JP2003529353A - ケストルムイエローリーフカーリングウイルスプロモーター - Google Patents

ケストルムイエローリーフカーリングウイルスプロモーター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、関連ヌクレオチド配列の転写のプロモーターとして機能する新規ＤＮＡ配列を記載する。より具体的には、本発明は、関連ヌクレオチド配列に構成的発現を付与するＤＮＡ配列を記載する。本発明はまた、そのようなプロモーター配列を含む組換え体ＤＮＡ配列を記載する。当該組換え体ＤＮＡ配列を使用し、トランスジェニック植物、特にすべての時間にそしてほとんどの組織及び器官で所望のヌクレオチド配列を発現させる植物を作出しうる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、植物の関連ヌクレオチド配列（associated nucleotide sequence）
の転写のプロモーターとして機能する新規ＤＮＡ配列に関する。より具体的には
、本発明は、所望の関連ヌクレオチド配列に構成的発現を付与する新規プロモー
ターに関する。
【０００２】 農業の分野では、人間の必要に従って植物を修飾する連続的な願望が存在する
。これを達成するための一つの方法は、現代の遺伝子工学を使用することによる
。例えば、植物に所望の遺伝子を導入することによって、該植物を特異的に修飾
し、望ましい表現型形質を発現させる。このために、植物をプロモーター領域、
コード領域及び終結領域を含むヘテロロガス遺伝子で最も普通に形質転換する。
植物での発現のための、ヘテロロガス遺伝子を遺伝的に改変するとき、プロモー
ターの選択は重要なファクターである。特定の刺激に応答した、又は特定の細胞
又は組織に限定されてのみ、ある種の遺伝子を発現させることが望ましい一方、
別の遺伝子は構成的に、すなわちすべての時に植物にわたり、そしてほとんどの
組織及び器官で発現させることがより望ましくあり得る。
【０００３】 過去に、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター）が、植物でのヘテロロガス遺伝子の構成的発現のために、
広く使用された。しかし、別のプロモーターを使用することが望まれる機会が存
在する。従って、本発明の主な目的は、植物での所望のヌクレオチド配列の発現
のためのそのような代替的なプロモーターを提供することである。本発明はまた
、本発明のプロモーターを含む、組換え体ＤＮＡ分子、発現ベクター及びトラン
スジェニック植物を提供する。
【０００４】 本発明はこうして： 関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することのできるＤＮＡ配列であって、ここ
で、当該ＤＮＡ配列がケストルムイエローリーフカーリングウイルス（Cestrum
yellow leaf curling virus, CmYLCV)のゲノムから得られ得るもの、を提供する
。ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターから得られ得る、そして配列番号１に
示すヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ配列が好ましい。
【０００５】 特に、ＤＮＡ配列を提供し、ここで ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号２に示すヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号５に示すヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号６に示すヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列
番号５又は配列番号６のいずれかに、ストリンジェント条件下でハイブリダイズ
し、とくにここで、前記のＤＮＡ配列は配列番号１９又は配列番号２０に示すヌ
クレオチド配列を含む。
【０００６】 本発明はさらに、配列番号１の、少なくとも５０ｎｔ、好ましくは約４００塩
基と約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、
そして最も好ましくは約３５０塩基の長さの連続的範囲（consecutive stretch
）を含む、ＤＮＡ配列を提供し、ここで当該ＤＮＡ配列は関連ヌクレオチド配列
の発現を駆動することができる。
【０００７】 本発明の特定の実施態様では、少なくとも５０ｎｔの、好ましくは約４００塩
基と約６５０塩基の間の、より好ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、
そして最も好ましくは約３５０塩基の長さの、当該連続的範囲は、配列番号１の
少なくとも５０ｎｔの、好ましくは約４００塩基と約６５０塩基の間の、より好
ましくは約２００塩基と約４００塩基の間の、そして最も好ましくは約３５０塩
基の長さの、対応する連続的範囲と、少なくとも７５％、好ましくは８０％、よ
り好ましくは９０％、そして最も好ましくは、９５％配列同一性を有する。
【０００８】 本発明はさらに、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスから単離され
る完全長転写物プロモーター領域を含む組換え体ＤＮＡ分子を提供する。加えて
、本発明は、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明に従うＤＮ
Ａ配列を含む、組換え体ＤＮＡ分子及びＤＮＡ発現カセットを提供する。本発明
はまた、当該組換え体ＤＮＡ及び発現カセットをそれぞれ含む、ＤＮＡ発現ベク
ターを提供する。
【０００９】 特に、組換え体ＤＮＡ分子及びＤＮＡ発現カセットを提供し、ここで、所望の
ヌクレオチド配列はコード配列を含み、特にここで、 ・該コード配列は、望まれる表現型形質をコードする ・該コード配列は、選択又はスクリーニングマーカー遺伝子をコードする ・該コード配列は、抗生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性
、又は他の有害生物に対する抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、生産加工での高成
績又は再生可能性の変化を付与するタンパク質をコードする
【００１０】 ・該コード配列は、当該コード配列で形質転換された細胞に正の選択的優位性を
付与するタンパク質をコードする ・該コード配列は、当該コード配列で形質転換された細胞に代謝優位性を付与す
るタンパク質であって、化合物を代謝することのできるものからなるものをコー
ドし、ここで、当該化合物はマンノース又はキシロース又はそれらの誘導体又は
前駆物質、又はタンパク質の基質であり、又は当該コード配列で形質転換された
細胞によって、そのような基質に代謝されることができる
【００１１】 ・当該コード配列は、キシロイソメラーゼ、フォスフォマンノ−イソメラーゼ、
マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ、マンノース−１−フォスフェー
トイソメラーゼ、フォスフォマンノ−ムターゼ、マンノースエピメラーゼ、マン
ノース又はキシロースフォスファターゼ、マンノース−６−フォスファターゼ、
マンノース−１−フォスファターゼ及びマンノース又はキシロースパーミアーゼ
をコードする ・該コード配列は、フォスフォマンノイソメラーゼをコードする ・該コード領域は非翻訳である ・該非翻訳コード領域は、ウイルス遺伝子由来の、特にＴＳＭＶ由来、より特に
ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子由来である ・該コード配列は、商業的に有益な酵素、又は植物での代謝物をコードする ・該コード配列は、アンチセンス方向である。
【００１２】 本発明はまた、前記のＤＮＡ配列又は組換え体ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ発現ベ
クターを提供する。本発明の特定の実施態様では、当該ＤＮＡ発現ベクターはｐ
ＮＯＶ２８１９又はｐＮＯＶ２８１９である。さらに所望のヌクレオチド配列に
作動可能に連結された本発明に従う第１のＤＮＡ配列、及び所望のヌクレオチド
配列に作動可能に連結された本発明に従う第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベ
クターを提供する。本発明の特定の実施態様では、前記のＤＮＡ発現ベクターは
ウイルスゲノムの発現を変化させることができる。
【００１３】 なおより特定の実施態様では、前記のＤＮＡ発現ベクターは、当該ウイルスゲ
ノムのセンスＲＮＡフラグメント又はその部分を細胞で発現することのできる第
１のＤＮＡ配列及び当該ウイルスゲノムのアンチセンスＲＮＡフラグメント又は
その部分を細胞で発現することのできる第２のＤＮＡ配列を含み、ここで、当該
センスＲＮＡフラグメント及び当該アンチセンスＲＮＡフラグメントは二本鎖Ｒ
ＮＡを形成することができる。
【００１４】 前記のように発現ベクターを提供し、ここで ・当該ウイルスは、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテックスウイルス、ト
バモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、クロステオ
ルウイルス（closteorviruses）、トンブスウイルス及びフロウイルスからなる
群より選択される ・当該ＤＮＡ配列は、ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャ
プシタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、又はウイルスムーブメン
トタンパク質遺伝子又はそれらの部分から由来するヌクレオチド配列を含む ・当該ＤＮＡ配列は、トマト黄化えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ）に由来する ・当該ＤＮＡはヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子に由来する
【００１５】 本発明はさらに、 本発明に従う、ＤＮＡ配列、組換え体ＤＮＡ分子又はＤＮＡ発現ベクターで安定
的に形質転換された宿主細胞を提供する。特に、ここで ・該宿主細胞は細菌である ・該宿主細胞は植物細胞である ・該宿主細胞は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ
、スイートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベツ
、カリフラワー、ブロコッリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス
、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ（squash,pumpkin)、ア
サ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ
、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナ
ップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、
サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワ
タ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidopsis thaliana、及
び樹木植物、例えば、針葉樹、落葉樹、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、オオ
ムギ、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマ
ト、テンサイ、ヒマワリ、又はワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、Sorghum bi
color、オーチャードグラス、テンサイ、及びダイズ細胞からなる群より選択さ
れる。
【００１６】 ・該宿主細胞は双子葉植物からの植物細胞である ・該宿主細胞はダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ及びナタネからなる群より選択
される双子葉植物細胞である ・該宿主細胞は、単子葉植物からの植物細胞である ・該宿主細胞は、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ライムギ、エンバク、シバ
クサ(turf grass)、イネ、及びオオムギからなる群より選択される単子葉植物か
らの植物細胞である。
【００１７】 加えて、本発明に従う、ＤＮＡ配列、組換え体ＤＮＡ分子又はＤＮＡ発現ベク
ターで安定的に形質転換された、植物及び種子を含むその後代を提供する。特に
ここで、 ・該植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、ス
イートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベツ、カ
リフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タ
マネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ（squiash,pumpkin)、アサ、
ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネ
クタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップ
ル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サト
ウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、
アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidopsis thaliana、及び樹
木植物、例えば、針葉樹、落葉樹、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ
、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマト、
テンサイ、ヒマワリ、又はワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、Sorghum bicolo
r、オーチャードグラス、テンサイ、及びダイズ細胞からなる群より選択される
。
【００１８】 本発明はさらに、 ・所望のヌクレオチド配列を発現する本発明に従うＤＮＡ配列の使用 ・本発明に従うＤＮＡ配列を生産する方法であって、ここで該ＤＮＡがポリメラ
ーゼ連鎖反応によって生産される、方法であって、ここで、使用される少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドが配列番号１の１５、１８、２０、２２、２４又は
より多い塩基対の連続範囲を示すものを含むもの を開示する。
【００１９】 明細書及び請求の範囲の明確そして矛盾のない理解を確保するために、以下の
定義を提供する： ＣｍＹＬＣＶ：ケストルムイエローリーフカーリングウイルス ＤＮＡシャッフリング：ＤＮＡシャッフリングは、急速、容易、そして効率的に
、好ましくは無作為に、ＤＮＡ分子に、再編制を導入するための方法、又は２又
は３以上のＤＮＡ分子の間に、好ましくは無作為にＤＮＡ配列の交換を生じる、
方法である。ＤＮＡシャッフリグから得られるＤＮＡ分子は、少なくとも１テン
プレートＤＮＡ分子に由来する天然に存在しないＤＮＡ分子である、シャッフル
されたＤＮＡ分子である。
【００２０】 発現：は、植物中で外生遺伝子又は導入遺伝子の転写及び／又は翻訳を意味す
る。アンチセンス構築物の場合、例えば、発現は、アンチセンスＤＮＡの転写の
みを意味し得る。 機能的に同等な配列：は、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター又はその部分
に実質的に類似するプロモーター活性を有する、そしてストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件で当該プロモーター配列とハイブリダイズする、ＤＮＡ配
列を意味する。
【００２１】 遺伝子：は、コード配列及び関連調節配列であって、ここで該コード配列がＲ
ＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、又
はアンチセンスＲＮＡに転写されるものを意味する。調節配列の例は、プロモー
ター配列、５’及び３’非翻訳配列及び終結配列である。存在し得るさらなるエ
レメント、例えば、イントロンが存在し得る。
【００２２】 所望の遺伝子：は植物に移入されたとき、外植物に望まれる特性、例えば、抗
生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性、又は他の有害生物へ
の抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、産業加工での高成績又は変化した再生可能性
を付与する任意の遺伝子を意味する。「所望の遺伝子」はまた、該植物での商業
的に有益な酵素又は代謝物の生産のために植物に移入されるものであり得る。
【００２３】 ここで使用する「ヘテロロガス」は、異なる天然又は合成起源を意味する。例
えば宿主細胞は、非翻訳宿主細胞中に存在しない核酸配列で形質転換されている
ならば、その核酸配列は、その宿主細胞についてヘテロロガスであるという。形
質転換核酸は、ヘテロロガスプロモーター、ヘテロロガスコード配列、又はヘテ
ロロガス終結配列を含み得る。又は、該形質転換核酸は、完全にヘテロロガスで
あり得、又はヘトロロガス及び外生核酸配列の任意の可能な組み合わせを含み得
る。
【００２４】 リーダー領域：転写開始部位及び翻訳開始部位の間の遺伝子の領域。 マーカー遺伝子：選択又はスクリーニング特性をコードする遺伝子を意味する。
作動可能に連結され／と関連し：調節ＤＮＡ配列は、該調節ＤＮＡ配列が該コー
ドＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように、該２配列が位置するならば、ＲＮＡ
又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列と「作動可能に連結され」又は「と関連
し」ているというものとする。
【００２５】 植物：は任意の植物、特に種子植物を意味する。 植物細胞：植物の構造及び生理学的単位であって、プロトプラスト及び細胞壁を
含むもの。植物細胞は、単離単一細胞又は培養細胞の形態で、又はより高度に組
織化された単位、例えば、植物組織又は植物器官の部分としての形態であり得る
。 植物材料：は、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、花粉管、卵、胚のう、
卵細胞、胞子体、胚、種子、挿し木、細胞又は組織培養物、又は任意の他の植物
の部分又は産物を意味する。
【００２６】 プロモーター：は関連ＤＮＡ配列の転写を開始させるＤＮＡ配列を意味する。
プロモーター領域は、また遺伝子発現のレギュレーターとして作用するエレメン
ト、例えば、アクチベーター、エンハンサー、及び／又はレプレッサーを含み得
、そして５’非翻訳リーダー配列の全部又は一部を含み得る。 組換え体ＤＮＡ分子：組換えＤＮＡ技術を使用してともに結合されているＤＮ
Ａ配列の組み合わせ。
【００２７】 組換えＤＮＡ技術：記載されるようなＤＮＡ配列をともに結合するため使用さ
れる手法、例えば、Sambrook et al., 1989, COld Spring Harbor, NY: Cold Sp
ring Harbor Laboratory Pressに記載される。 スクリーニングマーカー遺伝子：発現が選択的優位性を形質転換細胞に付与し
ないが、発現が形質転換細胞を、非形質転換細胞から表現型的に明瞭ならしめる
遺伝子を意味する。
【００２８】 選択マーカー遺伝子：は植物細胞での発現が、細胞に選択的優位性を与える遺
伝子を意味する。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞によって保有される
選択的優位性は、非形質転換細胞の成長と比較して、負の選択剤、例えば、抗生
物質又は除草剤の存在下で、成長する能力のためであり得る。非形質転換細胞と
比較して、形質転換細胞によって保有される選択的優位性はまた、養分、成長因
子又はエネルギー源として添加された化合物を利用する、増強された、又は新規
の能力のためであり得る。選択マーカー遺伝子はまた、選択剤の存在下での植物
細胞における発現が、選択剤の不存在下と比較して、形質転換植物細胞に正の影
響及び非形質転換植物細胞に負の影響、例えば、成長について有し、こうして形
質転換植物細胞に正の選択的優位性を与える、遺伝子又は遺伝子の組み合わせを
意味する。
【００２９】 配列同一性：ダイナミックプログラミングアルゴリズムに基づくコンピュータ
ープログラムを使用して決定される配列同一性のパーセンテージ。本発明の範囲
内で好ましいコンピュータープログラムは、クエリーがタンパク質又はＤＮＡで
あるかにかかわらず、すべての利用可能な配列データベースを探索するために設
