CN113234751A

CN113234751A - 基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用

Info

Publication number: CN113234751A
Application number: CN202110550307.9A
Authority: CN
Inventors: 谢致平; 史德海林·奥斯丁·巴特瑟; 王琰
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Kangtai Minsheng Biotechnology (Guangzhou) Co.,Ltd.
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-05-20
Also published as: CN113234751B

Abstract

本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，具体涉及基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用。其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件并插入到T‑DNA序列的多克隆位点。本发明构建的农杆菌转化载体能够进一步提高日本百脉根的发根转化效率，增加了获取转基因毛状根的概率，而且NopP的表达也没有影响日本百脉根与根瘤菌的正常结瘤共生，极大地提高日本百脉根发根转化的有效性与实用性。

Description

基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，涉及发根农杆菌的转化，具体涉及基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用。

背景技术

日本百脉根(Lotus japonicus)是发根转化以及植物-微生物互作研究的常用研究工具。其短暂的生活周期，可适用于各种遗传研究。早花品系生态型MG20(Kawaguchi,M.(2000)Lotus japonicus‘Miyakojima’MG-20an early-flowering accession suitablefor indoor handling.J Plant Res.113(4):507–509.)尤为适合室内实验。日本百脉根的基因组已测序完成(Li,C,Xue,D and Wang,Y,et al.(2020)A method for functionaltesting constitutive and ligand-induced interactions of lysin motif receptorproteins.Plant Methods.doi:10.1186/s13007-020-0551-4.)。因为其完整的基因组，日本百脉根也已成功运用于多种基因图谱研究中。作为一种典型的模式豆科植物，其常用于各种共生，如结瘤共生的研究中。在此情况下，发根农杆菌介导的发根转化已广泛用于日本百脉根的植物基因转移以研究基因功能。为研究结瘤共生，可利用MG20的转基因根来分析与固氮相关的宿主基因。日本百脉根的转基因根则可以接种诸如MAFF303099的百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)菌株来获取结瘤的毛状根。此外，诱导的转基因毛状根还能用来研究不同病原细菌菌株诱发的效应因子触发性免疫相关的植物防御(Sato,S,Nakamura,Y and Kaneko,T,et al.(2008)Genome structure of the legume,Lotusjaponicus.DNA Res.15(4):227-239)。

农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化是研究指定基因在植物体内功能的有效方法之一(Luo,Y,Liu,D and Jiao,S,et al.(2020)Identification of Robiniapseudoacacia target proteins responsive to Mesorhizobium amphore CCNWGS0123effector protein NopT.J Exp Bot.71(22):7347-7363.)。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的植物细胞转化能研究效应因子在整株植物中的功能。与诱导瘤状物形成的根癌农杆菌类似，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)也常用于不同宿主植物的转化，以诱导转基因毛状根的形成，所获转基因毛状根可广泛运用于各种植物生物技术。

转入带有T-DNA的二元载体的农杆菌，能在诱导的宿主植物毛状根中转化与表达特定基因。T-DNA通常含有指定基因的完整表达盒以及用于筛选转基因植物的标记基因。农杆菌介导的发根转化虽已广泛运用于植物转化，但是，受制于植物种类，该技术仍存在局限，并且转化方法也存有提升空间。对大多数植物而言，筛选合适的农杆菌，改造二元载体来提高转化效率尤为必要。而针对日本百脉根MG20的发根转化实验往往呈现出相对较低的转化效率(Kumagai,H and Kouchi,H.(2007)Gene silencing by expression of hairpinRNA in Lotus japonicus roots and root nodules.Mol Plant Microbe Interact.16(8):663-668；Díaz,C L,

M and Schlaman,R,et al.(2005)Induction of hairyroots for symbiotic gene expression studies.In Lotus japonicus Handbook,Márquez A J editor.Springer.pp.261-277；Estrada-Navarrete,G,Alvarado-Affantranger,X and Olivares,J E,et al.(2006)Agrobacterium rhizogenestransformation of the Phaseolus spp.:a tool for functional genomics.Mol PlantMicrobe Interact.19(12):1385-1393.)。由于未转化毛状根的比例较高，对实验结果的负面影响极其巨大，当务之急是改善当前日本百脉根的转化方法，利用更为高效的植物转化二元载体以及合适的发根农杆菌菌株来促进日本百脉根的转化效率。

