲ、イネアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ等が挙げられる。
　本実施形態の発現システムにおいて、第２の核酸断片は、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む。Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットは、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質を宿主植物細胞内で発現することができる限り特に制限されず、プロモーター、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸断片、ターミネーター、５’－ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。ここで、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質のプロモーターとしては、第１の核酸断片に用いることができるものとして上述したもののほか、例えばジェミニウイルス由来のＬＩＲにもプロモーター活性があるためこれを利用してもよい。
　本明細書において、「発現システム」とは、第１の核酸断片及び第２の核酸断片を組み合わせて植物細胞に導入することにより、目的タンパク質を発現させることができる系のことを意味する。発現システムは、本発明の効果が得られる限り、１個の核酸断片により構成されていてもよいし、２個以上の核酸断片の組み合わせにより構成されていてもよい。ここで、核酸断片はベクターであってもよい。
　すなわち、本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片及び第２の核酸断片は、それぞれ独立した核酸断片として別個に存在していてもよいし、連結して１本の核酸断片を構成していてもよい。
　また、第１の核酸断片及び第２の核酸断片が連結している場合、その連結の順序は特に限定されず、５’側に第１の核酸断片が存在していてもよいし、５’側に第２の核酸断片が存在していてもよい。
　本実施形態の発現システムにおいて、ＬＩＲ、ＳＩＲ、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡは、ジェミニウイルス由来のものを用いる。ジェミニウイルスとしては、ローリングサークル型ＤＮＡ複製機構を有するものであれば特に限定されず、例えば、ジェミニウイルス科マストレウイルス属のインゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）、バラ葉巻ウイルス（ＲＬＣＶ）等が挙げられる。
　配列番号２３にジェミニウイルス由来のＬＩＲの塩基配列を示す。また、配列番号２４にジェミニウイルス由来のＳＩＲの塩基配列を示す。また、配列番号２５にジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質（ＢｅＹＤＶの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＣ１及びＣ２）の塩基配列を示す。
　ＬＩＲの塩基配列、ＳＩＲの塩基配列及びＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする塩基配列は、前記塩基配列にコードされるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質により、ＬＩＲとＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットが高いコピー数で複製される機能を有する限り、それぞれ、配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号２３、２４、２５の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
　ＬＩＲの塩基配列、ＳＩＲの塩基配列及びＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする塩基配列が、それぞれ配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
　ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば、上述した式（１）にしたがって求めることができる。
　本実施形態の発現システムは、遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備えていてもよい。これにより、目的タンパク質の発現量を更に増加させることができる。遺伝子サイレンシング阻害因子としては、例えば、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９、タバコラットルウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子１６Ｋ等が挙げられる。
　第３の核酸断片は、上述した第１の核酸断片、第２の核酸断片とは独立した核酸断片として別個に存在していてもよいし、第１の核酸断片又は第２の核酸断片と任意の順序で連結していてもよいし、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が任意の順序で連結していてもよい。すなわち、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれていてもよい。
　本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が単一のベクターに含まれており、当該ベクターはＴ－ＤＮＡのＲＢ及びＬＢを更に備えており、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が、Ｔ－ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に存在していてもよい。
　Ｔ－ＤＮＡとは、双子葉植物の腫瘍であるクラウンゴールの病原細菌であるアグロバクテリウムの病原性株に見出されるＴｉプラスミドやＲｉプラスミドが有する特定領域である。Ｔ－ＤＮＡを有するアグロバクテリウムを植物細胞と共存させると、ＲＢとＬＢとの間に存在する核酸断片を宿主植物細胞内に移行させる。
　したがって、ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターをアグロバクテリウムに導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、宿主植物細胞内に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片を容易に導入することができる。
　ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターは、バイナリーベクター法に用いることができるベクターであることが好ましい。
　バイナリーベクター法とは、Ｔｉプラスミドの本来のＴ－ＤＮＡを除去したｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドと、人工のＴ－ＤＮＡを有する小型のシャトルベクターを利用する植物への遺伝子導入法である。ここで、シャトルベクターは大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持できるものが好ましい。
　ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、本来のＴ－ＤＮＡを有しないため、植物にクラウンゴールを形成することができない。しかしながら、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、Ｔ－ＤＮＡを宿主植物細胞内に導入するために必要なｖｉｒ領域を有している。
　このため、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに、所望の核酸断片を有するＴ－ＤＮＡを導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、所望の核酸断片を容易に宿主植物細胞内に導入することができる。
　すなわち、ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターは、大腸菌用の複製起点と、アグロバクテリウム用の複製起点を有しており、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持することができるシャトルベクターであってもよい。
　配列番号２６にＴ－ＤＮＡのＲＢの塩基配列を示す。また、配列番号２７にＴ－ＤＮＡのＬＢの塩基配列を示す。
　ＲＢ及びＬＢの塩基配列は、ＲＢとＬＢとの間に存在する核酸断片を宿主植物細胞内に移行させる機能を有する限り、それぞれ、配列番号２６及び２７の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号２６及び２７の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
　ＲＢ及びＬＢの塩基配列が、それぞれ配列番号２６及び２７の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号２６及び２７の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
　ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば、上述した式（１）にしたがって求めることができる。
［発現ベクター］
　１実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクターを提供する。
　本実施形態の発現ベクターは、上述した発現システムの作製に好適に用いることができる。実施例において後述するように、本実施形態の発現ベクターは、発現カセットのマルチクローニングサイトに目的タンパク質をコードする遺伝子断片を導入することにより、非常に高い目的タンパク質の発現量を達成することができる。これは、発現カセットが２個以上連結されたターミネーターを含んでいることによる。
　本実施形態の発現ベクターは、発現カセットが、２個のターミネーターを含んでいることが好ましい。実施例において後述するように、発現カセットが３個以上のターミネーターを含んでいる場合よりも、２個のターミネーターを含んでいる場合のほうが、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
　また、本実施形態の発現ベクターにおいて、発現カセットが含むターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであることが好ましい。
　実施例において後述するように、ターミネーターとしてシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターを含む発現ベクターは、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
　本実施形態の発現ベクターにおいて、ＬＩＲ、ＳＩＲ、プロモーター、ターミネーターについては上述したものと同様である。すなわち、本実施形態の発現ベクターにおいて、ジェミニウイルスは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）であってもよい。
　本明細書において、マルチクローニングサイトとは、制限酵素に認識される１種又は複数の塩基配列が並んだ領域である。すなわち、本実施形態の発現ベクターのマルチクローニングサイトにおいて、制限酵素部位は１個であってもよいし、複数であってもよい。本実施形態のベクターは、マルチクローニングサイトを有することから、目的タンパク質をコードする核酸断片を容易にクローニングすることができる。
　本実施形態の発現ベクターは、目的タンパク質をコードする核酸断片を含んでいなくてもよいし、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入されていてもよい。すなわち、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入されたベクターも本実施形態の発現ベクターに含まれる。
　本実施形態のベクターは、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含んでいてもよい。Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質については上述したものと同様である。
　本実施形態のベクターは、遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含んでいてもよい。遺伝子サイレンシング阻害因子については、上述したものと同様であり、例えば、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９であってもよい。
　本実施形態のベクターは、Ｔ－ＤＮＡのＲＢ及びＬＢを更に備えており、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が、Ｔ－ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に存在していてもよい。ＲＢとＬＢは上述したものと同様である。また、本実施形態のベクターは、バイナリーベクター法に用いることができるベクターであることが好ましい。
［目的タンパク質の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に上述した発現システムを導入する工程を備える、製造方法を提供する。ここで、発現システムは、上述したベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質をコードする遺伝子断片が導入されたものであってもよい。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、タバコ属植物及びタバコ属以外の植物を宿主として、高い発現量で目的タンパク質を製造することができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（レタスにおける一過性発現）
　まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株を、抗生物質（１００ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシン）を添加したＹＥＢ培地（６ｇ／Ｌイーストエキストラクト、５ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌスクロース、２ｍＭ硫酸マグネシウム）中、２８℃で２日間培養した。
　続いて、２日間培養した培養物を上記と同じ培地で１００倍希釈し、ＭＥＳを終濃度１０ｍＭとなるように添加してｐＨを５．６に調製し、更にアセトシリンゴンを終濃度２０μＭとなるように添加して、１４０ｒｐｍに設定したロータリーシェーカーを用いて２８℃で１８～２４時間培養してスケールアップした。
　続いて、ＯＤ５９５が約２．４に達した後、スクロースを終濃度５５ｇ／Ｌとなるように添加し、更にアセトシリンゴンを終濃度２００μＭとなるように添加し、２２℃で１時間インキュベートした。
　その後、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、更にＴｗｅｅｎ－２０を終濃度０．００５％となるように添加し、バキュームインフィルトレーションに用いた。
　続いて、市販のレッドリーフレタスを蒸留水で洗浄し、ペーパータオルで水を除去した。続いて、洗浄したレタスの基部を湿ったペーパータオルに乗せた。続いて、レタスをプラスチックラップで覆い、２４度で１日静置した。続いて、バキュームインフィルトレーションの前に、レタスに青色ＬＥＤライトを３０分間以上照射した。
　続いて、図１（ａ）に示すように、約１．２Ｌのアグロバクテリウム懸濁液を２Ｌのグラスビーカーに入れ、バキュームデシケーター内に設置した。続いて、図１（ｂ）に示すように、レタスをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力に設定して２０分間静置した。続いて、圧力を大気圧に戻し、レタスを水で洗浄した。
　続いて、ペーパータオルで水を除去した。続いて、洗浄したレタスの基部を湿ったペーパータオルで覆い、図１（ｃ）に示すようにレタスをボウルに入れた。続いて、図１（ｄ）に示すように、レタスをプラスチックラップで不完全に覆い、穴が開いた状態にした。レタスは、２４℃で１６時間明期及び８時間暗期の条件下で３～５日間静置した。
（ベンサミアナタバコ、トマト、ナス、トウガラシ、メロン、バラ及びコチョウランにおける一過性発現）
　まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株を、１０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、２０μＭアセトシリンゴン、１００ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシンを添加したＬ－ブロス培地中、２８℃で静止期まで培養した。
　続いて、培養物を遠心分離してアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収した後、インフィルトレーションバッファー（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、１００μＭアセトシリンゴン）を用いてＯＤ６００が約１となるように懸濁した。続いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスをこの液体中に２～３時間放置した。
　その後、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を、ニードルを付けていない１ｍＬのシリンジを用いて４週齢のベンサミアナタバコの葉の裏側にインフィルトレーションした。あるいは、場合により、ベンサミアナタバコをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で２０分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりインフィルトレーションした。また、同じ懸濁液を、４週齢のトマトの葉、４週齢のナスの葉、４週齢のトウガラシの葉、３週齢のメロンの葉、市販のバラの花弁、市販のコチョウランの花弁に同様にインフィルトレーションした。また、同じ懸濁液を、ニードルを付けた１ｍＬのシリンジを用いてトマトの果実にインフィルトレーションした。
（ベクターの作製）
《ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ａ）はｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクター（米国アリゾナ州立大学Ｍａｓｏｎ博士より分与された。）のＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。既知のベクターであるｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の複製システムを有している。また、ｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９の発現カセットを有している。
　まず、プライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰ－Ｆ、配列番号１）及びプライマー（ＥＧＦＰ－ｐＢＹＲ２ｆｐ－Ｒ、配列番号２）を用いてｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ｆｐベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターを作製した。
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｂ）はｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ｆｐベクターに、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを有するＥＧＦＰ遺伝子断片を導入した。
　具体的には、まず、プライマー（ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰ－Ｆ、配列番号３）及びプライマー（ＥＧＦＰ－ｐＲＩ２０１－Ｒ、配列番号４）を用いてＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
　続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断したｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ社）にクローニングし、ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰベクターを作製した。
　続いて、ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰベクターを鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＡｔＡＤＨ－Ｆ、配列番号５）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＨＳＰｔｅｒ－Ｒ、配列番号６）を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを有するＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
　続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ｆｐベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを作製した。配列番号２８にｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの全長の塩基配列を示す。
《ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｃ）はｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ＥＥ－Ｅｘｔ３－Ｆ、配列番号７）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＥＥ－Ｅｘｔ３－Ｒ、配列番号８）を用いて、タバコエクステンシン遺伝子ターミネーターをＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが２個連結したものであった。
《ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｄ）はｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターをプライマー（ｐＢＹＲ２Ｈ－ＨＳＰｔｅｒ－Ｆ、配列番号９）及びｐＢＹＲ２Ｈ－ＨＳＰｔｅｒ－Ｒ、配列番号１０）を用いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを鋳型としてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターが２個連結したものであった。
《ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｅ）はｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰからタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを除去するため、制限酵素ＸｍａＩ及びＣｌａＩで切断した。ＳＩＲ－Ｃ２をプライマー（ＨＳＰｔｅｒ－ＳＩＲ－Ｆ、配列番号１１）及びプライマー（Ｃ１－ＣｌａＩ－Ｃ２－Ｒ、配列番号１２）を用いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。上記ＸｍａＩ及びＣｌａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰにクローニングし、ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを１個有するものであった。
《ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｆ）はｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２Ｔ－３５Ｓｔｅｒ－Ｆ、配列番号１３）及びプライマー（３５Ｓｔｅｒ－ＮＯＳｔｅｒ－Ｒ、配列番号１４）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚ（Ｍａｒｋｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＮＯＳターミネーターはプライマー（３５Ｓｔｅｒ－ＮＯＳｔｅｒ－Ｆ、配列番号１５）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＮＯＳｔｅｒ－Ｒ、配列番号１６）を用いて、ｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ社）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰを作製した。ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター及びＮＯＳターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。
《ｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｇ）はｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２Ｔ－３５Ｓｔｅｒ－Ｆ、配列番号１３）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－３５Ｓｔｅｒ－Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを１個有するものであった。
《ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｈ）はｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－３５Ｓｔｅｒ－Ｆ、配列番号１８）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－３５Ｓｔｅｒ－Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーター及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。
《ｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターの作製》
　図２（ｉ）はｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－３５Ｓｔｅｒ－Ｆ、配列番号１８）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－３５Ｓｔｅｒ－Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター及び、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。
