CN113621644B - 筛选转基因植物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了筛选转基因植物的组合物和方法。本发明利用植物花青素生物合成途径中的酶类基因DFR、LDOX、UFGT构建了筛选植物转基因的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于筛选转基因植物，巧妙地利用花青素的显色，在愈伤组织阶段即可筛选出植物转基因的阳性细胞，有效地减轻转化后筛选的工作量。本方法能够在悬浮培养的愈伤组织中进行无细胞损伤的筛选，筛选过程无需进行组织化学检测或利用特殊的仪器设备，肉眼观测即可。利用本方法可获得高阳性率的转基因愈伤组织，极大缩短了筛选培养的时间。

Description

筛选转基因植物的组合物和方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物转基因阳性细胞的筛选方法。
背景技术
现行的植物基因工程一般通过农杆菌介导侵染宿主植物的愈伤组织，通过农杆菌的T-DNA介导将外源基因序列转化、并随机插入到植物细胞中基因组中。因常规转基因方法构建的转基因细胞效率较低，需要通过一定的筛选方法对阳性细胞进行筛选，目前常用筛选方法为抗生素筛选和除草剂筛选。但受限于植物细胞和转染方法的特殊性，该筛选方式将获得大量假阳性细胞，继而形成嵌合体细胞团。此外，潮霉素或除草剂对液体环境培养的植物愈伤组织筛选能力远低于固体培养的植物愈伤细胞，实践操作中难以进行。因此，迫切需要寻找一种能够在植物转基因系统中，使用便捷、可靠性更高、且同时适用于固体和液体培养的新筛选方法。
我们在初始研究中，目标是建立一种可视化、不损伤细胞即可进行持续检测鉴定的植物转基因筛选方法。最为直接的是以GFP、RFP等荧光蛋白和目的蛋白进行共表达，在相应激发光源下持续进行筛选，直至获得完全荧光的愈伤组织。但由于植物的细胞壁和胞外结构对常规荧光检测有强烈干扰，GFP等荧光蛋白的筛选不得不借助高精度仪器，操作要求较高，难以实现大量、简便的筛选。
花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质。花青素赋予植物缤纷的色彩，在植物发育过程中，具有使植物免受紫外辐射、抗病原菌侵染等重要生理作用。同时，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效。因此，可以利用花青素的这些特点，将花青素合成途径的结构基因及其调控因子基因作为一类可视化、安全和有效的标记基因来转化植物。不仅可以有效地减轻转化后筛选的复杂工作，目的性强，也大为提高实验结果的准确度和可信度，为开展转化后的分析工作奠定了很好的基础。
现有技术中，已有利用花青素显色来筛选转基因植物的方法。中国专利CN102352375B将花青素合成途径中的两个基因转录因子bi和cl基因运用到植物转基因中，根据基因在植株上的颜色表现，有选择的保留有价值的转化材料。中国专利CN102719450B将花青素调节基因Rosea 1和Delila整合进菊花基因组，转基因植物茎部在自然条件下出现明显紫红色，与对照有明显差异，从而区别转基因与非转基因植株。然而，现有技术中的筛选方法大多需要经过植物组织培养过程，即被转化的植物细胞要通过组织培养的方法进行植株再生，经过多代筛选，才能得到转基因阳性的植株，而植物组织培养过程存在繁琐冗长，耗时长，假阳性多等问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了能够筛选转基因植物的组合物和方法。
本发明利用植物花青素生物合成途径中的部分酶来构建高效的表达载体，将花青素合成所需的酶基因及外源基因转入水稻愈伤组织中，通过花青素在愈伤组织的表达来快速、高效地筛选转基因植物阳性细胞。
图1是植物中常见花色素苷生物合成途径(刘娟,冯群芳,张杰.二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)与花色的修饰[J].植物生理学报,2005,41(006):715-719.)，该途径内的不同酶类具有一定的时空表达特异性。经过多次试验证明，向植物中转入合成途径中的酶类DFR、ANS、3GT可能是本发明中较好的植物转基因筛选的路线选择。其中虚线方框内的路径为葡萄中花青素的合成路径，葡萄中与上述酶类对应的基因为：DFR、LODX、UFGT。
植物中花色素种类繁多，提供了各种颜色的选择空间，图1中，经过DFR催化的三种不同的反应底物二氢杨梅黄酮(DHM)、二氢槲皮素(DHQ)或二氢堪非醇(DHK)使愈伤组织最终呈现不同的颜色。基于显色的明显程度考虑，本领域技术人员可根据野生型植物愈伤组织的本底颜色，选择相应的DFR酶底物，以使得经转基因处理后的植物愈伤组织颜色与未经处理的植物愈伤组织颜色，通过肉眼即可清晰分辨，以确定转基因成功与否。
在一方面，本发明提供一种筛选转基因植物的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
根据密码子的简并性，针对某一基因，本领域技术人员可以设计出多种可编码该基因的序列。本领域技术人员可根据转基因植物的密码子偏好性对某一基因序列进行优化。在某些实施方式中，为实现DFR、LDOX、UFGT基因在植物花青素合成途径中的作用，其编码序列分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所记载的序列至少具有大约60％的相似性、大约65％的相似性、大约70％的相似性、大约75％的相似性、大约80％的相似性、大约85％的相似性、大约90％的相似性或大约95％的相似性、大约96％的相似性、大约97％的相似性、大约98％的相似性、大约99％的相似性。
在某些实施方式中，所述载体还包括其他标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
在某些实施方式中，所述载体筛选的转基因植物为双子叶植物或单子叶植物。优选的植物物种包括：烟草、水稻等，特别优选的植物物种为水稻。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
在另一方面，本发明提供一种含有所述筛选转基因植物的载体的宿主细胞，宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。
在某些实施方式中，所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中，包含DFR、LDOX、UFGT基因的载体共存于所述宿主细胞中。在某些实施方式中，DFR、LDOX、UFGT基因分别位于2个不同载体中。
在某些实施方式中，所述宿主细胞用于筛选的转基因植物为双子叶植物或单子叶植物。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
在另一方面，本发明提供一种筛选转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因和外源基因的载体；
2)将步骤1)构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT和外源基因的愈伤组织；
3)添加DFR基因编码的酶的底物；
4)挑选显色的愈伤组织；
在某些实施方式中，还增加如下步骤，将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1-5天；挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒。在某些实施方式中，进一步增加如下步骤，对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复上述步骤3)、4)，直到所有愈伤组织颗粒均全部完全显色。
在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，所述载体还包括其他的标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，所述酶的底物为二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇。在某些实施方式中，所述酶的底物为二氢槲皮素。
在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，经转基因处理后的植物愈伤组织颜色与未经处理的野生植物愈伤组织颜色，可肉眼清晰分辨。在某些实施方式中，所述植物在愈伤组织阶段不表达花青素。在某些实施方式中，所述植物在愈伤组织阶段表达的花青素颜色较浅，例如为乳白色。