作为广宿主菌株的中华根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234，能分泌多个III型效应因子，已鉴定的III型效应因子包括NopL，NopM，NopP和NopT等。根瘤菌通过将III型效应因子转运到宿主植物体内抑制植物免疫反应以促进其侵染并增加根瘤菌与豆科宿主之间的结瘤共生效率。

目前用于日本百脉根转化实验的发根农杆菌菌株包括A.rhizogenes LBA1334，K599和LBA9402。LBA1334被广泛用于日本百脉根的转化(Amin,A N,Hayashi,S andBartlem,D G.(2014)Robust in vitro assay system for quantitative analysis ofparasitic root-knot nematode infestation using Lotus japonicus.J BiosciBioeng.118(2):205-213.)。本发明人研究表明，携带pISV-DsRed1的LBA1334展现出较低的转化效率。而K599是因为其已用于百脉根(Lotus corniculatus)的转化(Jian,B,Hou,Wand Wu,C,et al.(2009)Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation ofSuperroot-derived Lotus corniculatus plants:a valuable tool for functionalgenomics.BMC Plant Biol.78(9):doi:10.1186/1471-2229-9-78.)。

发明内容

本发明人研究发现根瘤菌III型效应因子nopP的表达可以极大地促进了发根农杆菌介导的日本百脉根发根转化效率。

据此，本发明的目的在于提供根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在构建农杆菌转化载体中的应用。其中，农杆菌转化载体是带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，优选是发根农杆菌双元转化载体，所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达；更优选地，所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。

相应地，本发明提供基于根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因的农杆菌转化载体，其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达，优选为带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，优选是发根农杆菌双元转化载体，进一步的所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。

在具体的优选实施方式中，所述NopP的编码基因在载体中与增强型双35S启动子可操作连接。在具体实施方式中，含有荧光蛋白作为转基因植物筛选标记。

本发明还提供根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在日本百脉根(Lotusjaponicus)的毛状根的诱导和/或遗传转化中的应用。优选地，采用农杆菌介导法进行。更优选地，采用含有如上述的农杆菌转化载体的农杆菌(优选采用发根农杆菌双元转化载体，)转化日本百脉根，优选地所述农杆菌转化载体中含有预期转入植株的目标基因。最优选地，所述农杆菌为发根农杆菌双元转化载体，优选为Agrobacterium rhizogenesLBA9402、K599。在具体实施方式中，是将日本百脉根的幼苗切除根的伤口处涂抹所述农杆菌的新鲜菌落进行侵染。侵染后的幼苗在固体培养基中共培养进行毛状根的诱导和/或遗传转化操作。

本发明通过研究结果表明，使用携带nopP的农杆菌双元转化载体转化LBA1334和K599的菌株在同等实验条件下进行日本百脉根的发根转化，二者的转化效率进一步提升了8％。该结果说明nopP的表达极大地促进了发根农杆菌介导的日本百脉根发根转化效率。对于农杆菌LBA9402，当NGR234的nopP共表达时，诱导日本百脉根的转基因根的比例显著提高。

此外，本发明人还研究表明，携带pISV-DsRed1的K599所诱导的转基因根数量与LBA1334的结果相同，且比此前报道的携带其他二元载体的K599的结果要高的多(Stiller,J,Martirani,L and Tuppale,S,et al.(1997)High frequency transformation andregeneration of transgenic plants in the model legume Lotus japonicus.J ExpBot.312(48):1357-1365)。因而，本发明发根农杆菌菌株的筛选对于诱导特定植物的转基因毛状根尤为重要，从三个不同的发根农杆菌菌株LBA1334，K599和LBA9402中筛选得到了最合适的载体，其中LBA9402能够诱导大量的转基因毛状根。

综上所述，本发明提供了一种实验操作简单、快速、转化率高的发根农杆菌介导的日本百脉根转化系统，创新性地引入了根瘤菌III型效应因子NopP以进一步提高发根转化效率，增加了获取转基因毛状根的概率。NopP抑制宿主植物防御系统的生理特点使得其能在一定程度上克服发根农杆菌的宿主特异性限制，并且其表达也没有影响日本百脉根与MAFF303099的正常结瘤共生，极大地提高了发根转化的有效性与实用性，对模式豆科植物日本百脉根的共生机理研究起到了积极正面的促进作用。