　図２（ａ）～（ｉ）中、「３５Ｓ－ｐ×２」はエンハンスエレメントを２つ有するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを意味し、「ＴＭＶΩ」はタバコモザイクウイルスの５’－ＵＴＲを意味し、「ＡｔＡＤＨ５’」はシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲを意味し、「ＥＧＦＰ」はｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ－ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味し、「ＬＩＲ」はインゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）ゲノムのＬｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「ＳＩＲ」はＢｅＹＤＶゲノムのＳｈｏｒｔ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「Ｃ１」及び「Ｃ２」はＢｅＹＤＶの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＣ１及びＣ２を意味し、「ＬＢ」及び「ＲＢ」はそれぞれＴ－ＤＮＡの左側ボーダー配列及び右側ボーダー配列を意味し、「Ｎｏｓ－ｐ」はＮＯＳプロモーターを意味し、「ｐ１９」はトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする遺伝子を意味する。
［実験例１］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較１）
　ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターは、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターのＴＭＶΩがシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲに置き換えられ、更にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターが挿入された、ターミネーターを２つ有するベクターであった。
　下記表１にｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターの概要を示す。表１中、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、ベンサミアナタバコの葉、レタスの葉、ナスの葉、トマトの果実、トマトの葉、トウガラシの葉、メロンの葉、バラの花弁及びコチョウランの花弁にそれぞれ導入した。
　ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に青色ＬＥＤを照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ－５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰの蛍光を観察した。
　図３（ａ）～（ｉ）は、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図３（ａ）～（ｉ）において、スケールバーは１ｃｍを示す。図３（ａ）はベンサミアナタバコの葉の結果であり、図３（ｂ）はレタスの葉の結果であり、図３（ｃ）はナスの葉の結果であり、図３（ｄ）はトマトの果実の結果であり、図３（ｅ）はトマトの葉の結果であり、図３（ｆ）はトウガラシの葉の結果であり、図３（ｇ）はメロンの葉の結果であり、図３（ｈ）はバラの花弁の結果であり、図３（ｉ）はコチョウランの花弁の結果である。いずれの写真においても、左側がｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを導入した結果であり、右側がｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターを導入した結果である。
　その結果、バラを除いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの導入により、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターの導入よりもＥＧＦＰの発現量が増加したことが明らかとなった。バラにおいてはいずれのベクターを導入した場合においてもＥＧＦＰの蛍光が認められなかった。
　また、特に、トマトの果実及びトマトの葉においては、ＥＧＦＰの蛍光はｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを導入した場合のみにおいて観察され、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターの導入では、ＥＧＦＰの蛍光はほとんど観察されなかった。
　この結果から、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを１個有するｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターよりも、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの２個のターミネーターを有するｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。
［実験例２］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較２）
　ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉、レタスの葉、ナスの葉、トマトの葉、トウガラシの葉及びバラの花弁にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。
　続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）、並びに、レタスの葉、ナスの葉、トマトの葉、トウガラシの葉及びバラの花弁それぞれ１ｍｇ新鮮重量から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。
　続いて、調製したタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。
　また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥしたゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロット解析により、ＥＧＦＰタンパク質を検出した。
　図４（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図４（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、「ＧＦＰ」は、市販されている精製されたＧＦＰタンパク質（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を意味する。また、図４（ｂ）は、図４（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図４（ｃ）は、図４（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図４（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。
　また、図５（ａ）はレタスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図５（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないレタスの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図５（ｂ）は、図５（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図５（ｃ）は、図５（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図５（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。
　また、図６（ａ）はナスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図６（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないナスの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図６（ｂ）は、図６（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図６（ｃ）は、図６（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図６（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。
　また、図７（ａ）はトマトの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。図７（ａ）中、「ＮＴ」はベクターを導入していないトマトの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図７（ｂ）はトウガラシの葉及びバラの花弁から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。図７（ｂ）中、「ＮＴ」はベクターを導入していないトウガラシの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。
