CN115161251B

CN115161251B - 一种根瘤菌hh103的多基因突变体及应用

Info

Publication number: CN115161251B
Application number: CN202210517898.4A
Authority: CN
Inventors: 辛大伟; 陈庆山; 刘春燕; 齐照明; 胡振帮; 杨明亮; 邹佳男; 赵莹
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN115161251A

Abstract

本发明提供了一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用，属于农用微生物技术领域。为了在降低人工成本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。本发明提供了一种根瘤菌HH103的多基因突变体，其特征在于，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。经过数次实验和不同群体的验证表明NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变获得的突变体能减少大豆的根瘤的数量，为后续研究大豆‑根瘤菌共生体系形成提供了基础，为提高大豆与根瘤菌的共生效率提供了可能性。

Description

一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用

技术领域

本发明属于农用微生物领域，具体涉及一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用。

背景技术

氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。

豆科植物与根瘤菌的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的Ⅲ型泌出系统分泌的Ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是Ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。

大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。

发明内容

本发明的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。

本发明提供一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的多基因突变体，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。

进一步地限定，所述NopT基因的序列如SEQ ID NO.15所示；所述NopC基因的序列如SEQ ID NO.16所示；所述NopL基因的序列如SEQ ID NO.17所示。。

进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopT基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。

进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因和NopC基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的基多因突变体。

进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将NopL基因和NopT基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。

进一步地限定，三个基因进行突变或者沉默获得突变体的方法：将NopL基因、NopC基因和NopT基因与pJQ200SK载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌HH103中得到根瘤菌HH103的多基因突变体。

本发明提供一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是上述的根瘤菌HH103的多基因突变体。

本发明提供上述试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，将上述的试剂接种野生型大豆幼苗；所述大豆品种为Charleston、东农594、绥农14、ZYD00006、Nattosan、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、黑农44、黑农35或北丰11。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含上述的多基因突变体的菌液，接菌数量为大于2×105个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

本发明提供上述的多基因突变体在大豆育种中的应用。

有益效果：结瘤鉴定结果显示，两个单突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC在的结瘤数目均有不同程度的减少，其中HH103ΩNopC与野生型HH103相比减少结果最为显著；单基因突变体HH103ΩNopL结瘤数目略有增加，但其显著性最小，说明NopL在CSSL亲本绥农14中对共生结瘤的影响很小；双基因突变体HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT结瘤数目显著性减少，但是与单基因突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC相比结瘤数目略有上调；三基因突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL结瘤数目同样减少，而且其减少结果最为显著。为了减少单一大豆品种对结果产生的片面性，将双基因突变体与三基因突变体接种30份种植资源，除了个别品种以外，其他结果均与绥农14保持一致。

附图说明

图1为NopT上、下游片段，Cm片段和NopT-Cm大片段扩增，其中，M1：Trans 2K PlusDNA marker；M2：Trans 2K PlusⅡDNA marker；1：NopT上游片段(1020bp)；2：NopT下游片段(1000bp)；3：Cm片段(1010bp)；4、5：NopT-Cm大片段(3030bp)。

图2为NopT-Cm-pJQ200SK菌液PCR结果图，其中，M：Trans 2K Plus DNA marker；1：插入pJQ200SK的NopT-Cm大片段(3030bp)。

图3为突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的PCR鉴定，其中，M：Trans 2K Plus DNAmarker；图A：引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X进行第一轮鉴定；图B：引物NopT-S-F-X、Cm-R进行第二轮验证，图C：引物Cm-F、Cm-R进行第三轮PCR验证，其中10泳道为HH103ΩNopTΩNopCΩNopL突变体。

图4为突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的Southern鉴定，其中，M:DL 15000DNALadder；1:HH103(Xho I)；2:HH103ΩNopTΩNopCΩNopL(Xho I)。

图5为HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT的PCR鉴定结果图，其中，M：Trans 2K PlusDNA marker；1、2、3：HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。

图6为绥农14接种9种根瘤菌的表型结果图，其中，1：HH103；2：HH103ΩNopTΩNopCΩNopL；3：HH103ΩNopLΩNopT；4：HH103ΩNopLΩNopC；5：HH103ΩNopT；6：HH103ΩNopC；7：HH103ΩNopL；8：HH103ΩTtsI；9：HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。

图7为绥农14接种9种根瘤菌的数目结果图，柱状图上标有不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

图8为绥农14接种9种根瘤菌的干重结果图。

图9为30份种植资源接种5种根瘤菌的结瘤表型结果图，其中，1：HH103ΩNopTΩNopCΩNopL；2：HH103ΩNopLΩNopT；3：HH103ΩNopLΩNopC；4：HH103ΩTtsI；5：HH103。

图10为30份种植资源接种5种根瘤菌的结瘤数目结果图。

图11为pSoy10空载体的载体图。

图12为Fu28空载体的载体图。

图13为突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的PCR鉴定，注：M：Trans 2K Plus DNAmarker；图A：引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X进行第一轮鉴定；图B：引物NopT-S-F-X、Cm-R进行第二轮验证，图C：引物Cm-F、Cm-R进行第三轮PCR验证，其中10泳道为HH103ΩNopTΩNopCΩNopL突变体。

图14为pUC57-Flag载体图。

具体实施方式

HH103ΩTtsI(效应因子不表达突变体)记载在田博宇,孙志君,刘函西,等.根瘤菌TtsI突变体构建及结瘤表型鉴定[J].中国油料作物学报,2020,v.42；No.179(01):21-28.

pEASY-T1载体，Helper(Km)载体，pFAJ1702(Tet)载体和pGWC载体均为商业购买，商业购买。

pJQ200SK载体(Gm)记载在Quandt,J.,&Hynes,M.F.(1993).Versatile suicidevectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negativebacteria.Gene,127(1),15–21.doi:10.1016/0378-1119(93)90611-6文献中。

全基因组导入系群体(Chromosome Segments Substitution Lines，CSSL)记载在文章_陈庆山，“作物回交导入系的构建与应用”。

重组自交系群体(Recombinant Inbred Lines，RIL)记载在[1]王宏林.大豆重组自交系群体的构建,鉴定及其主要农艺性状QTL定位的研究[D].南京农业大学,2001.