附图说明

图1双元载体pISV-DsRed1 T-DNA结构示意图。

图2双元载体pISV-DsRed1-nopP中nopP基因插入位点结构示意图。

图3转化步骤过程概述。A.切除5天大小的日本百脉根MG20幼苗的根。箭头示意处为下胚轴切除点。B.幼苗与发根农杆菌共培养30min。C.转移幼苗至含有1/2浓度的Gamborg’s B5无机盐维生素培养基琼脂板。D.在放置了幼苗的琼脂表面覆盖灭菌滤纸，再用封口膜封闭平板。E.每周转移植物到新琼脂板并用新的滤纸覆盖。F.荧光显微镜镜检分析(28dpi)：选择至少具有一条红色荧光根(箭头处)的植物移栽到塑料盒中并接种百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099。G.4周后收获的植物长出了根瘤(箭头处)。H.荧光显微镜镜检分析根和根瘤(箭头处)。图中所示为一条红色荧光根上的两个根瘤。比例尺：1mm(A)，1cm(B)，2cm(C-E)，500μm(F)，2cm(G)和500μm(H)。

图4携带pISV-DsRed1的发根农杆菌的日本百脉根转化结果。表达红色荧光的根(箭头处)即为转化根。

图5pISV-DsRed1-nopP转化的日本百脉根荧光根(箭头处)鉴定及nopP基因表达水平的qRT-PCR检测。

图6日本百脉根的毛状根中表达nopP的结瘤结果。其中，携带对照载体pISV-DsRed1和pISV-DsRed1-nopP的发根农杆菌进行诱导发根。图中数据表示平均值±标准误差。柱顶不同字母表示对照组(C)和表达nopP的植物之间的统计学显著性差异(Duncan’sMultiple Range test，P<0.05)。A.挑选出至少含有一条红色荧光根的植物(28dpi)的转化效率(红色荧光根的百分比)。然后将挑选出的植物(对照组C，n＝15；nopP，n＝18)移栽到培养盒中并接种百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099。B.28dpi时，在明场(BF)和红色荧光视野(RF)下对长出的根瘤进行显微镜分析，箭头指示了检测到红色荧光信号的转基因根瘤。比例尺500μm。C.收获时每株植物的总根瘤数和红色荧光根瘤。D.收获时根系(根和根瘤的干重)的生物量。

具体实施方式

本发明的目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1转化载体的构建

本实验转化用到的载体pISV-DsRed1 T-DNA结构如图1所示，载体的构建方法采用标准的酶切连接方式。所有的载体均含有菇珊瑚Discosoma sp.中编码红色荧光蛋白的基因DsRed1作为转基因植物筛选标记(Chen et al.,2009)。先使用PCR从pX-DR扩增DsRed1连入中间载体pRT104，用HindIII切下来，带上了一个35S启动子，再克隆到pISV2678载体中，获得pISV-DsRed1。其中，载体T-DNA区域中所含的bar基因表达盒可在其他植物转化实验中使用除草剂Basta挑选转基因植物。

DsRed1基因PCR反应体系：

正向引物1：GCTCTAGAACAATGGCCTCCTCCGAGAACGTC

反向引物1：CCCTCGAGTCACAGGAACAGGTGGTGGCG

PCR反应程序设置：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个热循环；72℃延伸5min。

利用pISV-DsRed1本身的MCS多克隆位点，将nopP基因连接进去，受增强型双CaMV35S控制表达。具体是从根瘤菌NGR234基因组中克隆nopP基因(GenBank登录号U00090.2)并连接到T-DNA序列的多克隆位点(multiple cloning site，MCS)中，完成双元载体pISV-DsRed1-nopP的构建。构建方法示意图如图2所示。