　その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした植物では、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした植物よりもＥＧＦＰの発現量が顕著に増加したことが明らかとなった。
　具体的には、ＥＧＦＰの発現量を定量した結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコでは、１ｇ新鮮重量中に３．７ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコでは、１ｇ新鮮重量中に１．５ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。
　同様に、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたレタスでは、１ｇ新鮮重量中に０．３７ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたレタスでは、１ｇ新鮮重量中に０．２０ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。
　また、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたナスでは、１ｇ新鮮重量中に０．４６ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたナスでは、１ｇ新鮮重量中に０．４２ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。
　トマトの葉、トウガラシの葉、バラの花弁では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色において、明確なＥＧＦＰのバンドが観察されなかった。このため、これらのサンプルではイムノブロット解析のみ行った。
　その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたトマトの葉及びトウガラシの葉では、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした場合と比較してＥＧＦＰの発現量の顕著な増加が認められた。
　また、バラの花弁においては、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしてイムノブロット解析した場合においてもＥＧＦＰの発現は検出されなかった。
　以上の結果から、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを１個有するｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクターよりも、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの２個のターミネーターを有するｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。また、この発現システムがタバコだけでなくタバコ属以外の複数の種の植物においても機能することが明らかとなった。
［実験例３］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較１）
　ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクター、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを３個有する、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。
　下記表２に各ベクターの概要を示す。表２中、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ－ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に励起光を照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ－５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰの蛍光を観察した。
　図８（ａ）～（ｅ）は、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図８（ａ）～（ｅ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。
　その結果、ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｔ－ＥＧＦＰベクターよりも、ターミネーターを２個以上有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。
［実験例４］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較２）
　ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。
　続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。
　図９（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図９（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図９（ｂ）は、図９（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図９（ｂ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。
　その結果、ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ－ＥＧＦＰベクターよりも、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの方がＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。また、ＥＧＦＰの発現量は、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコにおいて、１ｇ新鮮重量中３．７ｍｇに達したことが明らかとなった。
［実験例５］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較３）
　ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ－ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ－ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを３個有するｐＢＹＲ２ＨＴＳ－ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。
　続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。
　図１０（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図９（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図１０（ｂ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。
　また、下記表３に、本実験例で使用した各ベクターの概要及びＥＧＦＰの発現量を示す。表３中、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ－ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。また、ＥＧＦＰの発現量は平均値±標準偏差で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、いずれのベクターにおいても、高いＥＧＦＰの発現が認められた。具体的には、いずれのベクターにおいても、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上のＥＧＦＰの発現が認められた。また、ターミネーターを２個有するベクターの方が、ターミネーターを３個有するベクターよりも、ＥＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。また、ターミネーターにシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを含むベクターは、ＥＧＦＰの発現量が特に高い傾向が認められた。特に、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターでは、植物体１ｇ新鮮重量あたり４ｍｇ程度のＥＧＦＰの発現が認められた。
［実験例６］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現レベルの比較）