在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，所述转基因的植物为双子叶植物或单子叶植物。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
本发明利用花青素合成途径中部分酶基因构建了筛选植物转基因的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于筛选转基因植物，巧妙地利用花青素的显色，在愈伤组织阶段即可筛选出植物转基因的阳性细胞，有效地减轻转化后筛选的工作量，缩短了筛选培养时间，不经过转基因植株的种植过程，即T0代筛选。同时，本发明建立的方法能够在悬浮培养的愈伤组织中进行无细胞损伤的筛选，获得高度可靠的转基因愈伤组织，无需进行组织化学检测或特殊的仪器设备、肉眼即可观测，加快植物愈伤组织悬浮培养的实验进程，为以植物悬浮细胞作为细胞反应器的应用提供新的技术路径。
附图说明
图1为花色素苷生物合成途径。
图2为pGP1.2-DFR载体图谱。
图3为pGP1.1-DFR载体图谱。
图4为EcoRI和HindIII双酶切验证载体pGP1.1-DFR，M：1KB DNA maker；1，2：双酶切验证载体pGP1.1-DFR。
图5为pCS1511-gfp载体图谱。
图6为pCS1511-hptII载体图谱。
图7为不同浓度DHQ处理对水稻愈伤组织的影响。
图8为DHQ显色结果，A：第一次筛选；B：第二次筛选；C：第三次筛选；D：第四次筛选；E完全显色颗粒；F：局部显色颗粒。
图9为不同细胞的抽提物在不同pH值下的颜色变化。
图10为PL基因扩增图，M：DL2000 maker；1，2：PCR扩增PL基因结果。
图11为pGP1.1-PL载体图谱。
图12为pCS1511-PL载体图谱。
图13为PL基因表达材料第一次DHQ染色筛选，A-B：局部显色颗粒；C：早期观察中轻微显色颗粒；D：对照组；图中红色箭头判定为显色的愈伤组织。
图14为PL基因在水稻愈伤细胞中转基因筛选完成后的细胞恢复生长过程，Aftertreatment：DHQ处理过夜全阳性细胞染色结果；Day 1-7：DHQ处理结束后取适量愈伤细胞替换培养基重新培养1-7天后的细胞生长状态。
图15为转基因PL-X3株系中各基因的表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明提供了筛选转基因植物的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。构建载体及载体进入宿主细胞等分子生物学操作方法在本领域公知的技术手册Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)中可获得。
宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。
本发明提供了利用上述载体及宿主细胞筛选转基因植物的方法。
在转基因植物中用于基因表达的遗传构建物典型地包括驱动一条或多条多聚核苷酸表达的启动子、终止子和/或检测遗传构建物在被转化植物中存在的选择性标记序列。
本发明所提供的筛选植物转基因的载体至少包含3个花青素合成途径所需酶的基因表达盒。在本发明的实施例中，所述基因表达盒具体由花青素合成途径中的DFR基因的表达盒，花青素合成途径中的LDOX基因的表达盒所组成，以及花青素合成途径中的UFGT基因的表达盒所组成。其表达产物花青素可作为植物转基因成功与否的可视化参考标记。所述花青素合成途径中的DFR基因序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途径中的LDOX基因序列如序列表中序列2所示；所述花青素合成途径中的UFGT基因序列如序列表中序列3所示。
所述花青素合成途径中的DFR基因的表达盒是一个含有所述DFR基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的DFR基因和终止子；所述花青素合成途径中的LDOX基因的表达盒是一个含有所述LDOX基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的LDOX基因和终止子。所述花青素合成途径中的UFGT基因的表达盒是一个含有所述UFGT基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的UFGT基因和终止子。
适用于本发明构建物的启动子可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如在大多数植物组织中有活性的组成型启动子，组成型植物启动子的例子包括CaMV35S启动子、胆脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子和来自于玉米的Ubi1启动子。
在植物转化遗传构建物中普遍使用的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)终止子或章鱼肉碱合成酶终止子、玉米(Zeamays)醇溶蛋白基因终止子、水稻(Oryzasativa)ADP葡糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanumtuberosum)PI-II终止子。
在植物转化中普遍使用的选择性标记基因包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(phophotransferase)II基因(NPTII)、赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite(AgrEvo)和Basta(Hoechst)抗性的phosphinothricin乙酰基转移酶(bar基因)和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
所述基因表达盒和目的基因可通过各种基因转移方式导入双子叶植物和/或单子叶植物。所述基因转移方式包括但不限于：电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法、花粉管通导法、农杆菌转化法等。在本发明的实施例中采用的具体方法为农杆菌转化法。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，在本发明的实施例中具体为水稻。
实施例1筛选转基因水稻阳性细胞株体系的构建与测试
1.实验材料与试剂
1.1试验材料
pCambia1302载体、pUC19载体：来自于浙江大学农生环分析测试中心实验室，为商业化载体。
pGP1.1载体：pCambia1302载体经过少量酶切位点修改后获得；
pGP1.2载体：在pUC19载体上添加了目的基因启动子和终止信号的表达盒；
水稻愈伤组织来源于：粳稻日本晴诱导(由江苏省农科院赠予)；
用于基因转化的农杆菌为：根瘤农杆菌EHA105；
二氢槲皮素(DHQ)：购于南京朗泽生物科技有限公司，99％。
培养箱型号：智能人工气候箱DRX-450B(宁波海曙赛福实验仪器厂)
摇床型号：DHZ-DA(江苏太仓市实验设备厂)
脱色摇床：TS-1脱色摇床(海门市麒麟医用仪器厂)
1.2常规培养基及试剂配方
30％次氯酸钠溶液：量取300ml NaClO，用蒸馏水定容至1000ml。
100mM AS：称取294.3mg As(乙酰丁香酮)，15ml DMSO溶解，1ml分装，-20℃保存。
激素溶液配制方法：
N6培养基大量元素母液(20倍)：
KNO3 56.6g/L
CaCl2·2H2O 3.32g/L(相当于CaCl2 2.506g/L)
MgSO4·7H2O 2.70g/L(相当于MgSO4 1.807g/L)
KH2PO4 8.0g/L
(NH4)2SO4 9.26g/L
B5微量元素母液(100倍)：
KI 0.0750g/L
H3BO3 0.30g/L
MnSO4·H2O 1.0g/L
ZnSO4·7H2O 0.2g/L
Na2MoO4·2H2O 0.025g/L
CuSO4·5H2O 0.0025g/L
CoCl2·6H2O 0.0025g/L
B5有机母液：
烟酸 1mg/ml
盐酸吡哆醇(VB6) 1mg/ml
盐酸硫胺素(VB1) 10mg/ml
肌醇 10mg/ml
铁盐(100倍)：
FeSO4·7H2O 2.78g/L
Na2EDTA·2H2O 3.73g/L
AA大量元素母液(10倍)：
KCl 29.5g/L