計された、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool)サーチプログラム
を含む。このサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ２．０（Gapped BLAST)は、
インターネット（currently http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上で公衆に
利用可能とされた。それは帰納的アルゴリズムを使用し、それは、グローバルア
ラインメントに対して、ローカルを探し、従って単離された領域のみに共有され
る、配列間の関連性を検出することができる。ＢＬＡＳＴサーチに割り当てられ
るスコアは、良く定義された統計的解釈を有する。当該プログラムを好ましくは
、デフォルト値に対して、所望のパラメーターセットで稼動させる。
【００３０】 形質転換：は細胞への核酸の導入を意味する。特に、それは所望の生物のゲノ
ムへのＤＮＡ分子の安定的組みこみを意味する。 ＴＳＷＶ：トマト黄化えそ病ウイルス。
【００３１】 本発明は、ケストルムイエローリーフカーリングウイルス（ＣｍＹＬＣＶ）の
ゲノムから得られ得るＤＮＡ配列に関する。所望の関連ヌクレオチド配列の発現
を駆動することのできる、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターから得られ得
るＤＮＡ配列が好ましい。その機能的及び／又は構造的同等物を含むＤＮＡ配列
はまた本発明に含まれる。本発明はこうして、関連ヌクレオチド配列の転写のプ
ロモーターとして機能するＤＮＡ配列に関する。該プロモーター領域はまた、遺
伝子発現のレギュレーター、例えば、アクチベーター、エンハンサー及び／又は
レプレッサーとして作用するエレメントを含み得、そして転写されたｍＲＮＡの
５’非翻訳リーダー配列を含み得る。
【００３２】 本発明の好ましい実施態様では、当該ＤＮＡ配列は、関連ヌクレオチド配列に
構成的発現を付与する。構成的発現は、所望のヌクレオチド配列がすべての時間
で、そしてほとんどの組織及び器官で発現されることを意味する。トランジエン
ト発現アッセイでＧＵＳ又はＣＡＴレポーター遺伝子と組み合わせて試験される
とき、本発明に従うＤＮＡ配列は、ＧＵＳ又はＣＡＴレポーター遺伝子の発現の
高いレベルを付与する。こうして、本発明に従うＤＮＡ配列は、好ましくはコー
ド配列である、所望の関連ヌクレオチド配列の高レベル発現に有用である。当業
者は、所望の関連コード配列がセンス又はアンチセンス方向で発現できることを
知っている。さらに、所望のコード配列は、形質転換されるべき植物について、
ヘテロロガス又はホモロガス起源であり得る。ホモロガスコード配列の場合、本
発明に従うＤＮＡ配列は、当該配列の異所性（ectopic)発現に有用である。本発
明の特定の実施態様では、本発明に従うＤＮＡ配列の制御下の所望のコード配列
の発現は、コサプレッションと呼ばれるプロセスによって、それ自身の発現及び
該遺伝子のオリジナルコピーのそれを抑圧する。
【００３３】 本発明のプロモーターはケストルムイエローリーフカーリングウイルス（Ｃｍ
ＹＬＣＶ）ゲノムＤＮＡから得ることができ、それは例えば、感染したCestrum
parqui植物から単離できる。ＣｍＹＬＣＶ感染したCestrum parqui植物を葉のモ
ザイク及びクリンクル葉奇形によって同定する。このＤＮＡを次いで配列決定及
び分析する。データベースの配列との配列比較は、ＣｍＹＬＣＶの該ゲノム構成
がカリモウイルスファミリーの他のメンバーのひとつと関連することを示す。Ｃ
ｍＹＬＣＶは８つのオープンリーディングフレームを含む。ＣｍＹＬＣＶ遺伝子
産物の配列比較は、遺伝子Ｉ産物が細胞間移動（intracellular movements）に
関係することを示す：遺伝子Ａは未知機能の小タンパク質をコードし、遺伝子Ｂ
はアリマキ伝達因子をコードする；遺伝子Ｃはビリオン関連タンパク質をコード
し；遺伝子ＩＶは主要なキャプシドタンパク質であり；遺伝子Ｖは逆転写酵素を
コードしそして遺伝子ＶＩは完全長転写物においてウイルス遺伝子の転写をトラ
ンスに活性化する。いわゆるＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターが特に興味
深い。
【００３４】 当業者は、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの種々の領域を本発明に従
って使用できることを知っている。本発明の特定の実施態様は、ＣｍｐＤプロモ
ーターと呼ばれる、配列番号１に示すＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター領
域である。この配列は、３５０ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーター及
び３２０ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列を含む。この
配列を、ＣｍＹＬＣＶゲノムＤＮＡを配列決定することによって取得する。それ
ぞれプロモーター及びリーダー配列は、データベース中の配列ヘの比較によって
同定する。ＣｍｐＥと呼ばれる、配列番号１の変異体であって、ここで該ＣｍＹ
ＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列が、３２０ｂｐの長さであるのに代
えて、３１８ｂｐであるものを配列番号１９に示す。
【００３５】 本発明のある好ましい実施態様は、ＣｍｐＣプロモーターと呼ばれる、配列番
号２に示すＤＮＡ配列である。ＣｍｐＣプロモーターは、配列番号１に示す配列
のフラグメントであり、そして配列番号１の塩基５ないし３５０に対応する、３
４６ｂｐのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターを含む。このＤＮＡ配列は、
ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又はケストルムイエローリ
ーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでフォ
ワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及びリバースプライマーＣｍｐＣ２
（配列番号１４）を使用してＰＣＲによって得られ得る。ＣｍｐＣプロモーター
の推定ＴＡＴＡボックスは配列番号２の塩基３０８ないし塩基３１５に位置する
。ＣｍｐＣプロモーターは少なくとも３つの推定エンハンサー領域を含む。ヌク
レオチド配列ＣＡＡＴを有するエンハンサー領域１は、配列番号２の塩基２３２
ないし塩基２３５に位置し、そしてヌクレオチド配列ＣＡＡＴをまた有するエン
ハンサー領域２は、配列番号２の塩基２４３ないし塩基２４６に位置する。エン
ハンサー領域３は配列番号２の塩基２４６ないし塩基２５３に位置し、そしてヌ
クレオチド配列ＴＧＡＣＧＴＡＡを有する。
【００３６】 本発明のさらなる好ましい実施態様は、ＣｍｓｐＳプロモーターと呼ばれる、
配列番号３に示されるＤＮＡである。ＣｍｐＳプロモーターはまた、配列番号１
に示される配列のフラグメントであり、そして配列番号２の３４６ｂｐと、Ｃｍ
ＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターのリーダー領域からのプラス５４ｂｐを含む
。該リーダー領域は、転写されるがタンパク質に翻訳されない、コード領域に先
行するヌクレオチド配列である。当業者は、リーダー領域が、遺伝子発現におけ
る重要な機能を有する調節エレメントを含むことができることを知っている。Ｃ
ｍｐＳプロモーターは、ケストルムイエローリーフカーリングウイルスからの又
はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parqui植物か
らのゲノムＤＮＡでフォワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及びリバー
スプライマーＣｍｐＣ２（配列番号１５）を使用してＰＣＲによって得られ得る
。ＣｍｐＳプロモーターは、リーダー領域の少なくとも２つの推定エンハンサー
領域を含む。エンハンサー領域４（ＧＡＧＡＧＡ）は、配列番号３の塩基３５４
ないし塩基３５９に位置し、そしてエンハンサー領域５（ＧＡＧＡＧＡＧＡ）は
配列番号３の塩基３６８ないし塩基３７５に位置する。
【００３７】 本発明のなおさらなる好ましい実施態様は、ＣｍｐＬプロモーターと呼ばれる
、配列番号４に示す配列である。先行するプロモーターとして、ＣｍｐＬプロモ
ーターは、配列番号１に示す配列のフラグメントであり、そして配列番号２の３
４６ｂｐと、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列の２８８ｂｐを
含む。ＣｍｐＬプロモーターは、ケストルムイエローリーフカーリングウイルス
からの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染したCestrum parq
ui植物からのゲノムＤＮＡでフォワードプライマーＣｍｐ１（配列番号１３）及
びリバースプライマーＣｍｐＬ２（配列番号１６）を使用してＰＣＲによって得
られ得る。ＣｍｐＦと呼ばれる、配列番号４の変異体であって、ここでＣｍＹＬ
ＣＶ完全長転写物５’非翻訳リーダー配列が、２８８ｂｐ長の代わりに２８６ｂ
ｐであるものは、配列番号２０に示される。
【００３８】 当業者は、配列番号１、２、３、４、１９及び２０に示すヌクレオチド配列が
、ホモロガス又はヘテロガスヌクレオチド配列でそれらの５’−及び３’末端で
伸長できることを知っている。例えば、配列番号１、２、３、４、１９及び２０
の５’末端を、配列番号６に示すヌクレオチドの全部又は一部によって伸長させ
ることができる。配列番号６は、配列番号２、３、４及び２０の上流に天然に見
出され、そしてＣｍＹＬＣＶのＯＲＦ ＶＩの一部（配列番号６の塩基１ないし
塩基１００）並びにＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの一部（配列番号６
の塩基１０１ないし塩基１０４）を含む。同様に、配列番号２、３、４、及び２
０の３’末端を、配列番号４及び２０の３’末端に天然に見出されるヌクレオチ
ド配列を表す、そしてＣｍＹＬＣＶ完全長転写物リーダー配列の一部を含む、配
列番号５に示すヌクレオチドのすべて又は一部によって伸張させることができる
。
【００３９】 前記の様に、本発明のＤＮＡ配列を、例えば、ケストルムイエローリーフカー
リングウイルスからの又はケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染し
たCestrum parqui植物からのゲノムＤＮＡでＰＣＲによって、取得することがで
きる。又は、本発明のＤＮＡ配列を、配列特異的プライマーを使用して、本発明
のＤＮＡ配列のホモログを含むカリモウイルスファミリーの任意の他のウイルス
から取得することができる。当業者は、配列番号１ないし配列番号６及び配列番
号１９及び２０に示すヌクレオチド配列に基づいて、所望の任意のプライマー組
み合わせを選択し、本発明に従って使用することのできる、種々の長さのＤＮＡ
フラグメントをＰＣＲ増幅できることを知っている。本発明はこうして、本発明
に従って機能する、すなわち関連ヌクレオチド配列の発現を付与することができ
る、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターに由来するフラグメントを含む。
【００４０】 これは、そのようなプロモーターフラグメントを生成し、それらを選択又はス
クリーニングマーカー遺伝子に融合し、そして融合構築物をプロモーター活性の
維持についてアッセイすることによって試験することができる。そのようなアッ
セイは当業者の通常の技術の範囲内である。本発明の好ましいＤＮＡフラグメン
トは、少なくとも約５０塩基の、好ましくは約４００塩基及び約６５０塩基の間
の、より好ましくは約２００塩基及び約４００塩基の間の、そして最も好ましく
は約３５０塩基の長さのものである。
【００４１】 当業者にとって、１又は２以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び
／又は置換を配列番号１、２、３、４、５、及び６又はその配列情報に由来する
より長い又はより短いフラグメントのＤＮＡ配列に導入することができることは
明白である。加えて、本発明の非修飾又は修飾ヌクレオチド配列を、本発明の配
列をシャッフリングすることによって変異させることができる。本発明に従う変
異体ＤＮＡ配列の機能について試験するために、所望の配列を、選択又はスクリ
ーニングマーカー遺伝子に作動可能に連結し、そしてマーカー遺伝子の発現をプ
ロトプラストでのトランジエント発現アッセイで、又は安定的に形質転換された
植物で、試験する。当業者は、関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することがで
きるＤＮＡ配列を、モジュラーウェー（modular way)で確立することを知ってい
る。従って、より短いＤＮＡフラグメントからの発現レベルは、最も長いフラグ
メントからのもと異なり得、そして互いに異なり得る。例えば、ダウンレギュレ
ーション上流エレメントの欠失は、関連ヌクレオチオ配列の発現レベルの増加に
つながり、一方、アップレギューレーションエレメントの欠失は、関連ヌクレオ
チド配列の発現レベルを減少させる。当業者はまた発達特異的又は組織特異的エ
レメントの欠失が、関連ヌクレオチド配列の時間的又は位置的に変化した発現プ
ロファイルにつながることを知っている。
【００４２】 本発明のプロモーターの機能的同等物、すなわち、配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のいずれかとストリンジェ
ント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、例えば、配列番号１９及び
配列番号２０に示す配列もまた、本発明に含まれる。ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件は、０．１％ＳＤＳを含むダブル強度（２Ｘ）シトレートバ
ッファー塩水（ＳＳＣ）中で６５℃、好ましくは６０℃及び最も好ましくは５５
℃の温度で、次いで同じ温度の支持のリンスであるがより低いＳＳＣ濃度を有す
るバッファーでのリンスによって、実施される。そのようなより低い濃度のバッ
ファーは典型的には、０．１％ ＳＤＳを含む１０分の１強度ＳＳＣ（０．１Ｘ
ＳＳＣ）、好ましくは０．１％ ＳＳＣを含む０．２ＸＳＳＣ、そして最も好ま
しくは０．１％ ＳＤＳを含む半分強度ＳＳＣ（０．５ＸＳＳＣ）である。実際
に、他の生物からのＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモーターの全部又は一部に対
する機能的同等物を、所望の生物、特に他のカリモウイルスから単離したゲノム
ＤＮＡと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号６、配列番号１９又は配列番号２０のいずれかをハイブリダイズさせるこ
とによって見出すことができる。
【００４３】 当業者は、他の生物中の相同配列を同定するための当業者に知られている多く
の方法が存在するから、そのような配列を見出すことをいかに進めるべきか知っ
ている。そのような新しく同定されたＤＮＡ分子を次いで、配列決定し、そして
該配列を配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号１９、又は配列番号２０のいずれかと比較し、そしてプロモー
ター活性について試験することができる。少なくとも５０ヌクレオチドの長さに
渡る配列番号１、２、３、４、５又は６のいずれかのヌクレオチド配列に少なく
とも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは
９５％配列同一性を有するＤＮＡ分子は、本発明の範囲内である。配列同一性の
パーセンテージはダイナミックプログラミングアルゴリズムに基づくコンピュー
タープログラムを使用して決定する。本発明の範囲内で好ましいコンピューター
プログラムは、クエリーがタンパク質であるかＤＮＡであるかにかかわらず、利
用可能な配列データベースのすべてを探索するために設計されたＢＬＡＳＴ（Ba
sic Local Alignment Search Tool)サーチプログラムを含む。このサーチツール
のバージョンＢＬＡＳＴ２．０（Gapped BLAST)は、インターネット上で公衆に
利用可能とされた（currently http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。それは
グラーバルアラインメントに対して、ローカルを探す機能的アルゴリズムを使用
し、従って単離領域のみを共有する配列間の関連性を検出することができる。Ｂ
ＬＡＳＴサーチで割り当てられるスコアーは、良く定義された統計的解釈を有す
る。当該プログラムは、好ましくはデフォルト値に対する至適パラメーターセッ
トで稼動させる。
【００４４】 本発明のさらなる目的は、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本
発明に従うＤＮＡ配列を含む組換え体ＤＮＡ分子を提供することである。所望の
ヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質に転写されない、リボゾームＲＮＡ、
アンチセンスＲＮＡ、又は任意の他の型のＲＮＡをコードすることができる。本
発明のさらなる好ましい実施態様では、所望のヌクレオチド配列は、タンパク質
産物に翻訳される。プロモーター配列と関連しているヌクレオチド配列は、形質
転換されるべき植物に関してホモロガス又はヘテロガス起源のものであり得る。
該配列はまた、完全に又は部分的に合成であり得る。起源にかかわらず、関連Ｄ
ＮＡ配列は、それが連結されているプロモーターの発現特性に従って、形質転換
植物中で発現する。該プロモーター配列と関連しているホモロガスヌクレオチド
配列の場合では、本発明に従うプロモーターは、当該ホモロガス配列の異所性（
Ectopic)発現に有用である。異所性発現は、プロモーター配列と関連しているヌ
クレオチド配列が、ここで当該配列がそれ自身のプロモーターの制御下で発現さ
れ得ない、組織及び器官及び／又は時間で発現されることを意味する。本発明の
特定の実施態様では、プロモーター配列と関連しているヌクレオチド配列の発現
は、コサプレッションといわれるプロセスによって、それ自身の発現及び遺伝子
の本来のコピーのそれを抑圧する。
【００４５】 本発明の好ましい実施態様では、関連ヌクレオチド配列は、植物全体ですべて
の時間及びほとんどの組織及び器官で発現が望まれるタンパク質をコードし得る
。そのようなヌクレオチド配列は、好ましくは、望まれる表現型的形質をそれで
形質転換される植物に付与するタンパク質を好ましくはコードする。例は、抗生
物質抵抗性、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性、又は他の有害生物に対
する抵抗性、除草剤耐性、高栄養価、産業加工の高い成績又は変化した再生可能
性を付与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。関連ヌクレオチ
ド配列はまた、植物での商業的に有益な酵素又は代謝物の生産のために、植物に
移入されるものであり得る。選択又はスクリーニングマーカー遺伝子、すなわち
選択又はスクリーニング形質をコードするコード領域に作動可能に連結される本
発明のＤＮＡ配列を含む遺伝子はまた、本発明に含まれる。
【００４６】 選択又はスクリーニングマーカー遺伝子の例は、以下に記載する。ある種の標
的種のために、種々の抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましくあり得る。形
質転換にルーチンに使用する選択マーカーは、カナマイシン、パラモマイシン、
ゲンチシン及び関連抗生物質への抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Vieira a
nd Messing, 1982, Gene 19:259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304:184-18
7)アミノグルコシド３’−アデニリルトランスフェラーゼをコードする、そして
ストレプトマイシン又はスペクチノマイシンへの抵抗性を付与する、細菌ａａｄ
Ａ遺伝子(Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res.19:4083-4089)、抗生
物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子（Blochlinger and Di
ffelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931)、及びメトトレキセートへの
抵抗性を付与する、ｄｈｆｒ遺伝子（Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1
099-1104)を含む。使用すべき他のマーカーは、除草剤ホスヒノスリシンへの抵
抗性を付与する、ホスヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(White e
t al., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al.1990, Theor. Appl.