SN14、野生豆ZYD00006绥农14、Charleston、东农594、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、Nattosan、黑农44、黑农35和北丰11均是黑龙江常见的品种，来自东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室。

快生型费氏中华根瘤菌HH103(源于西班牙塞维利亚大学Francisco Javier López-Baena实验室，记载在Weidner S,Becker A,Bonilla I,et al.Genome Sequence ofthe Soybean Symbiont Sinorhizobium fredii HH103[J].Journal of Bacteriology,2012,194(6):1617.)

2×TY液体培养基：胰蛋白胨(bacto-tryptone)16g、酵母提取物(bacto-yeastextract)10g、NaCl 5g、水1000mL,pH7.2，121℃灭菌30min.

pSOY1(spec)Fu系列载体包括Fu28由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠；植物表达载体pSoy10由傅永福研究员(中国农业科学院作物科学研究所)惠赠。

下述在途来自于文章Lu M,Cheng Z,Zhang X M,et al.Spatial Divergence ofPHR-PHT1 Modules Maintains Phosphorus Homeostasis in Soybean Nodules[J].PlantPhysiology,2020.文章的编号在论文中的参考文献中都有对应。

载体骨架记载网站：TAIR-Home Page(arabidopsis.org)

BioVector,a flexible system for gene specific-expression in plants文章记载所有设计Fu载体的文献的都用这个。文章中有详细的描述。

pUC57-Flag是将pUC57载体上连接Flag序列，在的碱基的序列如：SEQ ID NO.18所示。载体图如图14所示。

实施例1.构建重组载体

1.NopT基因大片段与Cm基因片段的克隆

(1)在NCBI下载HH103全基因组序列(NCBI ID号为txid1117943)、NopT编码序atggaggccctagtacccggatcgcaaaggcacgcctcagccgctgttcggcagaaggagtacgagaatctgaaggttcacctacgaagacaaggagcaggaccttctgaggccgacttcgcggcgcaaaacactatgttgcagaaagcaggccttgctccatccggaaaggagaaagtatacaaagtcggcgagcctaacttctcgcgcatgctgaccaagattacagccgacggatccaaccatttgctcagcttgtatttcgctgagggcggcgcacacaccgttgcgacctcggcaatggatggaaacaccacgctcttcgatcctaatttcggcgaatttactgtgcaatcagatcagattgatgatttgttccgaagcctagccaatcgctacagcaatccaaaccggcagcattttacaacggtgaccacccaaaaggtgacatga(SEQ IDNO.15)

NopC编码序列:atgg tcggagtgat tggaagtgga gttggctcca tcggcgtttccctggcccgc aaaggggggc atggacattc gactggacag ccgccgcgcg attcaggcgg gccctctggtcacaacaggc cggatcgcgg gagcggcgtt acggatggcc cgaccatttc tggggatcgc tcgcaggctgcaattcaaag cgaagccttc gaactagctc ttcgatcggt tgcgctgcaa cttatgaacg atgccatggctgatgccgac gaagctatgg cagaaactga agaggatgcc tga(SEQ ID NO.16)。

NopL编码序列：atggatatca attcaacccg cccactaaac gcaagcccac agcccgactctccaccacccgccaacgaga gtgcatttgc gcatcagctg agcggatttc aatatagccctccacatgccgctgactcac tattgccgca ggttgaagcc gattccccat atttggacaccgggcatccctactcgcagt atttggattc ggcatatcct tatccatcac cttgtgaatggcagcatgacctgtatacca ggactaggga aaggtctccc catcctagcg agcagcgaccgcatgctcgggtgctacagg acgcgcccga acacgaccag gatcagcacg tggaagccgcgggaccgcgagctggatcat ggcaagtggg gccatcacga tctggaccgt cgcaagccgggccatcctcgtccgccaccc cactgaacgc aagcccaccg ccacatgcca ccgacttagaaaccgagcatccctactcgc agtatttgga ttgggcgaat ccgtcattgc ttgattggcagcatgacctgcatacgcggg ctacagcttc tcccgcgcca ctgaccgctg agaggggaaagtctccccagcctagcgagc agcaaccgca tgctcgcgcg ctgcaggtgc ccgaatacgatcaggatttgatatggcagc gcgtggatgc cgcggggccg caagctggac cgtggcaggtggggccatcacactctggac cgtcgcaagc ccggccatcg cacgcttggc cgtcctcgtccgcaggggccgagccgactg aactttctga tttcgttatg gatagcggcg ttcgtgcgtgggaccactggttcttagctc ctcacatggc ctcagaagac cagatgagca tgctaagagccacggggctaatgccaaccg cagaggtccc gacaacaacg tttttgatga tgggcatgccgcacgttgccgaattccgag gcgagggagt tattcgcatc aggccatcgc tggattttga catttga(SEQID NO.17)。

