PL204327B1 - Wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, zrekombinowana cząsteczka DNA, wektor ekspresji DNA, transgeniczna komórka gospodarza i roślina transgeniczna i jej potomstwo - Google Patents

Wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, zrekombinowana cząsteczka DNA, wektor ekspresji DNA, transgeniczna komórka gospodarza i roślina transgeniczna i jej potomstwo

Info

Publication number
PL204327B1
PL204327B1 PL358790A PL35879001A PL204327B1 PL 204327 B1 PL204327 B1 PL 204327B1 PL 358790 A PL358790 A PL 358790A PL 35879001 A PL35879001 A PL 35879001A PL 204327 B1 PL204327 B1 PL 204327B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
sequence
seq
gene
protein
Prior art date
Application number
PL358790A
Other languages
English (en)
Other versions
PL358790A1 (pl
Inventor
Thomas Hohn
Livia Stavolone
Haan Petrus Theodorus De
Hope Thompson Ligon
Maria Kononova
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0007427A external-priority patent/GB0007427D0/en
Priority claimed from GB0010486A external-priority patent/GB0010486D0/en
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of PL358790A1 publication Critical patent/PL358790A1/pl
Publication of PL204327B1 publication Critical patent/PL204327B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/12011—Geminiviridae
    • C12N2750/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej sekwencji DNA funkcjonalnie połączonej ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, zrekombinowanej cząsteczki DNA, wektora ekspresji DNA, transgenicznej komórki gospodarza i rośliny transgenicznej i jej potomstwa. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy nowych sekwencji DNA, które działają jako promotory transkrypcji zasocjowanej sekwencji nukleotydów u roślin. Bardziej specyficznie ten wynalazek dotyczy nowych promotorów, które nadają konstytutywną ekspresję interesującej zasocjowanej sekwencji nukleotydów.
W dziedzinie rolnictwa istnieje ciągła chęć modyfikacji roślin według własnych potrzeb. Jeden sposób robienia tego jest za pomocą nowoczesnych technik inżynierii genetycznej. Na przykład, przez wprowadzanie interesującego genu do rośliny, roślina może być specyficznie modyfikowana, aby wyrażała pożądaną cechę fenotypową. W tym celu rośliny są najczęściej transformowane heterologicznym genem zawierającym region promotora, region kodujący i region terminacji. Przy przygotowaniu technikami inżynierii genetycznej genu heterologicznego w celu ekspresji w roślinach wybór promotora jest czynnikiem krytycznym. Podczas gdy może być pożądana ekspresja pewnych genów tylko w odpowiedzi na pewne bodź ce lub ograniczona do specyficznych komórek czy tkanek, inne geny są bardziej korzystnie wyrażane konstytutywnie, tzn. w całej roślinie zawsze i w większości tkanek. W przeszłości szeroko stosowano promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora (promotor CaMV 35S) do ekspresji konstytutywnej heterologicznych genów u roślin. Jednak są sytuacje, gdy jest pożądane stosowanie innych promotorów. Zatem głównym celem tego wynalazku jest dostarczenie takich alternatywnych promotorów do ekspresji interesującej sekwencji nukleotydów u roślin. Wynalazek także dostarcza zrekombinowane cząsteczki DNA, wektory ekspresyjne i rośliny transgeniczne zawierające promotory według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, w której sekwencja DNA składa się z sekwencji nukleotydów, charakteryzująca się tym, że sekwencja DNA składa się z sekwencji opisanych przez co najmniej jedną spośród SEK ID nr 1, SEK ID nr 2, SEK ID nr 3, SEK ID nr 4, SEK ID nr 19 oraz SEK ID nr 20.
Korzystnie, gdy sekwencja DNA ponadto składa się z co najmniej jednej sekwencji SEK ID nr 5 i SEK ID nr 6.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 1.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 2.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 3.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 4.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 19.
Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 20.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowana cząsteczka DNA zawierająca region promotora opisany jedną z powyższych sekwencji transkryptu pełnej długości wyizolowana z wirusa żółtego liściozwoju Cestrum funkcjonalnie połączona z heterologiczną sekwencją kodującą.
Korzystnie, gdy zrekombinowana cząsteczka DNA składa się z sekwencji DNA jak określono w zastrzeż eniu 1 funkcjonalnie połączonej z odpowiednią sekwencją nukleotydów.
Korzystnie, gdy odpowiednia sekwencja nukleotydów składa się z sekwencji kodującej.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje pożądaną cechę fenotypową.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje pierwsze białko, które w sposób bezpośredni lub pośredni reguluje gen kodujący drugie białko, w którym drugie białko włączone jest w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje pierwsze białko, które w sposób bezpośredni lub pośredni reguluje gen kodujący substrat drugiego białka, w którym drugie białko włączone jest w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje pierwsze białko zdolne do metabolizowania przez komórkę w celu wytworzenia substratu drugiego białka, które to drugie białko jest włączone w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje białko nadające pozytywną przewagę selekcyjną komórkom, które były transformowane tą sekwencją kodującą.
PL 204 327 B1
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca koduje białko zaangażowane w metabolizm komórkowy związku, przy czym związek ten składa się z mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
Korzystnie, gdy białko składa się z izomerazy ksylozy, izomerazy fosfomannozy, izomerazy mannozo-6-fosforanu, izomerazy mannozo-1-fosforanu, fosfomannomutazy, epimerazy mannozy, fosfatazy mannozy, fosfatazy ksylozy, mannozo-6-fosfatazy, mannozo-1-fosfatazy, permeazy mannozy lub permeazy ksylozy.
Korzystnie, gdy białko składa się z izomerazy fosfomannozy.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca składa się z regionu kodującego nie ulegającego translacji.
Korzystnie, gdy region kodujący nie ulegający translacji jest otrzymywany z genu wirusa.
Korzystnie, gdy gen wirusa pochodzi z wirusa plamistego więdnięcia pomidora (TSWV).
Korzystnie, gdy gen wirusa pochodzi z genu NP TSWV.
Korzystnie, gdy sekwencja kodująca jest w orientacji antysensowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresji DNA składający się z sekwencji DNA jak określono powyżej.
Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2819.
Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2820.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresji DNA składający się z sekwencji DNA jak określono w powyżej funkcjonalnie połączony z odpowiednią sekwencją nukleotydów.
Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA zdolny jest do zmiany ekspresji genomu wirusa w komórce.
Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA składa się z:
a) pierwszej sekwencji DNA zdolnej do ekspresji sensowego fragmentu RNA genomu wirusa w komórce; oraz
b) drugiej sekwencji DNA zdolnej do ekspresji antysensowego fragmentu RNA genomu wirusa w komórce, charakteryzuje się tym, że sensowy fragment RNA i antysensowy fragment RNA są zdolne do tworzenia dwuniciowego RNA.
Korzystnie, gdy wymieniony wirus jest wybrany z grupy złożonej z tospowirusów, potywirusów, potekswirusów, tobamowirusów, luteowirusów, kukumowirusów, bromowirusów, klosteorwirusów, tombuswirusów i furowirusów.
Korzystnie, gdy co najmniej jedna z wymienionych pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA, składa się z sekwencji nukleotydowej otrzymanej z co najmniej jednego genu białka płaszcza wirusa, genu białka nukleokapsydu wirusa, genu replikazy wirusa lub genu białka ruchu wirusa i różnych ich części.
Korzystnie, gdy co najmniej jedna spośród pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA pochodzi z wirusa plamistego więdnięcia pomidora (TSWV).
Korzystnie, gdy co najmniej jedna spośród pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA pochodzi z genu białka nukleokapsydu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję DNA jak określono powyżej.
Korzystnie, gdy wymienioną komórką gospodarza jest komórka roślinna.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest roślina transgeniczna i jej potomstwo, charakteryzujące się tym, że zawiera sekwencję DNA jak określono powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresji DNA zawierający sekwencje DNA, gdzie sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 19. Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2819 i pNO2820.
Korzystnie, gdy wektor ekspresji DNA zawiera zrekombinowana cząsteczkę DNA składającą się z sekwencji DNA jak okreś lono powyż ej funkcjonalnie połączonej z odpowiednią sekwencją nukleotydów. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 40, znamienny tym, że wektor ekspresji składa się z pNOV2819 i pNOV2820.
Aby zapewnić jasne i jednoznaczne zrozumienie opisu i zastrzeżeń patentowych, dostarczone są następujące definicje:
CmYLCV: Wirus żółtego liściozwoju Cestrum
Tasowanie DNA: Tasowanie DNA jest sposobem szybkiego, łatwego i wydajnego wprowadzania rearanżacji, korzystnie losowo do cząsteczki DNA lub generowania wymian sekwencji DNA między dwoma lub więcej cząsteczkami DNA, korzystnie losowo. Cząsteczka DNA wynikająca z tasowania
PL 204 327 B1 jest cząsteczką tasowanego DNA, która jest nie występującą naturalnie cząsteczką DNA pochodzącą z przynajmniej jednej matrycowej czą steczki DNA.
Ekspresja: dotyczy transkrypcji i/lub translacji endogennego genu lub transgenu u roślin. W przypadku konstruktów antysensownych, na przykład, ekspresja może dotyczyć tylko transkrypcji antysensownego DNA.
Funkcjonalnie ekwiwalentna sekwencja: dotyczy sekwencji DNA, która ma aktywność promotora zasadniczo podobną do transkryptu pełnej długości CmYLCV lub jego części i który w ostrych warunkach hybrydyzacji hybrydyzuje do tych sekwencji promotora.
Gen: dotyczy sekwencji kodującej i zasocjowanej sekwencji regulatorowej znamiennej tym, że sekwencja kodująca jest przepisywana do RNA takiego jak mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sensowny RNA lub antysensowny RNA. Przykładami sekwencji regulatorowych są sekwencje promotora, regiony 5'i 3'- nie ulegające translacji i sekwencje terminacji. Dalszymi elementami, które mogą być obecne są na przykład introny.
Interesujący gen: dotyczy dowolnego genu, który gdy jest przeniesiony do rośliny nadaje roślinie pożądaną cechę taką jak oporność na antybiotyk, oporność na wirusy, oporność na owady, oporność na choroby lub oporność na inne szkodniki, tolerancję herbicydów, polepszoną wartość odżywczą, ulepszone działanie w procesach przemysłowych lub zmienioną zdolność rozrodczą. „Interesujący gen” może też być takim, który jest przenoszony do roślin dla produkcji handlowo ważnych enzymów lub metabolitów w roślinie.
Heterologiczny jak jest to tu stosowane oznacza innego pochodzenia naturalnego lub syntetycznego. Na przykład jeśli komórka jest transformowana sekwencją kwasu nukleinowego, która nie występuje w nietransformowanej komórce gospodarza ta sekwencja kwasu nukleinowego jest określana jako heterologiczna w stosunku do komórki gospodarza. Transformujący kwas nukleinowy może zawierać heterologiczny promotor, heterologiczną sekwencję kodującą lub heterologiczną sekwencję terminacji. Alternatywnie transformujący kwas nukleinowy może być całkowicie heterologiczny lub może zawierać dowolną możliwą kombinację heterologicznych i endogennych sekwencji kwasu nukleinowego.
Region lidera: region w genie między miejscem startu transkrypcji i miejscem startu translacji.
Gen markera: dotyczy genu kodującego cechę do selekcji lub skriningu.
Funkcjonalnie połączony/zasocjowany z: mówi się, że regulatorowa sekwencja DNA jest „funkcjonalnie połączona” lub „zasocjowana z” sekwencją DNA, która koduje RNA lub białko, jeśli dwie sekwencje są położone tak, że sekwencja regulatorowa DNA wpływa na poziom ekspresji sekwencji kodującej lub strukturalnej DNA.
Roślina: dotyczy dowolnej rośliny, szczególnie roślin nasiennych.
Komórka roślinna: strukturalna i fizjologiczna jednostka rośliny zawierająca protoplast i ścianę komórkową. Komórka roślinna może być w formie izolowanej komórki pojedynczej lub komórki w hodowli, lub jako część zorganizowanej jednostki takiej jak na przykład tkanka roślinna lub narząd rośliny.
Materiał roślinny: dotyczy liści, łodyg, korzeni, kwiatów lub części kwiatów, owoców, pyłku, komórek jajowych, zygot, nasion, zrazów, hodowli komórkowych lub tkankowych lub dowolnej części lub produktu rośliny.
Promotor: dotyczy sekwencji DNA, która inicjuje transkrypcję zasocjowanej sekwencji DNA. Region promotora może zawierać też elementy, które działają jako regulatory ekspresji genu takie jak aktywatory, enhancery, i/lub represory i mogą obejmować całą lub część nie ulegającej translacji sekwencji lidera 5'.
Zrekombinowana cząsteczka DNA: kombinacja sekwencji DNA, które są razem połączone stosując technologię zrekombinowanego DNA.
Technologia zrekombinowanego DNA: procedury stosowane do łączenia razem sekwencji DNA jak opisano, na przykład, w Sambrook i wsp., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gen markera do skriningu: dotyczy genu, którego ekspresja nie nadaje przewagi selekcyjnej transformowanej komórce, ale którego ekspresja czyni transformowaną komórkę fenotypowo odrębną od nietransformowanych komórek.
Gen markera do selekcji: dotyczy genu, którego ekspresja w komórce roślinnej nadaje komórce przewagę selekcyjną. Przewaga selekcyjna posiadana przez komórki transformowane genem markera selekcyjnego może być wynikiem ich zdolności do wzrostu w obecności negatywnego czynnika selekcyjnego takiego jak antybiotyk lub herbicyd w porównaniu ze wzrostem komórek nietransformowanych.
PL 204 327 B1
Przewaga selekcyjna posiadana przez transformowane komórki w porównaniu z nietransformowanymi komórkami może też być wynikiem ich zwiększonej lub nowej zdolności do wykorzystania dodanego związku jako czynnika odżywczego, czynnika wzrostowego lub źródła energii. Gen markera do selekcji także dotyczy genu lub kombinacji genów, których ekspresja w komórce roślinnej w obecności czynnika selekcyjnego w porównaniu z brakiem czynnika selekcyjnego ma pozytywny wpływ na transformowaną komórkę i negatywny wpływ na nietransformowaną komórkę roślinną na przykład względem wzrostu, i tak daje komórce dodatnią przewagę selekcyjną.
Identyczność sekwencji: procent identyczności sekwencji określa się stosując programy komputerowe, które są oparte na dynamicznych algorytmach programowania. Korzystne programy komputerowe w zakresie tego wynalazku obejmują programy przeszukiwania BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) zaprojektowane do przebadania wszystkich dostępnych sekwencji baz danych niezależnie od tego czy pytanie dotyczy białka czy DNA. Wersja BLAST 2.0 (Gapped BLAST) do takiego przeszukiwania została ogólnie udostępniona w Internecie (obecnie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Stosuje algorytm heurystyczny, który szuka lokalnych w przeciwieństwie do globalnych porównań i jest więc zdolny do wykrywania stosunków między sekwencjami, które mają wspólne tylko regiony wyizolowane. Wartości przypisywane w poszukiwaniu BLAST mają dobrze zdefiniowaną interpretację statystyczną. Te programy są korzystnie uruchamiane z dowolnymi parametrami ustawionymi na wartości domyślne.
Transformacja: dotyczy wprowadzania kwasu nukleinowego do komórki. W szczególności dotyczy stabilnej integracji cząsteczki DNA do genomu interesującego organizmu.
TSWV: wirus plamistego więdnięcia pomidora.
Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji DNA do uzyskania z genomu wirusa żółtego liściozwoju Cestrum (CmYLCV). Korzystne są sekwencje DNA, które można uzyskać z promotora transkryptu pełnej długości CmYLCV, które są zdolne do sterowania ekspresją zasocjowanej interesującej sekwencji nukleotydów. Sekwencje DNA zawierające jego funkcjonalne i/lub strukturalne ekwiwalenty także są objęte przez wynalazek. Niniejszy wynalazek dotyczy więc sekwencji DNA, które działają jako promotory transkrypcji zasocjowanej sekwencji nukleotydów. Region promotora może też zawierać elementy, które działają jako regulatory ekspresji genów takich jak aktywatory, enhancery, i/lub represory i mogą zawierać nie ulegającą translacji sekwencję lidera 5' transkrybowanego mRNA.
Według korzystnego wykonania wynalazku, ta sekwencja DNA nadaje następnie ekspresję zasocjowanej sekwencji nukleotydów. Konstytutywna ekspresja oznacza, że interesująca sekwencja nukleotydów jest wyrażana zawsze i w większości tkanek i narządów. Gdy jest badana z regionem genu reporterowego GUS lub CAT w oznaczeniach ekspresji przejściowej sekwencja DNA według wynalazku nadaje wysoki poziom ekspresji genu reporterowego GUS lub CAT. Tak więc sekwencja DNA według wynalazku jest pożyteczna dla ekspresji na wysokim poziomie zasocjowanej interesującej sekwencji nukleotydów, która korzystnie jest sekwencją kodującą. Wiadomo specjaliście, że zasocjowana interesująca sekwencja kodująca może być wyrażana w orientacji sensownej lub antysensownej. Co więcej, interesująca sekwencja kodująca może być pochodzenia heterologicznego lub homologicznego względem rośliny, która ma ulec transformacji. W przypadku homologicznej sekwencji kodującej, sekwencja DNA według wynalazku jest pożyteczna dla ekspresji ektopowej tej sekwencji. W jednym szczególnym wykonaniu wynalazku ekspresja interesującej sekwencji kodującej pod kontrolą sekwencji DNA według wynalazku suprymuje swoją własną ekspresję i tę oryginalnej kopii genu za pomocą procesu zwanego kosupresją.
Promotory według wynalazku mogą być uzyskane z genomowego DNA wirusa żółtego liściozwoju Cestrum (CmYLCV), który może być wyizolowany, na przykład, z zakażonych roślin Cestrum parqui. Rośliny Cestrum parqui zakażone CmYLCV identyfikuje się na podstawie ich mozaiki liściowej i pofałdowanej deformacji liści. DNA następnie sekwencjonuje się i analizuje. Porównanie sekwencji z sekwencjami w bazie danych wykazał y, ż e genomowa organizacja CmYLCV jest zwią zana z jednym z innych czł onków rodziny Culimowirusów. CmYLCV zawiera 8 otwartych ramek odczytu. Porównanie sekwencji produktów genów CmYLCV wykazuje, że produkt genu I bierze udział w ruchach wewnątrzkomórkowych. Gen A koduje małe białko o nieznanej funkcji, gen B koduje czynnik przekazywania mszycom, gen C koduje białko związane z wirionem, gen IV jest głównym białkiem kapsydu, gen V koduje odwrotną transkryptazę i gen VI aktywuje w trans translację genów wirusa na transkrypcie pełnej długości. Szczególnie interesujący jest tak zwany promotor transkryptu CmYLCV pełnej długości.
Specjalista wie, że różne regiony promotora transkryptu CmYLCV pełnej długości mogą być stosowane według wynalazku. Jednym szczególnym wykonaniem jest region promotora transkryptu
PL 204 327 B1
CmYLCV pełnej długości przedstawiony na SEK ID NR: 1, zwany promotorem CmpD. Ta sekwencja zawiera 350 bp promotora transkryptu pełnej długości CmYLCV i 320 bp regionu sekwencji nie ulegającego translacji lidera 5' transkryptu pełnej długości. Tę sekwencję uzyskano przez sekwencjonowanie genomowego DNA CmYLCV. Sekwencja promotora i lidera, odpowiednio, są zidentyfikowane przez porównanie z sekwencjami w bazie danych. Wariant SEK ID NR: 1, zwany CmpE, cechujący się tym, że lider regionu 5' nie ulegającego translacji CmYLCV ma 318 bp zamiast 320 bp długości, jest przedstawiony w SEK ID NR: 19.
Jednym korzystnym wykonaniem wynalazku jest sekwencja DNA przedstawiona w SEK ID NR: 2, zwana promotorem CmpC. Promotor CmpC jest fragmentem sekwencji przedstawionej w SEK ID NR: 1 i zawiera 346 bp promotora transkryptu pełnej długości CmYLCV odpowiadające zasadzie 5 do 350 SEK ID NR: 1. Tę sekwencję DNA można uzyskać za pomocą PCR z genomowym DNA z wirusa żółtego liściozwoju Cestrum lub z roślin Cestrum parqui zakażonych wirusem żółtego liściozwoju Cestrum stosując starter 5' Cmp1 (SEK ID NR: 13) i starter 3' CmpC2 (SEK ID NR: 14). Przypuszczalna sekwencja TATA promotora CmpC jest umieszczona od zasady 308 do zasady 315 SEK ID NR: 2. Promotor CmpC zawiera przynajmniej 3 przypuszczalne regiony enhancera. Region enhancera 1 mający sekwencję nukleotydów CAAT jest zlokalizowany od zasady 232 do zasady 235 SEK ID NR: 2, i region enhancera 2 także mający sekwencję nukleotydów CAAT jest zlokalizowany od zasady 243 do zasady 246 SEK ID NR: 2. Region enhancera 3 jest zlokalizowany od zasady 246 do zasady 253 SEK ID NR: 2 i ma sekwencję nukleotydów TGACGTAA.
Innym korzystnym wykonaniem wynalazku jest DNA przedstawiony w SEK ID NR: 3, zwany promotorem CmpS. Promotor CmpS jest też fragmentem sekwencji przedstawionej w SEK ID NR: 1 i zawiera 346 bp SEK ID NR: 2 plus 54 bp z regionu lidera promotora transkryptu peł nej dł ugoś ci CmYLCV. Region lidera jest sekwencją nukleotydów poprzedzającą region kodujący, który jest transkrybowany, ale nie ulega translacji do białka. Wiadomo specjaliście, że region lidera może zawierać elementy regulatorowe z ważnymi funkcjami w ekspresji genu. Promotor CmpS można uzyskać za pomocą PCR z genomowym DNA z roślin Cestrum parqui zakażonych wirusem żółtego liściozwoju Cestrum stosując starter 5' Cmp1 (SEK ID NR: 13) i starter 3' CmpS2 (SEK ID NR: 15). Promotor CmpS zawiera przynajmniej 2 przypuszczalne regiony enhancera w regionie lidera. Region enhancera 4 (GAGAGA) jest zlokalizowany w zasadzie 354 do zasady 359 SEK ID NR: 3 i region enhancera 5 (GAGAGAGA) jest zlokalizowany w zasadzie 368 do zasady 375 SEK ID NR: 3.
Jeszcze innym korzystnym wykonaniem wynalazku jest sekwencja przedstawiona w SEK ID NR: 4, zwana promotorem CmpL. Jak poprzednie promotory, promotor CmpL jest fragmentem sekwencji przedstawionej w SEK ID NR: 1 i zawiera 346 bp SEK ID NR: 2 plus 288 bp sekwencji nie ulegającego translacji lidera 5' transkryptu pełnej długości. Promotor CmpL można uzyskać za pomocą PCR z genomowym DNA z roślin Cestrum parqui zakażonych wirusem żółtego liściozwoju Cestrum stosując starter 5' Cmp1 (SEK ID NR: 13) i starter 3' CmpL2 (SEK ID NR: 16). Wariant SEK ID NR: 4, zwany CmpF, znamienny tym, że sekwencja 5' nie ulegającego translacji lidera transkryptu pełnej długości ma 286 bp zamiast 288 bp długości jest przedstawiony w SEK ID NR: 20.