Genet. 79: 625-631)、グリフォサート抵抗性をコードする突然変異体ＥＰＳＰ
シンターゼ遺伝子(Hinchee et al.,1988, Bio/Technology 6:915-922)、イミダ
ゾリン又はスルフォニルウレア抵抗性を付与する突然変異体アセトラクテートシ
ンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（Lee et al., 1988, EMBO J. 7:1241-1248)、アトラ
ジンへの抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子(Smeda et al., 1993, Pla
nt Physiol.103: 911-917)、又はEP0769059に記載される突然変異体プロポリフ
ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含む。形質転換細胞の同定はまた、スクリー
ニングマーカー遺伝子、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）
、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は形質転換細胞に表現型的に明瞭な形質
を付与する任意の他のタンパク質をコードする遺伝子の発現を通して達成し得る
。
【００４７】 陽性選択を生じる、選択マーカー、例えば、特許出願ＷＯ９３／０５１６３に
記載されているフォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子、をまた使用し得る。
陽性選択に使用される他の遺伝子は、ＷＯ９４／２０６２７に記載され、そして
キシロイソメラーゼ及びフォスフォマンノ−イソメラーゼ、例えば、マンノース
−６−フォスフェートイソメラーゼ及びマンノース−１−フォスフェートイソメ
ラーゼ；フォスフォマンノムターゼ；マンノースエピメラーゼ、例えば、炭水化
物をマンノースに又はマンノースを炭水化物、例えばグルコース又はガラクトー
スに転換するもの；フォスファターゼ例えば、マンノースまたたキシロースフォ
スファターゼ、マンノース−６−フォスファターゼ及びマンノース−１−フォス
ファターゼ、及びマンノース又はその誘導体又は前駆体を細胞への輸送に関係す
るパーミアーゼをコードする。細胞ヘの化合物の毒性を減少させる物質は典型的
には、グルコース誘導体、例えば、メチル−３−Ｏ−グルコース又はフロリジン
である。形質転換された細胞は、集団中の非形質転換細胞を損傷又は死滅させる
ことなく、そして抗生物質又は除草剤抵抗性遺伝子の同時導入なくして同定する
。抗生物質又は除草剤抵抗性遺伝子の必要性を排除するという事実に加えて、Ｗ
Ｏ９３／０５１６３に記載されるように、陽性選択方法はしばしば、伝統的陰性
選択よりもより効率的である。
【００４８】 従って、本発明のプロモーターは、好ましくは以下の領域を含むタンパク質を
コードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている：（ａ）化合物の代謝
に関係するタンパク質をコードする、及び／又は（ｂ）タンパク質をコードして
いる遺伝子の活性を調節し、ここで該化合物はマンノース又はキシロース又はこ
れらの誘導体又は前駆体、又はタンパク質の基質であり、又はそのような基質を
導入される形質転換細胞によって代謝されることができる。当該ヌクレオチド配
列は、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼをコードし得、そして該化
合物はマンノースであり得る。又は、該ヌクレオチド配列はリン糖酸イソメラー
ゼ、リン糖酸ムターゼ、例えば、フォスフォマンノムターゼ、フォスファターゼ
、例えば、マンノース−６−フォスファターゼ、糖エピメラーゼ、糖パーメアー
ゼ、リン糖−パーミアーゼ又はキシロースイソメラーゼ、をコードし得、そして
該化合物はマンノース、マンノース−６−フォスフェート、Ｄ−マンノースアミ
ン又はキシロースであり得る。
【００４９】 本発明の好ましい実施態様では、本発明のプロモーターは、フォスフォマンノ
ースイソメラーゼ（ＰＭＩ）をコードする、E. coli manA遺伝子のコード領域（
Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reprts 16:219-221, Negrotto et al.,
2000, Plant Cell Reports 19:798-803)、及びAgrobacterium thmefaciens T-
ＤＮＡから得られるＮｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーター(Depicker et
al., J. Mol. Appl. Genet 1(6), 561-573(1982)）に作動可能に連結されてい
る。当業者は、Ｎｏｓターミネーターが植物中で機能する任意の他のターミネー
ターと置換し得ることを知っている。本発明のプロモーターは、配列番号１ない
し６及び１９ないし２０に記載される、ＣｍｐＤ、ＣｍｐＣ、ＣｍｐＳ、Ｃｍｐ
Ｌ、ＣｍｐＢ、ＣｍｐＡ、ＣｍｐＥ又はＣｍｐＦプロモーター、又はそれらに由
来する任意のプロモーターであってよい。本発明のなおより好ましい実施態様で
は、該プロモーターは、配列番号３に示すＣｍｐＳプロモーターである。
【００５０】 本発明のプロモーターをまた、使用して制御されるべきウイルスからの遺伝子
のコード領域と本発明のプロモーターとに作動可能に連結することによってウイ
ルスへ抵抗性又は耐性を提供し得る。マイナス鎖ウイルス、例えば、トマト黄化
えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ）のウイルス制御のために、該ウイルスヌクレオキャ
プシドタンパク質（ＮＰ）及びムーブメントタンパク質（ＭＰ）遺伝子配列を使
用することができ、そしてウイルスのアルファ様スーパーグループに属するウイ
ルス、例えば、ＴＭＶ及びＣＭＶのために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼ
（ＲｄＲｐ）及びムーブメントタンパク質（ＭＰ）遺伝子配列を使用することが
できる。ポティウイルスを含む、ウイルスのPicorna様スーパーグループに属す
るウイルスのために、任意のウイルス配列を本発明のプロモーターに作動可能に
連結し得る。
【００５１】 最終的に、ＤＮＡウイルスを含む、すべての他のウイルスのために、ＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）又はレプリカーゼ関連遺伝子配列を使用し
得る。ウイルス制御のためのそのような構築物は、ＷＯ００／６８３７４の実施
例８及び実施例９に例示されるように構築することができる。ＷＯ００／６８３
７４に開示されるプロモーターを本発明のプロモーターと置換することは当業者
の通常の技術の範囲内である。ＷＯ００／６８３７４の教示に従って、当業者は
また、当該ウイルスへの抵抗性又は耐性を付与するために、前記のウイルス配列
に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む構築物をいかにして調製す
るか知っている。 ＷＯ００／６８３７４に開示のように、トランスジェニック植物での二本鎖ウ
イルスＲＮＡを発現させる代わりに、ウイルスＲＮＡをまた、例えば、ＵＳ５５
８３０２又は本発明の実施例１２及び１３に記載のように、非翻訳ＲＮＡプラス
センスウイルスＲＮＡ分子として発現させることができる。
【００５２】 本発明の目的はさらに、所望の関連ヌクレオチド配列に融合された本発明のＤ
ＮＡ配列を含む組換え体発現ベクターを提供することである。これらのベクター
では、外来ＤＮＡをポリリンカー領域に挿入し、その結果これらの外生配列を、
例えば、細菌又は植物起源であり得る、好適な宿主細胞中で発現させることがで
きる。例えば、Agrobacterium tumafaciensバイナリーベクターｐＢＩＮ１９に
由来するプラスミドｐＢＩ１０１は、ベータガラクトシダーゼ（ＧＵＳ）発現シ
グナルを使用するプロモーターのクローニング及び試験を可能とする(Jefferson
et al., 1987, EMBP J 6: 3901-3907)。該ベクターのサイズは、１２．２ｋｂ
である。それは低コピーＲＫ２複製開始点を有し、そして細菌及び植物の両方で
のカナマイシン抵抗性を付与する。本発明に従って使用することのできる当業者
に知られる多くの他の発現ベクターが存在する。
【００５３】 本発明の組換え体ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物を提供することは
、本発明のさらなる目的である。本発明はこうして、植物細胞、そのような細胞
に由来する植物、植物材料、該後代、及びそのような植物に由来する種子、及び
以下に記載の形質転換方法のいずれかによって得られる改善された特性を有する
農業産物に関する。本発明に従って形質転換された植物は、単子葉又は双子葉植
物であり得、そしてイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンシ
ョ、スイートコーン、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリー、レタス、キャベ
ツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガ
ス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリ、カボチャ(squash,pumpkin)、アサ
、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、
ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリ、ブラックベリ、パイナップル
、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキ
ビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アル
ファルファ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidpsis thaliana、及び樹木植
物、例えば、針葉樹及び落葉樹を含むがこれらに限定されない。
【００５４】 形質転換されるべき好ましい植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ
、キャベツ、カリフラワー、ペッパー、スカッシュ、メロン、ダイズ、トマト、
テンサイ、ヒマワリ又はワタであるが、特にイネ、トウモロコシ、コムギ、Sorg
hum bicolor、オーチャードグラス、テンサイ及びダイズである。本発明の組換
え体ＤＮＡ配列を、多くの周知の方法によって植物細胞に導入することができる
。当業者はそのような方法の選択が形質転換の標的である植物の型、すなわち単
子葉又は双子葉植物に依存し得ることを認識する。植物細胞を形質転換する好適
な方法は、マイクロインジェクション（Crossway et al., 1986, Bio/Technique
s 4:320-334)、エレクトロポレーション（Riggs and Bates, 1986, Proc. Natl.
Acad. Sci.,USA 83:5602-5606)、アグロバクテリウム介在形質転換(Hichee et a
l., 1988, Bio Technology 6:915-922;EP0853675）、ディレクトジーントランス
ファー（Paszkowski et al., 1984, EMBO J.3:2717-2722)及びAgracetus, Inc.,
Madison,Wisconsin and Dupont, Inc.,Wilmington Delawareから入手可能な装
置を使用するバリスチックパーティクアクセラレーション(例えば、米国特許番
号4945050及びMacCabe et al.,1988, Bio/Technology 6:923-926参照）を含む。
【００５５】 形質転換されるべき細胞は、分化した葉細胞、胚形成細胞又は任意の他の型の
細胞であり得る。プロトプラストの直接的形質転換において、外生遺伝物質のプ
ロトプラストヘの取りこみは、化学物質又は電場の使用によって増強し得る。外
生材料を次いで、核ゲノムに組み込み得る。以前の研究は双子葉タバコ植物で実
行され、これは外来ＤＮＡが組み込まれそして後代植物ヘ送達されるという結果
である（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2712-2722;Potrykus et al., 19
85, Mol. Gen. Genet 199:169-177)。単子葉プロトプラスト、例えば、Triticum
monococcum、Lolium mutiflorum(イタリアンライグラス）、トウモロコシ、及
びブラックメキシカンスイートコーンをこの手法によって形質転換する。追加的
な好ましい実施態様は、EP0292435、並びにEP0846771に開示されたトウモロコシ
のためのプロトプラスト形質転換方法である。
【００５６】 トウモロコシ形質転換のためにKoziel et al., 1993, Bio/Technology 11:194
-200をまた参照されたい。イネの形質転換をプロトプラスト又はパーティクルボ
ンバードメントを利用するディレクトジーントランスファーによって実施し得る
。プロトプラスト介在形質転換はジャポニカ型及びインディカ型について記載さ
れている(Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7:379-384; Shimamoto et al
., 1989, Nature 338:274276; Datta et al.,1990, Bio/Technology 8:736-740)
。前記の両方の型はまた、パーティクルボンバードメントを使用してルーチンに
形質転換可能である（Christou et al., 1991, Bio/Technology 9:957-962)。特
許出願番号EP0332581は、Pooideaeプロトプラストの、作成、形質転換及び再生
のための技術を記載する。これらの技術は、Dactylis及びコムギを含むPooideae
植物のすべての形質転換を可能とする。さらに、コムギ形質転換は特許出願EP06
74715;及びWeeks et al.,1993(Plant Physiol.102:1077-1084）によって記載さ
れている。こうして構築した植物発現ベクターを例えば、慣行の植物形質転換方
法に従ってイネのカルスに導入し、そして根及び葉の分化をそれから誘導し、そ
れから培養のために植木鉢に移植し、それによって形質転換イネを取得すること
ができる。 本発明のＤＮＡ配列又はベクターでの形質転換から得られる植物は、所望のヌ
クレオチド配列を、植物全体で及びほとんどの組織及び器官で発現する。
【００５７】 前記のトランスジェニック植物に改変された遺伝的特性は、有性生殖又は栄養
成長によって受け渡され、そしてこうして維持されそして後代植物において増殖
することができる。一般に当該維持及び増殖は、特定の目的例えば、耕うん、播
種又は収穫に適合させるために開発された既知の農業的方法の使用をもたらす。
特殊なプロセス、例えば、水耕又は温室技術をまた、適用し得る。本発明に従う
トランスジェニック植物の有利な遺伝的特性の使用は、さらに、改善された特性
、例えば、有害生物、除草剤、又はストレスの耐性、高栄養価、高収量、又は倒
伏又は脱粒に起因するロスの減少をもたらす改善された構造を有する植物の開発
を目的とする植物育種をもたらすことができる。種々の育種ステップは、例えば
交雑すべき系統の選抜、親系統の授粉の管理、又は適当な後代植物の選抜のよう
な良く定義された人間の介入によって特徴付けられる。望まれる特性に依存して
、種々の育種方法をとる。関連技術は当業界で周知であり、そして雑種形成、同
系交配、戻し交雑、多系育種、変種ブレンド、種間交雑、異数性技術、等を含む
がこれらに限定されない。
【００５８】 雑種形成技術はまた、植物の不稔化を含み、機械的、化学的又は生物学的手段
によって雄性又は雌性不稔植物を得る。雄性不稔植物の異なる系統の花粉での他
家授粉は、該雄性不稔性であるが雌性稔性の植物のゲノムが両方の親系統の特性
を斉一に取得することを確保する。こうして、本発明に従うトランスジェニック
植物は、例えば、慣行方法、例えば、除草剤又は農薬処理の有効性が増加してい
る改善された植物系統の育種のために使用することができ、又はそれらの修飾さ
れた遺伝的特性のために当該方法を無しで済ますことを可能とする。又は、改善
されたストレス耐性を有する新しい作物を取得することができる、それは、それ
らの最適化された遺伝的「装置」のために、比較的不利な発達条件に耐えること
のできない産物よりも、よりよい品質の収穫産物を得る。
【００５９】 本発明のさらなる目的は、望まれる生物の所望のヌクレオチド配列を発現させ
るために使用することのできるＤＮＡ配列を提供することである。この生物は、
細菌、植物又は所望の任意の他の生物であることができる。 さらに配列番号１ないし６の開示は、当業者にポリメラーゼ連鎖反応のための
オリゴヌクレオチドを設計することを可能とし、それらは、配列番号１、２、３
、４、５、又は６の、１５及び好ましくは２０ないし３０又はより多い塩基対の
任意の連続配列によって特徴付けられるヌクレオチド配列を含むテンプレートか
らのＤＮＡフラグメントを増幅することを試みる。当該ヌクレオチドは、配列番
号１、２、３、４、５、又は６の１５及び好ましくは２０ないし３０又はより多
い塩基対をあらわす、ヌクレオチドの配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも１つを使用して実施されるポリメラーゼ連鎖反応及びそれらの増
幅産物は、本発明のさらなる実施態様を構成する。
【００６０】 配列表の配列の簡単な記載 配列番号１ ＣｍｐＤ 配列番号２ ＣｍｐＣ 配列番号３ ＣｍｐＳ 配列番号４ ＣｍｐＬ 配列番号５ ＣｍｐＢ 配列番号６ ＣｍｐＡ 配列番号７ Ｓ１フォワードプライマー 配列番号８ Ｓ２リバースプライマー 配列番号９ ＧＵＳフォワードプライマー 配列番号１０ ＧＵＳリバースプライマー