设计扩增NopT突变大片段序列(序列如SEQ ID NO.1所示，ccaggctgagtggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggat gcggggcctg caagcgagga tcgatctcgagcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacgacgccgggcaa tggcgcgggc cgcgccgacccatgcgttcg atcacggtcg ccattggcag cagggcccgg cgtacccggt acgtagcact gattgtttttgcgatcgttg accctggtct gtcgttgaag ctgtctcgat ggctgcccgc agcgcagcgc gctgtccatgtcggttgggc ttcgactttc aaatagcgca gcaggtgtgc gatgtgatcg cggcgagtttcctcacggcgagggtaaaag gcaatagcct gtgatctgcg tcgatatatg ttcggaagga gtgcccggccgggatagccc accaggcaca gttgcaccgc aaaaccaagc tggttgcgcc tgcgaagctt gatttccagccgatcagccg gcgacaggga ataatggcgg atcaagctgt cttcatcggc tggaatgtcg aaaagtcctgttgcgcaagt cagatggaga accttgcatg accgcgaatgtgggcgcgag gaatgtcgga accgattgtcctgccagttg gattgcggcg gcatcagcatcgaaccgccg aggccaatgc gctggatacc tccatgtacctctaccgatc cagtgtcgggcgaaatcggc tcggcggagt tctcctccga taagctgagc tgcagatggccaactgctgctcaaacccac ctggtccacc ggcgcgtcgt ccgattcctg cctcgcacgcagcagctgttgctgctcagc gtaccaaaga tcccacctct tcagcacaag catcgacgaggatttacgtggacttcagtg aacactacgc cgcgcaggac gcccgactca tgtcacctttagggcttgtgatgtactgga gagcacgcac gtgcgggtga gcacccgaga ttgcgctgcctgcggctata gctggggtgccgttgcacaa gccgagaatt cagatcgccg cgaatgtgaccccacttgaa ttcgctcatg agcctgcctcaatgcatccg cggacggatt gccaatcata tctgcgtggc cggtgtctga ctgtccactc tgcctccaacctgtacgagt ttcttaatcg aatttcgcga gaatggaaaa atcgagcttt tgcatagcta tcatccataccgtggatggacatgtaacat gctcaatcag tcgggcttgg gcataaggtg ttcgtctata gcccccgtcgcgagtcgaac gtgaacgcct ggaaggaagc ctcccgcgag cttacgaacg tgtgcttgttgctggtcgctatcaccaaag gcgatacctc cccttctcca ccattccctc aagaccgggcttgatctgca gcagccggtgtcagcgactt tccggtctat agtcccgatc gcatcttcatcggcgtcatt ggcagcctgc aggggccaaaaaatcgcggc gaggaacagt cacagcgcct tagatgtttc tatgcgagcg ttcatatggc gctgcattttgcggttgctg acctgcgagagcaggcggcc gattggcttg atgagcatcg tcaccgcgtc atcagtgagcttctggcggagtttgatgcc tgcgttatga ttgtcgcgta ccgacggctg gcgttgaagtcaccagcgagccaggctgag tggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggatgcggggcctgcaagcgagga tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctgcctaccacgacgccgggcaa tggcgcgggc cgcgccgacc catgcgttcg atcacggtcg ccattggcag)的引物(分为起始密码子上游1020bp和下游1000bp两个大片段设计引物，如表1所示)；

根据pGWC入门载体设计Cm大片段引物，三对引物分别利用Overlap PCR原理设计，如表1所示，使其引物含有20bp左右的序列重复；

表1 NopT-S，NopT-A突变片段-LF引物序列

(2)用细菌基因组DNA提取试剂盒获取快生型费氏中华根瘤菌HH103全基因组为模板；引物NopT-S-F，NopT-S-R扩增NopT上游基因，引物NopT-A-F，NopT-A-R扩增NopT下游基因，引物Cm-F，Cm-R扩增Cm基因。

NopT上游基因反应体系(100μL)如下：模板DNA，2μg；5×PS Buffer，20μL；dNTP，8μL；NopT-S-F，2μL；NopT-S-R，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH₂O，up to 100μL。

NopT上游基因PCR反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，48s；72℃，10min；4℃，Pause。

NopT下游基因反应体系(100μL)如下：模板DNA，2μg；5×PS Buffer，20μL；dNTP，8μL；NopT-A-F，2μL；NopT-A-R，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH₂O，up to 100μL。

NopT下游基因PCR反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，Pause。

Cm基因反应体系(100μL)如下：模板DNA，2μg；5×PS Buffer，20μL；dNTP，8μL；Cm-F，2μL；Cm-R，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH₂O，up to 100μL。

Cm基因PCR反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，Pause；4℃，Pause。

(3)目的片段胶回收：

1)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，将PCR产物目的片段用100V电压下，琼脂糖电泳跑1.5h；

2)在紫外灯光照射下，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，用干净刀片将含有目的片段的凝胶切下，放入1.5mL的离心管中；

3)在离心管中按照重量体积1：1加入胶块溶解液Buffer GM；

4)将离心管放入55℃水浴锅内进行水浴10min中间颠倒3次；

5)凝胶完全溶解后，步骤4的混合液转移至Spin Column中进行离心，1min，12000rpm，弃滤液；

6)向Spin Column内加入700μL Buffer WB，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复操作一次；

7)空离12000rpm 2min；

8)准备干净的1.5mL离心管，向Spin Column柱内加入Elution Buffer 30μL，静置2min后12000rpm离心2min洗脱DNA，得到产物放入-20℃冰箱保存。

2.同源重组片段NopT-Cm的克隆

(1)以上述构建好的NopT上游基因，NopT下游基因，Cm基因为模板，用NopT-S-F，NopT-A-R扩增NopT-Cm大片段(序列如SEQ ID NO.8所示)NopT-Cm大片段反应体系(100μL)如下：模板DNA，2μg；5×PS Buffer，20μL；dNTP，8μL；NopT-S-F，2μL；NopT-S-R，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH₂O，up to 100μL。

nNopT-Cm大片段PCR反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，48s；72℃，10min；4℃，Pause。

(2)产物胶回收获得NopT-Cm大片段；

(3)pEASY-Blunt Cloning Kit载体连接体系(10μL)：nNopT-Cm大片段，4μL；Solution，5μL；pEASY-Blunt Cloning Kit，1μL。16℃金属浴16h。获得重组载体nNopT-Cm-pEasy-Blunt。