CaCl2·2H2O 1.5g/L
MgSO4·7H2O 2.5g/L
NaH2PO4·2H2O 1.5g/L
粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(每升含量)：
N6大量 50ml B5微量 10ml 铁盐 10ml
烟酸 1ml 盐酸吡哆醇 1ml 盐酸硫胺素 1ml
肌醇 10ml L-pro 2.8g CH 0.3g
2，4-D 8ml 蔗糖 30g Phytagel 4.5g
PH值 5.8
粳稻愈伤组织继代培养基(每升含量)：
N6大量 50ml B5微量 10ml 铁盐 10ml
烟酸 1ml 盐酸吡哆醇 1ml 盐酸硫胺素 1ml
肌醇 10ml L-Glu 0.5g L-pro 0.5g
CH 0.3g 2，4-D 2ml
蔗糖 30g Phytagel 4.5g PH值 5.8
粳稻共培养培养基(每升含量)：
选择培养基每升含量：
粳稻分化培养基配方(每升含量)：
N6大量 50ml B5微量 10ml 铁盐 10ml
烟酸 1ml 盐酸吡哆醇 1ml 盐酸硫胺素 1ml
肌醇 10ml L-Glu 0.5g L-pro 0.5g
CH 0.3g 6-BA，1mg/ml 3ml NAA(1mg/ml) 0.5ml
蔗糖 30g Phytagel 4.5g PH值 5.8
粳稻生根培养基配方(每升含量)：
N6大量 25ml B5微量 5ml 铁盐 5ml
烟酸 0.5ml 盐酸吡哆醇 0.5ml 盐酸硫胺素 0.5ml
肌醇 5ml 蔗糖 20g Phytagel 5g
PH值 5.8
农杆菌生长的YEP液体培养基配方(每升含量)：
酵母提取物 10g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
pH 7.0
Str 50mg
Kan 30mg
悬浮农杆菌感染愈伤组织的培养基配方(AAM)每升含量：
物质名称对照
KT:激动素
6-BA：6-苄氨基嘌呤
NAA：萘乙酸
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸
CH：酸水解酪蛋白
Phytagel：植物凝胶
L-pro：L型脯氨酸
MES：2-(N-吗啉)乙磺酸
Str：链霉素
Crab：羧苄青霉素钠
Hyg B：潮霉素B
Kan：卡那霉素
Tryptone powder：蛋白胨
2.基因的合成
参考水稻密码子偏好性，对DFR、LDOX、UFGT基因进行优化，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因合成。
2.1DFR基因合成序列(VVDFR4)，如SEQ ID NO.4所示
CCATGGGCTCTCAGAGCGAGACCGTGTGCGTGACAGGAGCAAGCGGCTTCATCGGCTCCTGGCTGGTCATGAGGCTGCTGGAGAGGGGATACACCGTGCGGGCAACAGTGAGAGACCCTACCAACGTGAAGAAGGTGAAGCACCTGCTGGATCTGCCAAAGGCCGAGACCCACCTGACACTGTGGAAGGCCGACCTGGCCGATGAGGGCAGCTTCGACGAGGCCATCAAGGGATGCACCGGCGTGTTCCACGTGGCAACACCAATGGACTTTGAGAGCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATCAAGCCCACCATCGAGGGCATGCTGGGCATCATGAAGTCCTGTGCTGCCGCCAAGACAGTGCGGAGACTGGTGTTTACCAGCTCCGCCGGCACAGTGAATATCCAGGAGCACCAGCTGCCCGTGTACGACGAGTCCTGCTGGTCTGATATGGAGTTCTGTCGGGCCAAGAAGATGACCGCCTGGATGTACTTCGTGAGCAAGACACTGGCCGAGCAGGCCGCCTGGAAGTATGCCAAGGAGAACAATATCGACTTCATCACCATCATCCCGACACTGGTGGTGGGCCCTTTTATCATGTCTAGCATGCCACCTTCTCTGATCACCGCCCTGAGCCCAATCACAGGCAATGAGGCCCACTATTCCATCATCCGGCAGGGCCAGTTCGTGCACCTGGACGACCTGTGCAACGCCCACATCTACCTGTTTGAGAATCCTAAGGCCGAGGGCAGGTATATCTGCTCCTCTCACGACTGCATCATCCTGGATCTGGCCAAGATGCTGCGCGAGAAGTACCCTGAGTATAACATCCCAACCGAGTTCAAGGGCGTGGACGAGAATCTGAAGTCCGTGTGCTTTAGCTCCAAGAAGCTGACAGATCTGGGCTTCGAGTTTAAGTATTCTCTGGAGGACATGTTTACCGGCGCCGTGGATACATGCAGAGCAAAGGGACTGCTGCCACCCTCCCACGAGAAGCCTGTGGACGGCAAGACCGGCGCGCC
2.2LDOX基因合成序列(VVLDOX)，如SEQ ID NO.5所示
CTCGAGATGGTGACCAGCGTGGCACCACGCGTGGAGTCCCTCAGCTCCTCTGGCATCCAGAGCATCCCAAAGGAGTACATCAGGCCACAGGAGGAGCTGACCTCCATCGGCAACGTGTTCGAGGAGGAGAAGAAGGACGAGGGCCCTCAGGTGCCAACAATCGACCTGAAGGACATCGAGTCCGAGGATGAGGTGGTGCGGGAGAGATGCAGGGAGGAGCTGAAGAAGGCCGCGATGGAGTGGGGCGTGATGCACCTGGTGAACCACGGCATCTCTGACGATCTGATCAATCGCGTGAAGGTGGCCGGCGAGACCTTCTTTAACCTGCCGATGGAGGAGAAGGAGAAGTACGCCAATGACCAGGCCAGCGGCAAGATCGCCGGCTATGGCTCTAAGCTGGCCAACAATGCCAGCGGCCAGCTGGAGTGGGAGGACTATTTCTTTCACCTGATCTTTCCCGAGGACAAGCGGGATATGACCATCTGGCCCAAGACACCTAGCGATTACGTGCCTGCCACCTGTGAGTATTCTGTGAAGCTGAGAAGCCTGGCCACAAAGATCCTGAGCGTGCTGTCCCTGGGACTGGGCCTGGAGGAGGGCAGGCTGGAGAAGGAAGTGGGAGGCATGGAGGAGCTGCTGCTCCAGAAGAAGATCAACTACTATCCTAAGTGCCCACAGCCTGAGCTGGCCCTGGGAGTGGAGGCACACACCGACGTGTCTGCCCTGACATTCATCCTGCACAACATGGTGCCTGGCCTCCAGCTGTTTTACGAGGGCAAGTGGGTGACCGCCAAGTGCGTGCCAAATAGCATCATCATGCACATCGGCGATACAATCGAGATCCTGTCCAACGGCAAGTATAAGTCTATCCTGCACCGCGGCCTGGTGAATAAGGAGAAGGTGCGGATCTCCTGGGCCGTGTTCTGCGAGCCCCCTAAGGAGAAGATCATCCTGAAGCCACTGCCCGAGACCGTGTCCGAGACAGAGCCACCCCTGTTCCCTCCAAGAACCTTTTCTCAGCACATCCAGCACAAGCTGTTTAGGAAGACACAGGAGGCCCTGCTGTCTAAGTGAAGTAGATGCCGACCGGATCC
2.3UFGT基因合成序列(VVUFGT2)，如SEQ ID NO.6所示