Wiadomo specjaliście, że sekwencje nukleotydów przedstawione w SEK ID NR: 1, 2, 3, 4, 19 i 20 mogą być przedłużone na swoich 5-' i 3'-końcach z homologicznymi lub heterologicznymi sekwencjami nukleotydów. Na przykład, koniec 5' SEK ID NR: 1, 2, 3, 4, 19 i 20 może być przedłużony o całość lub część nukleotydów przedstawionych w SEK ID NR: 6. SEK ID NR: 6 jest naturalnie spotykana powyżej SEK ID NR: 2, 3, 4 i 20 i zawiera część ORF VI CmYLCV (zasada 1 do zasady 100 SEK ID NR: 6) jak i część promotora pełnej długości transkryptu CmYLCV (zasada 101 do zasady 104 SEK ID NR: 6). Podobnie końce 3' SEK ID NR: 2, 3, 4 i 20 mogą być przedłużone o całość lub część nukleotydów przedstawionych w SEK ID NR: 5, reprezentujących sekwencję nukleotydów naturalnie spotykaną na końcu 3' SEK ID NR: 4 i 20 i zawierająca część sekwencji lidera transkryptu pełnej długości CmYLCV.
Jak opisano powyżej, sekwencja DNA według wynalazku może być uzyskana na przykład za pomocą PCR z genomowym DNA z wirusa żółtego liściozwoju Cestrum lub z roślin Cestrum parqui zakażonych przez wirusa żółtego liściozwoju Cestrum. Alternatywnie sekwencje DNA według wynalazku mogą być uzyskane z dowolnego innego wirusa z rodziny Caulimowirusów zawierającą homologi sekwencji DNA według wynalazku stosując startery specyficzne do sekwencji. Dla specjalisty jest ewidentne, że w oparciu o sekwencje nukleotydów przedstawione w SEK ID NR: 1 do SEK ID NR: 6 i SEQ ID NR: 19 i 20, dowolna interesująca kombinacja starterów może być wybrana do amplifikacji fragmentów DNA różnych długości, które mogą być stosowane według wynalazku. Wynalazek obejmuje
PL 204 327 B1 więc fragmenty pochodzące z promotorów transkryptów pełnej długości CmYLCV, które działają według wynalazku, tzn. są zdolne do nadawania ekspresji zasocjowanej sekwencji nukleotydów.
To może być badane przez generowanie takich fragmentów promotora, robienie ich fuzji do genu markera do selekcji lub skriningu i oznaczenie konstruktów fuzyjnych pod kątem zachowania aktywności promotora. Takie oznaczenie są w obrębie normalnych umiejętności specjalistów. Korzystne fragmenty DNA według wynalazku mają przynajmniej około 50 zasad, korzystnie między około 400 zasad i około 650 zasad, bardziej korzystnie między około 200 zasad i około 400 zasad, a najbardziej korzystnie około 350 zasad długości.
Jest też jasne dla specjalisty, że mutacje, insercje, delecje i/lub substytucje jednego lub więcej nukleotydów mogą być wprowadzone do sekwencji DNA SEK ID NR: 1, 2, 3, 4, 5 i 6 lub dłuższe lub krótsze fragmenty pochodzące z informacji sekwencji stosując metody znane w dziedzinie. Dodatkowo niezmodyfikowana lub zmodyfikowana sekwencja nukleotydów według wynalazku może być zmieniona przez tasowanie sekwencji według wynalazku. Aby zbadać funkcję wariantu sekwencji DNA według wynalazku, interesująca sekwencja jest funkcjonalnie łączona z genem markera do selekcji lub skriningu i ekspresja genu markera jest testowana w oznaczeniach przejściowej ekspresji z protoplastami lub w stabilnie transformowanych roślinach. Specjalista będzie wiedział, że sekwencje DNA zdolne do sterowania ekspresją sekwencji nukleotydów są zbudowane w sposób modularny. Tak więc poziomy ekspresji krótszych fragmentów DNA mogą być różne od tej z najdłuższego fragmentu i mogą być różne od siebie. Na przykład delecja obniżającego ekspresję elementu doprowadzi do zwiększenia w poziomach ekspresji zasocjowanej sekwencji nukleotydów, podczas gdy delecja elementu podwyższającego aktywność zmniejszy poziomy ekspresji zasocjowanej sekwencji nukleotydów. Wiadomo także specjaliście, że delecja elementu specyficznego w stosunku do rozwoju lub tkanki doprowadzi do zmienionego czasowo lub przestrzennie profilu ekspresji zasocjowanej sekwencji nukleotydów.
Objęte przez ten wynalazek są także funkcjonalne ekwiwalenty promotorów niniejszego wynalazku tzn. sekwencje nukleotydów, które hybrydyzują w warunkach ostrych do dowolnej z SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 6, takiej jak na przykład, sekwencje przedstawione w SEK ID NR: 19 i SEK ID NR: 20. Ostrą hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze 65°C, korzystnie 60°C i najbardziej korzystnie 55°C, w roztworze soli buforowanej cytrynianem o podwójnym stężeniu (2X) (SSC) zawierającym 0,1% SDS, po czym następuje płukanie nośnika w tej samej temperaturze, ale z buforem mającym zmniejszone stężenie SSC. Takie bufory o zmniejszonym stężeniu mają typowo jedną dziesiątą stężenia SSC (0,1X SSC) zawierającego 0,1% SDS, korzystnie 0,2X SSC zawierającego 0,1% SSC, a najbardziej korzystnie SSC o połowie stężenia (0,5X SSC) zawierającego 0,1% SDS. Faktycznie, funkcjonalnie ekwiwalentne całości lub części promotora transkryptu pełnej długości CmYLCV z innych organizmów można znaleźć przez hybrydyzację dowolnej z SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 5, SEK ID NR: 6, SEK ID NR: 19 lub SEK ID NR: 20 z genomowym DNA wyizolowanym z interesującego organizmu, szczególnie z innego Caulimowirusa. Specjalista wie jak postępować by znaleźć takie sekwencje, jako że znanych jest wiele sposobów w dziedzinie do identyfikacji homologicznych sekwencji u innych organizmów. Takie nowo zidentyfikowane cząsteczki DNA mogą być następnie zsekwencjonowane i ich sekwencja może być porównana do dowolnej z SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 5, SEK ID NR: 6, SEK ID NR: 19 lub SEK ID NR: 20 i przetestowana pod kątem aktywności promotora. W obrębie zakresu niniejszego wynalazku są cząsteczki DNA mające przynajmniej 75%, korzystnie 80%, bardziej korzystnie 90%, i najbardziej korzystnie 95% identyczności sekwencji do sekwencji nukleotydów dowolnej z SEK ID NR: 1, 2, 3, 4 lub 6 na długości przynajmniej 50 nukleotydów. Procent identyczności sekwencji określa się stosując programy komputerowe, które są oparte na dynamicznych algorytmach programowania. Korzystne programy komputerowe w zakresie tego wynalazku obejmują programy przeszukiwania BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) zaprojektowane do przebadania wszystkich dostępnych sekwencji baz danych niezależnie od tego czy pytanie dotyczy białka czy DNA. Wersja BLAST 2.0 (Gapped BLAST) do takiego przeszukiwania została udostępniona publicznie w Internecie (obecnie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Stosuje algorytm heurystyczny, który szuka lokalnych w przeciwieństwie do globalnych porównań i jest więc zdolny do wykrywania stosunków między sekwencjami, które mają wspólne tylko regiony wyizolowane. Wartości przypisywane w poszukiwaniu BLAST mają dobrze zdefiniowaną interpretację statystyczną. Te programy są korzystnie uruchamiane z dowolnymi parametrami ustawionymi na wartości domyślną.
PL 204 327 B1
Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających sekwencję DNA według wynalazku funkcjonalnie połączoną z interesującą sekwencją nukleotydów. Interesująca sekwencja nukleotydów może, na przykład, kodować rybosomalny RNA, antysensowny RNA lub dowolny inny typ RNA, które nie ulega translacji do białka. W innym korzystnym wykonaniu wynalazku interesująca sekwencja nukleotydów ulega translacji do produktu białkowego. Sekwencja nukleotydów zasocjowana z promotorem może być pochodzenia homologicznego lub heterologicznego pod względem rośliny, która ma ulec transformacji. Sekwencja może być też całkowicie lub częściowo syntetyczna. Bez względu na pochodzenie zasocjowana sekwencja DNA może być wyrażana w transformowanej roślinie zgodnie z własnościami promotora, z którym jest związana. W razie homologicznej sekwencji nukleotydów zasocjowanych z sekwencją promotora promotor według wynalazku jest pożyteczny dla ektopowej ekspresji homologicznej sekwencji. Ektopowa ekspresja oznacza, że sekwencja nukleotydów zasocjowana z sekwencją promotora jest wyrażana w tkankach i narządach i/lub w momentach, kiedy ta sekwencja może nie być wyrażana pod kontrolą swojego własnego promotora. W jednym szczególnym wykonaniu wynalazku, ekspresja sekwencji nukleotydów zasocjowanej z sekwencją promotora znosi swoją własną ekspresję i ekspresję oryginalnej kopii genu w procesie zwanym kosupresją.
Według korzystnego wykonania wynalazku zasocjowana sekwencja nukleotydów może kodować białko, którego ekspresja jest pożądana w całej roślinie zawsze i w większości tkanek i narządów. Takie sekwencje nukleotydów korzystnie kodują białka nadające pożądaną cechę fenotypową transformowanej nią roślinie. Przykładami są sekwencje nukleotydów kodujące białka nadające oporność na antybiotyk, oporność na wirusy, oporność na owady, oporność na choroby lub oporność na inne szkodniki, tolerancję herbicydów, polepszoną wartość odżywczą, ulepszone działanie w procesach przemysłowych lub zmienioną zdolność rozrodczą. Zasocjowana sekwencja nukleotydów może też być taką, która jest przenoszona do roślin dla produkcji handlowo ważnych enzymów lub metabolitów w roś linie. Obję te przez niniejszy wynalazek są też geny markerów do selekcji lub skriningu, tzn. geny zawierające sekwencję DNA według wynalazku funkcjonalnie połączoną z region kodującym, który koduje cechę do selekcji lub skriningu.
Przykłady genów markerów do selekcji lub skriningu są opisane poniżej. Dla pewnych docelowych gatunków mogą być korzystne różne markery selekcyjne dla antybiotyków lub herbicydów. Markery selekcyjne rutynowo stosowane w transformacji obejmują gen nptll, który nadaje oporność na kanamycynę, paromomycynę, genetycynę i pokrewne antybiotyki (Vierra i Messing, 1982, Gene 19: 259-268; Bevan i wsp., 1983, Nature 304: 184-187); gen bakterii aadA (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089), kodujący 3'-adenylyloransferazę aminoglukozydu i nadający oporność na streptomycynę lub spektynomycynę, gen hph, który nadaje oporność na antybiotyk higromycynę (Blochin-ger i Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931) i gen dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Bourouis i Jary, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104). Inne markery do stosowania obejmują gen acetylotransferazy fosfinotricyny, który nadaje oporność na herbicyd fosfinotricynę (White i wsp., 1990, Nucl. Acids Res 18: 1062; Spencer i wsp., 1990, Theor. Appl. Genet 79: 625-631, zmutowany gen EPSPS kodujący oporność na glifozan (Hinchee i wsp., 1988, Bio/Technology 6: 915-922), zmutowany gen syntazy acetomleczanu (ALS), który nadaje oporność na imidazolion lub sulfonylomocznik (Lee i wsp., 1988, EMBO J. 7: 1241-1248), zmutowany gen psbA nadający oporność na atrazynę (Smeda i wsp., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917), lub zmutowany gen oksydazy protoporfirynogenu, co ujawniono w EP 0 769 059. Identyfikacja transformowanych komórek może być też osiągnięta przez ekspresję markerów takich jak geny kodujące acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), β-glukuronidazę (GUS), lucyferazę (LUC) i zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub dowolne inne białko, które nadaje fenotypowo odrębną cechę transformowanej komórce. Markery selekcyjne, które dają dodatnią selekcję, takie jak gen izomerazy fosforanu mannozy ujawniony w zgłoszeniu patentowym WO 93/05163, też są stosowane. Inne geny do stosowania w dodatniej selekcji są opisane w WO 94/20627 i kodują izomerazy ksylozy i fosfomannoizomerazy, takie jak izomeraza mannozo-6-fosforanu i mannozo-1-fosforanu, fosfomannomutaza, epimerazy mannozy, takie jak te, które przekształ cają węglowodany do mannozy lub mannozę do węglowodanów, takich jak glukoza lub galaktoza; fosfatazy takie jak fosfataza mannozy lub ksylozy, mannozo-6-fosfataza i mannozo-1-fosfataza i permeazy, które biorą udział w transporcie mannozy lub jej pochodnej lub prekursora do komórki. Czynnik, który zmniejsza toksyczność związku dla komórek jest typowo pochodną glukozy, taką jak metylo-3-O-glukoza lub florydzyna. Transformowane komórki identyfikuje się bez uszkodzenia lub niszczenia nietransformowanych komórek w populacji i bez równoczesnego wprowadzania genów oporności na
PL 204 327 B1 antybiotyk lub herbicyd. Jak ujawniono w WO 93/05163 oprócz faktu, że wyeliminowana jest potrzeba genów oporności na antybiotyk lub herbicyd, wykazano, że metoda dodatniej selekcji jest często znacznie bardziej wydajna niż tradycyjna selekcja negatywna.
Tak więc promotory według wynalazku są korzystnie funkcjonalnie połączone z sekwencją nukleotydów, która koduje białko, które zawiera region który: (a) koduje białko, które bierze udział w metabolizmie związku, i/lub (b) reguluje aktywność genu kodującego białko, znamienny tym, że związek jest mannozą lub ksylozą lub ich pochodną lub prekursorem, lub substratem białka, lub jest zdolne do bycia metabolizowanym przez transformowane komórki do takiego substratu. Ta sekwencja nukleotydów może kodować izomerazę mannozo-6-fosforanu i związek może być mannozą. Alternatywnie, sekwencja nukleotydów może kodować izomerazę fosfocukru, fosfomutazę taką jak fosfomannomutaza, fosfatazę taką jak mannozo-6-fosfataza, epimerazę cukru, permeazę cukru lub izomerazę ksylozy i związek może być mannozą, mannozo-6-fosforanem, D-mannozoaminą lub ksylozą.
W korzystnym wykonaniu wynalazku promotory według wynalazku są funkcjonalnie połączone z regionem kodującym genu manA E. coli manA (Joersbo i Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto i wsp., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803), kodującym izomerazę fosfomannozy (PMI), i terminator Nos (syntetaza nopaliny) uzyskany z T-DNA Agrobacterium tumefaciens T-DNA (Depicker i wsp., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982)). Specjalista wie, ż e terminator Nos moż e być zastą piony przez dowolny inny terminator, który działa w roślinach. Promotor według wynalazku może być promotorem CmpC, CmpS, CmpL, CmpB, CmpA, CmpE lub CmpF przedstawionym w SEK ID NR: 1 do 6 i 19 do 20, lub dowolnym promotorem pochodzącym od nich. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku, promotor jest promotorem CmpS przedstawionym w SEK ID NR: 3.
Promotory według wynalazku mogą być też stosowane do zapewnienia oporności lub tolerancji na wirusy przez funkcjonalne połączenie promotorów według wynalazku z regionami kodującymi genów z wirusów, które mają być kontrolowane.
Dla kontroli wirusów nici ujemnej, takich jak wirus plamistego więdnięcia pomidora (TSWV), sekwencje genów białka nukleokapsydu (NP) i białka ruchu (MP) mogą być stosowane i dla wirusów należących do nadgrupy wirusów alfa-podobnych takich jak TMV i CMV, mogą być stosowane sekwencje genu polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) i białka ruchu (MP). Dla wirusów należących do nadgrupy wirusów Picorna w tym potywirusów, dowolna sekwencja wirusa może być połączona do promotorów według wynalazku. W końcu dla wszystkich innych wirusów, w tym wirusów DNA, mogą być stosowane sekwencje genów polimerazy RNA zależnej od RNA lub sekwencji zasocjowanych z replikazą . Takie konstrukty dla kontroli wirusa mogą być skonstruowane jak podano przykł adowo w przykładzie 8 i przykładzie 9 WO 00/68374. Jest w zakresie normalnych umiejętności specjalisty zastąpienie promotorów ujawnionych w WO 00/68374 promotorami według wynalazku. Na podstawie informacji z WO 00/68374, specjalista także wie jak przygotować konstrukty zawierające promotory według wynalazku funkcjonalnie połączone z sekwencjami wirusa jak wymieniono tu uprzednio w celu nadania oporności lub tolerancji na wirus.
Zamiast wyrażać dwuniciowy wirusowy RNA w roślinach transgenicznych jak ujawniono w WO 00/68374, wirusowy RNA może być też wyrażony jako nie ulegający translacji RNA dodatni-sensowny cząsteczka RNA jak opisano na przykład w US 558302 lub w przykładach 12 i 13 według niniejszego wynalazku.
Jest dalej celem wynalazku dostarczenie zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencję DNA według wynalazku w formie fuzji z zasocjowaną interesującą sekwencją nukleotydów. W tych wektorach obcy DNA może być wstawiony do regionu polilinkera tak, że te egzogenne sekwencje mogą być wyrażane w odpowiedniej komórce gospodarza, która może być na przykład pochodzenia bakteryjnego lub roślinnego. Na przykład, plazmid pBI101 pochodzący z wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens pBIN19 pozwala na klonowanie i testowanie promotorów stosując sygnał ekspresji beta-glukuronidazy (GUS) (Jefferson i wsp, 1987, EMBO J 6: 3901-3907). Wielkość wektora wynosi 12,2 kb. Ma on niskokopijny origin replikacji RK2 i nadaje oporność na kanamycynę zarówno u bakterii i u roślin. Istnieją liczne inne wektory ekspresyjne znane specjalistom, które mogą być stosowane według wynalazku.
Jest więc dalszym celem tego wynalazku dostarczenie transgenicznych roślin zawierających zrekombinowaną sekwencję DNA według wynalazku. Wynalazek zatem dotyczy komórek roślinnych, roślin pochodzących z takich komórek, materiału roślinnego, potomstwa i nasion pochodzących z takich roś lin i produktów rolnych z ulepszonymi właś ciwościami uzyskanymi według dowolnego ze sposobów transformacji opisanych poniżej. Rośliny transformowane według tego wynalazku mogą być
PL 204 327 B1 jednoliścienne lub dwuliścienne i obejmują, ale nie ograniczają do ryżu, kukurydzy, pszenicy, jęczmienia, żyta, słodkiego ziemniaka, słodkiej kukurydzy, fasoli, grochu, cykorii, sałaty, kapusty, kalafiora, brokuł, rzepy, rzodkiewki, szpinaku, szparagów, cebuli, czosnku, papryki, selera, kabaczka, dyni, juty, cukini, jabłka, gruszki, pigwy, melona, śliwki, czereśni, brzoskwini, nektarynki, moreli, truskawki, winogrona, maliny, jeżyny, ananasa, awokado, papai, mango, banana, soi, pomidora, sorgo, trzciny cukrowej, buraka cukrowego, słonecznika, rzepaku, koniczyny, tytoniu, marchwi, bawełny, lucerny, ziemniaka, bakłażana, ogórka, Arabidopsis thaliana i roślin drzewiastych takich jak drzewa iglaste i liściaste. Korzystne rośliny do transformacji są to ryż, kukurydza, pszenica, jęczmienia, kapustą, kalafiorem, papryką, kabaczkiem, melonem, soją, pomidorem, burakiem cukrowym, słonecznikiem lub bawełną, ale szczególnie ryż, kukurydza, pszenica, Sorghum bicolor, kupkówka, burak cukrowy i soja. Zrekombinowane sekwencje DNA według wynalazku mogą być wprowadzone do komórki roślinnej za pomocą szeregu dobrze znanych sposobów. Specjaliści docenią, że wybór metody może zależeć od typu rośliny tzn. jednoliścienna lub dwuliścienna. Odpowiednie metody transformacji komórek roślinnych obejmują mikroiniekcję (Crossway i wsp., 1986, Bio Techniques 4: 320-334), elektroporację (Riggs i Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 5602-5606), transformację związaną z Agrobacterium (Hinchee i wsp., 1988, Bio/Technology 6: 915-922; EP 0 853 675), bezpoś rednie przeniesienie genów (Paszkowski i wsp., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722) i balistyczne przyspieszanie cząsteczek stosując urządzenia dostępne od Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin i Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (patrz na przykład opis patentowy USA 4.945.050; i McCabe i wsp., 1988 Bio/Technology 6: 923-926). Komórki do transformacji mogą być zróżnicowanymi komórkami liści, komórkami embriogenicznymi lub dowolnym innym typem komórki. W bezpośredniej transformacji protoplastów pobieranie egzogennego materiału genetycznego do protoplastu może być wzmagane przez zastosowanie czynnika chemicznego lub pola elektrycznego. Materiał egzogenny może być wówczas wintegrowany do genomu jądrowego. Uprzednia praca jest przeprowadzona w dwuliściennych roślinach tytoniu, co dało inkorporację obcego DNA i przeniesienie do roślin potomnych (Paszkowski i wsp., 1984, EMBO J. 3: 2712-2722; Potrykus i wsp., 1985, Mol. Gen. Genet., 199: 169-177). Za pomocą tej procedury transformuje się protoplasty jednoliściennych na przykład Triticum monococcum, Lolium multiflorum (włoski rajgras), kukurydzy, i słodkiej czarnej meksykańskiej kukurydzy. Dodatkowym korzystnym wykonaniem jest sposób transformacji protoplastów kukurydzy, jak ujawniono w EP 0 292 435 jak i w EP 0 846 771. Dla transformacji kukurydzy patrz też Koziel i wsp., 1993, Bio/Technology 11: 194-200. Transformacja ryżu może być przeprowadzona przez techniki bezpośredniego przeniesienia genów stosując protoplasty lub bombardowanie cząsteczkami. Transformacja z udziałem protoplastów jest opisana dla typów Japonica i typów Indica (Zhang i wsp., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379-384; Shimamoto i wsp., 1989, Nature 338: 274-276; Datta i wsp., 1990, Bio/Technology 8: 736-740). Oba typy opisane powyżej są także rutynowo transformowane stosując bombardowanie komórkami (Christou i wsp., 1991, Bio/Technology 9: 957-962). Zgłoszenie patentowe nr EP 0 332 581 ujawnia techniki dla generacji, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Te techniki pozwalają na transformację wszystkich roślin Pooideae w tym Dactylis i pszenicy. Co więcej, transformacja pszenicy jest ujawniona w zgłoszeniu patentowym nr EP 0 674 715; i przez Weeks i wsp., 1993 (Plant Physiol. 102: 1077-1084). Tak skonstruowany roślinny wektor ekspresyjny może, na przykład, być wprowadzony do kalusów ryżu według konwencjonalnego sposobu transformacji roślin i różnicowanie korzeni i liści jest indukowane z tego i następnie może być przeniesione do doniczki do hodowli w ten sposób otrzymując transformowany ryż.