(4)T1大肠杆菌转化：冰浴，30min；42℃水浴锅，45s；冷敷，2min；加入无抗性LB液体培养基500μL放入37℃水平摇床160rpm，1h。

(5)将小摇后的菌液均匀涂布在含有Km抗性的LB固体培养基上，吹干后放入37℃恒温培养箱中，次日将筛选出的菌落进行PCR鉴定；

(6)单克隆菌液PCR鉴定(20μL)：菌液，1μL；Taq Master Mix，10μL；NopT-S-F(10μM)，0.8μL；NopT-S-R(10μM)，0.8μL；ddH₂O，up to 10μL。

PCR反应条件(28个循环)：95℃，3min；95℃，15s；55℃，15s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，Pause。

确定正确条带，送上海生工公司测序，将测序结果与基因序列通过DNAMAN比对，并命名为nNopT-Cm-pEasy-Blunt，将正确菌液进行质粒提取。nNopT-Cm-pEasy-Blunt质粒提取

结果：克隆NopT基因大片段与Cm基因片段，Overlap PCR获得NopT-Cm大片段

以中华根瘤菌HH103基因组和pGWC载体为模板，用引物NopT-S-F、NopT-S-R扩增NopT上游片段，引物NopT-A-F、NopT-A-R扩增NopT下游片段，引物Cm-F、Cm-R扩增Cm片段，Overlap PCR获得NopT-Cm大片段，NopT上游片段的目标条带为1020bp，NopT下游片段的目标条带为1000bp，Cm的目标条带为1000bp，NopT-Cm大片段的目标条带为3030bp，扩增长度与理论相符。如图1所示。

3.重组自杀载体构建

(1)通过DNAMAN分析NopT-Cm和pJQ200SK载体的酶切位点，后者存在的酶切位点为SalI和XBaI，设计引物如表2所示。

表2 NopT-Cm-X引物序列

(2)以NopT-Cm大片段为模板，用引物NopT-S-F-X，NopT-A-R-X扩增NopT-Cm-X。NopT-Cm-X与pJQ200SK载体酶切。

酶切体系(150μL)：DNA，6μg；Cutsmart，15μL；EcoRI，EcoRI；ddH₂O，up to 150μL。放置金属浴中37℃，3-5h，酶切产物胶回收得到NopT-Cm-X序列。

连接体系及反应条件(10μL)：载体，0.5μg；片段，2μg；Buffer，1μL；T4连接酶，1μL；ddH₂O，up to 10μL，获得重组载体NopT-Cm-pJQ200SK。放置金属浴中16℃，16h。连接后转入大肠杆菌感受态，菌液PCR鉴定后，测序成功后命名NopT-Cm-pJQ200SK。

用SalI、XBaI双酶切NopT-Cm大片段和pJQ200SK载体，连接转化后，挑选单克隆用引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X进行菌液PCR，扩增长度与理论相符。如图2所示。

构建突变体HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopTΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT，采用传统的三亲杂交方法，构建完载体直接使用这个方法就可以构建了。

pJQ200SK-NopC-Spec载体记载在专利公开号为CN113388562A的专利中。

pJQ200SK-NopT-Spec载体(Mapping quantitative trait loci related tonodule number in soybean(Glycine max(L.)Merr.)in response to theSinorhizobium(Ensifer)fredii HH103 NopT type III effector)，经过三亲杂交的方法获得突变体HH103ΩNopT。

HH103ΩNopL记载在(Zhang,Y.,Liu,X.,Chen,L.et al.Mining for genesencoding proteins associated with NopL of Sinorhizobium fredii HH103 usingquantitative trait loci in soybean(Glycine max Merr.)recombinant inbredlines.Plant Soil 431,245–255(2018).)。

HH103ΩNopL和pJQ200SK-NopC-Spec进行三亲杂交获得HH103ΩNopLΩNopC；

HH103ΩNopT和pJQ200SK-NopC-Spec进行三亲杂交获得HH103ΩNopTΩNopC；

HH103ΩNopL和pJQ200SK-NopT-Spec进行三亲杂交获得HH103ΩNopLΩNopT。

实施例2.构建根瘤菌HH103的突变体

三亲杂交(1)菌株：双突突变体HH103ΩNopLΩNopC，T1大肠杆菌克隆菌株；

将带有NopT-Cm-pJQ200SK的大肠杆菌划线于含有Gent，Cm抗性的LB固体培养基；双突突变体HH103ΩNopLΩNopC划线于含Rif，Km，Spec抗性的TY固体培养基中；

将带有Helper质粒的大肠杆菌划线于含Km抗性的LB固体培养基。过夜培养直至长出单克隆；将3种菌挑单克隆分别于7mL相应培养基中培养至OD₆₀₀值为0.6左右；

每个用枪吸取1mL，分别放于新的1.5mL离心管中，常温下离心12 000rpm离心30s，弃上清，用1mL无抗TY反复重悬；

取重悬后的HH103ΩNopLΩNopC菌液200μL，NopT-Cm-pJQ200SK的大肠杆菌和带有Helper质粒的大肠杆菌各100μL加入到新的1.5mL离心管中，离心12000rpm离心30s，弃上清，用20μL无抗TY重新重悬；将混合菌液滴到无抗TY固体培养基平板上过夜培养；

过夜培养后，刮取大斑划线到含Rif/Spec/Km/Cm抗性的TY固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的Rif/Spec/Km/Cm抗性的TY固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体命名为HH103ΩNopTΩNopCΩNopL。

(2)HH103ΩNopTΩNopCΩNopL菌液PCR鉴定

利用引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X和NopT-S-F-X、Cm-R以及Cm-F、Cm-R三对引物分别扩增突变菌株HH103ΩNopTΩNopCΩNopL，通过电泳的方法，观察到目的条带，测序验证突变体。