TCATGAGCCAGACCACAACCAACCCTCACGTGGCCGTGCTGGCATTCCCCTTTTCCACCCACGCAGCACCTCTGCTGGCAGTGGTGCGGAGACTGGCTGCCGCCGCCCCACACGCCGTGTTCAGCTTCTTTTCTACAAGCCAGTCCAACGCCAGCATCTTTCACGATTCCATGCACACCATGCAGTGCAATATCAAGAGCTACGACGTGTCCGATGGCGTGGCAGAGGGATACGTGTTCGCAGGCCGGCCTCAGGAGGACATCGAGCTGTTCATGCGGGCCGCCCCAGAGTCTTTTAGACAGGGCATGGTCATGGCAGTGGCAGAGACAGGCAGACCCGTGAGCTGTCTGGTGGCCGACGCCTTCATCTGGTTTGCCGCCGATATGGCCGCCGAGATGGGAGTGGCATGGCTGCCTTTTTGGACCGCCGGCCCAAACTCTCTGAGCACACACGTGTACACCGACGAGATCAGGGAGAAGATCGGCGTGTCCGGCATCCAGGGAAGGGAGGATGAGCTGCTGAATTTCATCCCCGGCATGTCTAAGGTGAGGTTTCGCGACCTCCAGGAGGGCATCGTGTTCGGCAACCTGAACAGCCTGTTTTCTCGGATGCTGCACAGAATGGGCCAGGTGCTGCCTAAGGCCACAGCCGTGTTCATCAACTCCTTTGAGGAGCTGGACGATTCTCTGACAAATGATCTGAAGAGCAAGCTGAAGACCTACCTGAACATCGGCCCATTCAATCTGATCACCCCCCCTCCAGTGATCCCCAATACAACCGGCTGCCTCCAGTGGCTGAAGGAGAGGAAGCCCACATCTGTGGTGTATATCAGCTTTGGCACCGTGACAACCCCACCTCCAGCCGAGCTGGTGGCCCTGGCCGAGGCCCTGGAGGCCTCCAGGGTGCCCTTCATCTGGTCTCTGAGGGACAAGGCCCGCGTGCACCTGCCTGAGGGCTTTCTGGAGAAGACACGCGGCTACGGAATGGTGGTGCCCTGGGCACCTCAGGCAGAGGTGCTGGCCCACGAGGCAGTGGGAGCCTTCGTGACCCACTGCGGCTGGAACTCTCTGTGGGAGAGCGTGGCAGGAGGCGTGCCACTGATCTGTCGGCCCTTTTATGGCGACCAGCGGCTGAATGGCAGAATGGTGGAGGATGCCCTGGAGATCGGCGTGAGAATCGAGGGCGGCGTGTTCACAGAGTCCGGCCTGATGTCTTGTTTTGATCAGATCCTGAGCCAGGAGAAGGGCAAGAAGCTGAGGGAGAACCTGGGCGCCCTGAGGGAGACCGCCGACAGGGCCGTGGGCCCAAAGGGCAGCTCCACAGAGAATTTCAAGACCCTGGTGGACCTGGTGTCCAAGCCCAAGGACGTGTGAAGGTG ACC
3.载体构建
3.1pGP1.2-DFR载体构建
VVDFR4两端含有酶切位点NcoI、AscI，通过这两个酶切位点将DFR基因插入到载体pGP1.2相同的位点上，并命名为pGP1.2-DFR。载体图谱见图2。经测序，载体构建成功。
3.2pGP1.1-DFR载体构建
通过EcoRI和HindIII双酶切pGP1.2-DFR将DFR基因表达框切下并转移至同样酶切位点剪切的载体pGP1.1上，并命名为pGP1.1-DFR，载体图谱见图3。图3中，启动子p35S和CaMV 35S是一致的，仅标记不同，CaMV 35S2是一个增强的35S启动子，他们是来源于商业化载体pCambia1302。该载体作为中间载体出现，验证方法为EcoRI、HindIII双酶切验证，切割下条带在2kb左右，见图4。
3.3pCS1511-gfp(主功能载体)载体构建
通过BamHI和XhoI双酶切VVLDOX(合成时带上酶切位点)将LDOX基因切下并转移至同样酶切位点剪切的载体pGP1.1-DFR上，并命名为pCS1511-gfp。载体图谱见图5。经测序，载体构建成功。
3.4pCS1511-hptII(辅助载体)载体构建
该质粒的构建目标是引入hptII抗性基因以便进行相关筛选，通过BstEII和BspHI双酶切VVUFGT2(合成时带上酶切位点)将UFGT基因切下并转移至BstEII和NcoI(BspHI同尾酶)双酶切的载体pCambia1302上。因采用了同尾酶进行连接，故UTGT基因上游不再保留有酶切位点NcoI或BspHI，并命名为pCS1511-hptII。载体图谱见图6。经测序，载体构建成功。
4.初步筛选测试
4.1二氢槲皮素(DHQ)浓度筛选
二氢槲皮素，又名花旗松素、二氢栎皮素，工业制备主要从几个特定物种中提取，其中包括花旗松的叶片，为DFR基因的底物。因水稻自身DFR同源基因在日本晴水稻中可能处于突变状态，即无法行使原本的功能。因此，我们测试了外源添加二氢槲皮素对日本晴水稻愈伤组织的影响。我们向水稻固体继代培养基中添加DHQ母液至终浓度分别为0、4、8、20、40、80mg/L，接种入野生型水稻愈伤组织，正常培养1周后观察愈伤组织的表型。结果如图7。
图7结果表明，高浓度的DHQ会导致野生型细胞出现部分损伤而呈现褐化。此时，因色泽较深，对于后期进行颜色筛选有极大影响，所以不适合作为筛选浓度。相对的，低于20mg/L终浓度的DHQ在水稻固体继代培养基中不会造成愈伤组织的严重损伤，愈伤组织呈现正常的淡黄色，可以和诱导产生的红色色素区分。因固体培养时，平均分摊到每个细胞的培养基较多，而液体培养时，分摊相对较少。而DHQ是作为反应底物消耗的，所以，当液体培养时，需要的底物量就会相应增多，依据该原理，可设计出适合的底物浓度。
4.2筛选过程
4.2.1农杆菌感受态细胞的制备与转化
EHA105感受态细胞的制备：挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL液体YEP培养基中，28℃摇菌(250rmp)20-24h。吸取400μL菌液，接种于20mL YEP培养基中，28℃摇菌(280rmp)至OD600值0.3左右(约4h)。将扩大繁殖的菌液分装到无菌10mL离心管中，冰浴10min。4℃，5000rmp离心5min，弃上层液体培养基。加入5mL冰浴预冷的0.15mol/L NaCl溶液，充分悬浮菌体，并冰浴30min。4℃，5000rmp离心5min，弃上层NaCl溶液。加入600μL冰浴预冷的0.02mol/L CaCl2溶液充分悬浮菌体，即得EHA105感受态细胞，用1.5mL离心管分装成100μl/管，4℃短期存放备用；加入20％的无菌甘油，-70℃放置可保存半年。
液氮冻融法转化农杆菌：向EHA105感受态细胞中加入至少300～500ng回收纯化的表达载体(pCS1511-gfp或pCS1511-hptII)，轻轻混匀，冰浴30min后液氮速冻1min。37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min。加入800μL YEP培养基，28℃，100rmp复苏3h。4000rmp离心3min，吸掉800μL YEP培养基。混匀剩余菌液，涂抹于YEP(K+，Str+)平板，28℃倒置培养30-48h，由于农杆菌自身携带链霉素抗性基因，pCS1511-gfp和pCS1511-hptII的母载体pCambia1302含卡那霉素抗性基因，因此，在YEP(K+，Str+)平板上生长的菌落为阳性克隆。PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。
4.2.2农杆菌培养
小摇：取3ml YEP培养基于试管中，加入终浓度为30mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，用无菌镊子夹取无菌20μl吸头点蘸一个单一健壮的阳性克隆菌落，放试管中加盖放30℃摇床200rpm转速过夜培养；
大摇：取30ml YEP培养基于100ml三角瓶中，加入终浓度为30mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，从过夜小摇的菌液中吸取5μl，接种到培养基中，封口放入30℃摇床中，以200rpm转速过夜培养；
农杆菌激活培养：将大摇的菌液5000rpm离心5分钟以收集菌体，用AAM(含AS)培养基重悬，并调至OD600值为0.6±0.01，室温静置3.5小时。
4.2.3水稻愈伤组织诱导
挑选颗粒饱满的日本晴水稻种子，手工剥掉种皮，从中挑选表面没有霉斑的种子用蒸馏水浸泡10分钟，用75％的乙醇浸泡2分钟，倒掉乙醇，用30％次氯酸钠溶液浸泡30分钟，期间晃动5～6次。浸泡结束用无菌水洗涤5次，最后一次浸泡10分钟。将洗好的种子转移到无菌滤纸上晾干后，放入诱导培养基中。种子放入水稻诱导培养基时，应扁平摆放，胚应接触培养基表面，每皿15颗种子。培养皿封口放培养箱培养，培养条件：温度28℃；光照强度：全光照；光照时常：10h，黑暗时常14h。
4.2.4水稻愈伤组织继代
从诱导出的愈伤组织中挑颗粒规则，质地致密且小、颜色亮黄的愈伤组织继代到继代培养基上培养1周时间。
4.2.5农杆菌介导转化法