Rośliny wynikające z transformacji sekwencjami DNA lub wektorami według wynalazku będą wyrażały interesującą sekwencję nukleotydów w całej roślinie i większości tkanek narządów.
Genetyczne właściwości wprowadzone do transgenicznych nasion i roślin wymienionych powyżej są przekazywane przez rozmnażanie płciowe lub wzrost wegetatywny, i mogą więc być utrzymane i namnaż ane u roślin potomnych. Ogólnie, te utrzymywanie i namnażanie stosują znane metody rolnicze opracowane, aby pasowały do specyficznych celów takich jak uprawa, wysiewanie i zbieranie. Mogą być stosowane wyspecjalizowane procesy takie jak hydroponika lub techniki szklarniowe. Wykorzystanie korzystnych właściwości genetycznych roślin transgenicznych według wynalazku może być także przeprowadzane przez hodowlę roślin, która ma na celu opracowanie roślin o polepszonych właściwościach takich jak tolerancja szkodników, herbicydów lub stresu, poprawiona wartość odżywcza, poprawiona wydajność, lub lepsza budowa powodująca mniejsze straty z pokładania lub rozpadania. Różne etapy hodowlane są określane przez dobrze zdefiniowaną interwencję taką jak wybór linii do krzyżowania, sterowanie zapylaniem linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych.
PL 204 327 B1
W zależności od pożądanych właściwości stosuje się różne kroki hodowlane. Odpowiednie techniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, ale nie ograniczają się do, hybrydyzacji, chowu wsobnego, krzyżowania wstecznego, krzyżowanie wieloliniowego, mieszania odmian, hybrydyzacji międzygatunkowej, techniki aneuploidów itp. Techniki krzyżowania także obejmują sterylizację roślin aby uzyskać rośliny męsko lub żeńsko sterylne za pomocą sposobów mechanicznych, chemicznych lub biochemicznych. Krzyżowe zapylenie rośliny męskosterylnej pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosterylnej, ale żeńskopłodnej rośliny uzyska jednorodne właściwości obu linii rodzicielskich. Tak więc transgeniczne nasiona i rośliny według wynalazku mogą być stosowane do wyhodowania ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak traktowanie herbicydami lub pestycydami lub pozwalają na nie stosowanie takich metod ze względu na ich zmodyfikowane właściwości genetyczne. Alternatywnie można uzyskać nowe rośliny uprawne z polepszoną tolerancją stresu, które ze względu na swoje zoptymalizowane genetyczne „wyposażenie” dają zebrane produkty o lepszej jakości niż produkty, które nie były zdolne do tolerancji porównywalnych niesprzyjających warunków rozwojowych.
Jest innym celem tego wynalazku dostarczenie sekwencji DNA, która może być zastosowana do ekspresji interesującej sekwencji nukleotydów w pożądanym organizmie. Ten organizm może być bakterią, rośliną lub dowolnym innym interesującym organizmem.
Co więcej, ujawnienie SEK ID NR: 1 do 6 pozwala specjaliście na zaprojektowanie oligonukleotydów dla reakcji łańcuchowych polimerazy, w celu próby amplifikacji fragmentów DNA z matryc zawierających sekwencję nukleotydów charakteryzowaną przez ciągłą sekwencję 15 i korzystnie 20 do 30 lub więcej par zasad w SEK ID NR: 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Te nukleotydy zawierają sekwencję nukleotydów, która przedstawia 15 i korzystnie 20 do 30 lub więcej par zasad SEK ID NR: 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Reakcje łańcuchowe polimerazy przeprowadzone stosując przynajmniej jeden taki oligonukleotyd i ich produkty amplifikacji stanowią inne wykonanie tego wynalazku.
Krótki opis sekwencji listy sekwencji
SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR SEK ID NR
CmpD
CmpC
CmpS
CmpL
CmpB
CmpA
S1 starter 5'
S2 starter 3'
GUS starter 5'
GUS starter 3'
CAT starter 5'
CAT starter 3'
Cmp1 starter 5'
CmpC2 starter 3'
CmpS2 starter 3'
CmpL2 starter 3'
PA starter 5'
PA starter 3'
CmpE
CmpF terminator NOS starter 5' terminator NOS starter 3' starter 5' genu TSWV NP starter 3' genu TSWV NP' starter 5' promotora CmYLCV starter 3' promotora CmYLCV miejsce multiklonowania AGLINK miejsce multiklonowania BIGLINK starter Cmpf-B starter CmpS-B
PL 204 327 B1
SEK ID NR: 31
SEK ID NR: 32
SEK ID NR: 33 SEK ID NR: 34 SEK ID NR: 35 SEK ID NR: 36 SEK ID NR: 37 SEK ID NR: 38 SEK ID NR: 39 SEK ID NR: 40 SEK ID NR: 41 SEK ID NR: 42 SEK ID NR: 43 SEK ID NR: 44 SEK ID NR: 45 SEK ID NR: 46 SEK ID NR: 47 SEK ID NR: 48 SEK ID NR: 49 pNOV2804; wektor binarny, zawiera kasetę ekspresyjną PMI bez promotora-terminator nos pNOV3604; wektor do transformacji biolistycznej zawiera kasetę ekspresyjną PMI bez promotora-terminator nos starter 3' CmpMr starter 5' CmpMf starter 3' CmpMrs starter 5' CmpMfs synGFPI; gen GFP optymalizowany dla roślin z intronem
GIG; gen GUS z intronem starter 3' Cmp-C kaseta ekspresyjna CmpS-synGFPI-nos kaseta ekspresyjna CmpS-GIG-nos kaseta ekspresyjna CmpC-synGFPI-nos kaseta ekspresyjna CmpC-GIG-nos wektor pNOV2117 wektor pNOV4200 kaseta ekspresyjna ZmUbi-GFP-35S term kaseta ekspresyjna ZmUbi-GIG-nos kaseta ekspresyjna Ubq3(At)-synGFPI-nos kaseta ekspresyjna Ubq3(At)-GIG-nos
P r z y k ł a d y
Standardowe techniki rekombinacji DNA i klonowania molekularnego są dobrze znane w dziedzinie i są opisane na przykład, przez Sambrook i wsp., 1989, „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY oraz przez Ausubel i wsp.,1994, „Current protocols in molecular biology”, John Wiley i Sons, Nowy Jork.
P r z y k ł a d 1: Klonowanie wirusa
1. Ekstrahowanie DNA. Genomowy DNA wirusa ekstrahowano z roślin Cestrum parqui zakażonych wirusem żółtego liściozwoju Cestrum. Pięć gram zakażonych liści homogenizowano w 30 ml buforu do ucierania (0,2 M Tris pH 7,0, 0,02 M EDTA, 2 M mocznik) przez 60 sek przy maksymalnej prędkości w homogenizatorze Brinkman Polytron z sondą PT10 i łagodnie wytrząsano w 4°C przez noc z Triton X-100 (2% stężenie końcowe). Wirus oczyszczono z surowego homogenatu za pomocą wirowania z niską prędkością (10000 obr./min. przez 20 min. w rotorze Sorvall SS-34) i z uzyskanego supernatantu przez wirowanie z wysoką prędkością (27000 obr./min. przez 2 godz. w rotorze Beckman SW-28) przez poduszkę z sacharozy (3 ml 15% sacharozy). Osad zawierający wirus następnie zawieszono w 0,1 M Tris, pH 7,4, 2,5 mM MgCI2. Dodano DNazę I (Sigma) i RNazę A (Sigma) do stężenia 10 mg/ml każda. Po 30 min. w 37°C, reakcję zahamowano przez dodanie EDTA do 10 mM. DNA wirusa izolowano z cząsteczek CmYLCV przez traktowanie proteazą K (E. Merck, 0,5 mg/ml stężenie końcowe) w obecności 1% SDS w 65°C przez 15 min. Wirusowy DNA następnie oczyszczono przez ekstrakcję fenolową i strącanie etanolem. DNA wirusa zawarty w ostatecznym osadzie etanolowym rozpuszczono w wodzie.
2. Amplifikacja i klonowanie DNA. Sto nanogramów uzyskanego DNA stosowano jako matrycę do amplifikacji PCR w reakcji o objętości 50 μΐ zawierającej 10 μΜ każdego startera, 25 mM każdego dNTP, 5 μl buforu do reakcji pfu (Stratagene) i 2,5 jednostek polimerazy DNA pfu turbo (Stratagene). Do reakcji PCR stosowano starter 5' S1 (gaccacaaacatcagaag, SEK ID NR: 7) i starter 3' S2 (caaacttattgggtaatc, SEK ID NR: 8). Parametry cykliczne dla PCT to: 1x (94°C przez 1 min.); 30x (94°C przez 1 min., 50°C przez 1 min., 72°C przez 1 min.); 1x (72°C przez 10 min.). Każdy pojedynczy fragment DNA klonowano w plazmidzie pPCR-Script™ Amp SK(+) (Stratagene) według instrukcji producenta.
P r z y k ł a d 2: Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie klonów DNA wirusa przeprowadzono stosując zautomatyzowany sekwenator ABI PRISM 377 (Perkin Elmer) i ABI PRISM zestaw do cyklicznego sekwencjonowania dRhodamine terminator (Perkin Elmer) według instrukcji producenta. Opisane startery stosowano do reakcji sekwencjonowania jak i uniwersalne startery M13-20 oraz starter 3'.
PL 204 327 B1
P r z y k ł a d 3: Konstrukcja plazmidów do ekspresji przejściowej
Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono z polimerazą Pfu (Stratagene) jak opisano w Przykładzie 1.
1. Amplifikacja genów reporterowych. Zamplifikowano geny reporterowe beta-glukuronidazy (GUS) i acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT). Do amplifikacji genu GUS stosowano oligonukleotydy 5' GUS (cagggtaccactaaaatcacc, SEK ID NR: 9) i 3' GUS (aggggatccccaattcccc, SEK ID NR: 10) w temperaturze hybrydyzacji 60°C. Oligonukleotydy 5' CAT (aggggtaccatcgatatggag, SEK ID NR: 11) i 3' Cat (ttaggatccgccctgccac, SEK ID NR: 12) hybrydyzowano w 62°C. Startery 5' są zaprojektowane by zawierały miejsce rozpoznawane przez Kpnl a startery 3' miejsce BamHI.
2. Amplifikacja promotora CmYLCV. Wybrano trzy różne fragmenty promotora. CmpC (SEK ID NR: 2), CmpS (SEK ID NR: 3), i CmpL (SEK ID NR: 4). Do wszystkich trzech amplifikacji zastosowano starter 5' Cmp1 (cttctagacaaagtggcagac, SEK ID NR: 13) w temperaturze hybrydyzacji 52°C. Jest on zmodyfikowany (wytłuszczone) z oryginalnej sekwencji, aby zawierał miejsce rozpoznawane przez Xbal. Starter 3' CmpC2 (ttggtaccttaacaatgaggg, SEK ID NR: 14) stosowano do amplifikacji fragmentu CmpC i starter 3' CmpS2 (ctacttctaggtaccttgctc, SEK ID NR: 15) stosowano do fragmentu CmpS. Oba z nich są zmodyfikowane by zawierał y miejsce rozpoznawane przez Kpnl. Starter 3' CmpL2 (ttggtaccttaacaatgaggg, SEK ID NR: 16) był stosowany do amplifikacji fragmentu CmpL i jest zmodyfikowany by zawierał miejsce restrykcyjne Clal.
3. Amplifikacja sygnału poliadenylacji. Fragment sygnału poliadenylacji zamplifikowano z zakaźnego klonu wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) (Franck i wsp., Cell 21 (1), 285-294, 1980). Zastosowano oligonukleotydy PA (polyadenylation signal amplification - amplifikacja sygnału poliadenylacji) 5' (ggggatccccagtctctctc, SEK ID NR: 17) i PA 3' (gtgaattcgagctcggta, SEK ID NR: 18) do PCR i hybrydyzowano w 60°C. Starter 5' zaprojektowano by zawierał miejsce rozpoznawane przez BamHI a 3' miejsce EcoRI.
4. Wytworzone konstrukty
- pCmpCG (fragment promotora CmpC + gen GUS + polyA),
- pCmpSG (fragment promotora CmpS + gen GUS + polyA),
- pCmpCC (fragment promotora CmpC + gen CAT + polyA),
- pCmpSC (fragment promotora CmpS + gen CAT + polyA),
- pCmpLC (fragment promotora CmpL + gen CAT + polyA).
Kasety zawierające fragment promotora, geny reporterowe i sygnał poliadenylacji wstawiono do wektora pUC19 (Stratagene) strawionego Xbal i EcoRI.
5.Konstrukty stosowane do porównania
- pCapG (fragment promotora Cap + gen GUS + polyA),
- pCapSG (fragment promotora CapS + gen GUS + polyA),
- pCapC (fragment promotora Cap + gen CAT + polyA).
Fragmenty promotora zawarte w tych konstruktach uzyskano z CaMV (Franck i wsp., Cell 21 (1), 285-294, 1980, patrz GenBank numer dostępu V00141). Fragmenty GUS, CAT i polyA są identyczne do stosowanych do konstruktów CmYLCV. Cap odpowiada fragmentowi od zasady -227 do zasady + 33 z sekwencji TATA (zasada 7175 do zasady 7438 genomu CaMV, patrz GenBank numer dostę pu V00141) i CapS odpowiada fragmentowi od zasady -227 do zasady + 82 z sekwencji TATA (zasada 7175 do zasady 7486 genomu CaMV, patrz GenBank numer dostępu V00141). Te pozycje odpowiadają w przybliżeniu tym wybranym do fragmentów CmYLCV.
Przykład 4: Doświadczenia z ekspresją przejściową
1. Hodowle zawiesinowe i przygotowanie protoplastów Orychophragmus violaceus.
Hodowle zawiesinowe trzymano w 40 ml podłoża MS (Murashige i Skoog, Physiol Plant 15, 474-497, 1962) zawierającego 100 mg/ml inozytolu, 2% sacharozy i 0,1 mg/ml 2,4D. Protoplasty izolowano z 4- do 5-dniowych hodowli. Ściany komórkowe trawiono w 26°C przez 1 godz. w 0,1% pektoliazie Y23 (Seishin Pharmaceutical Co., Japonia), 1% celulazie Onozuka R10 (Yakult Honsha Co.,
Japonia), 0,4 M D-mannitolu i 0,1% MES, pH 5,5. Protoplasty sączono przez sito 50 μm i płukano dwukrotnie roztworem do elektroporacji (EP) (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, 0,2 M mannitolu, pH 7,1).
Nicotiana plumbaginifoha. Rośliny trzymano aksenicznie na podłożu OBR/MIN2 (Blonstein i wsp., Mol Gen Genet 211, 252-259, 1988) plus 7 g/l baktoagaru, pH 5,6. Dla przygotowania protoplastów liście odcięto i inkubowano przez noc w 26°C w roztworze 0,5% driselazy (Fluka), 0,25 mM PVP 10 (poliwinylopirolidon, m. cz. 10000), 3,85 mM CaCI2, 6 mg/l NAA, 2 mg/l BAP i 0,5 M sacharozy, pH 5,7. Protoplasty sączono przez sito 100 μm. Roztwór sacharozy (0,6 M sacharoza, 0,1% MES i 15 mM
PL 204 327 B1
CaCI2, pH 5,7) dodano do zawiesiny protoplastów dla pierwszego etapu oczyszczania i na zawiesinę nałożono roztwór W5 (150 mM NaCI, 125 mM CaCI2, 5 mM KCl, 6 mM glukoza; Menczel i wsp., Theor. Appl. Genet., 59, 191-195, 1981). Protoplasty następnie przepłukano raz roztworem W5 i na końcu roztworem EP.
Oryza sativa. Protoplasty przygotowano z hodowli zawiesiny ryżu ustalonej z O. sativa cv. Nipponbare jak opisano (Datta i wsp., 1990, Bio/Technology 8: 736-740).
2. Doświadczenie z ekspresją przejściową. Transfekcję za pomocą elektroporacji protoplastów
Orychophragmus violaceus w 0,66 ml buforu EP przeprowadzono przez wyładowanie kondensatora
960 μF przez odległość 4 mm zawiesiny protoplastów. Kondensator naładowano przy 450 woltach. Elektroporację przeprowadzono w obecności 5-10 μg DNA plazmidu, następnie protoplasty hodowano 16 do 24 godzin w 25°C. Transfekcję 2x106 protoplastów Nicotiana plumbaginifolia w 0,3 ml zawiesiny przeprowadzono w obecności 0,3 ml PEG (40% glikol polietylenowy 6000) i 5-10 μg DNA plazmidu. Protoplasty hodowano w 0,4 ml podłoża K3 (Godall i wsp., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990) przez 16 do 24 godzin w 25°C i przed zebraniem dodano 10 ml buforu W5.
Ekstrakty białkowe przygotowano za pomocą przynajmniej trzech cykli zamrażania i rozmrażania i klarowano przez wirowanie.
P r z y k ł a d 5: Oznaczenia CAT i GUS
Dla detekcji ekspresji genu CAT przeprowadzono podwójne ELISA z przeciwciałem typu sandwicz ((DAS)-ELISA) stosując zestaw ELISA do CAT (Boehringer) według instrukcji producenta. Aktywność CAT mierzono w urządzeniu Dynex MRXII. Przed oznaczeniem GUS próbki rozcieńczano w buforze GUS (0,05 M NaPO4, pH 7, 0,01 M EDTA, 0,1% Triton-X-100, 0,1% Sarkozyl). Reakcję przeprowadzono w obecności równej ilości buforu do reakcji (100 ml/l 10x buforu GUS, 200 mg/l BSA, 705 mg/l 4-metyloumbeliferylo-glukuronid) w 37°C i hamowano 2 M Ammediolem. Aktywność mieszono w Titertek Fluoroskan II.
Wyniki zarówno oznaczeń CAT i GUS normalizowano do standardowej wartości klonu. Wyniki uzyskane z dziesięciu różnych eksperymentów wykazują, że różne fragmenty promotorów CmYLCV działają jako wysoce aktywne promotory.
Ekspresja przejściowa w protoplastach N. plumbaginifolia gen reporter GUS
CmpCG 100
CmpSG 86,9 +/- 20%
CapG 9 +/- 20%
CapSG 38,9 +/- 15%
gen reporter CAT
CmpCC 100
CmpSC 78 +/- 20%
CapSC 89,5 +/-15%
CmpLC 9 +/-20%
Ekspresja przejściowa w protoplastach O.violaceus gen reporter GUS
CmpCG 100
CmpSG 84,6 +/- 15%
CapG 9,6 +/- 15%
CapSG 40,7 +/- 15%
PL 204 327 B1 gen reporter CAT
CmpCC 100
CmpSC 255 +/- 20%
CapSC 546 +/- 15%
CapLC 10 +/- 20%
Ekspresja przejściowa w protoplastach O. sativa gen reporter GUS
CmpCG 100
CmpSG 84,6 +/- 15%
CapG 9,6 +/- 15%
CapSG 40,7 +/- 15%
P r z y k ł a d 6. Przygotowanie roztworów i podłoży do regeneracji i transformacji roślin
Podłoża hodowlane GM, CIM i SIM są podłożami opisanymi przez Valvekens i wsp. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5536-5540).
Podłoże hodowlane GM zawiera sole minerale Murashige i Skoog'a (1962, Physiol. Plant. 15: 473-497), 1,0 mg/l tiaminy (wzorcowy 1 mg/ml), 0,5 mg/l pirydoksyny HCI (wzorcowy 1 mg/ml), 0,5 mg/l kwasu nikotynowego (wzorcowy 1 mg/ml), 0,5 g/l kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), 10 g/l sacharozy, 8 g/l agaru, z pH doprowadzonym do 5,8 1N KOH. CIM zawiera sole mineralne i witaminy podł o ż a B5 (Gamborg i wsp., 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158), 0,5 g/l kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), 20 g/l glukozy, 0,5 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) (wzorcowy 10 mg/ml w DMSO), 0,05 mg/l kinetyny (wzorcowy 5 mg/ml w DMSO), pH 5,8. Stałe podłoże CIM zawiera 8 g/l agaru. SIM zawiera sole mineralne i witaminy podłoża B5 (Gamborg i wsp., 1968, supra), 0,5 g/l kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), 20 g/l glukozy, 5 mg/l N6-(2-izopentenylo)adeniny (2iP) (wzorcowy 20 mg/ml w DMSO), 0,15 mg/l kwasu indolo-3-octowego (IAA) (wzorcowy 1,5 mg/ml in DMSO), 8 g/l agaru, pH 5,8. SIM V750 K100 jest podłożem SIM uzupełnionym 750 mg/l wancomycyny i 100 mg/l kanamycyny. SIM V500 K100 jest podłożem SIM uzupełnionym 500 mg/l wankomycyny i 100 mg/l kanamycyny. GM K50 jest podłożem GM uzupełnionym 50 mg/l kanamycyny.
Wszystkie podłoża hodowlane sterylizowano przez autoklawowanie (20 min., 121°C). Witaminy rozpuszczano w wodzie i dodawano do podłoży przed autoklawowaniem. Hormony rozpuszczano w sulfotlenku dimetylu (DMSO). Antybiotyki rozpuszczano w wodzie i sterylizowano przez sączenie (0,22 μm). Hormony i antybiotyki dodawano po autoklawowaniu i schłodzeniu podłoży do 65°C. We wszystkich przypadkach stosowano 9-cm szalki Petriego (Falcon, 3003) z wyjątkiem GM i GM K50, które zazwyczaj wlewano do 15-cm szalek Petriego (Falcon, 3025).
Płytki z podłożem stałym suszono przez użyciem w komorach laminarnych aby usunąć kondensat.
P r z y k ł a d 7: Szczep Arabidopsis i warunki wzrostu
Nasiona Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia (Col-0) typu dzikiego nabyto od Lehle Seeds, USA (1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, USA). Rośliny hodowano w 22°C w cyklu 16/8 godzin światło/ciemność w doniczkach, w mieszaninie 4 części piasku, 4 części ziemi ogrodowej i 1 części agrilitu.