分别用引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X和Cm-F、Cm-R以及NopT-S-F-X、Cm-R对突变体HH103ΩnopZ菌液进行PCR鉴定。用引物NopT-S-F-X和NopT-A-R-X扩增长度应该包含NopT-Cm大片段，长度为3030p。用引物Cm-F、Cm-R扩增，证明扩增菌液包含抗生素片段，长度为960bp。用引物NopT-S-F-X和Cm-R扩增长度应该包含抗生素片段与NopT上游片段，长度为2020p。最终筛选出突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL。如图13所示。

(3)Southern blot鉴定

引物：设计标记探针的引物，引物包括目的基因及Cm基因的一部分，总共大约200bp，设计引物如表3所示。

表3 Sb-NopT-Cm探针引物序列

(4)Southern blot药品准备：a)变性缓冲液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)。b)中和缓冲液(1M Tris-HCl，1.5M NaCl)pH为7.5。c)脱嘌呤液(0.25M HCl)。d)20×SSC(NaCl 175g，柠檬酸钠88g)。为中性溶液。2×SSC，pH为7.2；0.5×SSC，pH为7.2。e)马来酸缓冲液，pH为7.5。f)洗涤液，pH为7.5。g)检测缓冲液，pH为9.5。h)1×阻断液：10×阻断液(vial6)稀释10倍。i)Antibody solution：1×阻断液1：10000稀释。j)10×TBE Buffer。k)鲑鱼精。

1)用细菌基因组DNA提取试剂盒获取快生型费氏中华根瘤菌HH103和突变体HH103ΩnopT全基因组。

2)Southern blot探针的标记：用S-nopT(F/R)扩增目的基因，胶回收获得基因片段。模板DNA，5μL；ddH₂O，up to 16μL；DNA模板100℃8min，冰浴；加入DIG-High Prime(vail1)试剂离心，37℃金属浴12h，65℃5min，-20℃保存，酶切基因组。

3)凝胶电泳：将DNA样品放入样品口中，在60V电压下进行琼脂糖凝胶电泳，跑到三分之二处停止。

4)电泳后，将胶进行处理：脱嘌呤液25min，ddH₂O摇洗5min(两次)，变性缓冲液25min，ddH₂O摇洗6min(两次)，中和缓冲液30min，ddH₂O摇洗5min(两次)。

5)DNA转印：搭建转膜装置，在装置盒子内加入20×SSC，滤纸用2×SSC提前润湿，注意滤纸平板之间不留气泡，用绝缘材料封闭四边，放置短路产生，室温下，进行20h，中途注意装置内是否吸干液体，及时添加，转膜后，标记好正反，凝胶与尼龙膜直接接触一面为正面。

6)照射：尼龙膜用2×SSC清洗2次，用紫外交联仪对膜的两面进行照射，每次5min。照射后，放置4℃保存。

7)杂交实验过程：

预杂交：首先将地高辛(vail7)放入37℃水浴锅中预热，将尼龙膜放入杂交瓶中，排出其中的气泡，加入预杂交液37℃1h。

探针变性准备：将之前准备的探针放入100℃水浴锅中变性10min后冰浴准备(变性后的探针应立即使用)。

8)杂交：将杂交瓶中的液体出，加入新配置的杂交液，以及变性探针，重新放入杂交炉中，12h。

9)洗膜：室温下20mL，2×SSC10min，50℃20mL，0.5×SSC15min(溶液需要预热)，20mL洗涤缓冲液5min，20mL，检测缓冲液2h，20mL，阻断液5min，2mL CSPD显色液(在暗室中进行，用保鲜膜包裹，避光15min)

10)化学显影：在暗室中进行，注意避光，用吸水纸轻轻将残余的CSPD显色液吸干，将尼龙膜和X光片放入压片夹中，曝光显影2-3min，定影2-3min直至有条带显现出来。

结果：将pJQ200SK-nopT、HH103、Helper三种菌液按2:1:1的比例混合，滴到无抗TY固体培养基平板上过夜培养，用灭过的枪头分多次刮取大斑，划线到含Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体经PCR、Southern blot鉴定后命名为HH103ΩnopT。

实施例3.构建回补菌株HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT

(1)引物：在NopT起始密码子前500bp左右开始到NopT终止为扩增片段。用DNAMAN分析不能切开的酶有KpnⅠ、SalⅠ，设计引物。

表4 pFAJ1702-Flag-HNopT回补菌株引物序列

(2)用HNopT(F/R)扩增中华根瘤菌HH103全基因组，纯化产物后将pUC57-Flag载体和HNopT目标产物用KpnⅠ、SalⅠ进行双酶切3-5h，酶切后进行产物纯化，连接16h后转入T1大肠杆菌中，菌液PCR验证后进行测序，命名为pUC57-Flag-HNopT；

(3)用KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pUC57-Flag-HNopT，pFAJ1702，酶切后进行产物纯化，将带有Flag标签的HNopT连接到pFAJ1702，连接16h后转入T1大肠杆菌中，菌液PCR验证后进行测序，命名为pFAJ1702-Flag-HNopT；

(4)通过三亲杂交的方法获得NopT的回补菌株，回补菌株被命名为HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。

HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT菌液PCR鉴定：利用引物HNopT(F/R)分别扩增HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT、HH103野生型，后者作为对照，通过电泳的方法，观察到目的条带。验证回补菌株HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。

突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的菌液PCR鉴定：分别用引物NopT-S-F-X、NopT-A-R-X和Cm-F、Cm-R以及NopT-S-F-X、Cm-R对突变体HH103ΩnopT液进行PCR鉴定。用引物NopT-S-F-X和NopT-A-R-X扩增长度应该包含NopT-Cm大片段，长度为3030p。用引物Cm-F、Cm-R扩增，证明扩增菌液包含抗生素片段，长度为960bp。用引物NopT-S-F-X和Cm-R扩增长度应该包含抗生素片段与NopT上游片段，长度为2020p。最终筛选出突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL。扩增长度与理论相符。如图3所示。