nopP基因PCR反应体系：

正向引物2：GCATCGATGATGTACGGTCGAATTGATAGC，

反向引物2：CGGAATTCGTCACATGAGTCATCTTCGTA。

最终构建的双元载体pISV-DsRed1和pISV-DsRed1-nopP的用于日本百脉根的遗传转化研究。

其中，NopP(NCBI登录号U00090)基因序列如下(SEQ ID NO.1)：

对应蛋白质的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

MYGRIDSSSDFHYTQSASKQMDAETQEFADTFARMHLDRSNGGSSSAARYTLDHEPPVVPIDLETFRREIRKFHGKEITDIANNPQEYSDFVSAKARRTADVAQQYGIRRDSENARYFSYQLGNQCVGLMRTEGGFSMEEEFESKSWRDQFPGHQEITSTVDLQVAHPLVENAGDILLEHQLRRDGERPLLNWRAENPEAKARAAMMGFVEVDDCDMVLDPKQHPDKWTQTSAAEWRRKDKPPLYLRKFEDAETAQCSTSCSYETYEDDFM。

实施例二使用携带pISV-DsRed1的农杆菌LBA1334，K599和LBA1334进行日本百脉根转化

实验中施用的日本百脉根为(Regel)Larsen生态型MG20(Miyakojima MG20；Kawaguchi，2000)种子。具体方法包括以下步骤。

1、种子的表面消毒与萌发：用浓硫酸浸泡日本百脉根(Regel)Larsen生态型MG20(Miyakojima MG20；Kawaguchi，2000)种子10 min随后用无菌水清洗至少5次。然后用70％的酒精处理2 min再转入稀释10倍的市售漂白水(～0.35％活性氯，中国广州浪奇)中。10分钟内，每隔2分钟用涡旋混合器上摇匀种子。无菌水清洗5次，表面除菌的种子最终用无菌水重悬并置于4℃孵育过夜。然后将种子铺在1.0％的水琼脂平板上(每板约50粒种子，平板直径15cm)，以大约80o的角度斜放在温控植物房(24±2℃)的暗箱中。3天后，种子萌发的平板暴露在光照/黑暗条件下(16 h光照；光强度2000 lux；飞利浦Lifemax TL-D 36W/54-765和TL-D36W/29-530日光灯灯管比例为3:1)。再次孵育4天后，挑选绿色的，子叶打开的幼苗用于发根转化(约占到萌发幼苗的80％；发芽率超过50％)。

2、农杆菌的制备：为将二元载体转入发根农杆菌中，将0.5μg载体DNA加入到100μL预冷的无菌0.2cm电击杯中。电击仪(中国广东鼎国)设置为1500 V和10 ms。电击后，随即向电击杯中加入1mLYMB液体培养基(室温)。将菌体转移到1.5 mL离心管，混匀后置于摇床(200rpm，27℃)。孵育3h后，取100μL菌悬液涂布在含有100mg·L^-1卡那霉素的YMB琼脂平板上。平板在27℃下培养两到三天，使用长出的菌落进行伤口侵染与转化。

3、发根农杆菌介导的日本百脉根植物转化：日本百脉根生态型MG20的转化使用携带了pISV-DsRed1的发根农杆菌。所有步骤均在无菌条件下进行。细菌培养于含有卡那霉素(100mg·L^-1)和利福平(25mg·L^-1)的1.5％(w/v)的YMB琼脂培养基。27℃培养60h后，菌株将用于侵染子叶展开的萌发幼苗。用手术刀切除幼苗的根。然后将伤口完全浸没在发根农杆菌菌落中。黑暗环境下室温孵育30min，将接种后的幼苗放置在下述方法准备的琼脂平板上：用含有0.9％(w/v)技术琼脂(中国广州HSK)的1/2Gamborg’s B5无机盐维生素培养基(Sigma-Aldrich)填满圆形培养皿(直径15cm)，额外加入200μM乙酰丁香酮(中国广州HSK)。放置了幼苗的琼脂随后用同样大小的滤纸(中国杭州Whatman)覆盖以固定幼苗并减少冷凝水的产生。每个培养皿含有成排放置的10棵幼苗(位于平板中间)。使用封口膜封住平板，并用手术刀戳出小洞以保障空气交换，并以约80°斜放在黑暗环境中孵育(23±2℃)。所有平板均用锡箔纸半遮蔽以保护根系避免光照。