【００６１】 配列番号１１ ＣＡＴフォワードプライマー 配列番号１２ ＣＡＴリバースプライマー 配列番号１３ Ｃｍｐ１フォワードプライマー 配列番号１４ ＣｍｐＣ２リバースプライマー 配列番号１５ ＣｍｐＳ２リバースプライマー 配列番号１６ ＣｍｐＬ２リバースプライマー 配列番号１７ ＰＡフォワードプライマー 配列番号１８ ＰＡリバースプライマー 配列番号１９ ＣｍｐＥ 配列番号２０ ＣｍｐＦ
【００６２】 配列番号２１ ＮＯＳターミネーターフォワードプライマー 配列番号２２ ＮＯＳターミネーターリバースプライマー 配列番号２３ ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子フォワードプライマー 配列番号２４ ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子リバースプライマー 配列番号２５ ＣｍＹＬＣＶプロモーターフォワードプライマー 配列番号２６ ＣｍＹＬＣＶプロモーターリバースプライマー 配列番号２７ ＡＧＬＩＮＫマルチクローニング部位 配列番号２８ ＢＩＧＬＩＮＫマルチクローニング部位 配列番号２９ Ｃｍｐｆ−Ｂプライマー 配列番号３０ ＣｍｐＳ−Ｂプライマー
【００６３】 配列番号３１ ｐＮＯＶ２８０４；バイナリーベクター、プロモーターを欠くＰ
ＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセットを含む 配列番号３２ ｐＮＯＶ３６０４；バイオリスチックによる形質転換のためのベ
クター、プロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓターミネーター発現カセットを含む
配列番号３３ ＣｍｐＭｒリバースプライマー 配列番号３４ ＣｍｐＭｆフォワードプライマー 配列番号３５ ＣｍｐＭｒｓリバースプライマー 配列番号３６ ＣｍｐＭｆｓフォワードプライマー 配列番号３７ ｓｙｎＧＦＰＩ；イントロンを有する植物最適化ＧＦＰ遺伝子 配列番号３８ ＧＩＧ；イントロンを有するＧＵＳ遺伝子 配列番号３９ Ｃｍｐ−Ｃリバースプライマー 配列番号４０ ＣｍｐＳ−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット
【００６４】 配列番号４１ ＣｍｐＳ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット 配列番号４２ ＣｍｐＣ−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット 配列番号４３ ＣｍｐＣ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット 配列番号４４ ｐＮＯＶ２１１７ベクター 配列番号４５ ｐＮＯＶ４２００ベクター 配列番号４６ ＺｍＵｂｉ−ＧＦＰ−３５Ｓｔｅｒｍ発現カセット 配列番号４７ ＺｍＵｂｉ−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット 配列番号４８ Ｕｂｑ（Ａｔ）−ｓｙｎＧＦＰＩ−ｎｏｓ発現カセット 配列番号４９ Ｕｂｑ（Ａｔ）−ＧＩＧ−ｎｏｓ発現カセット
【００６５】 実施例 ここで使用する標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当業界で周
知であり、そして例えば、Sambrook te al., 1989''Molecular Cloning'', Cold
Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 及びAusubel et a
l., 1994, ''Current protocols in molecular biology'', John Wiley and Son
s, New Yorkに記載されている。
【００６６】 実施例１：ウイルスクローニング １．ＤＮＡ抽出 ウイルスゲノムＤＮＡをケストルムイエローリーフカーリングウイルス感染し
たアツバヤコウボク(Cestrum parqui)植物から抽出する。５グラムの感染した葉
を、粉砕バッファー（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ
、２Ｍ 尿素）の３０ｍｌ中で、６０秒間最大スピードで、Brinkman Polytron
ホモゲナイザーにおいて、ＰＴ１０プローブで、そして４℃で、終夜Triton X-1
00（２％最終濃度）とともに穏やかに振とうしつつホモゲナイズする。ウイルス
を低スピード遠心分離（Sorvall SS-34 ローターにおいて１０００００ｒｐｍで
２０分間）によって粗ホモジネートから及び高スピード遠心分離（Beckman SW-2
8ローターで２７０００ｒｐｍで２時間）によって得られる上清から、スクロー
スクッション（３ｍｌの１５％スクロース）を経由して精製する。ペレット含有
ウイルスを次いで、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ に再懸濁する。ＤＮアーゼＩ(Sigma)及びＲＮアーゼＡ(Sigma)をそれぞれ１０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度まで添加する。３７℃で３０分後、反応を１０ｍＭまでのＥＤＴ
Ａの添加によって停止させる。ウイルスＤＮＡをＣｍＹＬＣＶ粒子からプロテア
ーゼＫ（E.Merck, 0.5mg/ml最終濃度）で、６５℃で１５分間１％ ＳＤＳの存
在下で処理することによって単離する。ウイルスＤＮＡを次いで、フェノール抽
出及びエタノール沈降によって精製する。最終のエタノール沈殿物に含まれるウ
イルスＤＮＡを水に溶解する。
【００６７】 ２．ＤＮＡ増幅及びクローニング １００ナノグラムの取得したＤＮＡをテンプレートとして、１０μＭのそれぞ
れのプライマー、２５ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５μｌのｐｆｕ反応バッファ
ー（Straagene)及び２．５単位のpfu turbo ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene)
を含む５０μＭ反応体積中でＰＣＲ増幅のために使用する。Ｓフォワードプライ
マー（gaccacaaacatcagaag、配列番号７）及びＳ２リバースプライマー（caaact
tattgggtaatc、配列番号８）をＰＣＲ反応のために使用する。ＰＣＲのためのサ
イクリングパラメータは：１Ｘ（９４℃で１分間)；３０Ｘ（９４℃で１分間、
５０℃で１分間、７２℃で１分間）；１Ｘ（７２℃で１０分間）である。それぞ
れの単一ＤＮＡフラグメントをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）Amp SK(+)プラ
スミド(Stratagene)において製造者の指示に従ってクローニングする。
【００６８】 実施例２：ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡウイルスクローンの配列決定を、ABI PRISM 377 ＤＮＡ シーケンサー(
Perkin Elmer）及びABI PRISM dローダミンターミネーターサイクル配列決定キ
ット（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って使用し実行する。記載されたＳ１
プライマー及びＳ２プライマー（実施例１）を反応物の配列決定のために使用し
、並びにユニバーサルＭ１３−２０及びリバースプライマーを使用する。
【００６９】 実施例３：一過性（トランジエント）発現のためのプラスミドの構築 すべてのＰＣＲ反応を、実施例１に記載されるようにPfuポリメラーゼ(Strata
gene)で実施する。 １．レポーター遺伝子増幅 ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及びクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を増幅する。ＧＵＳ遺伝子増幅のため
に、ＧＵＳフォワード（cagggtaccactaaaacacc、配列番号９）及びＧＵＳリバー
ス（aggggatccccaattcccc、配列番号１０）オリゴヌクレオチドを、アニーリン
グ温度６０℃で使用する。ＣＡＴフォワード（aggggtaccatcgatatggag、配列番
号１１）及びＣａｔリバース（ttaggatccgccctgccac、配列番号１２）オリゴヌ
クレオチドは６２℃でアニールする。フォワードプライマーはＫｐｎＩ認識部位
を含み及びリバースのものはＢａｍＨＩ部位を含むように設計する。
【００７０】 ２．ＣｍＹＬＣＶプロモーター増幅 ３種の異なるプロモーターフラグメントを選択する。ＣｍｐＣ（配列番号２）
、ＣｍｐＳ（配列番号３）、及びＣｍｐＬ（配列番号４）。Ｃｍｐ１フォワード
プライマー（cttctagacaaagtggcagac、配列番号１３）を５２℃のアニーリング
温度でのすべての３種の増幅のために使用する。それをオリジナル配列から修飾
し（太字で示す（訳注；下線で示す））、ＸｂａＩ認識部位を含むようにする。
ＣｍｐＣ２リバースプライマー（ttggtaccttaacaatgaggg、配列番号１４）をＣ
ｍｐＣフラグメント増幅のために使用し、そしてＣｍｐＳ２リバースプライマー
（ctacttctaggtaccttgctc、配列番号１５）をＣｍｐＳフラグメントのために使
用する。それらの両方を修飾し、ＫｐｎＩ認識部位を含むようにする。ＣｍｐＬ
２リバースプライマー（ttggtaccttaacaatgaggg、配列番号１６）をＣｍｐＬフ
ラグメント増幅のために使用し、そしてそれを修飾し、ＣｌａＩ認識部位を含む
ようにする。
【００７１】 ３．ポリアデニル化シグナル増幅 ポリアデニル化シグナルフラグメントをカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａ
ｓＭＶ）感染性クローン(Franck et al., Cell 21(1),285-194,1980)から増幅す
る。ＰＡ（polyadenylation signal amplification)フォワード（ggggatccccagt
ctctctc、配列番号１７）及びＰＡリバース（gtgaattcgagctcggta、配列番号１
８）オリゴヌクレオチドをＰＣＲのために使用し、そして６０℃でアニールする
。フォワードプライマーを、ＢａｍＨＩ認識部位及びリバースのものはＥｃｏＲ
Ｉ部位を含むように設計する。
【００７２】 ４．生産した構築物 ・ｐＣｍｐＣＧ（ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣｍｐＳＧ（ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣｍｐＣＣ（ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣｍｐＳＣ（ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣｍｐＬＣ（ＣｍｐＬプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ） プロモーターフラグメント、レポーター遺伝子及びポリアデニル化シグナルを
含むカセットを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで制限されたｐＵＣ１９ベクター（St
ratagene)に挿入する。
【００７３】 ５．比較のために使用する構築物 ・ｐＣａｐＧ（Ｃａｐプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣａｐＳＧ（ＣａｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＵＳ遺伝子＋ポリＡ） ・ｐＣａｐＣ（Ｃａｐプロモーターフラグメント＋ＣＡＴ遺伝子＋ポリＡ） これらの構築物に含まれたプロモーターフラグメントを、ＣａＭＶから取得す
る（Franck et al.,Cell 21(1),285-194,GenBank 受託番号V00141参照）。GUS、
CAT及びポリＡフラグメントは、ＣｍＹＬＣＶ構築物のために使用されたこれら
と同一である。ＣａｐはＴＡＴＡボックスからの塩基―２２７ないし塩基＋３３
のフラグメントに対応し（ＣａＭＶゲノムの塩基７１７５ないし塩基７４３８、
GenBank受託番号V00141参照）、及びＣａｐＳはＴＡＴＡボックスから塩基−２
２７ないし塩基＋８２のフラグメントに対応する（ＣａＭＶゲノムの塩基７１７
５ないし塩基７４８６、GenBank 受託番号V00141参照）。これらの位置はCmYLCV
フラグメントのために選択されたものに近似的に対応する。
【００７４】 実施例４：トランジエント発現実験 １．懸濁培養及びプロトプラスト調製 Orychophragmus violaceus.懸濁培養を、１００ｍｇ／ｍｌ イノシトール、
２％ スクロース、及び０．１ｍｇ／ｍｌ ２，４−Ｄを含む４０ｍｌのＭＳ培
地（Murashige and Skoog,Physiol Plant 15,474-497, 1962)で維持する。プロ
トプラストを４ないし５日齢培養物から単離する。細胞壁を０．１％ペクトリア
ーゼＹ２３（Seishin Pharamaceutical Co Japan)、１％ セルラーゼ Onozuka
R10(Yakult Honsha Co.,Japan)、０．４Ｍ Ｄ−マンニトール、及び０．１％
ＭＥＳ、ｐＨ５．５中で１時間２６℃で消化する。プロトプラストを５０μｍシ
ーブを経由して濾過し、エレクトロポレーション（ＥＰ）溶液（１０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２Ｍ マンニトール
、ｐＨ７．１）で２回洗浄する。
【００７５】 Nicotiana plumbaginifolia.植物をＲＰＭ２培地（Blonstein et al., Mol Ge
n Genet 211,252-259,1988)プラス７ｇ／ｌ バクトアガー、ｐＨ５．６上で無
菌的に維持する。プロトプラスト調製のために、葉を切断し、そして０．５％
ドリセラーゼ(Fluka)、０．２５ｍＭ ＰＶＰ１０（ポリビニルピロリドンＭＷ
１００００）、３．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、６ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、２ｍｇ／ｌ
ＢＡＰ、及び０．５Ｍ スクロース、ｐＨ５．７の溶液中で２６℃で終夜インキ
ュベートする。プロトプラストを１００μｍシーブを経由して濾過する。スクロ
ース溶液（０．６Ｍ スクロース、０．１％ ＭＥＳ、及び１５ｍＭ ＣａＣｌ２ 、ｐＨ５．７９を、第１の精製ステップのためにプロトプラスト懸濁液に添加
し、そして該懸濁液Ｗ５溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２ 、５ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ グルコース；Menczel et al., Theor Appl Genet 5
9, 191-195, 1981)でオーバーレイする。プロトプラストを次いで、Ｗ５溶液で
１回洗浄し、そして最終的にＥＰ溶液で洗浄する。
【００７６】 Oryza sativa.プロトプラストを、記載されたように(Datta et al., 1990,Bio
/Technology 8:736-740)O.sativa cv.日本晴から確立した、形態形成性イネ懸濁
液カルチャーから調製する。
【００７７】 ２．トランジエント発現実験 ＥＰバッファーにおける２ｘ１０６Orychophragmus violaceusプロトプラスト
のエレクトロポレーションによるトランスフェクションを、プロトプラスト懸濁
液の４ｍｍの距離を経由して９６０μＦコンデンサーを本殿させることによって
実施する。コンデンサを４５０ボルトで負荷する。エレクトロポレーションを５
−１０μｇのプラスミドＤＮＡの存在下で実施し、次いでプロトプラストを１６
−２４時間２５℃で培養する。２ｘ１０６Nicotiana plubaginifoliaプロトプラ
ストの０．３ｍｌ懸濁液におけるトランスフェクションを０．３ｍｌ ＰＥＧ（
４０％ ポリエチレングリコール６０００）及び５−１０μｇのプラスミドＤＮ
Ａの存在下で実施する。プロトプラストを２５℃で１６−２４時間０．４ｍｌ
Ｋ３培地（Godall et al., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990で培養し、そ
して収集の前に１０ｍｌ Ｗ５バッファーで添加する。 タンパク質エキストラクトを、凍結及び融解の少なくとも３サイクルによって
調製し、遠心分離によって清浄化する。
【００７８】 実施例５：ＣＡＴ及びＧＵＳアッセイ ＣＡＴ遺伝子発現ダブル抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）−ＥＬＩＳＡを、製造者
の指示に従ってＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Boehringer)を使用して実施する。C
AT活性をDynex MRXII装置で測定する。ＧＵＳアッセイのためのサンプルをＧＵ
Ｓバッファー（０．０５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％ Sarkosyl)中に希釈する。反応を
、等量のＧＵＳ反応バッファー（１００ｍｌ／ｌ １０ｘＧＵＳバッファー、２
００ｍｇ／ｌ ＢＳＡ、７０５ｍｇ／ｌ ４−メチルウムベリフェリル−グルク
ロナイド）の存在下で３７℃で実施し、２Ｍ Ammediolで停止させる。活性をTi
tertek Fluoroskann IIで測定する。ＣＡＴ及びＧＵＳアッセイ結果の両方を標
準クローン値に標準化する。１０の異なる実験から得られた結果は、種々のＣｍ
ＹＬＣＶプロモーターフラグメントが高度に活性なプロモーターとして機能する
ことを示す。
【００７９】 N. plumbaginifoliaプロトプラストトランジエント発現
【表１】
【００８０】
【表２】
【００８１】 O.violaceusプロトプラストトランジエント発現
【表３】
【表４】
【００８２】 O.sativa プロトプラストトランジエント発現
【表５】
【００８３】 実施例６：植物再生及び形質転換のための溶液及び培地の調製 培養培地ＧＭ、ＣＩＭ及びＳＩＭは、Valvekens et al., (1988,Proc. Natl.