三基因突变体、双基因突变体、单基因突变体、回补菌株和野生型HH103的鉴定

(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩNopT、HH103ΩNopC、HH103ΩNopL、HH103ΩTTSI和HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT；

(2)大豆品种；染色体片段代换系(CSSL)父本绥农14；

(3)实验用品：缺氮植物营养液(1L包含MgSO₄ 0.5mol·L^-1、Na₂MoO₄ 0.2mmol·L^-1、MnSO₄ 2mmol·L^-1、H₃BO₃ 4mmol·L^-1、CaCl₂ 2mol·L^-1、CoSO₄ 0.2mmol·L^-1、K₂SO₄0.5mol·L^-1、CuSO₄ 4mmol·L^-1、KH₂PO₄ 1mol·L^-1、ZnSO₄ 1mmol·L^-1和C₆H₅FeO₇ 20mmol·L^-1)，双层钵植物培养系统、植物房、蛭石、白石子、锥形瓶、注射器等。

1)将大豆采用氯气灭菌法，过夜灭活表面细菌。

2)把灭菌后的大豆种子取出，在干净无菌的环境下吹除表面氯气。

3)灭过菌的种子种植在含有蛭石和营养液的双层钵中生长，每个双层钵种5粒大豆种子，种好种子的双层钵盖好盖子保墒。

4)生长一段时间，在双层钵上层铺上灭菌的小石子，石子为植物保墒，并将双层钵放置在设定好温度的房间中生长并定期浇水。

(2)植物接种菌液的获取：

1)取出回补菌株、突变体菌株和野生型菌株，在无菌操作台中将三种菌株划在固体平板上，封好平板放入培养箱中培养长出菌斑后，挑取菌斑在液体培养基中活化。

2)取100μL菌液于新鲜的TY液体培养基中，继续培养。

3)取培养好的菌液离心，留下沉淀物，实验前配置好MgSO4溶液并灭菌，用灭过菌的硫酸镁将沉淀吹起，这一操作重复三次。

4)用灭菌后的硫酸镁吹起菌块，并活化菌液，至菌液活性最佳时接种植。

5)植株接种菌液及根瘤性状的调查。

菌液接种：双层钵中的大豆植株对生针叶展开时为最佳接种时机，将活化好的菌液用20mL注射器打入蛭石中，确保每个双层钵接种两毫升菌液，接种后大豆植株继续生长，一个月后调查大豆根部结瘤情况。

根瘤性状调查方法：长成的大豆拔出植株，调查根瘤数量、每一株的根瘤用干净的离心管承装，并烘干根瘤称取根瘤干重。

突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的Southern blot鉴定：为验证突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的真实性，采用检测试剂盒和地高辛标记对突变体进行Southern blot鉴定。对突变体HH103ΩnopT和野生型根瘤菌HH103的基因组用Xho I限制性内切酶酶切。选用内切酶时避免选用Cm和目的基因内部的内切酶，以免将突变HH103ΩNopTΩNopCΩNopL片段切碎影响验证结果。如图4所示，酶切后突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL片段比野生型根瘤菌HH103片段多大约1000bp多，即Cm基因片段大小，验证突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL的准确性。扩增长度与理论相符。

HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT获得：将pFAJ1702-Flag-HNopT、HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、Helper三种菌液按2:1:1的比例混合，滴到无抗TY固体培养基平板上过夜培养，用灭过的枪头分多次刮取大斑，划线到含Tet/Rif/Spec/Km/Cm(50mg/mL)抗性的TY固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；筛选到的回补菌株经PCR鉴定后命名为HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT的PCR鉴定：扩增的CDS区，以HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT菌液为模板，用引物HNopT(F/R)进行菌液PCR验证，扩增长度与理论相符。如图5所示。

利用以下实验验证实验效果：

阳性根结瘤性状分析

(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩNopT、HH103ΩNopC、HH103ΩNopL、HH103ΩTTSI

(2)大豆品种；东农50

(3)实验用品：缺氮植物营养液(1L包含MgSO4 0.5mol·L-1、Na2MoO4 0.2mmol·L-1、MnSO4 2mmol·L-1、H3BO3 4mmol·L-1、CaCl2 2mol·L-1、CoSO4 0.2mmol·L-1、K2SO4 0.5mol·L-1、CuSO4 4mmol·L-1、KH2PO4 1mol·L-1、ZnSO4 1mmol·L-1和C6H5FeO7 20mmol·L-1)，双层钵植物培养系统、植物房、蛭石、白石子、锥形瓶、注射器等。

将野生型HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩNopT、HH103ΩNopC、HH103ΩNopL、HH103ΩTTSI接种空载体K599-pSoyI转化根。

三基因突变体、双基因突变体、单基因突变体、回补菌株和野生型HH103的结瘤鉴定接种SN14鉴定：对本实验室构建的导入系群体父本绥农14作为能力鉴定的材料，在双层钵植物生长营养系统中种植，在大豆根部分别接种快生型费氏中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩNopT、HH103ΩNopC、HH103ΩNopL、HH103ΩTTSI和HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT。接种一个月后对性状进行统计分析。如图6-8所示，HH103ΩTTSI(TTSI是所有效应因子缺失的涂突变体。作为对照菌)、两个单突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC在的结瘤数目均有不同程度的减少，其中HH103ΩNopC与野生型HH103相比减少结果最为显著；单基因突变体HH103ΩNopL结瘤数目略有增加，但其显著性最小，说明NopL在CSSL亲本绥农14中对共生结瘤的影响很小；双基因突变体HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT结瘤数目显著性减少，但是与单基因突变体HH103ΩNopT、HH103ΩNopC相比结瘤数目略有上调；三基因突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL结瘤数目同样减少，而且其减少结果最为显著。与中华根瘤菌HH103和TtsI相比，NopC突变能够引起根瘤数目的显著较少，也能够引起根瘤干重的显著降低。接种回补菌株HH103ΩpFAJ1702-Flag-HNopT后，数目与干重均增加，但不超过中华根瘤菌HH103，这可能与内源基因的表达形式有关。NopC突变能够造成根瘤菌侵染和根瘤发育受到影响，说明根瘤菌Ⅲ型效应因子NopC对于大豆-根瘤菌共生体系的正常建立是十分重要的。