　上述したように、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムは、現在商用で用いられている発現システムであり、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上の目的タンパク質を発現させることができることが知られている。そこで、上述したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現レベルを比較した。
　図１１は、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムを利用した発現ベクターである、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクター（Ｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＫｌｉｍｙｕｋ博士より分与された。）の構造を示す模式図である。
　図１１中、「ＲＢ」及び「ＬＢ」はそれぞれＴ－ＤＮＡの右側ボーダー配列及び左側ボーダー配列を意味し、「Ａｃｔ２」はシロイヌナズナ由来のＡｃｔ２プロモーターを意味し、「Ω」はタバコモザイクウイルス由来の５’－ＵＴＲのΩ配列を意味し、「ＲｄＲｐ」は、トバモウイルス（ターニップベインクリアリングウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを意味し、「ＭＰ」はｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「ＧＦＰ」はｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「ＮＴＲ」はｃｒ－ＴＭＶ（アブラナ科植物感染性トバモウイルス）由来の３’－ＵＴＲを意味し、「Ｎｏｓ－ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。また、「ＲｄＲｐ」及び「ＭＰ」のドットを付したボックスで示す領域はイントロンを意味する。
　ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクター及びＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、４週齢又は５週齢のベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。
　ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰ又はＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に青色ＬＥＤを照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ－５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した。
　図１２（ａ）及び（ｂ）は、発現したＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図１２（ａ）及び（ｂ）において、スケールバーは１ｃｍを示す。図１２（ａ）は４週齢のベンサミアナタバコの葉の結果であり、図１２（ｂ）は５週齢のベンサミアナタバコの葉の結果である。図１２（ａ）及び（ｂ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。図１２（ａ）及び（ｂ）中、「４ｗｏ」は４週齢の結果であることを示し、「５ｗｏ」は５週齢の結果であることを示す。
　その結果、４週齢及び５週齢のいずれのベンサミアナタバコの葉を用いた場合においても、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを導入した方が、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを導入するよりも、ＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。
　続いて、各ベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。
　図１３（ａ）は各ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図１３（ａ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。また、図１３（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰ又はＧＦＰタンパク質を示し、「４ｗｏ」は４週齢の結果であることを示し、「５ｗｏ」は５週齢の結果であることを示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。
　また、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）におけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図１３（ｂ）のグラフの数値は４週齢及び５週齢のベンサミアナタバコにおけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量の平均値±標準偏差で示す。また、図１３（ｂ）中、「＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを導入した方が、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを導入するよりも、タンパク質の発現量が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターによるタンパク質の発現量が、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現量よりも高いことを示す。
　本発明によれば、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することができる。

Claims (17)

  1. 　ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、
    　ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、
    　前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
  2. 　前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１に記載の発現システム。
  3. 　前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１又は２に記載の発現システム。
  4. 　遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備える、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現システム。
  5. 　前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項４に記載の発現システム。
  6. 　前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、請求項４又は５に記載の発現システム。
  7. 　Ｔ－ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ－ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項６に記載の発現システム。
  8. 　前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１～７のいずれか一項に記載の発現システム。
  9. 　目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に請求項１～８のいずれか一項に記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
  10. 　ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクター。
  11. 　前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１０に記載の発現ベクター。
  12. 　前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１０又は１１に記載の発現ベクター。
  13. 　ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  14. 　遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  15. 　前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項１４に記載の発現ベクター。
  16. 　Ｔ－ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ－ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  17. 　前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
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