随后数天，将放置幼苗的平板转移到植物房中，在上面提到的光照/黑暗条件下继续孵育(24±2℃，约80°倾斜放置)。平板置于黑暗的无盖塑料盒中(尺寸为30×12×5cm)以防根系受到光照影响。每隔7天，将幼苗转移到新配的琼脂平板中。农杆菌接种28天后对长出的毛状根进行分析。转化步骤如图3所示，具体步骤是：A.切除5天大小的日本百脉根MG20幼苗的根。箭头示意处为下胚轴切除点。B.幼苗与发根农杆菌共培养30min。C.转移幼苗至含有1/2浓度的Gamborg’s B5无机盐维生素培养基琼脂板。D.在放置了幼苗的琼脂表面覆盖灭菌滤纸，再用封口膜封闭平板。E.每周转移植物到新琼脂板并用新的滤纸覆盖。F.荧光显微镜镜检分析(28dpi)：选择至少具有一条红色荧光根的植物移栽到塑料盒中并接种百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099。G.4周后收获的植物长出了根瘤(箭头处)。H.荧光显微镜镜检分析根和根瘤。图中所示为一条红色荧光根上的两个根瘤。比例尺：1mm(A)，1cm(B)，2cm(C-E)，500μm(F)，2cm(G)和500μm(H)。

4、转化发根的鉴定

A.转化发根的RFP表达鉴定：通过荧光显微镜观察发根的RFP表达效果，确定发根为转基因阳性。具体如图4所示。而未转化的自然根作为阴性对照，无红色荧光。统计带有红色荧光的毛状根。

B.使用qRT-PCR鉴定nopP的表达：使用实时定量PCR(qRT-PCR)对转化根(28dpi)中效应因子基因的表达进行分析。按照RNA提取试剂盒(日本东京Takara)的说明书提取总mRNA(每个处理3份mRNA)，并用不含RNA酶的DNA酶(日本东京Takara)进行处理。单链cDNA的合成采用了HiScript II Q RT SuperMix的反转录试剂盒(中国南京Vazyme)。在LightCycler 480System(德国曼海姆Roche Diagnostics)使用

480SYBRGreen I Master Mix进行反应(反应设置3个重复)。日本百脉根组成型表达的泛素化基因(GenBank:DQ249171)的引物作为参考以对转录子丰度进行标准化矫正。每个PCR反应包含5μL的cDNA模板(500ng)，10μM的上下引物，2μL的SYBR Green I Master Mix至总体积10μL。热循环条件如下：(1)预变性，95℃ 2min；(2)30个循环，95℃ 30s，60℃ 20s，72℃ 20s；(3)溶解曲线，95℃30s，60℃ 20s，(4)72℃ 5min。使用Roche LightCycler 480软件计算阈值循环(C_T值)。根据制造商的建议，将C_T检测极限值定义为0.1阈值。基因相对表达水平采用2^-ΔΔCt方法进行计算(Livak and Schmittgen，2001)。

在20dpi时，每株植物长出了2-8条长1-4cm毛状根。统计毛状根总数，红色荧光根以及无红色荧光根。农杆菌处理28天后，收获所有的幼苗进行深入的分析。在接种了LBA9402(携带pISV-DsRed1)的植物中观测到了最大量的毛状根。通过荧光显微镜观测到表达了DsRed1的毛状根。在没有表达DsRed1的根中，背景自发荧光几乎可忽略不计。具有至少一条红色荧光根的植物认定为转基因植物，转化率以转基因植物中红色荧光根(图4)。在LBA9402(携带pISV-DsRed1)处理的转化中，46％的侵染植物被检测到带有红色荧光的转基因毛状根。与K599的转化率(37％)较为接近，LBA1334的转化率(36％)也低于LBA9402处理组。因此，与其它菌株相比，LBA9402(携带pISV-DsRed1)在诱导红色荧光根上更为高效。以上结果如表1所示。基于这些结果，LBA9402更适合用于发根转化，后续对其进一步优化。

表1携带pISV-DsRed1的发根农杆菌的日本百脉根转化结果

实施例三nopP基因的载体pISV-DsRed1-nopP转化到LBA9402

参照实施例二所述的转化方法，将含有nopP基因的载体pISV-DsRed1-nopP转化到LBA9402中，并最终用于发根转化。

1)在第28dpi进行显微镜分析检测红色荧光根。为检测效应基因的表达，从呈现红色荧光的根中提取总RNA。通过qRT-PCR检测到了nopP的转录，结果如图5所示，证实效应因子基因能与DsRed1共表达。