挑颗粒大小在2-3mm的愈伤组织于50ml无菌离心管中，愈伤组织体积量到离心管10ml刻度处。将激活处理好的农杆菌(分别携带p CS1511-gfp和pCS1511-hptII质粒)各取10ml，混匀后加到愈伤组织中，室温放于脱色摇床上，以50rpm摇动混匀，计时侵染50min。侵染结束吸干菌液，愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，放于带有滤纸的共培养培养基上于26℃黑暗培养2天。共培养结束用无菌水洗3遍，再用500mg/L的羧苄青霉素水溶液晃动洗涤15分钟，在滤纸上晾干，转到抑菌培养基上培养5天时间，转到筛选培养基上培养。
4.2.6初步筛选方法
潮霉素筛选：抑菌培养约1周后，愈伤组织恢复正常生理状态，将其转到带50mg/L潮霉素HygB的筛选培养基上培养约15天；待培养基上的新愈伤组织长出后，将新愈伤组织继代到新的筛选培养基上再次筛选。
4.2.7诱导显色
当进行到潮霉素第二次筛选后，按照如下步骤进行本彩色水稻愈伤组织筛选过程(悬浮系统)。DHQ诱导显色：将筛选培养基上的亮黄色、生理状态良好的愈伤组织转移到250ml三角瓶中，加入50ml含终浓度100mg/L DHQ的水稻液体继代培养基，26℃，130rpm摇床过夜培养。目视下，挑选颜色呈现灰绿色或深红色的愈伤组织即为显色成功的水稻愈伤组织，将这些愈伤组织的显色部分用无菌刀片切下后继代到悬浮培养基上培养。一般已经显色的愈伤组织在不含DHQ的培养基中培养3～5天即可消退相应颜色。待颜色退去后可重复进行筛选过程，直到所有颗粒均显色。筛选过程如图8所示。
根据图8结果，当筛选进行到第四代时，所有颗粒都能够完全显色，且颜色较之前筛选过程更深。关于局部显色的原因是因为农杆菌仅能侵染部分细胞，在一个愈伤组织团块中包含大量具有胞间连丝的水稻细胞，当其中含有具有潮霉素抗性的阳性细胞时，该团块往往就整体具有对潮霉素的抗性，从而在筛选培养基中生长。而基于本发明所述筛选方法的DHQ显色却能将这种差异区别出来，从而出现了上述局部显色的愈伤组织。因此，当愈伤组织完全显色时，表示该愈伤组织内部所有细胞均已经转入目标基因。
4.3显色物质检测
为了测定显色物质是否为花青素，我们将显色的愈伤组织扩大培养一轮，重新进行显色，并使用纯水简单抽提细胞裂解液进行有色物成分的初步验证。此外，考虑到在细胞培养过程中正常愈伤组织也会偶发性的出现细胞褐化现象，为了区别该显色是否和褐化现象类似，我们进行了显色物质检测的简单实验。结果如图9。由图9中可知，显色物质确实是花青素物质，有着不同pH值显示不同颜色的特性。此外，该显色与褐化过程完全不同，且全阳性愈伤组织的红色深度要大于褐化细胞。
实施例2 PL基因的转基因筛选验证试验
核酸酶Surveyor nuclease(以下简称PL基因)是效率较高的单链DNA特异性核酸酶。该酶可以有效检测异源双链DNA的错配、插入和缺失，对于识别基因组中的单核苷酸多态性和致病突变很重要。我们尝试利用本发明所述的筛选方法在水稻中进行PL基因，如SEQID NO.7所示的转基因阳性细胞株系筛选，以期获得该核酸酶。
1.PL基因序列的克隆
(1)取新鲜芹菜100mg的组织样品至研钵中，加液氮充分研磨，小心转移至加有1mlTrizol试剂的1.5ml Ep管中，剧烈涡旋1min后，加入0.2ml氯仿，再次涡旋后于室温反应5min。
(2)4℃，12000rpm离心15min，取上清液转移到新的1.5ml Ep管中加0.5ml氯仿重复抽提2次，再转移上清液。
(3)在转移后的澄清液体中加入0.5ml异丙醇，轻摇混匀后室温保持10min，4℃，7500rpm离心8min，弃去上清液。
(4)加1ml 75％的乙醇(750μl无水乙醇+250μl 1‰DEPC水)反复上下倒置清洗沉淀，4℃，7500rpm离心5min，弃去乙醇溶液。
(5)空气干燥沉淀10-15min后加50μl 1‰DEPC水溶解。
(6)用逆转录试剂盒(HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，R223，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对上述提取的RNA反转录获得芹菜cDNA。
(7)用超保真DNA聚合酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase，P501，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按照如下体系和方法(touchdown)从芹菜cDNA文库中扩增PL基因序列。
引物：
PL-1.1-F：AGCCATGGCCACCTACTGGGG，如SEQ ID NO.8所示
PL-1.1-R：GGTCACCTTTACACTATTTCAATATTGTT，如SEQ ID NO.9所示
扩增体系：
ddH2O：31.5μL
5×SF buffer：10μL
dNTP：1μL
DMSO：1.5μL
Phanta Enzyme：1μL
PL-1.1-F：2μL
PL-1.1-R：2μL
芹菜cDNA：1μL
扩增方法：
扩增图片如图10所示。
(8)将扩增得到的片段作为酶切目标即可。
2.pGP1.1-PL载体的构建
在克隆出PL基因后，进行载体构建。pCS1511-hptII为辅助载体，在应用该筛选系统时，无需调整基因序列；使用PL基因替换pCS1511-gfp载体中的mGFP基因，即可实现与测试方案中相同的效果。参考pCS1511-gfp的构建过程，我们需要首先对pGP1.1载体中的mGFP基因，使用PL基因进行替换，后续步骤则与pCS1511-gfp载体的构建步骤相同。
引物在PL基因序列两侧增加了酶切位点NcoI和BstEII，通过NcoI和BstEII酶切PL基因片段，同样的核酸内切酶酶切载体pGP1.1，连接后即可构建出载体pGP1.1-PL。载体图谱如图11。
3.pCS1511-PL载体构建
后续步骤同pCS1511-gfp构建过程。载体图谱见图12。
4.筛选过程
将pCS1511-PL载体和pCS1511-hptII载体一起共同转化获得抗潮霉素抗性的愈伤颗粒进行悬浮培养，按照实施例1中相应方法进行筛选，获得高阳性率的转基因株系。第一次筛选结果如图13所示。
5.筛选完成后细胞恢复生长过程
筛选结束后，换新培养基(去除底物DHQ)持续培养一周，愈伤细胞褪去染色，恢复正常黄色，且培养过程中细胞正常扩繁，没有出现显著的抑制生长情况。结果如图14。
6.PL基因的表达结果
在获得高阳性率的转基因株系(PL-X3株系)后，我们进行定量PCR检测，以便确认观察到细胞现象的可靠性。定量PCR检测过程如下：
(1)采取褪色后的转基因株系PL-X3提取RNA并获取cDNA(试验过程同上)。
(2)利用定量PCR试剂盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，Q111，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行定量PCR。
定量引物：
PL-qRT-F：CTAGCAGCTGTTTGCTCCTG，如SEQ ID NO.10所示
PL-qRT-R：GTAACACACCGGTCTTTCCG，如SEQ ID NO.11所示
DFR-qRT-F：AGTGCGGAGACTGGTGTTTA，如SEQ ID NO.12所示
DFR-qRT-R：CCAGTGTCTTGCTCACGAAG，如SEQ ID NO.13所示
LDOX-qRT-F：CATCTGGCCCAAGACACCTA，如SEQ ID NO.14所示
LDOX-qRT-R：CACGCTCAGGATCTTTGTGG，如SEQ ID NO.15所示
UFGT-qRT-F：CACGATTCCATGCACACCAT，如SEQ ID NO.16所示
UFGT-qRT-R：CCATGACCATGCCCTGTCTA，如SEQ ID NO.17所示
HptII-qRT-F：CGTGGTTGGCTTGTATGGAG，如SEQ ID NO.18所示
HptII-qRT-R：CCCAAGCTGCATCATCGAAA，如SEQ ID NO.19所示
按如下体系配置反应液：0.4μl基因定量引物F端和R端，0.4μl ROX参比染液，1-2μl上述cDNA模板，10μl SYBR GREEN MIX染液。然后添水使得体系达到20μl。按如下步骤设计荧光定量PCR程序：
加入荧光定量PCR仪(applied biosystems QuantStudio 6Flex)完成反应。结果如图15。