P r z y k ł a d 8: Szczep i hodowla Agrobacterium
Plazmidy wektorowe wprowadzano do szczepu biorcy Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) przez krzyżówki trójrodzicielskie według protokołu opisanego przez Walkerpeach i Velten („Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems”, in: Plant Molecular Biology Manual, B1: 1-19, 1994. Red.: S.B. Gelvin, R.A., Schilperoort, Kluvers Acad. Publishers.). Stosowano mobilizujący szczep E. coli HB101 niosący plazmid koniugacyjny pRK2013 (Ditta i wsp., 1980, Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Konstrukcja of gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). Agrobakterie stosowane do transformacji korzeni hodowano w podłożu LB (Sambrook i wsp., 1989, „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) bez antybiotyków w 28°C i 200 obr/min.
PL 204 327 B1
P r z y k ł a d 9: Sterylizacja nasion
Nasiona umieszczono w 70% EtOH/0,05% Tween 20 przez 1 minutę w 2 ml probówce Eppendorfa. 70% EtOH/0,05% Tween 20 usunięto pipetą i zastąpiono 5% NaOCI/0,05% Tween 20 przez 15 minut. Nasiona regularnie wytrząsano. Roztwór usunięto w warunkach sterylnych i nasiona przepłukano sterylną destylowaną wodą, 3 razy po 10 minut. Po ostatnim płukaniu nasiona trzymano w 0,5-1 ml wody. Nasiona mogą być użyte natychmiast lub przechowywane w 4°C przez dwa - trzy tygodnie. Sterylizowane nasiona (20-30) przenoszono pęsetą na podłoże GM w 15-cm szalkach Petriego. Siewki hodowano w pionowo umieszczonych szalkach w komorze wzrostowej (22°C; 16/8 cykl światło/ciemność).
P r z y k ł a d 10: Transformacja eksplantów korzeni Arabidopsis thaliana
Korzenie trzy-cztero tygodniowych siewek stosowano w procedurze transformacji. Korzenie nie powinny być zielone ani brązowe. Zielone części siewek usuwano skalpelem i pęsetą. Pozostałe korzenie zebrano i około 5 całych systemów korzeni umieszczono na szalkach ze stałym podłożem CIM. Korzenie delikatnie wciśnięto w powierzchnię szalki, aby zapewnić pełny kontakt z podłożem, ale nie powinny być zanurzone w agarze. Korzenie inkubowano przez trzy dni w komorze wzrostowej (22°C; 16/8 godzin cykl światło/ciemność). Korzenie następnie przeniesiono na sterylne szalki Petriego z bibułą zwilżoną płynnym podłożem CIM i pocięto skalpelem na kawałki 0,5-1 cm. Eksplanty korzeni następnie przeniesiono do 50 ml sterylnej probówki Falcon zawierającej 10 ml płynnego podłoża CIM. Do tego dodano 0,5 ml nocnej hodowli Agrobacterium (OD 0,6-1) i inkubowano przez 1-2 minut z delikatnym wytrząsaniem. Płyn wylano z probówki przez sterylne sieci metalowe (sito 50, Sigma, S-0895), które trzymano pęsetą. Korzenie na ogół pozostają na ścianie probówki blisko jej brzegu. Następnie eksplanty korzeni przenoszono na sterylną szalkę Petriego z bibułą i krótko podsuszono by usunąć nadmiar płynu. Eksplanty roślin umieszczono na szalkach ze stałym podłożem CIM i inkubowano w komorze wzrostowej przez 2 dni w słabym świetle (1,5-2 kiloluksów). Niewielkie ślady przerostu Agrobacterium powinny być widoczne po okresie kokultywacji. Eksplanty korzeni następnie przeniesiono do sterylnych 50 ml probówek Falcon z 20 ml płynnego podłoża CIM uzupełnionego 1000 mg/l wankomycyny. Probówki Falcon następnie delikatnie worteksowano by usunąć Agrobakterie. Płyn odlano z probówki jak opisano powyżej i eksplanty krótko osuszono na suchej bibule. Eksplanty następnie przeniesiono na płytki zawierające podłoże SIM V750 K100. Korzenie powinny być w bliskim kontakcie z podłożem. Eksplanty inkubowano w komorze wzrostowej w warunkach normalnych przez jeden tydzień i następnie przeniesiono do podłoża SIM V500 K100 i inkubowano przez dodatkowy tydzień. Następnie ilość wankomycyny zmniejszono do 250 mg/l. Pierwsze kiełki powinny pojawić się pod koniec trzeciego tygodnia hodowli na podłożach SIM. Kiełki wycinano gdy miały 0,3-0,5-cm długości, ewentualne pozostały kalus usuwano i kiełki przenoszono do szalek 15-cm zawierających podłoże GM K50. Na szalce umieszczano co najwyżej 3 kiełków. Aby uzyskać więcej kiełków, pozostałe eksplanty korzeni mogą być przeniesione do na świeże szalki SIM uzupełnione 125 mg/l wankomycyny i 100 mg/l kanamycyny przez dodatkowe dwa tygodnie. Ukorzenione siewki mogą być przeniesione do gleby aby umożliwić zawiązanie nasion. Siewki, które się nie ukorzeniają przenosi się do słoików Magenta (jeden na słoik) zawierających podłoże GM do produkcji nasion in vitro.
Nasiona z indywidualnych roślin transgenicznych kiełkowano na podłożu GM K50 w komorze wzrostowej przez 2 tygodnie. Fenotypowo normalne siewki oporne na kanamycynę, które tworzą prawdziwe zielone liście i rozgałęzione układy korzeni są wybrane dla dalszych analiz.
P r z y k ł a d 11: Histochemiczne oznaczenie β-glukuronidazy (GUS)
Siewki hodowane in vitro lub rośliny hodowane w glebie stosowano w oznaczeniach GUS. Albo całe siewki albo wycięte narządy zanurzano w roztworze do barwienia GUS. Roztwór do barwienia GUS zawiera 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-glukuronid (X-Gluc, Duchefa, 20 mM wzorcowy w DMSO), 100 mM bufor Na-fosforanowy pH 7,0, 10 mM EDTA pH 8,0 i 0,1% Triton X100. Próbki tkanek inkubowano w 37°C przez 1-16 godzin. Jeśli jest to konieczne, próbki mogą być klarowane kilkoma płukaniami 70% EtOH, aby usunąć chlorofil.
P r z y k ł a d 12: Konstrukcja wektora do transformacji tytoniu pZU627
Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono z Platinum Pfx DNA Polymerase (Life Technologies) według instrukcji producenta
1. Amplifikacja terminatora NOS i klonowanie
Terminator NOS zamplifikowano z pBIN19 (Bevan i wsp 1984) stosując starter terminatora NOS 5' (SEK ID NR: 21) i starter terminatora NOS 3' (SEK ID NR: 22). Starter 5' zmodyfikowano aby zawierał miejsce Pstl, a starter 3' zmodyfikowano aby zawierał miejsce Hindlll. Produkt amplifikacji terminatora
PL 204 327 B1
NOS sklonowano jako fragment Pstl/Hindlll w tych samych miejscach pBluescript (Stratagene) dając plazmid pZU400A.
2. Amplifikacja białka nukleokapsydu wirusa nakrapianego więdnięcia pomidora (TSWV NP) amplifikacja i klonowanie genu
Aby uzyskać gen TSWV NP nie ulegający translacji zastosowano zmodyfikowane startery genu TSWV NP do amplifikacji genu TSWV NP. Starter 5' genu TSWV NP wprowadza miejsce BamHI, Sphl, kodon start i kodon stop (SEK ID NR: 23). Starter 3' jest zmodyfikowany aby wprowadził miejsce Pstl (SEK ID NR: 24). Produkt amplifikacji sklonowano jako fragment BamHI/Pstl do miejsca BamHI/Pstl pZU400A powyżej i w tym samym kierunku jak terminator NOS. W powstałym klonie pZU400b miejsce Pstl między genem TSWV NP i terminatorem NOS usunięto stosując traktowanie polimerazą DNA T4 (Life Technologies) według instrukcji producenta. Z powstałego klonu oznaczonego pZU400C, sklonowano gen TSWV NP i terminator NOS jako fragment Sphl/Hindlll do miejsca Sphl/Hindlll wektora wahadłowego pZO1560 dając plazmid pZU400. pZO1560 jest pochodną pBluescript, w której oryginalne miejsce do wielokrotnego klonowania jest zastąpione przez miejsce do wielokrotnego klonowania AGLINK (SEK ID NR: 27).
3. Amplifikacja i klonowanie promotora CmYLCV
Promotor wirusa CmYLCV zamplifikowano stosując starter 5' promotora CmYLCV (SEK ID NR: 25) i starter 3' promotora CmYLCV (SEK ID NR: 26). Starter 5' zmodyfikowano aby zawierał miejsce Sstl i starter 3' zmodyfikowano aby zawierał miejsce Pstl. Zamplifikowany promotor wirusa CmYLCV sklonowano jako fragment Sstl/Pstl w tym samym kierunku i powyżej genu TSWV-N do miejsca Sstl/Pstl pZU400. Daje to klon pZU625, który zawiera kasetę genu wirusa, która produkuje nie ulegający translacji RNA TSWV NP.
4. Klonowanie kasety genu wirusa do pVictorHiNK
Kasetę genu wirusa sklonowano jako fragment Ascl/Pacl z pZU625 do miejsca Ascl/Pacl wektora pVictorHiNK pZU494. Daje to wektor do transformacji roślin pZU627.
pVictorHiNK jest binarnym wektorem zawierającym origin replikacji (ORI) pochodzący z plazmidu pVS1 Pseudomonas aeruginosa, o którym wiadomo, że jest wysoce stabilny w A. tumefaciens (Itoh i wsp., 1984. Plasmid 11: 206-220; Itoh i Haas, 1985. Gene 36;27-36). ORI pVS1 działa tylko w Agrobacterium i może być mobilizowany przez plazmid pomocniczy pRK2013 z E.coli do A. tumefaciens za pomocą procedury krzyżowania trójrodzicielskiego (Ditta i wsp., 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351).
Ten binarny wektor także zawiera origin replikacji ColEI, który jest funkcjonalny w E. coli i pochodzi z pUC19 (Yannisch-Perron i wsp., 1985. Gene 33: 103-119).
Dla utrzymywania w E.coli i A. tumefaciens ten wektor zawiera bakteryjny gen oporności na spektomycynę i streptomycynę kodowany przez gen 0,93 kb z transpozonu Tn7 (Fling i wsp., 1985. Nucl. Acid Res. 13:7095), który działa jako marker selekcyjny do utrzymania wektora w E. coli i A. tumefaciens. Ten gen jest w formie fuzji z promotorem tac dla wydajnej ekspresji u bakterii (Amman i wsp., 1983. Gene 25: 167-178).
Prawe i lewe graniczne fragmenty T-DNA 1,9 kb i 0,9 kb, odpowiednio, które stanowią 24 bp powtórzenia graniczne pochodzą z plazmidu Ti typu nopaliny szczepów A. tumefaciens pTil37 (Yadev i wsp., 1982. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 6322-6326). Nastę pnie region T-DNA mię dzy granicami modyfikuje się przez delecję sekwencji pochodzących z M13 i w celu poprawienia jego możliwości klonowania wprowadza się miejsce do multiklonowania BIGLINK (SEK ID NR: 28) dając pVictorHiNK.
VictorHiNK zawiera kasetę genu NPTII do selekcji transformantów podczas procesu transformacji roślin. Ta kaseta genu zawiera promotor NOS, gen NPTII i terminator NOS uzyskany z A. tumefaciens.
P r z y k ł a d 13: Transformacja roślin i skrining na oporność
1. Transformacja wektorów binarnych do materiału roślinnego
Metody przenoszenia wektorów binarnych do materiału roślinnego są dobrze ustalone i znane specjaliście. Istnieją warianty procedur ze względu na przykład różnice w stosowanych szczepach Agrobacterium, różnych źródłach materiału eksplantów, różnice w systemach regeneracji w zależności zarówno od odmiany hodowlanej i stosowanego gatunku rośliny. Wektor binarny pZU627 jest stosowany w doświadczeniach transformacji roślin według następujących procedur. PZU627 jest przenoszony przez krzyżowanie trójrodzicielskie do szczepu biorcy Agrobacterium tumefaciens, po czym przeprowadza się analizę typu Southerna ekskoniugantów dla sprawdzenia odpowiedniego przeniesienia konstruktu do szczepu biorcy, inokulację i kokultywację aksenicznego materiału eksplantu ze zrekombinowanym szczepem Agrobacterium tumefaciens, wybiórczym zabijaniem szczepu Agrobacterium
PL 204 327 B1 tumefaciens stosując odpowiednie antybiotyki, selekcję transformowanych komórek przez wzrost na podłożach selekcyjnych zawierających kanamycynę, przeniesienie roślinek do gleby, sprawdzenie nienaruszonego stanu wintegrowanego T-DNA za pomocą analizy typu Southern izolowanego chromosomalnego DNA rośliny.
2. Oporność roślin na zakażenia TSWV
Transformowane rośliny hodowano w szklarni w standardowych warunkach kwarantanny aby zapobiec jakimkolwiek zakażeniom przez patogeny. W stadium czterech liści rośliny zakażano TSWV przez mechaniczne zaszczepienie. Tkanki z roślin zakażonych ogólnoustrojowo TSWV zmielono w 5 objętościach lodowatego buforu do (10 mM bufor fosforanowy uzupełniony 1% Na2SO3) i wcierano w obecności sproszkowanego karborundu na dwa pierwsze wycią gnięte nowe liście. Inokulowane rośliny monitorowano pod kątem rozwoju objawów przez trzy tygodnie po inokulacji. Rośliny zawierające sekwencje pZU627 nie wykazują objawów TSWV podczas gdy nietransformowane rośliny kontrolne wykazują ogólnoustrojowe objawy TSWV w ciągu 7 dni po inokulacji. Oporne rośliny poddano samozapyleniu i zebrano nasiona. Potomne rośliny analizowano przez segregację wstawionego genu i nastę pnie ponownie testowane na oporność na zaka ż enie TSWV jak opisano powy ż ej.
P r z y k ł a d 14: Konstrukcja konstruktów CmpS-izomeraza fosfomannozy-nos przez transformację roślin
Promotor CmpS zamplifikowano PCR stosując startery Cmpf-B (cgc gga tcc tgg cag aca aag tgg cag a; SEK ID NR: 29) i CmpS-B (cgc gga tcc tac ttc tag gct act tg, SEK ID NR: 30) mające flankujące miejsca BamHI. Powstały fragment PCR sklonowano do miejsca BamHI pBluescript KS (+) aby wytworzyć pNOV4211.
Aby wytworzyć binarny wektor przez transformację poprzez Agrobacterium tumefaciens, promotor CmpS wycięto z pNOV4211 stosując BamHI i wstawiono do strawionego BamHI pNOV2804 (SEK ID NR: 31) powyżej genu PMI i powstały wektor nazwany pNOV2819. pNOV2804 (SEK ID NR: 31) jest binarnym wektorem z origin replikacji VS1, kopią genu virG Agrobacterium w szkielecie i pozbawioną promotora kasetą ekspresyjną między lewymi i prawymi granicami T-DNA. PMI (izomeraza fosfomannozy) jest regionem kodującym genu manA E. coli (Joersbo i Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto i wsp., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). Terminator nos (syntaza nopaliny) uzyskano z T-DNA Agrobacterium tumefaciens (Depicker i wsp., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573. Region kodujący izomerazy fosfomannozy i terminator nos są zlokalizowane w nt 290 do nt 1465 i nt 1516 do 1789 odpowiednio pNOV2804 (SEK ID NR: 31).
Aby stworzyć wektor do transformacji biolistycznej wycięto promotor CmpS z pNOV4211 stosując BamHI i wstawiono do strawionego BamHI pNOV3604 (SEK ID NR: 32) aby utworzyć pNOV2820, w ten sposób tworząc kasetę ekspresyjną PMI sterowaną przez promotor CmpS. pNOV3604 jest wektorem do przygotowywania fragmentów biolistycznych i jest oparty na pUC19 z origin replikacji ColEI i genem beta-laktamazy nadającym oporność na ampicylinę . Tak jak pNOV2804, pNOV3604 zawiera także kasetę ekspresyjną PMI bez promotora-terminator nos (patrz powyżej). Region kodujący izomerazy fosfomannozy i terminator nos są położone w nt 42 do nt 1217 i nt 1268 do 1541 odpowiednio pNOV3604 (SEK ID NR: 32).
Binarny wektor pNOV2819 jest stosowany do transformacji poprzez Agrobacterium tumefaciens i wektor pNOV2820 jest stosowany do transformacji biolistycznej.
P r z y k ł a d 15: Konstrukcja plazmidów CmpC-GUS przez stabilną ekspresję u roślin.
1. Konstrukcja wektora binarnego
Wybrano wektor pCambia 1302 (Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C.S., Rajagopal, S., Smith, L, Nguyen, T., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.S. Cao, M.L., Vijayachandra, K., i wsp. A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient transformation of plants. Prezentowane na the Rockefeller Foundation Meeting of the International Program on Rice Biotechnology, Malacca, Malaysia, 15-19 września 997) i zmodyfikowano dla eksperymentów. Promotor CaMV 35S przed genem GFP usunięto przez trawienie w pozycji 9788 endonukleazą Hindlll i w pozycji 1 endonukleazą Ncol i wektor religowano na dwóch kompatybilnych końcach. Trawienie endonukleazą Xhol w pozycjach 7613 i BstXI w pozycji 9494 wycina gen higromycyny i promotor CaMV 35S. Sekwencje promotora 35S wyeliminowano z wektora, aby wykluczyć jakiekolwiek ryzyko wyciszenia genów powodowane przez homologię.
Gen bar sterowany przez promotor 1' (Mengiste i wsp., Plant J, 1997, 12(4): 945-948) wprowadzono w miejsce EcoRI w pozycji 9737 jako marker do selekcji. Uzyskany wektor nazwano pCamBar.
PL 204 327 B1
2. Wytworzone konstrukty
Kasety CmpCG i CapG opisane w przykładzie 3 wstawiono do wektora pCamBar między miejscem Xbal w pozycji 9764 i EcoRI w pozycji 9737 aby otrzymać plazmidy pCamBarCmpCG i pCamBarCapG, odpowiednio. Dwa konstrukty zastosowano do transformacji komórek Agrobacterium tumefaciens.
P r z y k ł a d 16: Stabilna ekspresja w Arabidopsis thaliana
1. Wytwarzanie i transfekcja roślin
Nasiona Arabidopsis thaliana (Columbia 0) wt wysiano, chłodzono przez 3 dni w 4°C w ciemnościach aby zsynchronizować kiełkowanie, i przeniesiono do komory wzrostowej (22°C/24 godz. światła). Skiełkowane rośliny nasączano gdy wyprodukowały maksymalną ilość nieotwartych pączków. Nasączenia przeprowadzono według protokołu opisanego przez Clough i Bent, Plant J. 16: 735-743, 1987.
2. Selekcja roślin transgenicznych
Siewki otrzymane z nasion pokolenia T1 selekcjonowano przez rozpylanie herbicydu BASTA (Ptoss-Staufer AG/SA) (150 mg/l) co pięć dni, trzy razy. Zebrano dwadzieścia opornych roślin pCamBarCmpCG i dziewięć pCamBarCapG po selekcji. Hodowano je w opisanych warunkach by otrzymać nasiona generacji T2. Te nasiona poddano tej samej procedurze jak opisano powyżej dla wt, siewki T2 selekcjonowano za pomocą rozpylania BASTA i oporne mutanty analizowano za pomocą genu GUS.
3. Histochemiczna ekspresja GUS w stabilnie transformowanych roślinach Arabidopsis
Histochemiczne barwienie GUS przeprowadzono jak opisano w przykładzie 11. Analizę przeprowadzono w 15 ml probówkach do hodowli przez zanurzenie transformowanych siewek w roztworze X-gluc, zastosowanie ciśnienia 130 mBar przez 10 min. i inkubację w 37°C przez noc. Wyniki uzyskane dla roślin Arabidopsis transformowanych pCamBarCmpCG wskazują na konstytutywną ekspresję genu reportera GUS sterowanego przez promotor CmpC we wszystkich narządach wegetatywnych.
4. Ilościowe enzymatyczne oznaczenia GUS w stabilnie transformowanych roślinach Arabidopsis
A. Przygotowanie próbek
Cztery rośliny na linię transgeniczną i jeden liść na każdą z tych roślin wybrano do testu. Cztery liście zebrano do tej samej probówki Eppendorfa, zamrożono w ciekłym azocie i zmielono do drobnego proszku jednorazowymi urządzeniami do mielenia. Całość rozcieńczono 150 μl buforu GUS (0,05M NaPO4, pH7, 0,01M EDTA, 0,1% Triton-X-100, 0,1% Sarkozyl), inkubowano 5 min w 37°C i wirowano w mikrowirówce przez 5 min. z maksymalną szybkością. Supernatant przeniesiono do nowej probówki Eppendorfa i te próbki stosowano do testu enzymatycznego.
Białko w tych ekstraktach roślin oznaczano według metody Bradford (Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) stosując BSA jako standard. Obecność promotora i genu GUS w liniach mutanta jest potwierdzona przez analizę PCR stosując wyekstrahowane próbki jako matrycę.
B. Fluorometryczne oznaczenie GUS
Fluorometryczne oznaczenie GUS przeprowadzono jak opisano w przykładzie 5. Dla detekcji ekspresji genu GUS próbki rozcieńczono w buforze GUS. Reakcję przeprowadzono w obecności równej ilości buforu do reakcji GUS w 37°C i zahamowano 2 M Ammediolem. Aktywność mierzono w Titertek Fluoroskan II.
Piętnaście z dwudziestu wybranych linii transformowanych pCamBarCmpCG i osiem z dziewięciu linii transformowanych pCamBarCapG wykazują aktywność enzymatyczną GUS w liściach. Poziom aktywności w kilku transformowanych liniach jest porównywalny CapG. Jednak wyniki są zmienne w różnych liniach transgenicznych ze względu na różnice w ich genotypach (liczba loci i liczba wstawek transgenów na locus).
P r z y k ł a d 17: Konstrukcja wariantów promotora CmpC
Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono z polimerazą Pfu (Stratagene) jak opisano w przykładzie 1.
1. Amplifikacja i klonowanie DNA. Wyprodukowano dwa warianty, pCmpMG i pCmpMsG, plazmidu pCmpCG (przykład 3). Pierwszy deletuje sekwencję „GTGGTCCC” w promotorze CmpC i drugi mutuje ją do sekwencji „GTGCTCGC”.
Aby uzyskać pCmpMG zamplifikowano trzy produkty PCR:
- CmpM1 z użyciem startera 5' Cmp1 (patrz przykład 3, SEK ID NR: 13), startera 3' CmpMr (CCATCGTGGTATTTGGTATTG, SEK ID NR: 33) i plazmidu pCmpCG, jako matrycy;
- CmpM2 z użyciem startera 5' CmpMf (CAATACCAAATACCACGATGG; SEK ID NR: 34), startera 3' CmpC2 (patrz przykład 3; SEK ID NR: 14) i plazmidu pCmpCG, jako matrycy;
- CmpM z użyciem startera 5' Cmp1, startera 3' CmpC2i i równomolowej mieszaniny produktów PCR CmpM1 i CmpM2, jako matrycy.