2)用pISV-DsRed1处理的对照组与含有效应因子基因的二元载体转化的植物进行转化频率比对。每个二元载体处理50棵植物进行检测。在携带pISV-DsRed1的LBA9402处理组的植物中，22棵植物长出了转基因根(红色荧光根)，占到了植物总数的44％，。统计转基因植物中红色荧光根的百分比可知，携带pISV-DsRed1的LBA9402处理获得的转基因植物中，转基因根的频率最高，为48％，转基因植物中的红色荧光根占毛状根总数的33％。pISV-DsRed1-nopP处理组中58％的植株长出了至少一条红色荧光根，其转化效率(以红色荧光根百分比计)为64％，较pISV-DsRed1呈现显著性的提升。在pISV-DsRed1-nopP处理下64％的毛状根检测出红色荧光，结果见表2。因此，植物内nopP的表达提高了红色荧光植物的比例，较对照组提高了14％；并且其转化效率是对照组转化效率的1.9倍。

表2使用发根农杆菌LBA9402的日本百脉根转化结果

表3的结果为另一组发根转化实验，该实验中发根农杆菌LBA1334和K599也被用于检测nopP在发根转化中的作用。使用携带pISV-DsRed1-nopP的LBA1334和K599的菌株在同等实验条件下进行日本百脉根的发根转化。同表1的结果相比，携带pISV-DsRed1-nopP的LBA1334和K599在转化效率上提升了8％。

表3携带pISV-DsRed1-nopP的发根农杆菌的日本百脉根转化结果

实施例四nopP的表达不会影响日本百脉根与根瘤菌MAFF303099的结瘤共生

使用携带pISV-DsRed1或pISV-DsRed1-nopP的LBA9402对日本百脉根进行转化，随后对形成的毛状根接种百脉根中慢生根瘤菌MAFF303099。与此前的实验类似(表2)，同pISV-DsRed1相比，28dpi时pISV-DsRed1-nopP处理组呈现出更高比例的红色荧光根，超过了70％，而pISV-DsRed1处理组则不足40％(表4)。从中挑选出转基因植物(具有至少一条红色荧光根，幼苗数量为分别为15棵和18棵，见表4)随后移栽到装有蛭石和陶粒的塑料培养盒。之后对植物接种中慢生根瘤菌MAFF303099并在28天后对结瘤状况进行分析，结果如图6所示。大部分根瘤呈现出红色荧光。pISV-DsRed1和pISV-DsRed1-nopP诱导的毛状根在每株植物的结瘤数量上并无二致。因为更高的毛状根转化效率，相比于pISV-DsRed1，pISV-DsRed1-nopP转化的植物中具有更多的红色荧光瘤。但是，这个差异不具备统计学上显著性。此外，两个二元载体处理组的结瘤根在生物量上十分接近。这些结果表明，在同样的实验条件下，不同二元载体处理后的转基因植物在结瘤数量以及根系生物量(根及根瘤干重)上并无显著性差异(表5)。

表4日本百脉根转化结果

表5转基因日本百脉根结瘤实验结果(接种MAFF303099)

因此可知，宿主根中表达nopP并未显著影响日本百脉根与MAFF303099的结瘤。

序列表

<110> 中山大学

<120> 基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> Sinorhizobium fredii