结果表明，所有转入的基因均得到了表达，利用本发明所述的筛选转基因植物的组合物和方法可快速高效地获得PL基因阳性细胞株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州先端生物科技有限公司
江苏吉锐生物技术有限公司
<120> 筛选转基因植物的组合物和方法
<141> 2021-09-02
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> Vitis vinifera
<400> 1
atgggttcac aaagtgaaac cgtgtgcgtc accggtgcct ccggtttcat cggttcatgg 60
ctggtcatga ggctcctgga gcgcggctac actgttcggg ccaccgttcg cgatccaact 120
aacgtgaaaa aagtgaagca tttgctggac ttgcccaaag cggagacgca tctgactctc 180
tggaaggcag atcttgctga tgaaggaagt ttcgatgaag ctattaaagg ctgcaccggc 240
gtcttccatg ttgccacacc catggatttt gaatcgaagg atcctgagaa tgaagtgata 300
aagccaacta ttgaagggat gttgggcata atgaaatcgt gtgctgccgc aaagactgtc 360
agaaggcttg tattcacatc ctccgcagga actgtgaaca ttcaagaaca ccaactgcca 420
gtgtacgatg aaagctgctg gagtgatatg gaattttgcc gggctaaaaa gatgactgca 480
tggatgtact ttgtctccaa gacactggct gagcaagctg catggaagta tgccaaggaa 540
aataacattg acttcatcac tatcataccg actcttgtgg ttggcccctt cataatgtca 600
tcaatgcctc caagcctcat aactgctctt tccccgatca ctggaaacga agctcattat 660
tcaattatac ggcagggcca atttgttcac ctggatgacc tctgcaatgc tcatatttac 720
ttgtttgaga atcctaaggc agagggacgt tacatttgct cctcccacga ttgtatcatt 780
ctcgatcttg caaaaatgct tagagaaaaa taccccgagt ataatatccc cacagagttc 840
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gggtttgagt ttaaatacag cttagaggac atgtttactg gagctgtgga cacatgccgg 960
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<210> 2
<211> 1068
<212> DNA
<213> Vitis vinifera
<400> 2
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agcaatggta agtacaagag tattcttcac aggggactgg tcaacaagga gaaggtgagg 900
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gagacggtgt ctgagactga gccaccactc ttcccacctc gcaccttttc ccaacatatt 1020
cagcacaagc tcttcaggaa gacccaggag gctctactct ccaaatga 1068
<210> 3
<211> 1371
<212> DNA
<213> Vitis vinifera
<400> 3
atgtctcaaa ccaccaccaa cccccatgtg gccgtcctgg ccttcccctt ctccacccat 60
gcagcccccc tccttgccgt cgttcgccgc cttgctgccg ctgcccctca tgcagtcttc 120
tccttcttca gcaccagcca atccaacgcc tccatcttcc acgactccat gcataccatg 180
caatgtaata tcaagtccta tgatgtgtcc gacggtgtgg ctgaggggta tgtgttcgcc 240
gggcggcccc aggaggatat tgagctgttc atgagggctg cgccggagag ctttaggcag 300
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ttcatttggt ttgctgcaga tatggcagca gagatggggg tggcttggct gccgttttgg 420
actgcagggc ctaactcact ctccacccat gtttacactg atgaaatcag agaaaagatt 480
ggagtttcag gcattcaagg ccgtgaagac gagctgctca atttcattcc cggaatgtct 540
aaagtacgtt ttcgcgacct gcaggaaggc atcgtgttcg gaaacctaaa ctcgctcttc 600
tcacgcatgc tccatcggat gggccaagtg ctacctaagg cgactgcagt tttcataaac 660
tccttcgagg agctcgacga ttccctaacc aatgatctca aatccaagct caagacgtac 720
ctcaatatcg gtccatttaa cctaataacc ccaccgccgg ttatacccaa cacaaccggc 780
tgcctccaat ggctcaaaga aagaaaaccc acctcggtcg tgtacattag ctttggcacc 840
gtcacgacac cacccccagc cgagcttgta gccctagctg aggcactgga ggcaagccgg 900
gtaccgttta tatggtccct aagggacaag gcaagggtgc atttgccaga aggtttcttg 960
gagaagacca gagggtacgg aatggtggtt ccatgggctc ctcaggcgga ggtcctagca 1020
catgaggcag ttggggcttt tgtaacacat tgtggatgga actcattgtg ggaaagcgtg 1080
gccggtgggg tacccttgat ttgcaggccc ttttatgggg accaaaggct caatgggagg 1140
atggtggagg atgctttgga gattggagtg agaattgaag gtggggtttt cacagagagt 1200
gggctaatga gttgctttga tcaaattctc tcacaagaaa aagggaagaa actgagggaa 1260
aatctgggag ccctaagaga gactgcagac agggcagttg gtcctaaagg gagttctact 1320
gagaatttca aaaccctggt ggatttagtg tcaaaaccaa aggatgtcta g 1371
<210> 4
<211> 1021
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccatgggctc tcagagcgag accgtgtgcg tgacaggagc aagcggcttc atcggctcct 60
ggctggtcat gaggctgctg gagaggggat acaccgtgcg ggcaacagtg agagacccta 120
ccaacgtgaa gaaggtgaag cacctgctgg atctgccaaa ggccgagacc cacctgacac 180
tgtggaaggc cgacctggcc gatgagggca gcttcgacga ggccatcaag ggatgcaccg 240