Acad. Sci.USA.85:5536-5540)によって記載された培地である。 培養培地ＧＭは、Murashige and Skoog(1962, Physiol. Plant.15:473-497)の
ミネラル塩類、１．０ｍｇ／ｌ チアミン(ストック１ｍｇ／ｍｌ）、０．５ｍ
ｇ／ｌ ピリドキシンＨＣｌ（ストック１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｇ／ｌ ニコチ
ン酸（ストック１ｍｇ／ｍｌ）、０．５ｍｇ／ｌ ２−（Ｎ−モロフォリノ）エ
タンスルフォン酸（ＭＥＳ）、１０ｇ／ｌ スクロース、８ｇ／ｌアガーを含み
、１Ｎ ＫＯＨでｐＨを５．８に調節している。ＣＩＭはＢ５培地（Gamborg et
al., 1968, Exp. Cell Res. 50:151-158)のミネラル塩類及びビタミン、０．５
ｇ／ｌ ２−（Ｎ−モロフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、２０ｇ／ｌ
グルコース、０．０５ｍｇ／ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ
）（ストックＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍｌ）、０．０５ｍｇ／ｌ カイネチン（
ストックＤＭＳＯ中の５ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ５．８を含む。固体ＣＩＭ培地は、
８ｇ／ｌ アガーを含む。ＳＩＭはＢ５培地(Gamborg et al., 1968,前掲）のミ
ネラル塩及びビタミン、０．５ｇ／ｌ ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフ
ォン酸（ＭＥＳ）、２０ｇ／ｌ グルコース、５ｍｇ／ｌ Ｎ６−（イソペンチ
ル）アデニン（２Ｐｉ）（ストックＤＭＳＯ中の２０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍ
ｇ／ｌ インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）（ストックＤＭＳＯ中の１．５ｍｇ／
ｍｌ）、８ｇ／ｌ アガー、ｐＨ５．８を含む。ＳＩＭ Ｖ７５０ Ｋ１００は
、７５０ｍｇ／ｌ バンコマイシン及び１００ｍｇ／ｌ カナマイシンで補足さ
れたＳＩＭ培地である。ＳＩＭ Ｖ５００Ｋ１００は５００ｍｇ／ｌ バンコマ
イシン及び１００ｍｇ／ｌ カナマイシンで補足されたＳＩＭ培地である。ＧＭ
Ｋ５０は５０ｍｇ／ｌ カナマイシンで補足されたＧＭ培地である。
【００８４】 培養培地をすべて、オートクレーブ（１２１℃２０分）で滅菌する。ビタミン
を水に溶解し、そしてオートクレーブ前に培地に添加する。ホルモンをジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。抗生物質を水に溶解し、濾過によって滅
菌する（０．２２μｍ）。ホルモノ及び抗生物質を、オートクレーブ及び培地を
６５℃に冷却後に添加する。すべての場合に、９ｃｍペトリ皿（Falcon,3025)を
使用し、ただし通常１５ｃｍペトリ皿（Falcon,3025)へ注ぐ、ＧＭ及びＧＭ Ｋ
５０をのぞく。 固体培地を有するプレートを、濃縮を避けるために層流の利用の前に乾燥する
。
【００８５】 実施例７：アラビドプシス系統及び成長条件 Arabidopsis thaliana種子エコタイプコロンビア（Ｃｏｌ−０）野生型をLehl
e seeds, USA(1102 South Industrial Blvd.Suite D, Round Rock TX 78681, US
A)から購入する。植物を４部の砂、４部の園芸用土、及び１部のagrilitの混合
物で２２℃でポットで１６／８時間明／暗期サイクルで成長させる。
【００８６】 実施例８：アグロバクテリウム菌株及び培養 ベクタープラスミドを、Walkerpeach and Veltenによって記載されたプロトコ
ル（Plant Molecular Biology Manual, B1:1-19,1994.Eds.:S.B.Gelvin,R.A., S
chilpercort, Kluvers Acad. Publishers.における''Agrobacterium-mediated g
ene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems''）に
従って三元交配によってレシピエントAgrobacterium tumefaciens菌株ＬＢＡ４
４０４(Clontech)に導入する。使用するMobilizing菌株は、コンジュゲーション
プラスミドｐＲＫ２０１３を有するE.coli HB101(Ditta et al., 1980,グラム陰
性細菌からの広宿主範囲ＤＮＡクローニング系。Rhizobium meliotiのgenebank
の構築物、Proc. Natl.Acad. Sci.USA 77:7347-7351)である。根形質転換のため
に使用するアグロバクテリウムは、抗生物質なしで２８℃で２００ｒｐｍでＬＢ
培地において増殖させる（Sambrook et al., 1989, ''Molecular Cloning'', Co
ld Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）。
【００８７】 実施例９：種子滅菌 種子を２ｍｌエッペンドルフ管中で７０％ ＥｔＯＨ／０．０５％ Tween20
中に１分間置く。７０％ＥｔＯＨ／０．０５％Tween20をピペットで除去し、そ
して５％ ＮａＯＣｌ／０．０５％Tween20で１５分間交換する。種子を規則的
に振とうする。溶液を無菌条件で除去しそして種子を滅菌、蒸留水中で３回それ
ぞれ１０分間洗浄する。最後の洗浄後、種子を０．５−１ｍｌ水中に維持する。
種子を直ちに使用し、又は４℃で２ないし３週間貯蔵することができる。滅菌種
子（２０−３０）を、１５ｃｍペトリ皿中のＧＭ培地上にピンセットで移す。実
生をグロースチャンバー中の垂直に置いたプレートで成長させる（２２℃；１６
／８時間明／暗期サイクル）。
【００８８】 実施例１０：Arabidpsis thalianaの根外植体の形質転換 形質転換処理で、３週齢の実生の根を使用する。根は緑色又は褐色でないべき
である。実生の緑色部分をメス及びピンセットで除去する。残りの根を収集し、
そして、固体ＣＩＭ培地を有するプレートあたりおよそ５つの完全な根系を置く
。根をプレートの表面上に穏やかに押し、培地との十分な接触を確保する。しか
しそれらはアガー中に浸すべきではない。根をグロースチャンバー中で３日間イ
ンキュベートする（２２℃；１６／８時間明／暗期サイクル）。根を次いで滅菌
ペトリ皿に、液体ＣＩＭ培地で湿らせた濾紙と移し、そしてメスで０．５−１ｃ
ｍ断片に切断する。根外植体を次いで、１０ｍｌ液体ＣＩＭ培地を含む５０ｍｌ
滅菌Falcon管に移す。これに、０．５ｍｌの終夜アグロバクテリウムカルチャー
（ＯＤ０．６−１）を添加し、そして穏やかに振とうしつつ１−２分間インキュ
ベートする。液体を滅菌金属篩（５０メッシュ、Sigma,S-0895)を経由して管か
ら注ぎ、これをピンセットで保持する。根は通常その縁に近い管の壁に残る。次
いで根外植体を濾紙と滅菌ペトリ皿に移し、そして簡単に吸い取り乾燥させ、過
剰の液体を除く。根外植体を固体ＣＩＭ培地を有するプレート上に置き、そして
薄明かり光（１．５−２ｋｌｕｘ）で２日間グロースチャンバー中でインキュベ
ートする。アグロバクテリウムの過剰成長の薄い跡は、同時培養の期間の後、可
視的であるべきである。根外植体を次いで、１０００ｍｇ／ｌ バンコマイシン
で補足した、２０ｍｌの液体ＣＩＭ培地を有する滅菌５０ｍｌFalcon管に移す。
Falcon管を次いで、穏やかに撹拌し、アグロバクテリウムを除去する。液体を前
記の様に管から注ぎ、そして外植体を濾紙上で簡単に吸い取り乾燥させる。外植
体を次いで、SIM V750 K１００培地を含むプレートに移す。
【００８９】 根は培地とよく接触しているべきである。外植体を１週間通常の条件でグロー
スチャンバーでインキュベートし、それからＳＩＭ Ｖ５００ Ｋ１００培地に
移し、そしてさらに１週間インキュベートする。次いで、バンコマイシンの量を
２５０ｍｇ／ｌに減少させる。第１のシュートはＳＩＭ培地上での培養の第三週
の末に出現するものとする。シュートを、０．３−０．５ｃｍ長のときに切除し
、任意の残りのカルスを除去し、そしてシュートをＧＭ Ｋ５０培地を含む１５
ｃｍプレートに移す。プレート当たり最大３シュートを置く。より多いシュート
を得るために、残りの根外植体を、追加的２週間にわたり、１２５ｍｇ／ｌ バ
ンコマイシン及び１００ｍｇ／ｌ カナマイシンで補足した、新鮮ＳＩＭプレー
トに移す。発根したシュートを土壌に移し、種子を結実させることができる。発
根しないシュートを、ＧＭ培地を含むMagentaジャー（ジャー当たり１株）に移
し、インビトロで種子を生産させる。 個々のトランスジェニック植物からの種子を、２週間にわたり、グロースチャ
ンバーにおけるＧＭ Ｋ５０培地上で発芽させる。緑色本葉を形成しそして根系
が分岐する、表現型的に正常のカナマイシン抵抗性実生を、さらなる分析のため
に選択する。
【００９０】 実施例１１：組織化学的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイ インビトロ成長した実生又は土壌で成長した植物をＧＵＳアッセイに使用する
。実生全体又は切除した器官のいずれかをＧＵＳ染色溶液に浸す。ＧＵＳ染色溶
液は１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロナイド（X-Gluc
, Duchefa, 20mM ＤＭＳＯ中のストック）、１００ｍＭ Ｎａ−リン酸バッファ
ーｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、及び０．１％ Triton X100
を含む。組織サンプルを３７℃で１−１６時間インキュベートする。必要ならば
、サンプルを７０％ＥｔＯＨの数回の洗浄で清浄化し、クロロフィルを除去する
。
【００９１】 実施例１２：タバコ形質転換ベクターｐＺＵ６２７の構築 すべてのＰＣＲ反応を製造者の指示に従ってPlatinum Pfx ＤＮＡポリメラー
ゼ(Life Technologies)で実施する。
【００９２】 １．ＮＯＳターミネーター増幅及びクローニング ＮＯＳターミネーターをｐＢＩＮ１９（Bevan et al.,1984)から、ＮＯＳター
ミネーターフォワードプライマー（配列番号２１）及びＮＯＳターミネーターリ
バースプライマー（配列番号２２）を使用して増幅する。フォワードプライマー
を修飾し、ＰｉｓｔＩ部位を含ませ、そしてリバースプライマーを修飾し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位を含ませる。ＮＯＳターミネーター増幅産物をＰｓｔＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントとしてpBlurscript（Stratagene)の同じ部位にクローニン
グし、プラスミドPZU400Aを得る。
【００９３】 ２．トマト黄化えそ病ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（ＴＳＷＶ ＮＰ
）遺伝子の増幅及びクローニング 非翻訳ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子を取得するために、修飾ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子プ
ライマーを使用し、ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子を増幅する。ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子フ
ォワードプライマーは、ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ、開始及び停止コドンを導入する
（配列番号２３）。リバースプライマーを修飾し、ＰｓｔＩ部位を導入する（配
列番号２４）。増幅産物をＮＯＳターミネーターの上流に及び同じ方向でpZU400
AのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位にＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントとしてクロ
ーニングする。得られたクローンｐＺＵ４００ｂにおいて、ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝
子及びＮＯＳターミネーターの間のＰｓｔＩ部位を、製造者の指示に従って、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies)処理を使用して除去する。ｐＺＵ４
００Ｃと命名された、得られるクローンから、ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子及びＮＯＳ
ターミネーターを、シャトルベクターｐＺＯ１５６０のＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩ
ＩにＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングし、プラスミド
ｐＺＵ４００を得る。ｐＺＯ１５６０はpBluescript誘導体であり、ここに本来
の多重クローニング部位は、ＡＧＬＩＮＫ多重クローニング部位によって置換さ
れている（配列番号２７）。
【００９４】 ３．ＣｍＹＬＣＶプロモーター増幅及びクローニング ＣｍＹＬＣＶウイルスプロモーターを、ＣｍＹＬＣＶプロモーターフォワード
プライマー（配列番号２５）及びＣｍＹＬＣＶプロモーターリバースプライマー
（配列番号２６）を使用して増幅する。フォワードプライマーを修飾し、Ｓｓｔ
Ｉ部位を含ませ、リバースプリマ−を修飾しＰｓｔＩ部位を含ませる。増幅され
たＣｍＹＬＣＶウイルスプロモーターを、ｐＺＵ４００のＳｓｔＩ／ＰｓｔＩ部
位に、ＴＳＷＶ−Ｎ遺伝子と同じ方向で、上流に、ＳｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメ
ントとしてクローニングする。これは、クローンｐＺＵ６２５を生じ、それは、
非翻訳ＴＳＷＶ ＮＰ ＲＮＡを生産するウイルス遺伝子カセットを含む。
【００９５】 ４．pVictorHiNKへのウイルス遺伝子カセットのクローニング ウイルス遺伝子カセットをpVictorHiNKベクターｐＺＵ４９４のAscI/PacI部位
に、ｐＺＵ６２５からのＡｓｃＩ／ＰａｃＩフラグメントとしてクローニングす
る。これは、植物形質転換ベクターｐＺＵ６２７を生じる。ｐＶｉｃｔｏｒＨＩ
ＮＫは、Pseudomonas aeruginosaプラスミドｐＶＳ１に由来する複製開始点（Ｏ
ＲＩ）を含むバイナリーベクターであり、それはA.tumefaciens において高度に
安定であると知られる(Itoh et al., 1984.Plasmid 11:206-220;Itoh and Haas,
1985.Gene 36;27-36)。ｐＶＳ１ ＯＲＩはアグロバクテリウム中でのみ機能性
であり、そして三元交配手法によってE.coliからA. tumefaciensにヘルパープラ
スミドｐＲＫ２０１３によって移動することができる(Ditta et al., 1980.Proc
.Natl. Acad.Sci.USA 77:7347-7351)。このバイナリベクターはまた、E.coliで
機能性である、ｐＵＣ１９に由来する、ＣｏＩＥＩ複製開始点を含む(Yannisch-
Perron et al., 1985.Gene 33:103-119)。
【００９６】 E.coli及びa.tmefaciens中での維持のために、このベクターは、トランスポゾ
ンＴｎ７からの０．９３ｋｂ遺伝子によってコードされる、スペクトマイシン及
びストレプトマイシンへの細菌性抵抗性遺伝子を含み（Fling et al., 1985.Nuc
l.Acid Res.13:7095)、それはE.coli及びA.tumefaciensでのベクターの維持のた
めの選択マーカーとして機能する。該遺伝子を効率的な細菌での発現のためにｔ
ａｃプロモーターに融合する（Amman et al., 1983.Gene 25:167-178)。１．９
ｋｂ及び０．９ｋｂのライト及びレフトＴ−ＤＮＡボーダーフラグメントであっ
て、それぞれ２４ｂｐボーダーリピートを含むものは、ノパリン型A.tumefacien
s菌株ｐＴｉＩ３７のＴｉプラスミド（Yadev et al., 1982.Proc. Natl. Acad.