PL 204 327 B1
Aby uzyskać pCmpMsG zamplifikowano trzy produkty PCR:
-CmpMs1 z użyciem startera 5' Cmp1, startera 3' CmpMrs (CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, SEK ID NR: 35) i plazmidu pCmpCG, jako matrycy;
- CmpMs2 z użyciem startera 5' CmpMfs (AAGTGCTCGCTACCACGATGG, SEK ID NR: 36), startera 3' Cmp2 i plazmidu pCmpCG, jako matrycy;
- CmpsM z użyciem startera 5' Cmp1, startera 3' Cmp2 i równomolowej mieszaniny produktów PCR CmpMs1 i CmpMs2 PCR, jako matrycy.
Aby uzyskać plazmidy pCmpMG i pCmpMsG, oryginalny plazmid pCmpCG strawiono endonukleazami Xbal i BamHI aby wyeliminować fragment CmpC i wstawić go zamiast produktów PCR CmpM i CmpMs.
P r z y k ł a d 18: Eksperymenty z ekspresją przejściową z konstruktami pCmpM i pCmpMs
1. Hodowle zawiesinowe i przygotowanie protoplastów
Hodowle zawiesinowe i protoplasty wyprodukowano jak opisano w przykładzie 4.
2. Oznaczenia GUS
Transfekcję i przygotowanie ekstraktów białek przeprowadzono jak opisano w przykładzie 4, a oznaczenie GUS przeprowadzono jak opisano w przykładzie 5.
Wyniki oznaczeń GUS są uzyskane ze średniej dziesięciu różnych eksperymentów i normalizowane do standardowej wartości klonu. Delecja sekwencji „GTGGTCCC” w konstrukcje CmpCG obniża ekspresję genu reportera GUS do około 50% ekspresji genu reportera GUS z CmpC we wszystkich rodzajach protoplastów (patrz poniżej). Efekt indukowany przez mutację „GTGCTCGC” zależy od gatunku rośliny. W protoplastach O. violaceus i O. sativa poziom ekspresji genu GUS jest obniżony do 65,2% i 73,6%, odpowiednio. W protoplastach N. plumbaginifolia aktywność promotora CmpMs jest podobna do promotora CmpM.
N. plumbaginifolia
CmpCG 100
CmpMG 52 +/- 12%
CmpMsG 53,7 +/- 16%
CapG 28,3 +/- 14%
O. violaceus
CmpCG 100
CmpMG 55,2 +/- 12%
CmpMsG 73,6 +/- 10%
CapG 5 +/- 1%
O. sativa
CmpCG 100
CmpMG 59,6 +/- 21%
CmpMsG 65,2 +/- 20%
CapG 42,5 +/- 16%
P r z y k ł a d 19: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin zawierających fragmenty 5' promotora funkcjonalnie połączone z genami reportera GFP lub GUS
1. Amplifikacja i klonowanie promotora
Skonstruowano gen chimerowy, który zawiera sekwencję DNA z promotora transkryptu pełnej długości CmYLCV (SEK ID NR: 1) w formie fuzji z GFP zoptymalizowanym dla roślin z intronem (synGFPI, SEK ID NR: 37) lub sekwencję genu reportera GUS z intronem (GIG; SEK ID NR: 38). Gen GIG zawiera intron ST-LS1 z Solanum tuberosum w nt 385 do nt 576 SEK ID NR: 38 (uzyskane od Dr Stanton Gelvin, Purdue University, i opisany w Narasimhulu i wsp 1996, Plant Cell, 8: 873-886). SynGFPI jest zoptymalizowanym dla roślin genem GFP, do którego wprowadzono intron ST-LS1 (nt 278 do nt 465 SEK ID NR: 37). Dla promotorów, genomowy DNA CmYLCV stosowano jako matrycę do
PL 204 327 B1 reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Zaprojektowano startery specyficzne dla genów aby zamplifikować sekwencję DNA. Fragment genu odpowiadający CmpC (SEK ID NR: 2) wyizolowano stosując starter 5' Cmpf-B (SEK ID NR: 29) w kombinacji ze starterem 5' do 3' CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG (SEK ID NR: 39) jako starterem 3'. Wyizolowano fragment genu odpowiadający CmpS (SEK ID NR: 3) stosując starter 5' Cmpf-B (SEK ID NR: 29) w kombinacji ze starterem 3' CmpS-B (SEK ID NR: 30). Wszystkie trzy startery zawierają miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BamHI CGCGGA na ich końcu 5'. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono z polimerazą Pfu według zaleceń producenta (Stratagene). Stosowano termocycler (DNA Engine, MJResearch, Inc. Waltham, MA USA) do amplifikacji fragmentów promotora stosując następujące warunki PCR: [(94°C:10s):(94°C:10s/56°C: 30s/72°C:1min)X20]:(72°C:1,5m)]. Po trawieniu restrykcyjnym BamHI fragmenty promotora zligowano do wektorów opartych na pUC z genem GIG lub genem synGFPI do stworzenia fuzji promotor-gen reportera funkcjonalnie połączone z terminatorem nos.
2. Wytworzone kasety promotor-reporter:
- fragment promotora CmpS + gen synGFPI + nos (SEK ID NR: 40),
- fragment promotora CmpS + gen GIG + nos (SEK ID NR: 41),
- fragment promotora CmpC + gen synGFPI + nos (SEK ID NR: 42),
- fragment promotora CmpC + gen GIG + nos (SEK ID NR: 43).
SEK ID NR Promotor Gen (synGFPI lub GIG) Terminator
40 nt 1 do nt 402 nt 411 do nt 1331 nt 1343 do nt 1618
41 nt 1 do nt 405 nt 425 do nt 2425 nt 2479 do nt 2751
42 nt 1 do nt 354 nt 380 do nt1292 nt 1304 do nt 1577
43 nt 1 do nt 354 nt 399 do nt 2399 nt 2453 do nt 2725
3. Subklonowanie do wektora binarnego Agrobacterium
Kasety promotor-reporter (SEK ID NR: 40 do 43) zawierające fragment promotora, gen reportera i terminator nos wstawiono do wektora binarnego pNOV2117 dla kukurydzy i do wektora binarnego pNOV4200 do transformacji pomidora. pNOV2117 (SEK ID NR: 44) jest wektorem binarnym z origin replikacji VS1, kopią genu virG Agrobacterium w szkielecie kasetą ekspresyjną promotor ubikwityny kukurydzy-gen PMI-terminator nos między lewą i prawą granicą T-DNA. PMI (izomeraza fosfomannozy) jest regionem kodującym genu manA E. coli (Joersbo i Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto i wsp., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). Terminator nos (syntaza nopaliny) uzyskano z T-DNA Agrobacterium tumefaciens (Depicker i wsp., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573). Promotor ubikwityny kukurydzy, region kodujący izomerazy fosfomannozy i terminator nos są zlokalizowane w nt 31 do nt 2012, nt 2109 do nt 3212 i nt 3273 do 3521, odpowiednio, pNOV2117 (SEK ID NR: 44). Kasety reporter-promotor są wstawione najbliżej do prawej granicy. Kaseta ekspresyjna markera selekcyjnego w wektorze binarnym jest najbliżej lewej granicy.
Do transformacji pomidora stosowano pNOV4200 (SEK ID NR: 45) jako wektor binarny, który zawiera origin replikacji VS1, kopię genu virG Agrobacterium w szkielecie i kasetę markera selekcji na higromycynie między sekwencjami lewej i prawej granicy. Kaseta selekcji na higromycynie zawiera promotor ubikwityny 3 Arabidopsis (Ubq3(At), Callis i wsp., J. Biol. Chem. 265: 12486-12493 (1990)) funkcjonalnie połączony z genem kodującym oporność na higromycynę (określany tu jako „HYG”, syntetyczny gen fosfotransferazy higromycyny B z E. coli, opis patentowy: JP 1986085192-A 1 30-APR-1986) i terminator nos (Depicker i wsp., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982). Promotor ubikwityny Arabidopsis, gen HYG i terminator nos są zlokalizowane w nt 162 do nt 11494, nt 1897 do nt 2939 i nt 2939 do nt 3236, odpowiednio, pNOV4200 (SEK ID NR: 45). Kasety reporter-promotor (SEK ID NR: 40 do 43) są wstawione najbliżej prawej granicy. Kaseta ekspresyjna markera selekcyjnego w wektorze binarnym jest najbliżej lewej granicy.
Poniżej przedstawiono orientacje markera selekcyjnego i kaset promotor-reporter w konstruktach binarnego wektora.
4. Konstrukty wektorów binarnych:
- NOV4215 (RB fragment promotora CmpS + gen synGFPI + nos - ZmUbi + gen PMI + nos LB),
- NOV4216 (RB nos + gen synGFPI + fragment promotora CmpS - ZmUbi + gen PMI+ nos LB),
- NOV4217 (RB fragment promotora CmpS + gen synGFPI + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB),
PL 204 327 B1
- NOV4220 (RB fragment promotora CmpS + gen GIG + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB),
- NOV4224 (RB fragment promotora CmpC + gen GIG + nos - ZmUbi + gen HYG + nos LB),
- NOV4226 (RB fragment promotora CmpC + gen synGFP + nos - ZmUbi + grn PMI + nos LB).
Dodatkowe kasety skonstruowano ze znanymi promotorami do stosowania jako porównanie.
W tym celu skonstruowano kasetę promotora ZmUbi-GFP-35S term (SEK ID NR: 46), zawierającą promotor ubikwityny kukurydzy (Christensen i wsp. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)) funkcjonalnie połączony z synGFP i terminatorem 35S (35S term) i także skonstruowano kasetę promotora zawierającą promotor ubikwityny kukurydzy funkcjonalnie połączony z genem GIG i terminatorem nos (NOV 3612, SEK ID NR: 47) Promotor ZmUbi, gen GFP i terminator 35S są zlokalizowane w nt 1 do nt 2019, nt 2020 do nt 2751 i nt 2876 do nt 2949, odpowiednio SEK ID NR: 46. Promotor ubikwityny 3, gen GIG i terminator nos są zlokalizowane w nt 1 do nt 1982, nt 2015 do nt 4015 i nt 4069 do nt 4341, odpowiednio SEK ID NR: 47. Kasetę ZmUbi-GIG nos (SEK ID NR: 47) sklonowano do wektora opartego na pUC. Kasetę ZmUbi-GFP-nos (SEK ID NR: 46) sklonowano do wektora binarnego pNOV2117 do transformacji kukurydzy jak opisano powyżej. Skonstruowano kasetę promotora zawierającą promotor Ubikwityny3 (Ubq3(At)) funkcjonalnie połączony z synGFPI i terminatorem nos (SEK ID NR: 48) i promotor Ubikwityny3 Arabidopsis funkcjonalnie połączony z genem GIG i terminator nos (SEK ID NR: 49). Promotor Ubikwityna3, synGFPI i terminator nos są zlokalizowane w nt 1 do nt 1332, nt 1738 do nt 2658 i nt 2670 do nt 2943, odpowiednio, SEK ID NR: 48. Promotor Ubikwityny 3, gen GIG i terminator nos są zlokalizowane w nt 1 do nt 1335, nt 1746 do nt 3746 i nt 3800 do NT 4072, odpowiednio, SEK ID NR: 49. Jak opisano powyżej kasety promotora sklonowano w wektorze binarnym pNOV4200 zawierającym kasetę selekcyjnego markera higromycyny do transformacji pomidora. Poniżej przedstawiono orientacje markerów selekcyjnych i kaset promotor-reporter w konstruktach wektora binarnego.
5. Konstrukty wektorów binarnych
- NOA/2110 (RB Promotor ZmUbi + gen synGFP + term 35S - ZmUbi + gen PMI + nos LB),
- NOV4209 (RB Promotor Ubq3(At) + gen synGFPI + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB),
- NOV4208 (RB Promotor Ubq3(At) + GUS - Intron - gen GUS + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB).
P r z y k ł a d 20: Transformacja kukurydzy z udziałem Agrobacterium
Transformację niedojrzałych zarodków kukurydzy przeprowadzono jak opisano w Negrotto i wsp., (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803. Dla tego przykładu wszystkie składniki podłoży są jak opisano w Negrotto i wsp., powyżej. Jednak mogą być zastąpione różnymi składnikami podłoży opisanymi w literaturze.
1. Plazmidy do transformacji i marker selekcyjny
Geny stosowane do transformacji wklonowano do wektora odpowiedniego do transformacji kukurydzy jak opisano w przykładzie. Stosowane wektory zawierają gen izomerazy fosfomannozy (PMI) (Negrotto i wsp. (2000) Plant Celi Reports 19: 798-803).
2. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium szczep LBA4404 (pSB1) zawierający plazmid do transformacji roślin hodowano na podłożu stałym YEP (ekstrakt drożdżowy (5 g/l), pepton (10 g/l), NaCI (5 g/l),15 g/l agar, pH 6,8) przez 2 do 4 dni w 28°C. Około 0,8X 109 Agrobakterii zawieszono w podłożu LS-inf uzupełnionym 100 μM acetosyringonem (As) (Negrotto i wsp., (2000) Plant Cell Rep., 19: 798-803). Bakterie preindukowano w tym podłożu przez 30-60 minut.
3. Zaszczepienie
Niedojrzałe zarodki z A188 lub innego odpowiedniego genotypu kukurydzy wycięto z 8 - 12 dniowych kolb do płynnej LS-inf + 100 μM As. Zarodki przepłukano jeden raz świeżym podłożem do zakażenia. Następnie dodano roztwór Agrobacterium i zarodki worteksowano przez 30 sekund i pozwolono im na osadzenie z bakteriami przez 5 minut. Zarodki następnie przenoszono tarczką do góry na podłoże LSAs i hodowano w ciemności przez dwa do trzech dni. Następnie między 20 i 25 zarodków na szalkę petriego przenoszono do LSDc uzupełnionej cefotaksymem (250 mg/l) i azotanem srebra (1,6 mg/l), i hodowano w ciemności w 28°C przez 10 dni.
4. Selekcja transformowanych komórek i regeneracja transformowanych roślin
Niedojrzałe zarodki produkujące kalus embriogeniczny przenoszono do podłoża LSD1M0,5S. Hodowle selekcjonowano na tym podłożu przez 6 tygodni z etapem subkultury po 3 tygodniach. Przeżywające komórki przenoszono albo na podłoże LSD1M0,5S do nahodowania lub do podłoża Reg1. Po hodowli w świetle (16 godzin światła/8 godzin ciemności), zielone tkanki przeniesiono do podłoża
PL 204 327 B1
Reg2 bez regulatorów wzrostu i inkubowano przez 1-2 tygodni. Roślinki przenoszono do skrzynek Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) zawierających podłoże Reg3 i hodowano w świetle. Rośliny, które są PCR dodatnie dla kasety promotor-reporter przenoszono do gleby i hodowano w szklarni.
P r z y k ł a d 21: Stabilna transformacja pomidora
Transformację pomidora przeprowadzono zasadniczo jak opisano w Meissner i wsp., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997.
1. Plazmidy do transformacji i marker selekcyjny
Geny stosowane do transformacji wklonowano do wektora binarnego odpowiedniego do transformacji pomidora jak opisano w Przykładzie 19. Wektory zawierają gen oporności na higromycynę do selekcji.
2. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium szczep GV3101 zawierający plazmid do transformacji roślin hodowano na podłożu płynnym LB (ekstrakt drożdży (5 g/l), pepton (10 g/l), NaCI (5 g/l), 15 g/l agar, pH 6,8) przez 2 dni w 22°C. Około 0,8X 109 Agrobakterii zawieszono w podłożu do zaszczepienia KCMS (sole MS (4,3 g/l), mio-inozytol, tiamina (1,3 μg/ml), 2,4-D (0,2 μg/ml), kinetyna 0,1 μg/ml i 3% sacharoza, pH 5,5) uzupełnionym 100 μM acetosyringonem. Bakterie preindukowano w tym podłożu przez 60 minut.
3. Sterylizacja i kiełkowanie nasion
Nasiona odmiany Micro-Tom pomidora (Meissner i wsp., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997) i odmiany ZTV-840 namoczono w 20% roztworze bielinki z Tween przez 20 min. Nasiona następnie płukano trzy razy sterylną wodą i wysiano na podłoże TSG (1/2 sole MS, 1% sacharoza, 1% PhytoAgar, pH 5,8) w skrzynkach Magenta (Magenta Corp, Chicago III) do kiełkowania. Wycinano liścienie i ogonki liściowe pocięto na odcinki 5 mm 7 do 10 dni po kiełkowaniu.
4. Zaszczepienie
Siedmio do dziesięcio-dniowe liścienie i odcinki ogonków liściowych liścieni inkubowano przez 24 godz. na płytkach odżywczych komórek tytoniu BY-2 (sole MS, mio-inozytol 0,1 mg/ml, hydrolizat kazeiny 0,2 mg/ml, tiamina-HCI 1,3 μg/ml, 3% sacharoza, pH 5,5) przed zaszczepieniem Agrobacterium.
Liścienie zanurzono w płynnej zawiesinie KCMS Agrobacterium przez 5 minut. Między 20 i 25 liścieni następnie przenoszono stroną odosiową na te same płytki komórek odżywczych i hodowano w ciemności przez dwa do trzy dni.
5. Selekcja transformowanych liścieni i ogonków liściowych i regeneracja transformowanych roślin
Liścienie i fragmenty ogonków liściowych przeniesiono na podłoże selekcyjne TSM-1 (4,3 g/l soli MS, 1X witaminy B5, 2% sacharoza, 1% glukoza, 1 μg/ml zeatyny, 0,05 μg/ml IAA, 5 μg/ml higromycyny i 250 μg/ml karbenicyliny pH 5,8) dwa do trzech dni po zaszczepieniu Agrobacterium na świetle. Liścienie i fragmenty ogonków liściowych produkujące kalus embriogeniczny przeniesiono na podłoże TSM-2 (sole MS 4,3 g/l, 1X witaminy MS, 2% sacharoza, 1 μg/ml zeatyny, 5 μg/ml higromycyny i 250 μg/ml karbenicyliny, pH 5,8). Przeżywające kalusy tworzące roślinki przeniesiono do skrzynek Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) zawierających podłoże TRM (4,3 g/l soli MS, 1X witaminy MS, 2% sacharoza pH 5,8) i hodowano na świetle. Po wytworzeniu korzeni pierwotne transformanty przeniesiono do gleby.
P r z y k ł a d 22: Oznaczenie fluorometryczne zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)
W celu wykrycia ekspresji genu synGFP przeprowadzono oznaczenie fluorometryczne.
Krążki liści stabilnie transformowanej kukurydzy i pomidora zamrożono w suchym lodzie. Zamrożoną tkankę zmielono dokładnie i zmieszano z 300 μl buforu do ekstrakcji GFP (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 100 mM NaCI, 1 mM MgCI2, 10 mM DTT i 0,1% sarkozyl). Ekstrakty oddzielono od szczątków liści przez wirowanie, a następnie przeniesiono do czarnych płytek 96-studzienkowych z przezroczystym dnem (Costar 3615). Względne jednostki fluorescencji (RFU) mierzono za pomocą czytnika Spectra Fluor Plus Plate Reader przy wzbudzeniu 465 nm i emisji 512 nm. Aktywność GFP normalizowano do całkowitego białka mierzonego stosując oznaczenie BCA (według Pierce).
P r z y k ł a d 23: Analiza ekspresji w stabilnie transformowanych roślinach kukurydzy i pomidora
1. Transgeniczne rośliny Zea mays To
Ekspresja GFP jest 10 do 20 razy wyższa pod kontrolą promotora CmpS (NOV4215, NOV4216) w porównaniu z promotorem ZmUbi (NOV2110). Te wyniki uzyskano z próbek liści 42 niezależnych linii To reprezentujących łącznie 93 rośliny To.
PL 204 327 B1
2. Oznaczenie GFP Elisa
Przeprowadzono ilościowe oznaczenie typu sandwich w celu detekcji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Stosowano dwa handlowo dostępne poliklonalne przeciwciała. Anty-GFP IAP kozy (Roc-kland, #600-1-1-215) jest oczyszczone za pomocą immunopowinowactwa i przeciwciało królika anty-GFP (Torrey Pines Biolabs, #TP401) oczyszczono za pomocą białka A. Białko GFP w ekstrakcie roś linnym wyłapano na mikrotytracje do fazy stał ej za pomocą przeciwciał a królika. Następnie wytworzono „sandwicz” między przeciwciałem królika w fazie stałej, białkiem GFP i drugorzędowym przeciwciałem kozy, które jest w studzience. Po etapie płukania, gdzie usuwano niezwiązane drugorzędowe przeciwciało, związane przeciwciało wykrywano stosując przeciwciało oznakowane fosfatazą alkaliczną. Dodano substrat dla enzymu i mierzono powstawanie barwy przez odczyt absorbancji każdej studzienki. Odczyt następnie dopasowywano do krzywej standardowej stężeń GFP w stosunku do absorbancji.
Gen reportera synGFP
Kaseta wektora binarnego Aktywność GFP (średnia) RFU/mg białka ELISA (średnia) ng GFP/mg białka
NOV4215 (CmpS) 4722, 3 657,1
NOV4216 (CmpS) 2795,8 246,1
NOV2110 (ZmUbi) 272,0 41,4
2. Rośliny To Lycopersicon esculentum
Fragment CmpS promotora CmYLCV (NOV 4217) daje poziom ekspresji synGFP, który jest znacząco wyższy niż poziom ekspresji promotora Ubq3 Arabidopsis (NOV 4209).
Gen reporter synGFP
Wyniki uzyskano z oceny intensywności fluorescencji synGFP przez mikroskopię w kalusie i pierwotnych kiełkach 5 niezależnych stabilnie transformowanych linii kalusa transformowanych kasetą NOV4217 i 2 niezależnych stabilnie transformowanych linii kalusa transformowanych kasetą NOV4209.
Kaseta wektora binarnego (promotor) Kalus ID Intensywność fluorescencji GFP
NOV4217 (CmpS) NOV4217-1 +++++
NOV4217 (CmpS) NOV4217-2 ++++
NOV4217 (CmpS) NOV4217-3 ++++
NOV4217 (CmpS) NOV4217-4 +++
NOV4217 (CmpS) NOV4217-5 +++
NOV4209 (Ubq3(At)) NOV4209-1 +
NOV4209 (Ubq3(At)) NOV4209-2 +
Gen reportera Gus-Intron-GUS
Wyniki uzyskano z oceny intensywności barwienia GUS w 11 niezależnych stabilnie transformowanych liniach kalusa zawierających kasety promotor CmpS-reporter (linie NOV4220-1 do NOV4220-11). Oceniano dwie stabilnie transformowane linie kalusa zawierające fragment promotora CmpC promotora CmYLCV promotor (NOV4224-1, NOV4224-2). Dla porównania oceniano dwie stabilnie transformowane linie kalusa zawierające promotor Arabidopsis Ubikwityna 3 (Ubq3) (NOV4208-1, NOV4208-2).