gcgtgttcca cgtggcaaca ccaatggact ttgagagcaa ggaccctgag aacgaagtga 300
tcaagcccac catcgagggc atgctgggca tcatgaagtc ctgtgctgcc gccaagacag 360
tgcggagact ggtgtttacc agctccgccg gcacagtgaa tatccaggag caccagctgc 420
ccgtgtacga cgagtcctgc tggtctgata tggagttctg tcgggccaag aagatgaccg 480
cctggatgta cttcgtgagc aagacactgg ccgagcaggc cgcctggaag tatgccaagg 540
agaacaatat cgacttcatc accatcatcc cgacactggt ggtgggccct tttatcatgt 600
ctagcatgcc accttctctg atcaccgccc tgagcccaat cacaggcaat gaggcccact 660
attccatcat ccggcagggc cagttcgtgc acctggacga cctgtgcaac gcccacatct 720
acctgtttga gaatcctaag gccgagggca ggtatatctg ctcctctcac gactgcatca 780
tcctggatct ggccaagatg ctgcgcgaga agtaccctga gtataacatc ccaaccgagt 840
tcaagggcgt ggacgagaat ctgaagtccg tgtgctttag ctccaagaag ctgacagatc 900
tgggcttcga gtttaagtat tctctggagg acatgtttac cggcgccgtg gatacatgca 960
gagcaaaggg actgctgcca ccctcccacg agaagcctgt ggacggcaag accggcgcgc 1020
c 1021
<210> 5
<211> 1094
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctcgagatgg tgaccagcgt ggcaccacgc gtggagtccc tcagctcctc tggcatccag 60
agcatcccaa aggagtacat caggccacag gaggagctga cctccatcgg caacgtgttc 120
gaggaggaga agaaggacga gggccctcag gtgccaacaa tcgacctgaa ggacatcgag 180
tccgaggatg aggtggtgcg ggagagatgc agggaggagc tgaagaaggc cgcgatggag 240
tggggcgtga tgcacctggt gaaccacggc atctctgacg atctgatcaa tcgcgtgaag 300
gtggccggcg agaccttctt taacctgccg atggaggaga aggagaagta cgccaatgac 360
caggccagcg gcaagatcgc cggctatggc tctaagctgg ccaacaatgc cagcggccag 420
ctggagtggg aggactattt ctttcacctg atctttcccg aggacaagcg ggatatgacc 480
atctggccca agacacctag cgattacgtg cctgccacct gtgagtattc tgtgaagctg 540
agaagcctgg ccacaaagat cctgagcgtg ctgtccctgg gactgggcct ggaggagggc 600
aggctggaga aggaagtggg aggcatggag gagctgctgc tccagaagaa gatcaactac 660
tatcctaagt gcccacagcc tgagctggcc ctgggagtgg aggcacacac cgacgtgtct 720
gccctgacat tcatcctgca caacatggtg cctggcctcc agctgtttta cgagggcaag 780
tgggtgaccg ccaagtgcgt gccaaatagc atcatcatgc acatcggcga tacaatcgag 840
atcctgtcca acggcaagta taagtctatc ctgcaccgcg gcctggtgaa taaggagaag 900
gtgcggatct cctgggccgt gttctgcgag ccccctaagg agaagatcat cctgaagcca 960
ctgcccgaga ccgtgtccga gacagagcca cccctgttcc ctccaagaac cttttctcag 1020
cacatccagc acaagctgtt taggaagaca caggaggccc tgctgtctaa gtgaagtaga 1080
tgccgaccgg atcc 1094
<210> 6
<211> 1381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tcatgagcca gaccacaacc aaccctcacg tggccgtgct ggcattcccc ttttccaccc 60
acgcagcacc tctgctggca gtggtgcgga gactggctgc cgccgcccca cacgccgtgt 120
tcagcttctt ttctacaagc cagtccaacg ccagcatctt tcacgattcc atgcacacca 180
tgcagtgcaa tatcaagagc tacgacgtgt ccgatggcgt ggcagaggga tacgtgttcg 240
caggccggcc tcaggaggac atcgagctgt tcatgcgggc cgccccagag tcttttagac 300
agggcatggt catggcagtg gcagagacag gcagacccgt gagctgtctg gtggccgacg 360
ccttcatctg gtttgccgcc gatatggccg ccgagatggg agtggcatgg ctgccttttt 420
ggaccgccgg cccaaactct ctgagcacac acgtgtacac cgacgagatc agggagaaga 480
tcggcgtgtc cggcatccag ggaagggagg atgagctgct gaatttcatc cccggcatgt 540
ctaaggtgag gtttcgcgac ctccaggagg gcatcgtgtt cggcaacctg aacagcctgt 600
tttctcggat gctgcacaga atgggccagg tgctgcctaa ggccacagcc gtgttcatca 660
actcctttga ggagctggac gattctctga caaatgatct gaagagcaag ctgaagacct 720
acctgaacat cggcccattc aatctgatca ccccccctcc agtgatcccc aatacaaccg 780
gctgcctcca gtggctgaag gagaggaagc ccacatctgt ggtgtatatc agctttggca 840
ccgtgacaac cccacctcca gccgagctgg tggccctggc cgaggccctg gaggcctcca 900
gggtgccctt catctggtct ctgagggaca aggcccgcgt gcacctgcct gagggctttc 960
tggagaagac acgcggctac ggaatggtgg tgccctgggc acctcaggca gaggtgctgg 1020
cccacgaggc agtgggagcc ttcgtgaccc actgcggctg gaactctctg tgggagagcg 1080
tggcaggagg cgtgccactg atctgtcggc ccttttatgg cgaccagcgg ctgaatggca 1140
gaatggtgga ggatgccctg gagatcggcg tgagaatcga gggcggcgtg ttcacagagt 1200