接种30份种质资源鉴定

(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩTTSI；

(2)大豆品种：30份种质资源(包括栽培种，农家种，地方种)；

为了减少单一大豆品种对结果影响从而产生的片面性，我们将根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩTTSI接种30份种质资源，除了极个别材料产生的极值结果，其余材料均与绥农14的结瘤鉴定结果一致，结果如图9-图10所示。

实施例4.减少大豆根瘤数量的试剂

试剂的成分：突变体菌液。

使用方法：(1)分别将HH103ΩNopTΩNopCΩNopL、HH103ΩNopLΩNopC、HH103ΩNopLΩNopT、HH103ΩNopTΩNopC突变体进行培养活化，控制OD600为0.65-0.86；

(2)将步骤(1)得到的菌液进行4000rpm，10min离心，用10mM的硫酸镁溶液进行重悬洗菌重复4次；将硫酸镁溶液重悬后的菌液OD₆₀₀＝0.2；

(3)大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗进行接菌，接菌数量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

将结瘤数量过多的大豆品种使用的根瘤菌进行突变，降低结瘤数目，减少共生固氮消耗的能量，保证大豆产量。通过突变体调节接种根瘤菌在大豆上的结瘤数目，保证结瘤数目在合理范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1910

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccaggctgag tggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggat gcggggcctg 60

caagcgagga tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacga 120

cgccgggcaa tggcgcgggc cgcgccgacc catgcgttcg atcacggtcg ccattggcag 180

cagggcccgg cgtacccggt acgtagcact gattgttttt gcgatcgttg accctggtct 240

gtcgttgaag ctgtctcgat ggctgcccgc agcgcagcgc gctgtccatg tcggttgggc 300

ttcgactttc aaatagcgca gcaggtgtgc gatgtgatcg cggcgagttt cctcacggcg 360

agggtaaaag gcaatagcct gtgatctgcg tcgatatatg ttcggaagga gtgcccggcc 420

gggatagccc accaggcaca gttgcaccgc aaaaccaagc tggttgcgcc tgcgaagctt 480

gatttccagc cgatcagccg gcgacaggga ataatggcgg atcaagctgt cttcatcggc 540

tggaatgtcg aaaagtcctg ttgcgcaagt cagatggaga accttgcatg accgcgaatg 600

tgggcgcgag gaatgtcgga accgattgtc ctgccagttg gattgcggcg gcatcagcat 660

cgaaccgccg aggccaatgc gctggatacc tccatgtacc tctaccgatc cagtgtcggg 720

cgaaatcggc tcggcggagt tctcctccga taagctgagc tgcagatggc caactgctgc 780

tcaaacccac ctggtccacc ggcgcgtcgt ccgattcctg cctcgcacgc agcagctgtt 840

gctgctcagc gtaccaaaga tcccacctct tcagcacaag catcgacgag gatttacgtg 900

gacttcagtg aacactacgc cgcgcaggac gcccgactca tgtcaccttt agggcttgtg 960

atgtactgga gagcacgcac gtgcgggtga gcacccgaga ttgcgctgcc tgcggctata 1020

gctggggtgc cgttgcacaa gccgagaatt cagatcgccg cgaatgtgac cccacttgaa 1080

ttcgctcatg agcctgcctc aatgcatccg cggacggatt gccaatcata tctgcgtggc 1140

cggtgtctga ctgtccactc tgcctccaac ctgtacgagt ttcttaatcg aatttcgcga 1200

gaatggaaaa atcgagcttt tgcatagcta tcatccatac cgtggatgga catgtaacat 1260

gctcaatcag tcgggcttgg gcataaggtg ttcgtctata gcccccgtcg cgagtcgaac 1320

gtgaacgcct ggaaggaagc ctcccgcgag cttacgaacg tgtgcttgtt gctggtcgct 1380

atcaccaaag gcgatacctc cccttctcca ccattccctc aagaccgggc ttgatctgca 1440

gcagccggtg tcagcgactt tccggtctat agtcccgatc gcatcttcat cggcgtcatt 1500

ggcagcctgc aggggccaaa aaatcgcggc gaggaacagt cacagcgcct tagatgtttc 1560

tatgcgagcg ttcatatggc gctgcatttt gcggttgctg acctgcgaga gcaggcggcc 1620

gattggcttg atgagcatcg tcaccgcgtc atcagtgagc ttctggcgga gtttgatgcc 1680

tgcgttatga ttgtcgcgta ccgacggctg gcgttgaagt caccagcgag ccaggctgag 1740

tggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggat gcggggcctg caagcgagga 1800

tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacga cgccgggcaa 1860

tggcgcgggc cgcgccgacc catgcgttcg atcacggtcg ccattggcag 1910

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcgtcgacct ccacaatcgc ctcgagact 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gggcgtaatc ccagtacctc ctc 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctctagaaa gcttgatttc cagcc 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atccgaacaa tcccagtcag gcccta 26

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

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<210> 8

<211> 2570

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

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caagcgagga tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacga 120