Kaseta wektora binarnego (promotor) Kalus ID Barwienie GUS
1 2 3
NOV4220 (CmpS) NOV4220-1 ++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-2 +++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-3 ++++
PL 204 327 B1 cd. tabeli
1 2 3
NOV4220 (CmpS) NOV4220-4 +++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-5 +++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-6 +++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-7 ++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-8 +++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-9 ++++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-10 +++
NOV4220 (CmpS) NOV4220-11 ++++
NOV4224 (CmpC) NOV4224-1 ++++
NOV4224 (CmpC) NOV4224-2 +++
NOV4208 (Ubq3 (At)) NOV4208-1 +
NOV4208 (Ubq3(At)) NOY4208-2 ++
P r z y k ł a d 24: Eksperymenty z ekspresją przejściową u kukurydzy
1. Przygotowanie zarodków
Niedojrzałe zarodki z A188 lub innych odpowiednich genotypów kukurydzy wycinano z 8 - 12 dniowych kolb do płynnego 2DG4 + 0.5d (podłoże D Duncana zmodyfikowane aby zawierało 20 mg/l glukozy i uzupełnione 10 g/I mannozy) i hodowano przez 1 do 2 dni.
2. Plazmoliza
Niedojrzałe zarodki inkubowano w 12% roztworze sacharozy przez 3-4 godziny przed bombardowaniem. Zarodki umieszczano na szalkach w 8-10 mm kółkach.
3. Bombardowanie
Transfekcję przez bombardowanie cząsteczkami zarodków kukurydzy przeprowadzono w obecności 5 μg DNA plazmidu przy 650 psi jak opisano (Wright i wsp, 2001, Plant Cell Reports, w druku).
Jeżeli odnośnik „w druku” nie wystarczy oto szczegóły z tamtej pracy:
Fragment DNA strącono na złote mikronośniki (<1 um) jak opisano w DuPont Biolistics Manual. Geny dostarczano do docelowych komórek tkanki stosując PDS-1000He Biolisitcs. Ustawienia na urządzeniu są jak następuje: 8 mm między przeponą bezpieczeństwa i makronośnikiem, 10 mm między makronośnikiem i ekranem hamującym i 7 cm między ekranem hamującym i celem. Do płytek strzelano dwukrotnie cząsteczkami pokrytymi DNA stosując 650 psi-przeponą bezpieczeństwa. Aby zmniejszyć uszkodzenie tkanek z fali uderzeniowej helu umieszczono siatkę ze stali nierdzewnej, 200 otworów na cal liniowy poziomo i pionowo (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) między ekranem hamującym i tkanką docelową. Zarodki hodowano na płytkach przez 48 godz. w ciemności w 25°C. Ekstrakty białkowe przygotowano przez lizę komórek w buforze do lizy GUS i klarowano przez wirowanie.
P r z y k ł a d 25: Oznaczenia GUS
Dla detekcji ekspresji genu GUS przeprowadzono oznaczenia histochemiczne i chemiluminescencyjne
1. Histochemiczne oznaczenie β-glukuronidazy (GUS)
Zarodki kukurydzy i linie kalusa in vitro pomidora zastosowano do oznaczeń GUS. Albo całe zarodki albo małe kawałki kalusa zanurzono w roztworze do barwienia GUS. Roztwór do barwienia GUS zawiera 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indoliloglukuronid (X-Gluc, Duchefa, 20 mM wzorcowy w DMSO), 100 mM bufor Na-fosforan pH 7,0, 10 mM EDTA pH 8, i 0,1% Triton X100. Próbki tkanki inkubowano w 37°C przez 1-16 godzin. Jeśli jest to potrzebne próbki klarowano płucząc kilka razy 70% EtOH aby usunąć chlorofil.
2. Oznaczenie chemiluminescencyjne β-glukuronidazy (GUS)
W celu ilościowej analizy ekspresji Gus przeprowadzono oznaczenie chemiluminescencyjne stosując GUS-Light Kit (Tropix. Inc) według instrukcji producenta.
Aktywność mierzono Luminometrem.
PL 204 327 B1
Wyniki GUS z konstruktem pCmpS i pCmpMG (Przykład 17) normalizowano do wartości porównawczego klonu (pNOV3612, Przykład 19). Wyniki uzyskane z dwóch różnych eksperymentów wykazują, że delecja 8 bp w promotorze CmYLCV (pCmpMG, Przykład 17) nie wpływa znacząco na poziom ekspresji reporterów GUS w porównaniu do pCmpS.
Ekspresja przejściowa w zarodkach Z.mays
Aktywność GUS 48 i 72 godzin po transfekcji
Konstrukt ID Aktywność GUS, RFU/mg białka
48 godz. 72 godz.
pCmpS 103,7 51,7
pCmpMG 81,4 70,8
ZmUbi (pNOV3612) 52,6 70,2
PL 204 327 B1
LiSTA SEKWENCJI <110> Syngenta Participations AG <120> Promotory wirusa liściozwoju eestrum <130> S-31359A <140>
<141>
<150> GB 0007427.8 <151> 2000-03-27 <150> GB 0010486.9 <151> 2000-04-28 <150> EP 01101802.5 <151> 2001-01-26 <150> US <151> 2001-02-28 <160> 49 <170> Patentln Ver. 2.2 <210> 1 <211> 670 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju eestrum <400> 1 attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60 gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120 aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180 ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240 atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300 acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aateteagag 360 agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420 ttcaggcagg gtggccagga agaagaaaag ccaagacgac gaaaacaggt aagagctaag 480 ctttctcatc tcaaagatga ttcttgatga tttttgtctc cacggtccgt ataggateca 540 ctgaattgat aaatateata tggtttgtat aaaacccgat atttaaatct gtateattet 600 gtttgaataa aacttgatac tttgttggag tcgtttgtaa aaacataaac aattataatc 660 tgttaaaaac ^70 <210> 2 <211> 346 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju eestrum <400> 2 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc caeaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120
PL 204 327 B1 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaa 346 <210> 3 <211> 400 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 3 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag 400 <210> 4 <211> 634 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 4 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420 ggcagggtgg ccaggaagaa gaaaagccaa gacgacgaaa acaggtaaga gctaagcttt 480 ctcatctcaa agatgattct tgatgatttt tgtctccacg gtccgtatag gatccactga 540 attgataaat atcatatggt ttgtataaaa cccgatattt aaatctgtat cattctgttt 600 gaataaaact tgatactttg ttggagtcgt ttgt 634 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 5 aaaaacataa acaattataa tctgttaaaa ac 32 <210> 6 <211> 104 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 6 ggcacagctg tcagttgtgc aaatccgagt catctggacc acaaacatca gaagagggtc 60 tacaagagtc agaagacgaa gacttttcgg tgctagttta atta 104
PL 204 327 B1 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 7 gaccacaaac atcagaag 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji oligonukleotyd <400> 8 caaacttatt gggtaatc <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 9 cagggtacca ctaaaatcac c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji oligonukleotyd <400> 10 aggggatccc caattcccc <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja
PL 204 327 B1 <220>
<22 3> Cpis syntetycznej sekwencji: ołigonukleotyd <400> 11 aggggtacca tcgatatgga g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Opis syntetycznej sekwencji: ołigonukleotyd <400> 12 ttaggatccg ccctgccac 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Opis syntetycznej sekwencji ołigonukleotyd <400> 13 cttctagaca aagtggcaga c <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 _ <223> Cpis syntetycznej sekwencji oligonukleotyd <400> 14 ttggtacctt aacaatgagg g <210 15 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji ołigonukleotyd <400 15 ctacttctag gtaccttgct c
PL 204 327 B1 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 16 ttggtacctt aacaatgagg g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: cligonukleotyd <400> 17 ggggatcccc agtctctctc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<22 3> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 18 gtgaattcga gctcggta 18 <210> 19 <211> 668 <212> DNA <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 19 attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60 gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120 aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180 ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240 atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300 acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360 agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420 ttcaggcagg tggccaggaa gaagaaaagc caagacgacg aaaacaggta agagctaagc 480 tttctcatct caaagatgat tcttgatgat ttttgtctcc acggtccgta taggatcact 540 gaattgataa atatcatatg gtttgtataa aacccgatat ttaaatctgt atcattctgt 600 ttgaataaaa cttgatactt tgttggagtc gtttgtaaaa acataaacaa ttataatctg 660 ttaaaaac 668
PL 204 327 B1 <210> 20 <211> 632 <212> ΠΝΑ <213> Wirus liściozwoju cestrum <400> 20 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 ageaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420 ggcaggtggc caggaagaag aaaagccaag acgacgaaaa caggtaagag ctaagctttc 480 tcatctcaaa gatgattctt gatgattttt gtctccacgg tccgtatagg atcactgaat 540 tgataaatat catatggttt gtataaaacc cgatatttaa atctgtatca ttctgtttga 600 ataaaacttg atactttgtt ggagtcgttt gt 632 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 21 cccgctgcag atcgttcaaa catttggc 28 <210> 22 <211> 27 <212> CNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 22 cccgaagctt tctagagatc tagtaac 27 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 23 gggcggatcc gcatgcatgt cttaaggtaa gctcactaag g 41
PL 204 327 B1 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <22Q>
<22 3> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 24 ccgcgctgca ggctgctttc aagcaagttc tgcg 34 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 25 ttgagagctc gtttaattac tggcagacaa agtgg 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 26 ttgactgcag gtttatgttt ttacaaacga ctcc 34 <210> 27 <211> 137 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: AGLINK miejsce irsultiklonowania <400> 27 gcggccgctc cggattcgaa ttaattaacg tacgaagctt gcatgcctgc agtgatcacc 60 atggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcggcgcgcc caattgattt 120 aaatggccgc tgcggcc 137 <210> 28 <211> 216 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja
PL 204 327 B1 <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: B1GLINK miejsce multiklonowania <400> 28 · ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt acccggggat 60 cctctagagt cgaccatggt gatcactgca ggcatgcaag cttcgtacgt taattaattc 120 gaatccggag cggccgcacg cgtgggcccg tttaaacctc gagagatctg ctagccctgc 180 aggaaattta ccggtgcccg ggcggccagc atggcc 216 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 29 cgcggatcct ggcagacaaa gtggcaga 28 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 30 cgcggatcct acttctaggc tacttg 26 <210> 31 <211> 7195 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: wektor pNOV2804 <400> 31 gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60 aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg 120 acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg 180 gccatttaaa tcaattgggc gcgtacgtag cactagtgcg cgatcgctta attaagcggc 240 gcgcctaaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgatca tgcaaaaact 300 cattaactca gtgcaaaact atgcctgggg cagcaaaacg gcgttgactg aactttatgg 360 tatggaaaat ccgtccagcc agccgatggc cgagctgtgg atgggcgcac atccgaaaag 420 cagttcacga gtgcagaatg ccgccggaga tatcgtttca ctgcgtgatg tgattgagag 480 tgataaatcg actctgctcg gagaggccgt tgccaaacgc tttggcgaac tgcctttcct 540 gttcaaagta ttatgcgcag cacagccact ctccattcag gttcatccaa acaaacacaa 600 ttctgaaatc ggttttgcca aagaaaatgc cgcaggtatc ccgatggatg ccgccgagcg 660
PL 204 327 B1 taactacaaa gatcctaacc acaagccgga gctggttttt gcgctgacgc ctttccttgc 720 gatgaacgcg tttcgtgaat tttccgagat tgtctcccta ctccagccgg tcgcaggtgc 780 acatccggcg attgctcact ttttacaaca gcctgatgcc gaacgtttaa gcgaaetgtt 840 cgccagcctg ttgaatatgc agggtgaaga aaaatcccgc gcgctggcga ttttaaaatc 900 ggccctcgat agccagcagg gtgaaccgtg goaaacgatt cgtttaattt ctgaatttta 960 cccggaagac agcggtctgt tctccccgct attgctgaat gtggtgaaat tgaaccctgg 1020 cgaagcgatg ttcctgttcg ctgaaacacc gcacgcttac ctgcaaggcg tggcgctgga 1080 agtgatggca aactccgata acgtgctgcg tgcgggtctg acgcctaaat acattgatat 1140 tccggaactg gttgccaatg tgaaattcga agccaaaccg gctaaccagt tgttgaccca 1200 gccggtgaaa caaggtgcag aactggactt cccgattcca gtggatgatt ttgccttctc 1260 gctgcatgac cttagtgata aagaaaccac cattagccag cagagtgccg ccattttgtt 1320 ctgogtcgaa ggcgatgcaa cgttgtggaa aggttctcag cagttacagc ttaaaccggg 1380 tgaatcagcg tttattgccg ccaacgaatc accggtgact gtcaaaggcc acggccgttt 1440 agcgogtgtt tacaacaagc tgtaagagct tactgaaaaa attaacatct cttgctaagc 1500 tgggagctct agatccccga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt 1560 aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt 1620 taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat 1680 tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta 1740 ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattgg gtaccatgcc 1800 cgggcggcca gcatggccgt atccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 1860 ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 1920 caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagaattaat tctcatgttt gacagcttat 1980 catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat 2040 ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 2100 gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt 2160 gacaattaat catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 2220 aggaaacaga ccatgaggga agcgttgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta 2280 gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc 2340 gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta 2400 aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc 2460 cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc 2520 attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac 2580 attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca 2640 aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg 2700 gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg 2760 cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc 2820 gcagtsaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg 2880 ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat 2940 cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc 3000 accaaagtag tcggcaaata aagctctagt ggatctccgt acccccgggg gatctggctc 3060 gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc tcctaaatca atagtagctg 3120 taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt tttgtcataa aattgaaata 3180 cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc tgacgaactg cccatttagc 3240 tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag cgctgtgaac aagggttcag 3300 attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct tgtcgatgac gacgtcgcta 3360 tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt caaagtgacc gcggtagccg 3420 acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt cgatgtcgtg gttgttgatc 3480 taaatttagg tcgtgaagat gggctcgaga tcgttcgtaa tctggcggca aagtctgata 3540 ttccaatcat aattatcagt ggcgaccgcc ttgaggagac ggataaagtt gttgcactcg 3600 agctaggagc aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca 3660 ttcgggttgc cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt 3720 gttttactga ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg 3780 aggtgaaact tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg 3840 acgttctatc gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg 3900 acaggagtat agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa 3960 gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg 4020 tttcgcacgg ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt 4080 gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 4140
PL 204 327 B1 ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc 4200 cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc 4260 agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt 4320 tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt 4380 ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg 4440 gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt 4500 actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga 4560 caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc 4620 cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca 4680 cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg 4740 tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat 4800 cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt 4860 gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg 4920 cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga 4980 acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgea agctgatcgg 5040 gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct 5100 agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga 5160 gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt 5220 ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg 5280 gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 5340 aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct 5400 ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 5460 tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 5520 ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 5580 gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca 5640 ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt 5700 gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt 5760 gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag 5820 ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct 5880 gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 5940 ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 6000 cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 6060 cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 6120 actgaatccg gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6180 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6240 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6300 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6360 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6420 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6480 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6540 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6600 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6660 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6720 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6780 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 6840 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6900 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6960 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 7020 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7080 tttgatccgg aattaattcc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 7140 cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttag 7195 <210> 32 <211> 4224 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja
PL 204 327 B1 <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: wektor pNOV3604 <400> 32 agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccgat catgcaaaaa ctcattaact 60 cagtgcaaaa ctatgcctgg ggcagcaaaa cggcgttgac tgaactttat ggtatggaaa 120 atccgtccag ccagccgatg gccgagctgt ggatgggcgc acatccgaaa agcagttcac 180 gagtgcagaa tgccgccgga gatatcgttt cactgcgtga tgtgattgag agtgataaat 240 cgactctgct cggagaggcc gttgccaaac gctttggcga actgcctttc ctgttcaaag 300 tattatgcgc agcacagcca ctctccattc aggttcatcc aaacaaacac aattctgaaa 360 tcggttttgc caaagaaaat gccgcaggta tcccgatgga tgccgccgag cgtaactata 420 aagatcctaa ccacaagccg gagctggttt ttgcgctgac gcctttcctt gcgatgaacg 480 cgtttcgtga attttccgag attgtctccc tactccagcc ggtcgcaggt gcacatccgg 540 cgattgctca ctttttacaa cagcctgatg ccgaacgttt aagcgaactg ttcgccagcc 600 tgttgaatat gcagggtgaa gaaaaatccc gcgcgctggc gattttaaaa tcggccctcg 660 atagccagca gggtgaaccg tggcaaacga ttcgtttaat ttctgaattt tacccggaag 720 acagcggtct gttctccccg ctattgctga atgtggtgaa attgaaccct ggcgaagcga 780 tgttcctgtt ogctgaaaca ccgcacgctt acctgcaagg cgtggcgctg gaagtgatgg 840 caaactccga taacgtgctg cgtgcgggtc tgacgcctaa atacattgat attccggaac 900 tggttgccaa tgtgaaattc gaagccaaac cggctaacca gttgttgacc cagccggtga 960 aacaaggtgc agaactggac ttcccgattc cagtggatga ttttgccttc tcgctgcatg 1020 accttagtga taaagaaacc accattagcc agcagagtgc cgccattttg ttctgcgtcg 1080 aaggcgatgc aacgttgtgg aaaggttctc agcagttaca gcttaaaccg ggtgaatcag 1140 cgtttattgc cgccaacgaa tcaccggtga ctgtcaaagg ccacggccgt ttagcgcgtg 1200 tttacaacaa gctgtaagag cttactgaaa aaattaacat ctcttgctaa gctgggagct 1260 ctagatcccc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 1320 atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 1380 taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 1440 cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 1500 tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt gggtaccgaa ttcactggcc 1560 gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 1620 gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 1680 caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 1740 ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 1800 tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 1860 ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 1920 ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 1980 taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 2040 gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 2100 agacaataac cctgataaat gcttcaatgg cgcgccgcgg ccgcttaaga atattgaaaa 2160 aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 2220 tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2280 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2340 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 2400 gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 2460 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 2520 agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 2580 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 2640 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 2700 accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 2760 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 2820 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 2880 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 2940 gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 3000 ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 3060 tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 3120 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 3180
PL 204 327 B1 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 3240 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3300 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 3360 ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcacogc ctacatacct cgctctgcta 3420 atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3480 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 3540 cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 3600 agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc oggtaagcgg cagggtcgga 3660 acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 3720 gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 3780 ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 3840 gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 3900 gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 3960 gaagcggaag agcttaagcg gccgcggcgc gccgcccaat acgcaaaccg cctctcccog 4020 cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 4080 gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 4140 ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 4200 acagctatga ccatgattac gcca 4224 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Opis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 33 ccatcgtggt atttggtatt g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<22 3> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 34 caataccaaa taccacgatg g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji oligonukleotyd <400> 35 cgtggtagcg agcactttgg t
PL 204 327 B1 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Cpis syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 36 aagtgctcgc taccacgatg g <210> 37 <211> 912 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja optymalizowanego genu GFP z intronem <400> 37 atgagcaagg gcgaggagct gacgtgaacg gccacaagtt aagctgaccc tgaagttcat gtgaccacct tcacctacgg cacgacttct tcaagagegc tatatatata ataattatca aataaaagaa tgtagtatat atttataact tttctaatat atcagcttca aggacgacgg acactagtga accgcatcga ggccacaagc tggagtacaa aagaacggca tcaaggcgaa ctggccgacc actaccagca aaccactacc tgagcaccca atggtgctgc tggagttcgt aaggttaact ag gttcaccggc gtggtgccaa tcctggtgga gctggacggc cagcgtgagc ggcgagggcg agggcgacgc gacctacggc 120 ctgtaccacc ggcaagctcc cggtcccgtg gccgaccctg 180 cgtgcagtgt ttcagccgct acccggacca catgaagcgc 240 catgccggag ggctacgtaa gtttctgctt ctacctttga
300 ttaattagta gtaatataat atttcaaata tttttttcaa 360 agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta 420 atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtgca ggagcgcacc 480 caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 540 gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 600 ctacaacagc cacaacgtgt acatcaccgc ggacaagcag 660 cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 720 gaacaccccg atcggcgacg gtcctgtgct gctgccggac
780 gagcgccctg agcaaggacc cgaacgagaa gcgcgaccac 840 gaccgccgcc ggcatcaccc acggcatgga cgagctgtac
900
912
PL 204 327 B1 <210> 38 <211> 2001 <212> DNA.