ccggcctgat gtcttgtttt gatcagatcc tgagccagga gaagggcaag aagctgaggg 1260
agaacctggg cgccctgagg gagaccgccg acagggccgt gggcccaaag ggcagctcca 1320
cagagaattt caagaccctg gtggacctgg tgtccaagcc caaggacgtg tgaaggtgac 1380
c 1381
<210> 7
<211> 882
<212> DNA
<213> Apium graveolens
<400> 7
atggccacct actggggaaa acaaggacat tttgcaattt gtaaaattgc ccaggggttc 60
cttagtaaag atgcactgac tgcagtgaaa gcattgctcc cagaatatgc agatggtgat 120
ctagcagctg tttgctcctg ggctgacgag gttcgatttc atatgcgttg gagtagccca 180
ttacattatg tggacacgcc tgatttcagg tgtaactata aatactgtag agattgccat 240
gattctgttg gacggaaaga ccggtgtgtt actggagcaa ttcacaacta cacagagcaa 300
cttctattgg gtgttcatga cttgaactca aaaatgaata acaacttgac ggaggcactt 360
atgttcttat cacatttcgt tggtgatgtc catcagcctc tacatgttgg cttccttggc 420
gatgaaggag gaaacacaat caccgtccgc tggtatcgga ggaaaaccaa tttgcatcat 480
gtatgggaca caatgatgat tgaatcctcc ttgaagacat tctacaattc agatctttct 540
agcttaatac aagctattca gagcaatatt acaggtgtct ggcttaccga cagcttatct 600
tggagcaatt gcactgctga tcatgtggtt tgtccagacc cgtatgcttc tgaaagcatt 660
gagttggcct gcaagtttgc ctacagaaat gccacacctg ggaccacttt aggagatgag 720
tacttcctct ctcggttgcc tgttgcggag aagaggttgg ctcaggctgg ggtccgtttg 780
gctgctactc ttaaccgaat cttcacttca aaccccagcg atctcacaag attgaatatg 840
cataatggtg gacatagaag cagtaacaat attgaaatag tg 882
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
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<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggtcaccttt acactatttc aatattgtt 29
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ctagcagctg tttgctcctg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtaacacacc ggtctttccg 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
agtgcggaga ctggtgttta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccagtgtctt gctcacgaag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
catctggccc aagacaccta 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cacgctcagg atctttgtgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cacgattcca tgcacaccat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ccatgaccat gccctgtcta 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
cgtggttggc ttgtatggag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cccaagctgc atcatcgaaa 20

Claims (9)

1.筛选转基因植物的组合物，包括筛选载体以及筛选底物，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因以及外源基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述筛选底物选自二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇，所述植物为水稻。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述外源基因为核酸酶基因。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述筛选载体还包括其他标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
4.包含权利要求1-3所述任一组合物的宿主细胞。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于：所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中。
6.筛选转基因植物的方法，其特征在于，所述植物为水稻，包括以下步骤：
1）构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因和外源基因的载体，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示；
2）将步骤1）构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT和外源基因的愈伤组织；
3）添加DFR基因编码的酶的底物，所述底物选自二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇；
4）挑选显色的愈伤组织；
5）将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1-5天，再挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒；
6）对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复权利要求步骤3）、4），直到所有愈伤组织颗粒均全部完全显色。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述外源基因为核酸酶基因。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1）还包括其他的标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：经转基因处理后的植物愈伤组织颜色与未经处理的野生植物愈伤组织颜色，可肉眼清晰分辨。
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植物花青素生物合成相关基因的研究及应用;石少川等;《植物研究》;20111231;第31卷(第5期);参见摘要、第634页左栏、第635页右栏后两段、第636页左栏前两段、第638页最后1段以及图1 *

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