Sci.USA.79:6322-6326)に由来する。次に、該ボーダー間のＴ−ＤＮＡ領域を、
Ｍ１３に由来する配列を削除することによって修飾しそして、そのクローニング
融通性を改良するために、ＢＩＧＬＩＮＫ多重クローニング部位（配列番号２８
）を導入し、ｐＶｉｃｔｏｒＨｉＮＫを得る。 ＰＶｉｔｏｒＨＩＮＫは、植物形質転換プロセス中の形質転換体の選択のため
のＮＰＴＩＩ遺伝子カセットを含む。この遺伝子カセットは、ＮＯＳプロモータ
ー、ＮＰＴＩＩ遺伝子及びＮＯＳターミネーターを含み、A.tumegaciensから得
られる。
【００９７】 実施例１３：植物形質転換及び抵抗性についてのスクリーニング １．植物材料ヘのバイナリーベクターの形質転換 バイナリーベクターを植物材料へ移入する方法は、よく確立され、そして当業
者に知られている。手法の変形が、例えば使用されるアグロバクテリウム菌株の
違い、外植体材料の異なる起源、依存する再生系の相違、並びに使用される植物
種としての品種のために存在する。バイナリーベクターｐＺＵ６２７を以下の手
法に従って植物形質転換実験において使用する。ＰＺＵ６２７を、アクセプター
agrobacterium tumefaciens 菌株へ三元交配によって移入させ、次いでアクセプ
ター菌株への構築物の妥当な移入の確認のために共コンジュゲート体（ex-conju
gants）のサザンブロット分析及び接種及び無菌的外植体材料の組換え体Agrobac
terium tumefaciens菌株とのインキュベーション及び同時培養、適当な抗生物質
を使用するAgrobacterium tumefaciens菌株の選択死滅、カナマイシンを含む選
択培地上での成長による形質転換細胞の選択、プラントレットの土壌への移植、
組みこみＴ−ＤＮＡのインタクト性についての、該植物の単離クロモソームＤＮ
Ａのサザンブロット分析によるアッセイが続く。
【００９８】 ２．ＴＳＷＶ感染に対する植物の抵抗性 形質転換植物を標準的隔離条件下でグリーンハウスで成長させ、病原体による
任意の感染を防止する。４葉ステージで、植物を機械的接種によってＴＳＷＶで
感染させる。ＴＳＷＶで全身的に感染した植物からの組織を、５体積の氷冷接種
バッファー（１％ Ｎａ２ＳＯ３で補足した１０ｍＭ リン酸バッファー）中で
粉砕し、最初の２つの完全に伸長した新しい葉へのカーボランダム粉末の存在下
でこすりつける。接種した植物を、接種後３週間の間、全身性発達について監視
する。ｐＺＵ６２７配列を含む植物は、ＴＳＷＶ徴候を示さず、一方、非形質転
換コントロール植物は接種７日以内に重度な全身性ＴＳＭＶ徴候を示す。抵抗性
植物を自殖させ、そして種子を収穫する。後代植物を挿入された遺伝子の分離に
ついて分析し、そして次に前記のようにＴＳＷＶ感染に対する抵抗性について再
スクリーニングする。
【００９９】 実施例１４：植物形質転換のためのＣｍｐＳ−ホスホマンノースイソメラーゼ−
ｎｏｓ構築物の構築 ＣｍｐＳプロモーターを、Ｃｍｐｆ−Ｂ（cgcggatcctggcagacaaagtggcaga、配
列番号２９）及びＣｍｐＳ−Ｂ（cgcggatcctacttctaggctacttg、配列番号３０）
プライマーであってＢａｍＨＩ部位にフランキングであるものを使用してＰＣＲ
増幅する。得られるＰＣＲフラグメントをpBluescriptKS（＋）のＢａｍＨＩ部
位にクローニングしｐＮＯＶ４２１１を形成する。
【０１００】 Agrobacterium tumefaciensを介する形質転換のためのバイナリーベクターを
作出するために、ＣｍｐＳプロモーターをｐＮＯＶ４２１１からＢａｍＨＩを使
用して切除し、そしてＰＭＩ遺伝子の上流のＢａｍＨＩ消化したｐＮＯＶ２８０
４に挿入し、そしてｐＮＯＶ２８０４（配列番号３１）と呼ばれるベクターを得
る。ｐＮＯＶ２８０４（配列番号３１）はＶＳ１複製開始点、バックボーンの１
コピーのアグロバクテリウムｖｉｒＧ遺伝子、及びプロモーターを欠くＰＭＩ−
ｎｏｓターミネーター発現カセットであってＴ−ＤＮＡのレフト及びライトボー
ダーの間のものを有するバイナリーベクターである。ＰＭＩ（ホスホマンノース
イソメラーゼ）はE.coli manA遺伝子のコード領域である（Joersbo and Okkels,
1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell
Reports 19:798-803)。ｎｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターはAgrobac
terium tumefaciensＴ−ＤＮＡから得られる（Depicker et al., 1982, J.Mol.A
ppl. Genet.1(6),561-573）。ホスホマンノースイソメラーゼコード領域及びｎ
ｏｓターミネーターをｐＮＯＶ２８０４の、それぞれｎｔ２９０ないしｎｔ１４
６５及びｎｔ１５１６ないし１７８９に位置する（配列番号３１）。
【０１０１】 バイオリスチック形質転換のためのベクターを作出するために、ＣｍｐＳプロ
モーターをｐＮＯＶ４２１１からＢａｍＨＩを使用して切除し、そしてＢａｍＨ
Ｉ消化したｐＮＯＶ３６０４に挿入し（配列番号３２）、ｐＮＯＶ２８２０を形
成し、こうしてＣｍｐＳプロモーターによって駆動されるＰＭＩ発現カセットを
作出する。ｐＮＯＶ３６０４はバイオリスチックフラグメントを調製するための
ベクターであり、そしてｐＵＣ１９に基づき、ＣｏｌＥＩ複製開始点及びアンシ
ピリン抵抗性を付与するベータ−ラクトマンノース遺伝子を有する。ｐＮＯＶ２
８０４のように、ｐＮＯＶ３６０４はまた、プロモーターを欠くＰＭＩ−ｎｏｓ
ターミネーター発現カセット（前記参照）を含む。ホスホマンノースイソメラー
ゼコード領域及びｎｏｓターミネーターは、ｐＮＯＶ３６０４（配列番号３２）
の、それぞれｎｔ４２ないしｎｔ１２１７及びｎｔ１２６８ないし１５４１に位
置する。 バイナリーベクターｐＮＯＶ２８１９をAgrobacterium tumefaciens を介する
形質転換のために使用し、そしてベクターｐＮＯＶ２８２０をバイオリスチック
形質転換のために使用する。
【０１０２】 実施例１５：インプランタの安定的発現のためのＣｍｐＣ−ＧＵＳプラスミドの
構築 １．バイナリーベクターの構築 ベクターｐＣａｍｂｉａ１３０２（Cambia, Canberra, Australia; Roberts,C
.S., Rajagopal,S., Smith, L., Nguyen,T., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.
S.Cao, M.L., Vijayachandra, K., et al.植物の進歩した操作及び効率的な形質
転換のためのモジュラーベクターの総括的セット。Rockfeller Foundation Meet
ing of the International Program on Rice Biotechnology, Malacca, Malaysi
a, September 15-19, 1997で提示された）を選択し、実験のために修飾する：Ｇ
ＦＰ遺伝子の前のＣａＭＶ ３５ＳプロモーターをＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレ
アーゼで位置９７８８で及び位置１でＮｃｏＩエンドヌクレアーゼでの消化によ
って除去し、そして該ベクターを２つのコンパチブル末端でレレゲート（relega
ted)する。位置７６１３でのＸｈｏＩエンドヌクレアーゼで及び位置９４９４で
のＢｓｔＸＩでの消化は、ハイグロマイシン遺伝子及びそれの前のＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターを切除する。３５Ｓプロモーター配列を該ベクターから排除し、
ホモロジーに介在された遺伝子サイレンシングのあらゆるリスクを排除する。 １’プロモーター（Mengiste et al., Plant J, 1997, 12(4):945-948)によっ
て駆動されるｂａｒ遺伝子を、選択マーカーとして位置９７３７のＥｃｏＲＩ部
位に導入する。取得したベクターをｐＣａｍＢａｒと命名する。
【０１０３】 ２．生産された構築物 実施例３に記載したカセットＣｍｐＣＧ及びＣａｐＧを、位置９７６４のＸｂ
ａＩ部位及び位置９７３７のＥｃｏＲＩ部位の間でｐＣａｍＢａｒベクターに挿
入し、それぞれｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧ及びｐＣａｍＢａｒＣａｐＧプラスミ
ドを取得する。２種の構築物を使用し、Agrobacterium tumefaciens細胞を形質
転換する。
【０１０４】 実施例１６：Arabidopsis thalianaにおける安定的発現 １．植物生産及びトランスフェクション Arabidopsis thaliana（コロンビア０）ｗｔ種子を播種し、暗黒で４℃で３日
間低温処理し、発芽を斉一化し、そして成長ルームに移動する（２２℃／２４時
間光）。開いていない芽（buds)の最大数を生産したとき、発芽した植物をイン
フィルトレートした。該インフィルトレーションを、Clugh and Bent, Plant J.
16:735-743,1987によって記載されたプロトコルに従って実施する。
【０１０５】 ２．トランスジェニック植物の選択 Ｔ１世代種子から取得した実生を、ＢＡＳＴＡ除草剤（Pluess-Staufer AG/SA
)(150mg/l)で５日ごとに３回スプレーすることによって選択する。２０のｐＣａ
ｍＢａｒＣｍｐＣＧ及び９のｐＣａｍＢａｒＣａｐＧ抵抗性植物を、選択後に収
集する。これらを記載した条件下で成長させ、Ｔ２世代種子を取得する。これら
の種子は、ｗｔについて前記と同じ処理を経験し、Ｔ２実生はＢＡＳＴＡスプレ
ーによって選択し、そして抵抗性突然変異体をＧＵＳ遺伝子発現について分析す
る。
【０１０６】 ３．安定的に形質転換されたアラビドプシス植物における組織化学的ＧＵＳ発現 実施例１１に記載のように組織化学的ＧＵＳ染色をする。１５ｍｌ培養管中で
、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液中の形質転換実生の浸漬、１０分間１３０ｍＢａｒ圧の適用
及び３７℃で終夜のインキュベーションによって分析を実施する。ｐＣａｍＢａ
ｒＣｍｐＣＧで形質転換したアラビドプシス植物から得られた結果は、すべての
栄養性器官でＣｍｐＣプロモーターによって駆動されるＧＵＳレポーター遺伝子
の構成的発現を指摘している。
【０１０７】 ４．安定的に形質転換されたアラビドプシス植物の定量的酵素的ＧＵＳアッセイ
Ａ．サンプル調製 トランスジェニック系統当たり４植物及びこれらの植物のそれぞれあたり１葉
を試験のために選択する。同じエッペンドルフ管に４葉を収集し、液体窒素で凍
結し、そしてディスポーザルグラインダーで微粉末に粉砕する。これを１５０μ
ｌ ＧＵＳバッファー（０．０５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７、０．０１Ｍ ＥＤＴ
Ａ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％ Ｓａｒｋｏｓｙｌ）中に
希釈し、３７℃で５分間インキュベートし、そして最大スピードで５分間ミクロ
遠心分離で回転させる。上清を新しいエッペンドルフ管に移し、そしてこれらの
サンプルを酵素的試験に使用する。これらの植物エキストラクト中のタンパク質
を、標準としてＢＳＡを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法に従って評価する（Br
adford, M.M.Anal. Biochem.72:248-254,1976)。突然変異系統におけるプロモー
ター及びＧＵＳ遺伝子の存在を、テンプレートとして抽出したサンプルを使用し
てＰＣＲ分析によって確認する。
【０１０８】 Ｂ．蛍光ＧＵＳアッセイ 蛍光ＧＵＳアッセイを、実施例５に記載したようにする。ＧＵＳ遺伝子発現検
出のために、サンプルをＧＵＳバッファーに希釈する。反応を、３７℃でＧＵＳ
反応バッファーの等量の存在下で実施し、そして２Ｍ Ａｍｍｅｄｉｏｌで停止
させる。活性をTitertek Fluoroskan IIにおいて測定する。 ｐＣａｍＢａｒＣｍｐＣＧで形質転換された選択された系統の２０のうち１５
、及びｐＣａｍＢａｒＣａｐＧで形質転換された９系統のうち８は、葉のＧＵＳ
酵素的活性を示す。幾つかのＣｍｐＣＧ形質転換系統中の活性のレベルは、Ｃａ
ｐＧに匹敵する。しかし、結果は、遺伝子型の相違のために、異なるトランスジ
ェニック系統について変わりうる（遺伝子座の数及び遺伝子座あたりの導入遺伝
子挿入の数）。
【０１０９】 実施例１７：ＣｍｐＣプロモーター変異体の構築 すべてのＰＣＲ反応を、実施例１に記載したようにＰｆｕポリメラーゼ(Strat
agene)で実施する。 １．ＤＮＡ増幅及びクローニング ２種の変異体である、ｐＣｍｐＣＧプラスミド（実施例３）のｐＣｍｐＭＧ及
びｐＣｍｐＭｓＧを、生産する。前者はＣｍｐＣプロモーターの配列「ＧＴＧＧ
ＴＣＣＣ」を欠失し、そして後者は配列「ＧＴＧＣＴＣＧＣ」に突然変異してい
る。ｐＣｍｐＭＧを取得するために、３種ＰＣＲ産物を増幅する： ＣｍｐＭ１ Ｃｍｐ１フォワードプライマー（実施例３、配列番号１３参照）、
ＣｍｐＭｒリバースプライマー（ccatcgtggtatttggtattg、配列番号３３）及び
テンプレートしてのｐＣｍｐＣＧプラスミドをテンプレートとして使用する。
【０１１０】 ＣｍｐＭ２ ＣｍｐＭｆフォワードプライマ（caataccaaataccacgatgg、配列番
号３４）、ＣｍｐＣ２リバースプライマー（実施例３；配列番号１４参照）及び
テンプレートとしてのｐＣｍｐＣＧプラスミドを使用する。 ＣｍｐＭ Ｃｍｐ１フォワードプライマー、ＣｍｐＣ２リバースプライマー及び
テンプレートとしての等モルの混合物のＣｍｐＭ１及びＣｍｐＭ２ ＰＣＲ産物
を使用する。
【０１１１】 ｐＣｍｐＭｓＧを取得するために、３種のＰＣＲ産物を増幅する： ＣｍｐＭｓ１ Ｃｍｐ１フォワードプライー、ＣｍｐＭｒｓリバースプライマー
（cgtggtagcgagcactttggt、配列番号３５）及びテンプレートとしてのｐＣｍｐ
ＣＧを使用する。 ＣｍｐＭｓ２ ＣｍｐＭｆｓフォワードプライマー（aagtgctcgctaccacgatgg、
配列番号３６）、Ｃｍｐ２リバースプライマー及びテンプレートとしてのｐＣｍ
ｐＣＧプラスミドを使用する ＣｍｐｓＭ Ｃｍｐ１フォワードプライマー、Ｃｍｐ２リバースプライマー及び
テンプレートしての等モルの混合物のＣｍｐＭｓ１及びＣｍｐＭｓ２ＰＣＲ産物
を使用する。 ｐＣｍｐＭＧ及びｐＣｍｐＭｓＧプラスミドを取得するために、もとのｐＣｍ
ｐＣＧプラスミドをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで制限し、Ｃｍ
ｐＣフラグメントを排除し、そしてその代わりにＣｍｐＭ及びＣｍｐＭｓ ＰＣ
Ｒ産物を挿入する。
【０１１２】 実施例１８：ｐＣｍｐＭ及びｐＣｍｐＭｓ構築物でのトランジエント発現実験 １．懸濁培養及びプロトプラスト調製 懸濁培養及びプロトプラストを実施例４に記載のように生産する。 ２．ＧＵＳアッセイ トランフェニクション及びタンパク質エキストラクト調製を、実施例４に記載
のように実施し、そしてＧＵＳアッセイを実施例５に記載の用に実施する。 ＧＵＳアッセイ結果を、１０の異なる実験の平均から取得し、標準クローン値
に標準化した。ＣｍｐＣＧ構築物中の「ＧＴＧＧＴＣＣＣ」配列の欠失は、ＧＵ
Ｓレポーター遺伝子の発現を、すべてのプロトプラスト種（以下参照）のＣｍｐ
ＣからのＧＵＳレポーター遺伝子発現の約５０％に減少させる。「ＧＴＧＣＴＣ
ＧＣ」突然変異によって誘導された効果は、植物種に依存する。O. violaceus及
びO.sativaプロトプラストにおいて、ＧＵＳ遺伝子発現のレベルは、それぞれ６
５．２％及び７３．６％へ減少している。N.plumbaginifoliaプロトプラストに
おいて、ＣｍｐＭｓプロモーター活性はＣｍｐＭプロモーターに類似する。
【０１１３】
【表６】
【表７】
【表８】
【０１１４】 実施例１９：ＧＦＰ又はＧＵＳレポーター遺伝子に作動可能に連結された５’−
プロモーターフラグメントを含む植物形質転換ベクターの構築 １．プロモーター増幅及びクローニング キメラ遺伝子を構築し、それは、イントロンを有する植物最適化ＧＦＰ（ｓｙ
ｎＧＦＰＩ、配列番号３７）又はイントロンを有するＧＵＳレポーター遺伝子（
ＧＩＧ；配列番号３８）配列に融合された、ＣｍＹＬＣＶ完全長転写物プロモー
ター（配列番号１）からのＤＮＡ配列を含む。ＧＩＧ遺伝子は、配列番号３８の
ｎｔ３８５ないしｎｔ５７６のSolanum tuberosumからのＳＴ−ＬＳ１イントロ
ン（Dr. Stanton Gelvin, Purdue Universityから取得し、そしてNarasimhulu,
et al 1996, Plant Cell, 8:876-886.に記載されている）を含む。ＳｙｎＧＦＰ
Ｉは、ＳＴ−ＬＳ１イントロンが導入されている（配列番号３７のｎｔ２７８な
いしｎｔ４６５）植物最適化ＧＦＰ遺伝子である。プロモーターのために、Ｃｍ
ＹＬＣＶゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのテンプレート
として使用する。遺伝子特異的プライマーを該ＤＮＡ配列を増幅するために設計
する。ＣｍｐＣ（配列番号２）に対応する、遺伝子フラグメントを、Ｃｍｐｆ−
Ｂフォワードプライマー（配列番号２９）をリバースプライマーとして５’ない
し３’プライマー cgcggattgctcccttaacaatgagg （配列番号３９）と組み合わ
せて使用して単離する。ＣｍｐＳ（配列番号３）に対応する、遺伝子フラグメン
トを、Ｃｍｐｆ−Ｂ（配列番号２９）フォワードプライマーをＣｍｐＳ−Ｂリバ
ースプライマー（配列番号３０）と組み合わせて使用して単離する。すべての３
種のプライマーは、それらの５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位ＣＧＣＧＧ
Ａを含む。すべてのＰＣＲ反応を製造者の推奨（Stratagene)に従ってＰｆｕポ
リメラーゼで実施する。サーモサイクラー（ＤＮＡ Engine, MJResearch, Inc.