<400> 1

tcacatgaag tcatcttcgt aagtctcgta agagcagctg gttgaacact gtgcggtttc 60

ggcatcctca aatttgcgga gatagagcgg cggtttgtct ttacgccgcc attcagcggc 120

actggtctgc gtccatttgt cgggatgctg tttggggtca aggaccatgt cgcaatcatc 180

cacttcaaca aaccccatca tcgctgcacg ggctttcgcc tctgggtttt ccgcgcgcca 240

gttcagcaac ggtcgttcgc cgtccctccg aagttggtgc tcgagcagaa tatcgcctgc 300

attctcaacg agaggatggg cgacttgaag atccacggtg gaggtaatct cttggtgacc 360

aggaaattgg tctctccaac ttttggattc gaactcttct tccatgctga acccaccttc 420

cgttctcatc agtccaacac actggtttcc caactggtaa ctgaaatatc gagcgttctc 480

agaatcccga cgaatgccgt attgctgagc aacgtccgca gtgcgtctgg cttttgcgga 540

cacgaagtct gaatattcct gtggattgtt ggcgatgtca gtgatttctt tgccatgaaa 600

tttcctgatc tccctcctga aagtctcgag atcaatcggc accaccggag gttcgtgatc 660

gagggtatat ctggccgccg acgatgaacc gccgttggac ctgtctaagt gcattcgggc 720

aaacgtgtcc gcgaactctt gggtttctgc atccatttgc ttgctggcac tctgcgtgta 780

atggaaatcg gacgagctat caattcgacc gtacat 816

<210> 2

<211> 271

<212> PRT

<213> Sinorhizobium fredii

<400> 2

Met Tyr Gly Arg Ile Asp Ser Ser Ser Asp Phe His Tyr Thr Gln Ser

1 5 10 15

Ala Ser Lys Gln Met Asp Ala Glu Thr Gln Glu Phe Ala Asp Thr Phe

20 25 30

Ala Arg Met His Leu Asp Arg Ser Asn Gly Gly Ser Ser Ser Ala Ala

35 40 45

Arg Tyr Thr Leu Asp His Glu Pro Pro Val Val Pro Ile Asp Leu Glu

50 55 60

Thr Phe Arg Arg Glu Ile Arg Lys Phe His Gly Lys Glu Ile Thr Asp

65 70 75 80

Ile Ala Asn Asn Pro Gln Glu Tyr Ser Asp Phe Val Ser Ala Lys Ala

85 90 95

Arg Arg Thr Ala Asp Val Ala Gln Gln Tyr Gly Ile Arg Arg Asp Ser

100 105 110

Glu Asn Ala Arg Tyr Phe Ser Tyr Gln Leu Gly Asn Gln Cys Val Gly

115 120 125

Leu Met Arg Thr Glu Gly Gly Phe Ser Met Glu Glu Glu Phe Glu Ser

130 135 140

Lys Ser Trp Arg Asp Gln Phe Pro Gly His Gln Glu Ile Thr Ser Thr

145 150 155 160

Val Asp Leu Gln Val Ala His Pro Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Ile

165 170 175

Leu Leu Glu His Gln Leu Arg Arg Asp Gly Glu Arg Pro Leu Leu Asn

180 185 190

Trp Arg Ala Glu Asn Pro Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ala Met Met Gly

195 200 205

Phe Val Glu Val Asp Asp Cys Asp Met Val Leu Asp Pro Lys Gln His

210 215 220

Pro Asp Lys Trp Thr Gln Thr Ser Ala Ala Glu Trp Arg Arg Lys Asp

225 230 235 240

Lys Pro Pro Leu Tyr Leu Arg Lys Phe Glu Asp Ala Glu Thr Ala Gln

245 250 255

Cys Ser Thr Ser Cys Ser Tyr Glu Thr Tyr Glu Asp Asp Phe Met

260 265 270

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gctctagaac aatggcctcc tccgagaacg tc 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccctcgagtc acaggaacag gtggtggcg 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcatcgatga tgtacggtcg aattgatagc 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cggaattcgt cacatgagtc atcttcgta 29

Claims

1.根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在构建农杆菌转化载体中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，农杆菌转化载体是带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达；更优选地所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。

3.一种基于根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因的农杆菌转化载体，其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达，优选为带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，更具体为发根农杆菌双元转化载体，进一步的所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。

4.如权利要求1所述的农杆菌转化载体，其特征在于，所述NopP的编码基因在载体中与增强型双35S启动子可操作连接。

5.如权利要求3或4所述的农杆菌转化载体，其特征在于，含有荧光蛋白作为转基因植物筛选标记。

6.根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在日本百脉根(Lotus japonicus)毛状根的诱导和/或遗传转化中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，采用农杆菌侵染法进行，优选是发根农杆菌。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，采用含有如权利要求4或5所述的农杆菌转化载体的农杆菌转化日本百脉根，优选地所述农杆菌转化载体中含有预期转入植株的目标基因。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为Agrobacteriumrhizogenes LBA9402、K599。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，是将日本百脉根的幼苗切除根的伤口涂抹所述农杆菌的菌液并共培养以进行毛状根的诱导和/或遗传转化操作。