<213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja genu GUS z intronem <400> 38 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420 taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480 gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540 ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600 ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660 cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720 accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780 aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840 gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900 aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960 agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020 ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080 gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140 atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200 ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtoggcttt 1260 aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320
PL 204 327 B1 gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380 cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440 ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500 acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560 gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620 ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680 cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740 accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800 gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860 caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920 aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980 cagcagggag gcaaacaatg a 2001 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja startera PCR <400> 39 cgcggattgc tcccttaaca atgagg 26 <210> 40 <211> 1618 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej CnpS-synGFPI-nos
PL 204 327 B1 <400> 40 tcctggcaga caaagtggca gacatactgt cccacaaatg aagatggaat ctgtaaaaga 60 aaacgcgtga aataatgcgt ctgacaaagg ttaggtcggc tgcctttaat caataccaaa 120 gtggtcccta ccacgatgga aaaactgtgc agtcggtttg gctttttctg acgaacaaat 180 aagattcgtg gccgacaggt gggggtccac catgtgaagg catcttcaga ctccaataat 240 ggagcaatga cgtaagggct tacgaaataa gtaagggtag tttgggaaat gtccactcac 300 ccgtcagtct ataaatactt agcccctccc tcattgttaa gggagcaaaa tctcagagag 360 atagtcctag agagagaaag agagcaagta gcctagaagt aggatccacc atgctgcaga 420 tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccggcg tggtgccaat cctggtggag ctggacggcg 480 acgtgaacgg ccacaagttc agcgtgagcg gcgagggcga gggcgacgcg acctacggca 540 agctgaccct gaagttcatc tgtaccaccg gcaagctccc ggtcccgtgg ccgaccctgg 600 tgaccacctt cacctacggc gtgcagtgtt tcagccgcta cccggaccac atgaagcgcc 660 acgacttctt caagagcgcc atgccggagg gctacgtaag tttctgcttc tacctttgat 720 atatatataa taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa 780 ataaaagaat gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa 840 tttataactt ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtgcag gagcgcacca 900 tcagcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 960 cactagtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1020 gccacaagct ggagtacaac tacaacagec acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga 1080 agaacggcat caaggcgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1140 tggccgacca ctaccagcag aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca 1200 accactacct gagcacccag agcgccctga gcaaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca 1260 tggtgctgct ggagttcgtg accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca 1320 aggttaacta gagctcaaga tcccccgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa 1380 agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatcta atttctgttg 1440 aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 1500 tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 1560 gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcc gggaattg 1618
PL 204 327 B1 <210> 41 <211> 2730 <212> ΕΝΑ <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej CłnpS-GIG-nos <400> 41 aggatcctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa 60 aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac 120 caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaac 180 aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa 240 taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac 300 tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aaaatctcag 360 agagatagtc ctagagagag aaagagagca agtagcctag aagtaggatc ccctcgaggt 420 cgaccatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt 480 gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt 540 tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag 600 atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt 660 gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg 720 tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca 780 cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata 840 tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa 900 agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat 960 aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca 1020 acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 1080 aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc 1140 tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag 1200 actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac 1260 tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag 1320
PL 204 327 B1 tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag 1380
ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag 1440
tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtogtc 1500
atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg 1560
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag 1620
agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg 1680
gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca 1740
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga 1800
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata 1860
cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg 1920
acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca 1980
tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 2040
gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac 2100
tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 2160
tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg 2220
tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga 2280
cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca 2340
aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa 2400
aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta 2460
cagcctcggg aattagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 2520
tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 2580
acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 2640
tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 2700
actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 2730 <210> 42 <211> 1577 <212> DNA <213> Syntetyczny
PL 204 327 B1 <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej OopC-synGFPI-nos <400> 42 tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60 cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120 gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag 180 attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga 240 gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg 300 tcagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaacgatc cgcgaagggc 360 gaattcgttt aaacctgcag atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccaa 420 tcctggtgga gctggacggc gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg 480 agggcgacgc gacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctcc 540
cggtcccgtg gccgaccctg gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgt ttcagccgct 600
acccggacca catgaagcgc cacgacttct· tcaagagogc catgccggag ggctacgtaa 660
gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca ttaattagta gtaatataat 720
atttcaaata tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt 780
ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat atgaccaaaa tttgttgatg 840
tgcaggtgca ggagcgcacc atcagcttca aggacgaogg caactacaag acccgcgccg 900
aggtgaagtt cgagggcgac acactagtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 960
aggaggacgg caacatcctg ggccacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaatgtgt 1020
acatcaccgc ggacaagcag aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaata 1080
tcgaggacgg cagogtgcag ctggccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacg 1140
gtcctgtgct gctgccggac aaccactacc tgagcaccca gagogccctg agcaaggacc 1200
cgaacgagaa gcgcgaccac atggtgctgc tggagttcgt gaccgccgcc ggcatcaccc 1260
acggcatgga cgagctgtac aaggttaact agagctctag atccccgaat ttccccgatc 1320
gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 1380
ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 1440
cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 1500
tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 1560
tactagateg ggaattg
PL 204 327 B1 <210> 43 <211> 2725 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej CmpC-GIG-nos <400> 43 tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60 cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120 gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag ISO attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga 240 gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg 300 tcagtctata aatacttagc ccctccctca.ttgttaaggg agcaacgatc cgcgaagggc 360 gaattcctgc agcccggggg atcccctcga ggtcgaccat ggtccgtcct gtagaaaccc 420 caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact 4S0 gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc 540 caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct 600 ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt 660 tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc 720 agggcggcta tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg 760 tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta 840 atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt 900 ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt 960 gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc 1020 cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct 1080 ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg 1140 acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc 1200 aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg 1260 caactggaca aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg 1320
PL 204 327 B1 gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag acgcattaat ggactggatt ggggccaact aagagatgct cgactgggca gatgaacatg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac aactgcatca gccgattatc atcaccgaat caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa ctacagcctc gggaattaga tccccgaatt gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc attacgttaa gcatgtaata attaacatgt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc aaaaacgctggactggcatg aacttcggtg tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga aatgcatgac gttatttatg agatgggttt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg catctatgrtt actagatcgg gaatt
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2725
<210> 44
<211> 9172
<212> DNA
<213> Syntetyczny
PL 204 327 B1 <220>
<223> Syntetyczna sekwencja wektora pNOV2117 <400> 44
aagcttggcg cgccggtacc agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 60
ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 120
tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 180
acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 240
aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 300
atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 360
ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 420
tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 480
attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 540
attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 600
tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 660
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 720
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 780
gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 840
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 900
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 960
cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc 1020
cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 1080
tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 1140
cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 1200
cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 1260
cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 1320
caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 1380
gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 1440
acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 1500
aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 1560
tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 1620
PL 204 327 B1 ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 1680 tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 1740 atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 1800 atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 1860 aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 1920 agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 1980 tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcagggatcc ccgatcatgc 2040 aaaaactcat taactcagtg caaaactatg cctggggcag caaaacggcg ttgactgaac 2100 tttatggtat ggaaaatccg tccagccagc cgatggccga gctgtggatg ggcgcacatc 2160 cgaaaagcag ttcacgagtg cagaatgccg ccggagatat cgtttcactg cgtgatgtga 2220 ttgagagtga taaatcgact ctgctcggag aggecgttgc caaacgcttt ggcgaactgc 2280 ctttcctgtt caaagtatta tgcgcagcac agccactctc cattcaggtt catccaaaca 2340 aacacaattc tgaaatcggt tttgccaaag aaaatgccgc aggtatcccg atggatgccg 2400 ccgagcgtaa ctataaagat cctaaccaca agccggagct ggtttttgcg ctgacgcctt 2460 tccttgcgat gaacgcgttt cgtgaatttt ccgagattgt ctccctactc cagccggtcg 2520 caggtgcaca tccggcgatt gctcactttt tacaacagcc tgatgccgaa cgtttaagcg 2580 aactgttcgc cagcctgttg aatatgcagg gtgaagaaaa atcccgcgcg ctggcgattt 2640 taaaatcggc cctcgatagc cagcagggtg aaccgtggca aacgattcgt ttaatttctg 2700 aattttaccc ggaagacagc ggtctgttct ccccgctatt gctgaatgtg gtgaaattga 2760 accctggcga agcgatgttc ctgttcgctg aaacaccgca cgcttacctg caaggcgtgg 2820 cgctggaagt gatggcaaac tccgataacg tgctgcgtgc gggtctgacg cctaaataca 2880 ttgatattcc ggaactggtt gccaatgtga aattcgaagc caaaccggct aaccagttgt 2940 tgacceagec ggtgaaacaa ggtgcagaac tggacttccc gattccagtg gatgattttg 3000 ccttctcgct gcatgacctt agtgataaag aaaccaccat tagccagcag agtgccgcca 3060 ttttgttctg cgtcgaaggc gatgcaacgt tgtggaaagg ttctcagcag ttacagctta 3120 aaccgggtga atcagcgttt attgccgcca acgaatcacc ggtgactgtc aaaggccacg 3180 gccgtttagc gcgtgtttac aacaagctgt aagagcttac tgaaaaaatt aacatctctt 3240 gctaagctgg gagctcgatc cgtcgacctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt 3300 tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 3360
PL 204 327 B1 acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 3420 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 3480
actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatctgcta gccctgcagg 3540
aaatttaccg gtgcccgggc ggccagcatg gccgtatccg caatgtgtta ttaagttgtc 3600
taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa cagctccccg 3660
accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagaa ttaattctca 3720
tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat 3780
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 3840
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 3900
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 3960
ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact 4020
caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta 4080
catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg 4140
gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg 4200
gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt 4260
gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa 4320
tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg 4380
gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag 4440
gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg 4500
ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc 4560
cgcatttggt acagogcagt aacoggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 4620
gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat 4680
cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 4740
gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccc 4800
cgggggatct ggctcgcggc ggacgcacga cgccggggcg agaccatagg cgatctccta 4860
aatcaatagt agctgtaacc tcgaagcgtt tcacttgtaa caacgattga gaatttttgt 4920
cataaaattg aaatacttgg ttcgcatttt tgtcatccgc ggtcagccgc aattctgacg 4980 aactgcccat ttagctggag atgattgtac atccttcacg tgaaaatttc tcaagcgctg 5040 tgaacaaggg ttcagatttt agattgaaag gtgagccgtt gaaacacgtt cttcttgtcg 5100
PL 204 327 B1
atgacgacgt cgctatgcgg catcttatta ttgaatacct tacgatccac gccttcaaag 5160
tgaccgcggt agccgacagc acccagttca caagagtact ctcttccgcg acggtcgatg 5220
tcgtggttgt tgatctaaat ttaggtcgtg aagatgggct cgagatcgtt cgtaatctgg 5280
cggcaaagtc tgatattcca atcataatta tcagtggcga ccgccttgag gagacggata 5340
aagttgttgc actcgagcta ggagcaagtg attttatcgc taagccgttc agtatcagag 5400
agtttctagc acgcattcgg gttgccttgc gcgtgcgccc caacgttgtc cgctccaaag 5460
accgacggtc tttttgtttt actgactgga cacttaatct caggcaacgt cgcttgatgt 5520
ccgaagctgg cggtgaggtg aaacttacgg caggtgagtt caatcttctc ctcgcgtttt 5580
tagagaaacc ccgcgacgtt ctatcgcgcg agcaacttct cattgccagt cgagtacgcg 5640
acgaggaggt ttatgacagg agtatagatg ttctcatttt gaggctgcgc cgcaaacttg 5700
aggcagatcc gtcaagccct caactgataa aaacagcaag aggtgccggt tatttctttg 5760
acgcggacgt gcaggtttcg cacgggggga cgatggcagc ctgagccaat tcccagat.cc 5820
ccgaggaatc ggcgtgagcg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct 5880
gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 5940
ggcagaagca cgccccggtg aatogtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 6000
ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 6060
accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 6120
ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 6180 cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg 6240 ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg 6300 ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 6360 gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 6420 gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 6480 gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 6540 gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 6600 caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 6660 ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 6720 caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 6780 gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 6840
PL 204 327 B1
ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 6900
ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 6960
aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 7020
gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 7080
tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 7140
tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 7200
aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 7260
cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 7320
acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgctgaggt ctgcctcgtg aagaaggtgt 7380
tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc cagaaagtga gggagccacg 7440
gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac 7500
ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg 7560
atttattcaa caaagccgcc gtcccgtcaa gtcagcgtaa tgctctgeca gtgttacaac 7620
caattaacca attctgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc 7680
atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 7740
tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 7800
ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 7860
tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gctctgcatt aatgaatcgg 7920
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggagctct tccgcttcct cgctcactga 7980
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 8040
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 8100
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 8160
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 8220
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 8280
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 8340
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 8400
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 8460
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 8520
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 8580
PL 204 327 B1 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 8640 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 8700 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 8760 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 8820 cttcacctag atccttttga tccggaatta attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg 8880 gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg attattctaa taaacgctct 8940 tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc 9000 gggaascgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg 9060 atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt 9120 ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt ac 9172 <210> 45 <211> 8849 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja wektora pNOV4200 <400> 45 ggtacccccg ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc gtacgttaat taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcgaga gatctgctag ccctgcagga aatttaccgg tgcccgtacc ggatttggag ccaagtctca taaacgccat tgtggaagaa agtcttgagt tggtggtaat gtaacagagt agtaagaaca gagaagagag agagtgtgag atacatgaat tgtcgggcaa caaaaatcct gaacatcttą ttttagcaaa gagaaagagt tccgagtctg tagcagaaga gtgaggagaa atttaagctc ttggacttgt gaattgttcc gcctcttgaa tacttcttca atcctcatat attcttcttc tatgttacct gaaaaccggc atttaatctc gcgggtttat tccggttcaa catttttttt gttttgagtt attatctggg cttaataacg caggcctgaa ataaattcaa ggcccaactg tttttttttt taagaagttg ctgttaaaaa aaaaaaaagg gaattaacaa caacaacaaa aaaagataaa gaaaataata acaattactt taattgtaga ctaaaaaaac atagatttta
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
PL 204 327 B1 tcangaaaaa aagagaaaag aaataaaaac ttggatcaaa aaaaaacata cagatcttct 720 aattattaac ttttcttaaa aattaggtcc tttttcccaa caattaggtt tagagttttg 780 gaattaaacc aaaaagattg ttctaaaaaa tactcaaatt tggtagataa gtttccttat 840 tttaattagt caatggtaga tacttttttt tcttttcttt attagagtag attagaatct 900 tttatgccaa gtattgataa attaaatcaa gaagataaac tatcataatc aacatgaaat 950 taaaagaaaa atctcatata tagtattagt attctctata tatattatga ttgcttattc 1020 ttaatgggtt gggttaacca agacatagtc ttaatggaaa gaatcttttt tgaacttttt 1080 ccttattgat taaattcttc tatagaaaag aaagaaatta tttgaggaaa agtatataca 1140 aaaagaaaaa tagaaaaatg tcagtgaagc agatgtaatg gatgacctaa tccaaccacc 1200 accataggat gtttctactt gagtcggtct tttaaaaacg cacggtggaa aatatgacac 1260 gtatcatatg attccttcct ttagtttcgt gataataatc ctcaactgat atcttccttt 1320 ttttgttttg gctaaagata ttttattctc attaatagaa aagacggttt tgggcttttg 1380 gtttgcgata taaagaagac cttcgtgtgg aagataataa ttcatccttt cgtctttttc 1440 tgactcttca atctctccca aagcctaaag cgatctctgc aaatctctcg cgactctctc 1500 tttcaaggta tattttctga ttctttttgt ttttgattcg tatctgatct ccaatttttg 1560 ttatgtggat tattgaatct tttgtataaa ttgcttttga caatattgtt cgtttcgtca 1620 atccagcttc taaattttgt cctgattact aagatatcga ttcgtagtgt ttacatctgt 1680 gtaatttctt gcttgattgt gaaattagga ttttcaagga cgatctattc aatttttgtg 1740 ttttctttgt tcgattctct ctgttttagg tttcttatgt ttagatccgt ttctctttgg 1800 tgttgttttg atttctctta cggcttttga tttggtatat gttcgctgat tggtttctac 1860 ttgttctatt gttttatttc aggtggatct cgactctagg ggggcaataa gatatgaaaa 1920 agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct 1980 ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag 2040 ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg 2100 tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggcat 2160 tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc 2220 tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg 2280 ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc 2340 aatacactac atggcgtgat ttcatatgog cgattgctga tccccatgtg tatcactggc 2400
PL 204 327 B1 aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc 2460 tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca 2520 atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg 2580 gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg 2640 agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc 2700 gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt 2760 tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga 2820 ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag 2880 aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactog tccgagggca aaggaataga 2940 gtagatgccg accgggatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 3000 tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 3060 acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 3120 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 3180 actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttgggtacgg 3240 gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 3300 caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa 3360 aatcaccact cgatacaggc agcccatcag aattaattct catgtttgac agcttatcat 3420 cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 3480 tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 3540 aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac 3600 aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 3660 aaacagacca tgagggaagc gttgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt 3720 ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca 3780 gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg 3840 cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct 3900 ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt 3960 ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt 4020 cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa 4080 gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt 4140
PL 204 327 B1 cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaecttaa cgctatggaa ctcgccgccc 4200 gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca 4260 gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg 4320 gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca agaagatcgc 4380 ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact acgtgaaagg cgagatcacc 4440 aaagtagtcg gcaaataaag ctctagtgga tctccgtacc cccgggggat ctggctcgcg 4500 gcggacgcac gacgccgggg cgagaccata ggcgatctcc taaatcaata gtagctgtaa 4560 cctcgaagcg tttcacttgt aacaacgatt gagaattttt gtcataaaat tgaaatactt 4620 ggttcgcatt tttgtcatcc gcggtcagcc gcaattctga cgaactgccc atttagctgg 4680 agatgattgt acatccttca cgtgaaaatt tctcaagcgc tgtgaacaag ggttcagatt 4740 ttagattgaa aggtgagccg ttgaaacacg ttcttcttgt cgatgacgac gtcgctatgc 4800 ggcatcttat tattgaatac cttacgatcc acgccttcaa agtgaccgcg gtagccgaca 4860 gcacccagtt cacaagagta ctctcttccg cgacggtoga tgtogtggtt gttgatctag 4920 atttaggtcg tgaagatggg ctcgagatcg ttcgtaatct ggcggcaaag tctgatattc 4980 caatcataat tatcagtggc gaccgccttg aggagacgga taaagttgtt gcactcgagc 5040 taggagcaag tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc 5100 gggttgcctt gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt 5160 ttactgactg gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg 5220 tgaaacttac ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa cccogcgacg 5280 ttctatcgcg cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca 5340 ggagtataga tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc 5400 ctcaactgat aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt 5460 cgcacggggg gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag 5520 cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 5580 gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 5640 tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 5700 cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 5760 gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 5820 tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 5880
PL 204 327 B1 cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 5940 gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 6000 gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 6060 tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 6120 tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 6180 agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 6240 gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 6300 gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 6360 ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 6420 cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 6480 aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 6540 catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 6600 gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 6660 tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 6720 cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 6780 aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 6840 ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 6900 gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 6960 aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 7020 actcgaccgc cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc 7080 ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt 7140 gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc 7200 gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg 7260 ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat 7320 tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatateagg attatcaata 7380 ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 7440 aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 7500 attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 7560 gaatccggtg agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 7620
PL 204 327 B1
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 7680
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 7740
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 7800
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 7860
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 7920
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 7980
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 8040
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 8100
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 8160
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 8220
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 8280
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 8340
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 8400
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 8460
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 8520
gatccggaat taattcctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 8580
ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 8640
gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat 8700
catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg 8760
ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac gctgcaggaa ttggccgcag cggccattta aatcaattgg gcgcgccgaa ttcgagctc 8820 8849
<210> 46 <211> 2949 <212> ΕΝΑ <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej 2mUbi-GFP-35S term