Waltham, MA USA)を使用し、プロモーターフラグメント増幅し、以下のＰＣＲ条
件を使用する：[（９４℃：１０ｓ）：（９４℃：１０ｓ／５６℃：３０ｓ／７
２℃：１ｍｉｎ）Ｘ２０]：（７２℃：１．５ｍ）]。ＢａｍＨＩでの制限消化に
続いて、プロモーターフラグメントをｐＵＣに基づくベクターに、ＧＩＧ遺伝子
又はｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子とライゲートし、ｎｏｓターミネーターと作動可能に
連結されたプロモーター−レポーター遺伝子融合物を作出する。
【０１１５】 ２．生産したプロモーター−レポーターカセット ・ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番
号４０） ・ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４１）
・ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番
号４２） ・ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋ｎｏｓ（配列番号４３）
【表９】
【０１１６】 ３．アグロバクテリウムバイナリーベクターヘのサブクローニング プロモーターフラグメント、レポーター遺伝子及びｎｏｓターミネーターを含
むプロモーター−レポーターカセット（配列番号４０ないし４３）を、トウモロ
コシのためにバイナリーベクターｐＮＯＶ２１１７及びトマト形質転換のために
バイナリーベクターｐＮＯＶ４２００に挿入する。ｐＮＯＶ２１１７（配列番号
４４）は、ＶＳ１複製開始点、バックボーン中のアグロバクテリウムｖｉｒＧ遺
伝子の１コピー、及びＴ−ＤＮＡのレフト及びライトボーダーの間のトウモロコ
シユビキチンプロモーター−ＰＭＩ遺伝子−ｎｏｓターミネーター発現カセット
を有するバイナリーベクターである。ＰＭＩ（ホスホマンノースイソメラーゼ）
はE.coliｍａｎＡ遺伝子のコード領域である（Joersbo and Okkels, 1996, Plan
t Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports19:7
98-803)。ｎｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターをAgrobacterium tumef
aciensＴ−ＤＮＡから取得する（Depicker et al, 1982,J.Mol. Appl.Genet. 1(
6),561-573)。トウモロコシユビキチンプロモーター、ホスホマンノースイソメ
ラーゼコード領域及びｎｏｓターミネーターは、それぞれ、ｐＮＯＶ２１１７（
配列番号４４）のｎｔ３１ないしｎｔ２０１２、ｎｔ２１０９ないしｎｔ３２１
２及びｎｔ３２７３ないし３５２１に位置する。レポーター−プロモーターカセ
ットを、ライトボーダーの近傍に挿入する。バイナリーベクター中の選択マーカ
ー発現カセットは、レフトボーダーの近傍にある。
【０１１７】 トマト形質転換のために、ｐＮＯＶ４２００（配列番号４５）をバイナリーベ
クターとして使用し、これは、ＶＳ１複製開始点、バックボーン中の１コピーの
アグロバクテリウムｖｉｒＧ遺伝子、及びハイグロマイシン選択マーカーカセッ
トであってレフト及びライトボーダー配列の間であるものを含む。ハイグロマイ
シン選択マーカーカセットは、ハイグロマイシン抵抗性をコードする遺伝子に作
動可能に連結された、アラビドプシスユビキチン３プロモーター（Ｕｂｑ３（Ａ
ｔ）、Callis et al., J. Biol. Chem. 265:12486-12493(1990))（ここで「ＨＹ
Ｇ」と命名し、E.coliからの合成ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ
遺伝子、特許：JP 1986085192-A1 30-APR-1986)及びｎｏｓターミネーター（Dep
icker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6),561-573(1982)を含む。アラビドプ
シスユビキチンプロモーター、ＨＹＧ遺伝子及びｎｏｓターミネーターは、それ
ぞれｐＮＯＶ４２００（配列番号４５）のｎｔ１６２ないしｎｔ１１４９４、ｎ
ｔ１８９７ないしｎｔ２９３９及びｎｔ２９３９ないしｎｔ３２３６に位置する
。レポーター−プロモーターカセット（配列番号４０ないし４３）をライトボー
ダーの近傍に挿入する。バイナリーベクターの選択マーカー発現カセットはレフ
トボーダーの近傍である。 バイナリーベクター構築物中の選択マーカー及びプロモーター−レポーターカ
セットの方向を、以下に示す。
【０１１８】 ４．バイナリーベクター構築物： ・ＮＯＶ４２１５（ＲＢ ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ
遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ） ・ＮＯＶ４２１６（ＲＢ ｎｏｓ＋ｓｙｎＧＦＰＩ遺伝子＋ＣｍｐＳプロモータ
ーフラグメント−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ） ・ＮＯＶ４２１７（ＲＢ ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ
遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ） ・ＮＯＶ４２２０（ＲＢ ＣｍｐＳプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋
ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ） ・ＮＯＶ４２２４（ＲＢ ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ＧＩＧ遺伝子＋
ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ） ・ＮＯＶ４２２６（ＲＢ ＣｍｐＣプロモーターフラグメント＋ｓｙｎＧＦＰＩ
遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓＬＢ）
【０１１９】 追加的カセットを、比較のために使用すべき既知のプロモーターと構築する。
この目的のために、プロモーターカセット、ＺｍＵｂｉ−ＧＦＰ−３５Ｓｔｅｒ
ｍ（配列番号４６）であって、ｓｙｎＧＦＰ及び３５Ｓターミネーター（３５Ｓ
ｔｅｒｍ）に作動可能に連結された、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ch
ristensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619-632(1989))を含むものを構築し
、そしてＧＩＧ遺伝子及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたトウモ
ロコシユビキチンプロモーターを含むプロモーターカセット（ＮＯＶ３６１２、
配列番号４７）をまた構築する ＺｍＵｂｉプロモーター、ＧＦＰ遺伝子及び３
５Ｓターミネーターは、配列番号４６のそれぞれｎｔ１ないしｎｔ２０１９、ｎ
ｔ２０２０ないしｎｔ２７１５及びｎｔ２８７６ないしｎｔ２９４９に位置する
。ＺｍＵｂｉプロモーター、ＧＩＧ遺伝子およびｎｏｓターミネーターは、配列
番号４７のそれぞれ、ｎｔ１ないしｎｔ１９８２、ｎｔ２０１５ないしｎｔ４０
１５およびｎｔ４０６９ないし４３４１に位置する。ＺｍＵｂｉ−ＧＩＧｎｏｓ
カセット（配列番号４７）をｐＵＣに基づくベクターにクローニングする。Ｚｍ
Ｕｂｉ−ＧＦＰ−ｎｏｓカセット（配列番号４６）を前記の様に、トウモロコシ
形質転換のためのｐＮＯＶ２１１７バイナリーベクターにクローニングする。
【０１２０】 ｓｙｎＧＦＰＩ及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたアラビドプ
シスユビキチン３プロモーター（Ｕｂｑ３（Ａｔ））（配列番号４８）及びＧＩ
Ｇ遺伝子及びｎｏｓターミネーターに作動可能に連結されたアラビドプシスユビ
キチン３プロモーター（配列番号４９）を構築する。該ユビキチン３プロモータ
ー、ｓｙｎＧＦＰＩ及びｎｏｓターミネーターは、配列番号４８の、それぞれｎ
ｔ１ないしｎｔ１３３２、ｎｔ１７３８ないしｎｔ２６５８及びｎｔ２６７０な
いしｎｔ２９４３に位置する。ユビキチン３プロモーター、ＧＩＧ遺伝子および
ｎｏｓターミネーターは、配列番号４９のそれぞれ、ｎｔ１ないしｎｔ１３３５
、ｎｔ１７４６ないしｎｔ３７４６およびｎｔ３８００ないしｎｔ４０７２に位
置する。前記の様に、プロモーターカセットを、トマト形質転換のためのハイグ
ロマイン選択マーカーカセットを含むｐＮＯＶ４２００バイナリーベクターにク
ローニングする。バイナリーベクターにおける選択マーカー及びプロモーター−
レポーターカセットの方向は以下に示す。
【０１２１】 ５．バイナリーベクター構築物 ・ＮＯＶ２１１０（ＲＢ ＺｍＵｂｉプロモーター＋ｓｙｎＧＦＰ遺伝子＋３５
Ｓｔｅｒｍ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓ ＬＢ） ・ＮＯＶ４２０９（ＲＢ Ｕｂｑ３（Ａｔ）プロモーター＋ｓｙｎＧＦＩＰ遺伝
子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓ ＬＢ） ・ＮＯＶ４２０８（ＲＢ Ｕｂｑ３（Ａｔ）プロモーター＋ＧＵＳ−イントロン
−ＧＵＳ遺伝子＋ｎｏｓ−Ｕｂｑ３（Ａｔ）＋ＨＹＧ遺伝子＋ｎｏｓ ＬＢ）
【０１２２】 実施例２０：トウモロコシのアグロバクテリウム介在形質転換 未成熟トウモロコシ胚の形質転換を、Negrotto et al.,(2000)Plant Cell Rep
orts 19:798-803に記載されたように本質的に実施する。この例のために、すべ
ての培地構成成分は、前掲のNegrotto et alに記載された通りである。しかし、
文献中の種々の培地構成成分を置換しうる。
【０１２３】 １．形質転換プラスミド及び選択マーカー 形質転換のために使用した遺伝子を、実施例１９に記載したようにトウモロコ
シ形質転換のために適当なベクターにクローニングする。使用されたベクターは
、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子(Negrotto et al., (2000)Pl
ant Cell Reports 19:798-803)を含む。 ２．Agrobacterium tumefaciensの調製 植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳ
Ｂ１）を、ＹＥＰ（酵母エキストラクト（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）
、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、１５ｇ／ｌ アガー、ｐＨ６．８）固体培地上で２な
いし４日間２８℃で成長させる。およそ０．８Ｘ１０９ アグロバクテリウムを
、１００μＭ アセトシリンゴン（Ａｓ）（Negrotto et al., (2000)Plant Cel
l Rep 19:798-803)で補足したＬＳ−ｉｎｆ培地において懸濁する。細菌をこの
培地中で３０−６０分間予め誘導する。
【０１２４】 ３．接種 Ａ１８８又は他のトウモロコシ遺伝子型からの未成熟胚を８−１２日齢雌穂か
ら液体ＬＳ−ｉｎｆ＋１００μＭ Ａｓに切除する。胚を新鮮感染培地で１回リ
ンスする。アグロバクテリウム溶液を次いで添加し、そして胚を３０秒間撹拌し
、５分間細菌を据えるに任せる。この胚を次いで、ＬＳＡ培地に胚盤側を上にし
て移し、そして暗黒で２ないし３日間培養する。次いで、ペトリプレートにつき
２０と２５の間の胚を、セフォタキシム（２５０ｍｇ／ｌ）及び硝酸銀（１．６
ｍｇ／ｌ）で補足したＬＳＤｃ培地に移し、そして暗黒で２８℃で１０日間培養
する。
【０１２５】 ４．形質転換細胞の選択及び形質転換植物の再生 肺形成性カルスを生産する未熟胚を、ＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地に移す。カルチ
ャーをこの培地上で、３週でサブカルチャーステップとともに、６週間選択する
。生存しているカルスをＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地又はバルクアップ又はＲｅｇ１
培地のいずれかに移す。明条件（１６時間明／８時間暗期方式）での培養に続い
て、緑色組織を次いで、成長調節物質のないＲｅｇ２培地に移し、そして１−２
週間インキュベートする。プラントレットを、Ｒｅｇ培地を含むMagenta GA-7ボ
ックス（Magenta Crop, Chicaggo III)に移し、そして明条件で成長させる。プ
ロモーター−レポーターカセットについてＰＣＲ陽性である植物を、土壌に移し
、グリーンハウスで成長させる。
【０１２６】 実施例２１：トマトの安定的形質転換 トマトの形質転換をMeissner et al., The Plant Journal 12:1465-1472,1997
に記載されたように本質的に実施する。 １．形質転換プラスミド及び選択マーカー 形質転換のために使用した遺伝子を、実施例１９に記載したように、トマト形
質転換に好適なバイナリーベクターにクローニングする。ベクターは、選択のた
めのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含む。
【０１２７】 ２．Agrobacterium thmefaciensの調製 植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム菌株ＧＶ３１０１を、ＬＢ
（酵母エキストラクト（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ
／Ｌ）、１５ｇ／Ｌ アガー、ｐＨ６．８）液体培地上で２週間２２℃で成長さ
せる。近似的に０．８Ｘ１０９アグロバクテリウムを、１００μＭ アセトシリ
ンゴンで補足した、ＫＣＭＳ接種培地（ＭＳ塩（４．３ｇ／ｌ）、Ｍｙｏ−Ｉｎ
ｏｓｉｔｏｌ、チアミン（１.３μｇ／ｍｌ）、２，４−Ｄ（０．２μｇ／ｍｌ
）、カイネチン ０．１μｇ／ｍｌ及び３％ スクロース、ｐＨ５．５）におい
て懸濁する。細菌をこの培地中で６０分間予め誘導する。
【０１２８】 ３．種子滅菌及び発芽 トマトのＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ品種の種子（Meissner et al., The Plant Journ
al 12:1465-1472, 1997)及びＺＴＶ−８４０品種を、Ｔｗｅｅｎ２０と２０％
ブリーチ溶液に２０分間浸漬する。種子を次いで、滅菌水で３回洗浄し、そして
ＴＳＧ培地（１／２ＭＳ塩、１％ スクロース、１％ ファイトアガー、ｐH５
．８）上に、発芽のためにMagentaボックス（Magenta Crop, Chicago III)にお
いておく。子葉を切除し、そして子葉軸（cotyledon petioles）を、発芽７ない
し１０日後に５ｍｍセグメントに切断する。
【０１２９】 ４．接種 ７ないし１０日齢子葉及び子葉軸セグメントを、アグロバクテリウム接種に先
立ち、タバコＢＹ−２フィーダー細胞プレート（MS塩、Ｍｙｏ−ｉｎｓｉｔｏｌ
０．１ｍｇ／ｍｌ、カゼインヒドロライセート ０．２ｍｇ／ｍｌ、チアミン
−ＨＣｌ １．３μｇ／ｍｌ、３％ スクロース、ｐＨ５．５）上で２４時間イ
ンキュベートする。 子葉を液体ＫＣＭＳアグロバクテリウム懸濁液に５分間浸す。２０と２５の間
の子葉を次いで、胚軸側を上にして同じフィーダー細胞プレート上に移し、そし
て２ないし３日間暗黒下で培養する。
【０１３０】 ５．形質転換した子葉及び子葉葉柄の選択及び形質転換植物の再生 子葉及び葉柄(petioles)セグメントを、明条件で、アグロバクテリウムでの接
種２ないし３日後、選択培地ＴＳＭ−１（４．３ｇ／ｌ ＭＳ塩、１ＸＢ５ ビ
タミン、２％ スクロース、１％ グルコース、１μｇ／ｍｌ ゼアチン、０．
０５μｇ／ｍｌ ＩＡＡ，５μｇ／ｍｌ ハイグロマイシン、及び２５０μｇ／
ｍｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８）に移す。胚形成性カルスを生産する子葉及
び葉柄セグメントを、TRM培地（４．３ｇ／ｌ ＭＳ塩、１ＸＭＳビタミン、２
％ スクロース、１μｇ／ｍｌ ゼアチン、５μｇ／ｍｌ ハイグロマイシンお
よび２５０μｇ／ｍｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８）に移す。プラントレット
を形成する生存しているカルスをＴＲＭ培地（４．３ｇ／ｌ ＭＳ塩、１ＸＭＳ
ビタミン、２％ スクロース ｐＨ５．８）を含むMagenta(Magenta Crop, Chic
ago III）に移し、そして明条件で成長させる。一次根形成後、形質転換体を土
壌に移す。
【０１３１】 実施例２２：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光アッセイ ｓｙｎＧＦＰ発現の検出のために、蛍光アッセイを実施する。安定的に形質転
換されたトウモロコシ及びトマトのリーフディスクをドライアイスで凍結する。
凍結組織を完全に磨砕し、そして３００μｌのＧＦＰ抽出バッファー（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．１％ Ｓａｒｃｏｓｙｌ）と混合する。エキスト
ラクトを遠心分離によって葉残骸から分離し、透明底の９６ウェル黒色プレート
への移動が続く（Costar3615)。相対的蛍光単位（RFU)を、４６５ｎｍ励起およ
び５１２ｎｍ放射でSpectra Fluor Plus Plate Reader によって測定する。ＧＦ
Ｐ活性をＢＣＡアッセイ（Pierceに従って）を使用して測定された総タンパク質
に対して標準化する。
【０１３２】 実施例３２：安定に形質転換されたトウモロコシ及びトマト植物の発現分析 １．Zea maysトランスジェニックＴ０植物 GFP発現は、ＺｍＵｂｉプロモーター（ＮＯＶ２１１０）と比較して、Ｃｍｐ
Ｓプロモーターの制御下で（ＮＯＶ４２１５、ＮＯＶ４２１６）、１０−２０倍