PL 204 327 B1 <400> 46 gcatgcctgc tgtctaagtt tatctatctt caataatatc aattgagtat cttttttttt tttagggttt tattttagcc tagatataaa taaaaaaact cgtcgacgag agcagacggc cgttggactt cggcacggca ccaccgctcc cctctttccc atccacccgt ctaccttctc catgtttgtg gcgacctgta cctgggatgg tgcatagggt gggtcatctt cgttctagat ctgtatgtgt gatctaggat ttgttcgctt gagtagaata gtcatacatc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60 ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120 tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtaeta 180 agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240 tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 300 gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360 agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420 tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480 atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaatacce tttaagaaat 540 aaggaaacat ttttcttgtt tegagtagat aatgccagcc tgttaaacgc 600 tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga 660 acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tetegagagt tccgctccac 720 gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 780 ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc 840 ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac 900 caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 960 cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 1020 tagateggeg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1080 ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct getagegtte gtacacggat 1140 cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 1200 ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 1260 ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 1320 ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 1380 cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 1440 gtgccataca tatteatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 1500 aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgettt 1560 ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttetagateg 1620 ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 1680 tteatagtta cgagtttaag atggatggaa atategatet aggataggta 1740
PL 204 327 B1
tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 1800
tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 1860
gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 1920
gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 1980
ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatccacca tgctgcagat gagcaagggc 2040
gaggagctgt tcaccggcgt ggtgccaatc ctggtggagc tggacggcga cgtgaacggc 2100
cacaagttca gcgtgagcgg cgagggcgag ggcgacgcga cctacggcaa gctgaccctg 2160
aagttcatct gtaccaccgg caagctcccg gtcccgtggc cgaccctggt gaccaccttc 2220
acctacggcg tgcagtgttt cagccgctac ccggaccaca tgaagcgcca cgacttcttc 2280
aagagcgcca tgccggaggg ctacgtgcag gagcgcacca tcagcttcaa ggacgacggc 2340
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca cactagtgaa ccgcatcgag 2400
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg gccacaagct ggagtacaac 2460
tacaacagcc acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga agaacggcat caaggcgaac 2520
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tggccgacca ctaccagcag 2580
aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca accactacct gagcacccag 2640
agcgccctga gcaaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca tggtgctgct ggagttcgtg 2700
accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca aggttaacta gagctcaaga 2760
tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac cagactttta 2820 ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt gcagtgagtt gctggttttt gtacaactta 2880 gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa 2940 atccagtgg 2949 <210> 47 <211> 4341 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej ZraUBi-GIG-nos
PL 204 327 B1 <400> 47 cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct 60 aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct 120 atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata 180 atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg 240 agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt 300 tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag 360 ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt 420 tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat 480 ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa 540 aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg 600 acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag 660 acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg 720 gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca 780 cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac 840 cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc 900 tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca aceagatcte ccccaaatcc 960 acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 1020 cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080 tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140 cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200 ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260 tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320 catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380 ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440 atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 1500 taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560 tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620 agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680 tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740
PL 204 327 B1 tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800 ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 1860 ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920 tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980 tgttacttct gcagggatcc cctcgaggtc gaccatggtc cgtcctgtag aaaccccaac 2040 ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg 2100 aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg 2160 cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta 2220 tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga 2280 tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg 2340 cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg 2400 taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat 2460 aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt 2520 agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg 2580 atgtgcaggt atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg 2640 aatggtgatt accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa 2700 ctatgccgga atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga 2760 tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt 2820 ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac 2880 tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatcog cacctctggc aaccgggtga 2940 aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc 3000 gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa 3060 accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt 3120 cgataacgtg crtgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta 3180 ccgtacctcg cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat 3240 cgtggtgatt gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga 3300 agcgggcaac aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca 3360 agcgcactta caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt 3420 gatgtggagt attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc 3480
PL 204 327 B1 gccactggcg gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt 3540 aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa 3600 ccgttattac ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga 3660 aaaagaactt ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg 3720 cgtggatacg ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca 3780 gtgtgcatgg ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga 3840 acaggtatgg aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa 3900 caagaaaggg atcttcactc gcgaccgcaa accgaagteg gcggcttttc tgctgcaaaa 3960 acgctggact ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa 4020 caactctcct ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attagatccc cgaatttccc 4080 cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4140 gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4200 catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4260 cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4320 tatgttacta gatcgggaat t 4341 <210> 48 <211> 2943 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej Ubq3(At)-synGFPI-nos <400> 48 accggatttg gagccaagtc tcataaacgc cattgtggaa gaaagtcttg agttggtggt 60 aatgtaacag agtagtaaga acagagaaga gagagagtgt gagatacatg aattgtcggg 120 caacaaaaat cctgaacatc ttattttagc aaagagaaag agttccgagt ctgtagcaga 180 agagtgagga gaaatttaag ctcttggact tgtgaattgt tccgcctctt gaatacttct 240 tcaatcctca tatattcttc ttctatgtta cctgaaaacc ggcatttaat ctcgcgggtt 300 tattccggtt caacattttt tttgttttga gttattatct gggcttaata acgcaggcct 360
PL 204 327 B1
gaaataaatt caaggcccaa ctgttttttt ttttaagaag ttgctgttaa aaaaaaaaaa 420
agggaattaa caacaacaac aaaaaaagat aaagaaaata ataacaatta ctttaattgt 480
agactaaaaa aacatagatt ttatcatgaa aaaaagagaa aagaaataaa aacttggatc 540
aaaaaaaaaa catacagatc ttctaattat taacttttct taaaaattag gtcctttttc 600
ccaacaatta ggtttagagt tttggaatta aaccaaaaag attgttctaa aaaatactca 660
aatttggtag ataagtttcc ttattttaat tagtcaatgg tagatacttt tttttctttt 720
ctttattaga gtagattaga atcttttatg ccaagtattg ataaattaaa tcaagaagat 780
aaactatcat aatcaacatg aaattaaaag aaaaatctca tatatagtat tagtattctc 840
tatatatatt atgattgctt attcttaatg ggttgggtta accaagacat agtcttaatg 900
gaaagaatct tttttgaact ttttccttat tgattaaatt cttctataga aaagaaagaa 960
attatttgag gaaaagtata tacaaaaaga aaaatagaaa aatgtcagtg aagcagatgt 1020
aatggatgac ctaatccaac caccaccata ggatgtttct aettgagtcg gtcttttaaa 1080
aacgcacggt ggaaaatatg acacgtatca tatgattcct tcctttagtt tcgtgataat 1140
aatcctcaac tgatatcttc ctttttttgt tttggctaaa gatattttat tctcattaat 1200
agaaaagacg gttttgggct tttggtttgc gatataaaga agaccttcgt gtggaagata 1260
ataattcatc ctttcgtctt tttctgactc ttcaatctct cccaaagcct aaagcgatct 1320
ctgcaaatct ctcgcgactc tctctttcaa ggtatatttt ctgattcttt ttgtttttga 1380
ttcgtatctg atctccaatt tttgttatgt ggattattga atcttttgta taaattgctt 1440
ttgacaatat tgttcgtttc gtcaatccag cttctaaatt ttgtcctgat tactaagata 1500
tcgattcgta gtgtttacat ctgtgtaatt tcttgcttga ttgtgaaatt aggattttca 1560
aggacgatct attcaatttt tgtgttttct ttgttcgatt ctctctgttt taggtttctt 1620
atgtttagat ccgtttctct ttggtgttgt tttgatttct cttacggctt ttgatttggt 1680
atatgttcgc tgattggttt ctacttgttc tattgtttta tttcaggtgg atccaccatg 1740
ctgcagatga gcaagggcga ggagctgttc accggcgtgg tgccaatcct ggtggagctg 1800
gacggcgacg tgaacggcca caagttcagc gtgagcggcg agggcgaggg cgacgcgacc 1860
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgt accaccggca agctcecggt cccgtggccg 1920
accctggtga ccaccttcac ctacggcgtg cagtgtttca gccgctaccc ggaccacatg 1980
aagcgccacg acttcttcaa gagcgccatg ccggagggct acgtaagttt ctgcttctac 2040
ctttgatata tatataataa ttatcattaa ttagtagtaa tataatattt caaatatttt 2100
PL 204 327 B1 tttcaaaata aaagaatgta gtatatagca attgcttttc tgtagtttat aagtgtgtat 2160 attttaattt ataacttttc taatatatga ccaaaatttg ttgatgtgca ggtgcaggag 2220 cgcaccatca gcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 2280 ggcgacacac tagtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 2340 atcctgggcc acaagctgga gtacaactac aacagccaca atgtgtacat caccgcggac 2400 aagcagaaga acggcatcaa ggcgaacttc aagatccgcc acaatatcga ggacggcagc 2460 gtgcagctgg ccgaccacta ccagcagaac accccgatcg gcgacggtcc tgtgctgctg 2520 ccggacaacc actacctgag cacccagagc gccctgagca aggacccgaa cgagaagcgc 2580 gaccacatgg tgctgctgga gttcgtgacc gccgccggca tcacccacgg catggacgag 2640 ctgtacaagg ttaactagag ctctagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg 2700 caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2760 ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2820 tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2880 tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa 2940 ttg 2943 <210> 49 <211> 4072 <212> DNA <213> Syntetyczny <220>
<223> Syntetyczna sekwencja kasety ekspresyjnej Ubq3(At)-GIG-nos <400> 49 cggatttgga gccaagtctc ataaacgcca ttgtggaaga aagtcttgag ttggtggtaa 60 tgtaacagag tagtaagaac agagaagaga gagagtgtga gatacatgaa ttgtcgggca 120 acaaaaatcc tgaacatctt attttagcaa agagaaagag ttccgagtct gtagcagaag 180 agtgaggaga aatttaagct cttggacttg tgaattgttc cgcctcttga atacttcttc 240 aatcctcata tattcttctt ctatgttacc tgaaaaccgg catttaatct cgcgggttta 300 ttccggttca acattttttt tgttttgagt tattatctgg gcttaataac gcaggcctga 360 aataaattca aggcccaact gttttttttt ttaagaagtt gctgttaaaa aaaaaaaaag 420
PL 204 327 B1
ggaattaaca acaacaacaa aaaaagataa agaaaataat aacaattact ttaattgtag 480
actaaaaaaa catagatttt atcatgaaaa aaagagaaaa gaaataaaaa cttggatcaa 540
aaaaaaacat acagatcttc taattattaa cttttcttaa aaattaggtc ctttttccca 600
acaattaggt ttagagtttt ggaattaaac caaaaagatt gttctaaaaa atactcaaat 660
ttggtagata agtttcctta ttttaattag tcaatggtag atactttttt ttcttttctt 720
tattagagta gattagaatc ttttatgcca agtattgata aattaaatca agaagataaa 780
ctatcataat caacatgaaa ttaaaagaaa aatctcatat atagtattag tattctctat 840
atatattatg attgcttatt cttaatgggt tgggttaacc aagacatagt cttaatggaa 900
agaatctttt ttgaactttt tccttattga ttaaattctt ctatagaaaa gaaagaaatt 960
atttgaggaa aagtatatac aaaaagaaaa atagaaaaat gtcagtgaag cagatgtaat 1020
ggatgaccta atccaaccac caccatagga tgtttctact tgagtcggtc ttttaaaaac 1080
gcacggtgga aaatatgaca cgtatcatat gattccttcc tttagtttcg tgataataat 1140
cctcaactga tatcttcctt tttttgtttt ggctaaagat attttattct cattaataga 1200
aaagacggtt ttgggctttt ggtttgcgat ataaagaaga ccttcgtgtg gaagataata 1260
attcatcctt tcgtcttttt ctgactcttc aatctctccc aaagcctaaa gcgatctctg 1320
caaatctctc gcgactctct ctttcaaggt atattttctg attctttttg tttttgattc 1380
gtatctgatc tccaattttt gttatgtgga ttattgaatc ttttgtataa attgcttttg 1440
acaatattgt tcgtttcgtc aatccagctt ctaaattttg tcctgattac taagatatcg 1500 attcgtagtg tttacatctg tgtaatttct tgcttgattg tgaaattagg attttcaagg 1560 acgatctatt caatttttgt gttttctttg ttcgattctc tctgttttag gtttcttatg 1620 tttagatccg tttctctttg gtgttgtttt gatttctctt acggcttttg atttggtata 1680 tgttcgctga ttggtttcta cttgttctat tgttttattt caggtggatc ccctcgaggt 1740 cgaccatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt 1800 gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt 1860 tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag 1920 atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt 1980 gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg 2040 tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca 2100 cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata 2160
PL 204 327 B1
tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa 2220
agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat 2280
aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca 2340
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 2400
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc 2460
tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag 2520
actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac 2580
tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag 2640
tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag 2700
ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag 2760
tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc 2820
atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg 2880
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag 2940
agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg 3000
gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca 3060
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga 3120
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata 3180
cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg 3240
acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgaogctcac accgatacca 3300
tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 3360
gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac 3420
tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 3480 tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg 3540 tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga 3600 cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca 3660 aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa 3720 aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta 3780 cagcctcggg aattagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 3840 tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 3900
PL 204 327 B1 acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 3960 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 4020 actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa tt
4072

Claims (41)

1. Wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, w której sekwencja DNA składa się z sekwencji nukleotydów, znamienna tym, że sekwencja DNA składa się z sekwencji opisanych przez co najmniej jedną spośród SEK ID nr 1, SEK ID nr 2, SEK ID nr 3, SEK ID nr 4, SEK ID nr 19 oraz SEK ID nr 20.
2. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja DNA ponadto składa się z co najmniej jednej sekwencji SEK ID nr 5 i SEK ID nr 6.
3. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 1.
4. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 2.
5. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 3.
6. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 4.
7. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 19.
8. Sekwencja DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencją nukleotydów jest SEK ID nr 20.
9. Zrekombinowana cząsteczka DNA zawierająca region promotora transkryptu pełnej długości wyizolowana z wirusa żółtego liściozwoju Cestrum funkcjonalnie połączona z heterologiczną sekwencją kodującą określoną jedną z powyższych zastrzeżeń.
10. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 9, znamienna tym, że składa się z sekwencji DNA jak określono w zastrzeżeniu 1 funkcjonalnie połączonej z odpowiednią sekwencją nukleotydów.
11. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że odpowiednia sekwencja nukleotydów składa się z sekwencji kodującej.
12. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje pożądaną cechę fenotypową.
13. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 12, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje pierwsze białko, które w sposób bezpośredni lub pośredni reguluje gen kodujący drugie białko, w którym drugie białko włączone jest w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
14. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 12, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje pierwsze białko, które w sposób bezpośredni lub pośredni reguluje gen kodujący substrat drugiego białka, w którym drugie białko włączone jest w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
15. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 12, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje pierwsze białko zdolne do metabolizowania przez komórkę w celu wytworzenia substratu drugiego białka, które to drugie białko jest włączone w metabolizm komórkowy jednego ze związków mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
16. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 12, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje białko nadające pozytywną przewagę selekcyjną komórkom, które były transformowane tą sekwencją kodującą.
17. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 12, znamienna tym, że sekwencja kodująca koduje białko zaangażowane w metabolizm komórkowy związku, przy czym związek ten składa się z mannozy, pochodnej lub prekursora mannozy, ksylozy lub pochodnej bądź prekursora ksylozy.
18. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 17, znamienna tym, że białko składa się z izomerazy ksylozy, izomerazy fosfomannozy, izomerazy mannozo-6-fosforanu, izomerazy mannozo-1-fosforanu, fosfomannomutazy, epimerazy mannozy, fosfatazy mannozy fosfatazy ksylozy, mannozo-6-fosfatazy, mannozo-1-fosfatazy, permeazy mannozy lub permeazy ksylozy.
19. Zrekombinowana cząsteczka według zastrz. 18, znamienna tym, że białko składa się z izomerazy fosfomannozy.
PL 204 327 B1
20. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja kodująca składa się z regionu kodującego nie ulegającego translacji.
21. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 20, znamienna tym, że region kodujący nie ulegający translacji jest otrzymywany z genu wirusa.
22. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 21, znamienna tym, że gen wirusa pochodzi z wirusa plamistego więdnięcia pomidora (TSWV).
23. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że gen wirusa pochodzi z genu NP TSWV.
24. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że sekwencja kodująca jest w orientacji antysensowej.
25. Wektor ekspresji DNA składający się z sekwencji DNA jak określono w zastrzeżeniu 1.
26. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 25, znamienny tym, że wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2819.
27. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 25, znamienny tym, że wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2820.
28. Wektor ekspresji DNA składający się z sekwencji DNA jak określono w zastrz. 1 funkcjonalnie połączony z odpowiednią sekwencją nukleotydów.
29. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 28, znamienny tym, że wektor ekspresji DNA zdolny jest do zmiany ekspresji genomu wirusa w komórce.
30. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 29, znamienny tym, że wektor ekspresji DNA składa się z: a) pierwszej sekwencji DNA zdolnej do ekspresji sensowego fragmentu RNA genomu wirusa w komórce; oraz
b) drugiej sekwencji DNA zdolnej do ekspresji antysensowego fragmentu RNA genomu wirusa w komórce, znamienny tym, że sensowy fragment RNA i antysensowy fragment RNA są zdolne do tworzenia dwuniciowego RNA.
31. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 30, znamienny tym, że wymieniony wirus jest wybrany z grupy złożonej z tospowirusów, potywirusów, potekswirusów, tobamowirusów, luteowirusów, kukumowirusów, bromowirusów, klosteorwirusów, tombuswirusów i furowirusów.
32. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 31, znamienny tym, że co najmniej jedna z wymienionych pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA, składa się z sekwencji nukleotydowej otrzymanej z co najmniej jednego genu białka płaszcza wirusa, genu białka nukleokapsydu wirusa, genu replikazy wirusa lub genu białka ruchu wirusa i różnych ich części.
33. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 32, znamienny tym, że co najmniej jedna spośród pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA pochodzi z wirusa plamistego więdnięcia pomidora (TSWV).
34. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 33, znamienny tym, że co najmniej jedna spośród pierwszej sekwencji DNA i drugiej sekwencji DNA pochodzi z genu białka nukleokapsydu.
35. Transgeniczna komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera sekwencję DNA jak określono w zastrzeżeniu 1.
36. Komórka gospodarza według zastrz. 35, znamienna tym, że wymienioną komórką gospodarza jest komórka roślinna.
37. Roślina transgeniczna i jej potomstwo, znamienne tym, że zawiera sekwencję DNA jak określono w zastrzeżeniu 1.
38. Wektor ekspresji DNA zawierający sekwencje DNA jak określono w zastrzeżeniu 7.
39. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 38, znamienny tym, że wektor ekspresji DNA składa się z pNOV2819 i pNOV2820.
40. Wektor ekspresji DNA zawierający zrekombinowaną cząsteczkę DNA jak określono w zastrzeżeniu 10.
41. Wektor ekspresji DNA według zastrz. 40, znamienny tym, że wektor ekspresji składa się z pNOV2819 i pNOV2820.
PL358790A 2000-03-27 2001-03-26 Wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, zrekombinowana cząsteczka DNA, wektor ekspresji DNA, transgeniczna komórka gospodarza i roślina transgeniczna i jej potomstwo PL204327B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0007427A GB0007427D0 (en) 2000-03-27 2000-03-27 Organic compounds
GB0010486A GB0010486D0 (en) 2000-04-28 2000-04-28 Organic compounds
EP01101802 2001-01-26
US27207601P 2001-02-28 2001-02-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL358790A1 PL358790A1 (pl) 2004-08-23
PL204327B1 true PL204327B1 (pl) 2010-01-29

Family

ID=27224121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL358790A PL204327B1 (pl) 2000-03-27 2001-03-26 Wyizolowana sekwencja DNA funkcjonalnie połączona ze zasocjowaną sekwencją nukleotydów, zrekombinowana cząsteczka DNA, wektor ekspresji DNA, transgeniczna komórka gospodarza i roślina transgeniczna i jej potomstwo

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP1268826B1 (pl)
JP (1) JP4739634B2 (pl)
KR (1) KR100766290B1 (pl)
CN (1) CN100457913C (pl)
AR (1) AR044724A1 (pl)
AT (1) ATE393829T1 (pl)
AU (2) AU2001242516B2 (pl)
BR (1) BR0109530B1 (pl)
CA (1) CA2406191C (pl)
DE (1) DE60133807T2 (pl)
EA (1) EA006761B1 (pl)
ES (1) ES2304127T3 (pl)
HU (1) HU225788B1 (pl)
NZ (1) NZ521412A (pl)
PL (1) PL204327B1 (pl)
WO (1) WO2001073087A1 (pl)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
EP1781784A2 (en) 2004-08-02 2007-05-09 BASF Plant Science GmbH Method for isolation of transcription termination sequences
PL1951879T3 (pl) 2005-10-05 2016-05-31 Bayer Ip Gmbh Rośliny o podwyższonej zawartości aminocukrów
EP1772052A1 (de) 2005-10-05 2007-04-11 Bayer CropScience GmbH Verbesserte Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan
AR064558A1 (es) 2006-12-29 2009-04-08 Bayer Cropscience Sa Proceso para la modificacion de las propiedades termicas y de digestion de almidones de maiz y harinas de maiz
EP2036983A1 (de) 2007-09-12 2009-03-18 Bayer CropScience AG Pflanzen, die erhöhte Mengen an Glucosaminglycanen synthetisieren
KR100987352B1 (ko) * 2008-04-15 2010-10-12 주식회사 인트론바이오테크놀로지 비특이 증폭을 감소시킬 수 있는 ｐｃｒ용 프라이머 및이를 이용한 ｐｃｒ 방법
EP2143797A1 (de) 2008-07-10 2010-01-13 Bayer CropScience AG Weizenstärke sowie Weizenmehle und Lebensmittel enthaltend diese Weizenstärke/Weizenmehle
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
CA2749524C (en) * 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
CN103635483B (zh) 2011-07-01 2016-11-09 孟山都技术公司 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物
WO2013015993A1 (en) 2011-07-28 2013-01-31 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
BR112014020164B1 (pt) 2012-02-16 2022-09-13 Syngenta Participations Ag Polipeptídeo pesticida vip3 manipulado, molécula de ácido nucleico, vetor e composição
WO2013192256A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
US10604757B2 (en) 2014-12-23 2020-03-31 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
UA125114C2 (uk) 2015-04-10 2022-01-12 Сінгента Партісіпейшнс Аг Кормова композиція для тварин і способи її застосування
MX2018000890A (es) 2015-07-22 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas.
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
CA3145052A1 (en) * 2019-07-05 2021-01-14 Bejo Zaden B.V. Tomato spotted wilt virus resistance in cichorium
BR112022008415A2 (pt) 2019-11-05 2022-09-06 Pairwise Plants Services Inc Composições e métodos para substituição do dna codificado pelo rna dos alelos
US11976278B2 (en) 2019-12-06 2024-05-07 Pairwise Plants Services, Inc. Recruitment methods and compounds, compositions and systems for recruitment
AU2021212189A1 (en) 2020-01-30 2022-08-04 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
US11959072B2 (en) 2020-01-31 2024-04-16 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2021158798A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Pairwise Plants Services, Inc. Thornless / prickleless rubus plants
WO2021168288A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pairwise Plants Services, Inc. Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing
WO2021188526A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Pairwise Plants Services, Inc. Natural guide architectures and methods of making and using the same
US11999946B2 (en) 2020-03-26 2024-06-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US11882808B2 (en) 2020-03-27 2024-01-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving resistance to soybean rust
US20230212600A1 (en) 2020-04-16 2023-07-06 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
EP4156909A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
BR112022025598A2 (pt) 2020-06-17 2023-01-03 Pairwise Plants Services Inc Métodos para controlar o tamanho do meristema para melhoria da safra
AU2021300169A1 (en) 2020-06-30 2023-02-02 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
EP4204436A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas proteins and methods of use thereof
CN112210560A (zh) * 2020-11-05 2021-01-12 四川农业大学 一种玉米叶黄化基因oy2以及与其连锁的InDel分子标记和应用
EP4240844A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
US20220259612A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants
CN117203227A (zh) 2021-02-25 2023-12-08 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中根结构的方法和组合物
WO2022265905A2 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof
AR126172A1 (es) 2021-06-17 2023-09-27 Pairwise Plants Services Inc Modificación de factores de transcripción de la familia de factores reguladores del crecimiento en soja
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CN117794358A (zh) 2021-07-01 2024-03-29 成对植物服务股份有限公司 用于增强根系发育的方法和组合物
US20230078990A1 (en) 2021-08-12 2023-03-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
CA3229224A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
US20230074699A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
WO2023049728A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same
CA3232804A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
CA3237641A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
CA3234455A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
WO2023114750A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Pairwise Plants Services, Inc. Model editing systems and methods relating to the same
WO2023133440A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for trichome removal
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
WO2023164722A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023196886A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
US20230416771A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240000031A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006792A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024036240A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131623B2 (en) * 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
ATE196318T1 (de) * 1989-10-31 2000-09-15 Monsanto Co Promotor für transgene pflanzen
US5824857A (en) * 1991-11-08 1998-10-20 Washington University Plant promoter

Also Published As

Publication number Publication date
KR100766290B1 (ko) 2007-10-11
EP1268826A1 (en) 2003-01-02
DE60133807D1 (en) 2008-06-12
JP4739634B2 (ja) 2011-08-03
CA2406191C (en) 2012-05-29
EA200200960A1 (ru) 2003-06-26
ES2304127T3 (es) 2008-09-16
EA006761B1 (ru) 2006-04-28
CN100457913C (zh) 2009-02-04
WO2001073087A1 (en) 2001-10-04
HU225788B1 (en) 2007-09-28
HUP0300570A3 (en) 2004-11-29
BR0109530A (pt) 2002-12-10
CN1430673A (zh) 2003-07-16
BR0109530B1 (pt) 2014-09-16
PL358790A1 (pl) 2004-08-23
AU2001242516B2 (en) 2005-07-14
NZ521412A (en) 2003-11-28
EP1268826B1 (en) 2008-04-30
HUP0300570A2 (hu) 2003-08-28
DE60133807T2 (de) 2009-06-25
JP2003529353A (ja) 2003-10-07
AR044724A1 (es) 2005-10-05
WO2001073087A8 (en) 2003-01-03
ATE393829T1 (de) 2008-05-15
KR20020086724A (ko) 2002-11-18
AU4251601A (en) 2001-10-08
CA2406191A1 (en) 2001-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2406191C (en) Cestrum yellow leaf curling virus promoters
US20040086847A1 (en) Cestrum yellow leaf curling virus promoters
CN108368517B (zh) 用于快速植物转化的方法和组合物
CN101522902B (zh) 通过邻氨基苯甲酸合酶的叶绿体靶向表达产生高色氨酸玉蜀黍
AU2024201406A1 (en) Simultaneous gene editing and haploid induction
CN103031310B (zh) 在植物中表达蛋白质
AU2010258955B2 (en) Expression cassettes derived from maize
AU2022202025A1 (en) Stabilising fatty acid compositions
Tripathi et al. Agrobacterium-mediated transformation of plantain (Musa spp.) cultivar Agbagba
KR20200056434A (ko) 조직-선호적 프로모터 및 이용 방법
WO2000020557A9 (en) Gemini virus vectors for gene expression in plants
KR20130132405A (ko) 형질전환 빈도를 증가시키기 위해 변형된 아그로박테리움 균주
CA2730126C (en) Plant regulatory sequence
US20200407741A1 (en) Replicating and non-replicating vectors for recombinant protein production in plants and method of use thereof
AU2016350610A1 (en) Methods and compositions of improved plant transformation
CN101939423A (zh) 用于捕获和修饰基因组dna大片段和用合成叶绿体构建生物体的系统
CN113621642A (zh) 一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用
CN115997023A (zh) 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因
AU2005252598B8 (en) Transformation vectors
CN108690850A (zh) 一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用
CN113621644B (zh) 筛选转基因植物的组合物和方法
CN107828816A (zh) 一种酵母‑农杆菌穿梭载体及构建方法和应用
CN114302644B (zh) 调控植物中基因表达的启动子
Palanichelvam et al. A comparative analysis of the avirulence and translational transactivator functions of gene VI of Cauliflower mosaic virus
GB2475435A (en) Producing a product using shuttle vectors containing essential chloroplast genes

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140326