より高い。これらの結果を、全部で９３Ｔ０植物を表す４２独立Ｔ０系統の葉サ
ンプルから取得する。
【０１３３】 ２．ＧＦＰ Ｅｌｉｓａアッセイ 定量的サンドイッチイムノアッセイを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の検出の
ために実施する。２種の商業的に入手可能なポリクローナル抗体を使用する。ヤ
ギ抗ＧＦＰ ＩＡＰ（Rockland,#600-1-1-215)をイムノアフィニティ精製し、そ
してウサギ抗ＧＦＰ抗体(Torrey Pines Biolabs, #TP401）はタンパク質Ａ精製
する。植物エキストラクト中のＧＦＰタンパク質をウサギ抗体によって固相マイ
クロタイターに捕捉する。次いで「サンドイッチ」を固相ウサギ抗体、ＧＦＰタ
ンパク質、及びウェル中の第２のヤギ抗体の間に形成する。洗浄ステップ後、こ
こで非結合の第２抗体を除去し、結合抗体をアルカリフォスファターゼ標識した
抗体を使用して検出する。酵素のための基質を転化し、そして呈色発生をそれぞ
れのウェルの吸光度を読むことによって測定する。読みを次いで、標準曲線に適
合させ、吸光度に対するＧＦＰ濃度値をプロットする。
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】 ２．Lycopersicon esculentumＴ０植物 ＣｍＹＬＣＶプロモーターのＣｍｐＳフラグメント（ＮＯＶ４２１７）は、ア
ラビドプシス（ＮＯＶ４２０９）のＵｂｑ３プロモーターの発現レベルよりも(t
hen)有意に高いｓｙｎＧＦＰ発現レベルという結果である。
【０１３６】 ｓｙｎＧＦＰレポーター遺伝子 結果を、ＮＯＶ４２１７カセットで形質転換した５独立的安定的形質転換カル
ス系統及びＮＯＶ４２０９カセットで形質転換した２独立的安定的形質転換カル
ス系統の、カルス及び一次シュートの顕微鏡観察法によってｓｙｎＧＦＰ蛍光の
強度を評価することから取得する。
【０１３７】
【表１１】
【０１３８】 Ｇｕｓ−イントロン−ＧＵＳレポーター遺伝子 毛ｋｋをＣｍｐＳプロモーター−レポーターカセットを含む１１独立的安定的
形質転換カルス系統（系統ＮＯＶ４２２０−１ないしＮＯＶ４２２０−１１）の
ＧＵＳ染色の強度を評価することから取得する。ＣｍＹＬＣＶプロモーターのＣ
ｍｐＣプロモーターフラグメントを含む２安定的形質転換カルス系統（ＮＯＶ４
２２４−１、ＮＯＶ４２２４−２）を評価する。比較のために、アラビドプシス
ユビキチン３（Ｕｂｑ３）プロモーター（ＮＯＶ４２０８−１、ＮＯＶ４２０８
−２）を含む２安定的形質転換カルス系統を評価する。
【０１３９】
【表１２】
【０１４０】
【表１３】
【０１４１】 実施例２４：トウモロコシのトランジエント発現実験 １．胚調製 Ａ１８８又は他の好適なトウモロコシ遺伝子型からの未成熟胚を８−１２日齢
雌穂から液体２ＤＧ４＋０．５ｄ（１０ｇ／ｌ マンノースで補足された、２０
ｍｇ／ｌグルコースを含むように修飾されたDuncan's D培地 )に切除し、そして
１ないし２日間培養する。 ２．プラスモリシス 未成熟胚を１２％ スクロース溶液中で、ボンバードメントに先立ち３−４時
間インキュベートする。胚をプレート上で８−１０ｍｍ円に配列する。
【０１４２】 ３．ボンバードメント トウモロコシ胚のParticle Bombardmentによるトランスフェクションを、記載
されたように（Wright et al., 2001, Plant Cell Reports, In Press)６５０ｐ
ｓｉで５μｇのプラスミドＤＮＡの存在下で実施する。「インプレス」文献の場
合は引用しない。論文から詳細をここにとりあげる： フラグメントＤＮＡをDupont Biolistics Manualに記載されたように金のマイ
クロキャリアー（＜１μｍ）に沈殿させる。遺伝子を、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ i
olistics装置を使用して標的組織細胞に送達する。装置のセッティングは、以下
の通りである：ラプチュアディスクとマクロキャリアーの間は８ｍｍ、マクロキ
ャリアーとストッピングスクリーンの間は１０ｍｍ及びストッピングスクリーン
と標的の間は７ｃｍ。プレートを６５０ｐｓｉ−ラプチュアディスクを使用して
ＤＮＡコートした粒子で２回撃つ。ヘリウム爆風の衝撃波からの組織損傷を減少
させるために、ステンレススチールメッシュであって、水平及び垂直に直線イン
チあたり２００の開口のもの（Mcmaster-Carr, New Brunswick, NJ）を、ストッ
ピングスクリーンと標的の間に置く。胚を２５℃で４８時間プレート上で培養す
る。タンパク質エキストラクトをＧＵＳバッファー中で細胞を溶解させることに
よって調製し、そして遠心分離で清浄化する。
【０１４３】 実施例２５：ＧＵＳアッセイ ＧＵＳ遺伝子発現の検出のために、組織化学的及び化学蛍光アッセイを実施す
る。 １．組織化学的β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）アッセイ トウモロコシ胚及びトマトインビトロカルス系統をＧＵＳアッセイに使用する
。胚全体又はカルスの小断片をＧＵＳ染色溶液に浸漬する。ＧＵＳ染色溶液は、
１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロナイド（Ｘ−Ｇｌｕ
ｃ, Duchefa, DMSO中の20mMストック）、１００ｍＭ Ｎａ―フォスフェートバ
ッファーｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、及び０．１％ Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ１００を含む。組織サンプルを１−１６時間３７℃でインキュベートす
る。必要ならば、サンプルを７０％ ＥｔＯＨで数回洗浄し、クロロフィルを除
去する。
【０１４４】 ２．β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）化学蛍光アッセイ Ｇｕｓ発現の定量的アッセイのために、ＧＵＳ化学蛍光アッセイを、製造者の
指示に従ってＧＵＳ−ＬｉｇｈｔＫｉｔ（Tropix. Inc)を使用して実施する。活
性をＬｕｉｍｏｍｅｔｅｒで測定する。 構築物ｐＣｍｐＳ及びｐＣｍｐＭＧでのＧＵＳ結果（実施例１７）を、比較ク
ローン値（ｐＮＯＶ３６１２、実施例１９）に対して標準化する。２つの異なる
実験から取得した結果は、ＣｍＹＬＣＶプロモーターにおける８ｂｐ 欠失（ｐ
ＣｍｐＭＧ、実施例１７）が、ｐＣｍｐＳと比較してＧＵＳレポーターの発現レ
ベルに有意に影響を与えないことを示す。
【０１４５】 Z. mays胚におけるトランジエント発現
【表１４】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０１１０１８０２．５ (32)優先日 平成13年１月26日(2001．1．26) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ６０／２７２，０７６ (32)優先日 平成13年２月28日(2001．2．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ペトルス・テオドルス・デ・ハーン オランダ、エヌエル−2343エルエル・ウー フストヘースト、フィンセント・ファン・ ゴッホラーン46番 (72)発明者 ホープ・トンプソン・リゴン アメリカ合衆国27539ノースカロライナ州 エイペックス、サウス・ポイント・ドライ ブ3616番 (72)発明者 マリア・コノノワ アメリカ合衆国27613ノースカロライナ州 ローリー、ストロベリー・メドーズ・スト リート7920番 Ｆターム(参考） 2B030 AB04 CA05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 AA20 CA01 CA20 DA01 EA01 EA04 FA02 GA11 GA17 HA20 4B065 AA88X AA95Y AB01 AC14 BA02 BD50 CA53

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、関連（associat
    ed)ヌクレオチド配列の発現を駆動することのできるＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 配列番号２に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    のＤＮＡ配列。
  3. 【請求項３】 配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    のＤＮＡ配列。
  4. 【請求項４】 配列番号４に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    のＤＮＡ配列。
  5. 【請求項５】 配列番号５に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    のＤＮＡ配列。
  6. 【請求項６】 配列番号６に示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    のＤＮＡ配列。
  7. 【請求項７】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番
    号５又は配列番号６のいずれかにストリンジェント条件でハイブリダイズするＤ
    ＮＡ配列。
  8. 【請求項８】 配列番号１９に示すヌクレオチド配列を含む、請求項７に記
    載のＤＮＡ配列。
  9. 【請求項９】 配列番号２０に示すヌクレオチド配列を含む、請求項７に記
    載のＤＮＡ配列。
  10. 【請求項１０】 関連ヌクレオチド配列の発現を駆動することのできる、配
    列番号１の少なくとも５０ｎｔの連続範囲を含むＤＮＡ配列。
  11. 【請求項１１】 少なくとも５０ｎｔの連続範囲が、配列番号１の少なくと
    も５０ｎｔの連続範囲と少なくとも７０％配列同一性を有する、請求項１０に記
    載のＤＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 ケストルムイエローリーフカーリングウイルスから単離さ
    れた完全長転写物プロモーターを含む組換え体ＤＮＡ分子。
  13. 【請求項１３】 所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、請求項
    １ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含む組換え体ＤＮＡ分子。
  14. 【請求項１４】 所望のヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項１３
    に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
  15. 【請求項１５】 コード配列が望ましい表現型形質をコードする、請求項１
    ４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
  16. 【請求項１６】 コード配列が、当該コード配列で形質転換された細胞に陽
    性選択的優位性を付与するタンパク質をコードする、請求項１５に記載の組換え
    体ＤＮＡ分子。
  17. 【請求項１７】 コード配列が、化合物を代謝することのできるものからな
    る当該コード配列で形質転換された細胞に代謝優位性を付与するタンパク質をコ
    ードする、請求項１５又は１６に記載の組換え体ＤＮＡ分子であって、当該化合
    物が、マンノース又はキシロースまたはそれらの誘導体又は前駆体、又はタンパ
    ク質の基質であるか、または当該コード配列で形質転換された細胞によって、そ
    のような基質に代謝されることのできる、組換え体ＤＮＡ分子。
  18. 【請求項１８】 コード配列が、キシロイソメラーゼ、ホスホマンノ−イソ
    メラーゼ、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ、マンノース−１−フ
    ォスフェートイソメラーゼ、フォスフォマンノムターゼ、マンノースエピメラー
    ゼ、マンノース又はキシロースフォスファターゼ、マンノース−６−フォスファ
    ターゼ、マンノース−１−フォスファターゼ及びマンノース又はキシロースパー
    ミアーゼからなる群より選択される酵素をコードする、請求項１７に記載の組換
    え体ＤＮＡ分子。
  19. 【請求項１９】 コード配列がフォスフォマンノイソメラーゼをコードする
    、請求項１８に記載の組換え体分子。
  20. 【請求項２０】 コード領域が非翻訳である、請求項１４に記載の組換え体
    ＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 非翻訳コード領域がウイルス遺伝子由来である、請求項２
    ０に記載の組換え体ＤＮＡ。
  22. 【請求項２２】 ウイルス遺伝子がＴＳＷＶ、特にＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子に
    由来する、請求項２１に記載の組換え体ＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 コード配列がアンチセンス方向である、請求項１４に記載
    の組換え体ＤＮＡ分子。
  24. 【請求項２４】 請求項１ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ配列または
    請求項１２ないし２３のいずれかの組換え体ＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ発現ベク
    ター。
  25. 【請求項２５】 ＤＮＡ発現ベクターがｐＮＯＶ２８１９である、請求項２
    ４のＤＮＡ発現ベクター。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡ発現ベクターがｐＮＯＶ２８２０である、請求項２
    ４のＤＮＡ発現ベクター。
  27. 【請求項２７】 所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１
    ないし１１のいずれかに記載の第１のＤＮＡ配列、及び所望のヌクレオチド配列
    に作動可能に連結された請求項１ないし１１のいずれかに記載の第２のＤＮＡ配
    列を含む、ＤＮＡ発現ベクター。
  28. 【請求項２８】 ウイルスゲノムの発現を変化させることのできる、請求項
    ２７に記載のＤＮＡ発現ベクター。
  29. 【請求項２９】 当該ウイルスゲノムまたはその一部のセンスＲＮＡフラグ
    メントを細胞で発現することのできる第１のＤＮＡ配列、及び当該ウイルスゲノ
    ムまたはその一部のアンチセンスＲＮＡフラグメントを細胞で発現することので
    きる第２のＤＮＡ配列を含む請求項２８に記載のＤＮＡ発現ベクターであって、
    当該センスＲＮＡフラグメント及び当該アンチセンスＲＮＡフラグメントが二本
    鎖ＲＮＡを形成することのできる、ベクター。
  30. 【請求項３０】 当該ウイルスが、トスポウイルス、ポティウイルス、ポテ
    ックスウイルス、トバモウイルス、ルテオウイルス、ククモウイルス、ブロモウ
    イルス、クロステオルウイルス（closteorviruses)、トムブスウイルス及びフロ
    ウイルスからなる群より選択される、請求項２９に記載のＤＮＡ発現ベクター。
  31. 【請求項３１】 ウイルスコートタンパク質遺伝子、ウイルスヌクレオキャ
    プシドタンパク質遺伝子、ウイルスレプリカーゼ遺伝子、またはウイルスムーブ
    メントタンパク質遺伝子又はそれらの一部に由来するヌクレオチド配列を含む、
    請求項３０に記載のＤＮＡ発現ベクター。
  32. 【請求項３２】 当該ＤＮＡ配列が、トマト黄化えそ病ウイルス（ＴＳＷＶ
    ）に由来する、請求項３１に記載のＤＮＡ発現ベクター。
  33. 【請求項３３】 当該ＤＮＡがヌクレオキャプシド遺伝子に由来する、請求
    項３２に記載のＤＮＡ発現ベクター。
  34. 【請求項３４】 請求項１ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ配列、又は
    請求項１２ないし２３のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子、又は請求項２４
    ないし３３のいずれかに記載のＤＮＡ発現ベクターで、安定的に形質転換された
    宿主細胞。
  35. 【請求項３５】 宿主細胞が植物細胞である、請求項３４の宿主細胞。
  36. 【請求項３６】 請求項１ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡ配列、又は
    請求項１２ないし２３のいずれかに記載の組換え体ＤＮＡ分子、又は請求項２４
    ないし３３のいずれかに記載のＤＮＡ発現ベクターで、安定的に形質転換された
    植物及びその後代。
  37. 【請求項３７】 当該植物が、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ライムギ
    、エンバク、シバクサ、イネ、オオムギ、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ及び
    ナタネからなる群より選択される、請求項３６の植物。
  38. 【請求項３８】 所望のヌクレオチド配列を発現させるための、請求項１な
    いし１１のいずれかのＤＮＡ配列の使用。
  39. 【請求項３９】 ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応によって生産される、請求
    項１に記載のＤＮＡ配列を生産する方法であって、少なくとも１つの使用される
    オリゴヌクレオチドが配列番号１の１５又は１６以上の塩基対の連続範囲を示す
    ヌクレオチドの配列を含む、方法。
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