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gcagccggtg tcagcgactt tccggtctat agtcccgatc gcatcttcat cggcgtcatt 2160

ggcagcctgc aggggccaaa aaatcgcggc gaggaacagt cacagcgcct tagatgtttc 2220

tatgcgagcg ttcatatggc gctgcatttt gcggttgctg acctgcgaga gcaggcggcc 2280

gattggcttg atgagcatcg tcaccgcgtc atcagtgagc ttctggcgga gtttgatgcc 2340

tgcgttatga ttgtcgcgta ccgacggctg gcgttgaagt caccagcgag ccaggctgag 2400

tggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggat gcggggcctg caagcgagga 2460

tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacga cgccgggcaa 2520

tggcgcgggc cgcgccgacc catgcgttcg atcacggtcg ccattggcag 2570

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gcgtcgacct ccacaatcgc ctcgagact 29

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctctagaaa gcttgatttc cagcc 25

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tgtgatggct tccatgtc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tcggattgac ggatgact 18

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ggggtaccag ataggcagtt cgtggag 27

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gcgtcgactg tcaccttttg ggtggtcacc 30

<210> 15

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atggaggccc tagtacccgg atcgcaaagg cacgcctcag ccgctgttcg gcagaaggag 60

tacgagaatc tgaaggttca cctacgaaga caaggagcag gaccttctga ggccgacttc 120

gcggcgcaaa acactatgtt gcagaaagca ggccttgctc catccggaaa ggagaaagta 180

tacaaagtcg gcgagcctaa cttctcgcgc atgctgacca agattacagc cgacggatcc 240

aaccatttgc tcagcttgta tttcgctgag ggcggcgcac acaccgttgc gacctcggca 300

atggatggaa acaccacgct cttcgatcct aatttcggcg aatttactgt gcaatcagat 360

cagattgatg atttgttccg aagcctagcc aatcgctaca gcaatccaaa ccggcagcat 420

tttacaacgg tgaccaccca aaaggtgaca tga 453

<210> 16

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atggtcggag tgattggaag tggagttggc tccatcggcg tttccctggc ccgcaaaggg 60

gggcatggac attcgactgg acagccgccg cgcgattcag gcgggccctc tggtcacaac 120

aggccggatc gcgggagcgg cgttacggat ggcccgacca tttctgggga tcgctcgcag 180

gctgcaattc aaagcgaagc cttcgaacta gctcttcgat cggttgcgct gcaacttatg 240

aacgatgcca tggctgatgc cgacgaagct atggcagaaa ctgaagagga tgcctga 297

<210> 17

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

atggatatca attcaacccg cccactaaac gcaagcccac agcccgactc tccaccaccc 60

gccaacgaga gtgcatttgc gcatcagctg agcggatttc aatatagccc tccacatgcc 120

gctgactcac tattgccgca ggttgaagcc gattccccat atttggacac cgggcatccc 180

tactcgcagt atttggattc ggcatatcct tatccatcac cttgtgaatg gcagcatgac 240

ctgtatacca ggactaggga aaggtctccc catcctagcg agcagcgacc gcatgctcgg 300

gtgctacagg acgcgcccga acacgaccag gatcagcacg tggaagccgc gggaccgcga 360

gctggatcat ggcaagtggg gccatcacga tctggaccgt cgcaagccgg gccatcctcg 420

tccgccaccc cactgaacgc aagcccaccg ccacatgcca ccgacttaga aaccgagcat 480

ccctactcgc agtatttgga ttgggcgaat ccgtcattgc ttgattggca gcatgacctg 540

catacgcggg ctacagcttc tcccgcgcca ctgaccgctg agaggggaaa gtctccccag 600

cctagcgagc agcaaccgca tgctcgcgcg ctgcaggtgc ccgaatacga tcaggatttg 660

atatggcagc gcgtggatgc cgcggggccg caagctggac cgtggcaggt ggggccatca 720

cactctggac cgtcgcaagc ccggccatcg cacgcttggc cgtcctcgtc cgcaggggcc 780

gagccgactg aactttctga tttcgttatg gatagcggcg ttcgtgcgtg ggaccactgg 840

ttcttagctc ctcacatggc ctcagaagac cagatgagca tgctaagagc cacggggcta 900

atgccaaccg cagaggtccc gacaacaacg tttttgatga tgggcatgcc gcacgttgcc 960

gaattccgag gcgagggagt tattcgcatc aggccatcgc tggattttga catttga 1017

<210> 18

<211> 3235

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccccggggca tgcggatccg 420

gtaccgtcga cattaatatg cattgcgcag actacaagga tgacgatgac aagggcgccg 480

attataaaga tgacgatgac aagcaattgg actataagga cgatgacgat aaatagataa 540

atgacccggg ctcctcctct gctaacgtaa gcctctctgt tttttttctc tgtttctttt 600

gaaatgaatc caattagtga tgataatctg tgtttgatgt atcattgatt taacatcttg 660

acaatgaatc gtgatcggaa gtgataaagt tatgggtcaa cggtttcaaa gagagagaaa 720

gacttttaga gtcaactctc gactctttct taattatgtt attgctattt gtctcttttc 780

ttgaagtctg aacaattctt gggattgttt tgcaggttct agcttctcca accacaggag 840

ctcatggact acaaggatga cgatgacaag ggcgccgatt ataaagatga cgatgacaag 900

caattggact ataaggacga tgacgataaa agatcttcta gagatatcac tagtctcgag 960

ccatggctgc agcatatgta gataaatgag agctcaagct tggcgtaatc atggtcatag 1020

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 1080

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 1140

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 1200

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 1260

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 1320

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 1380

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1440

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1500

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1560

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1620

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1680

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1740

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 1800

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 1860

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 1920

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 1980

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2040

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 2100

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 2160

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 2220

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 2280

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 2340

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2400

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 2460

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 2520

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 2580

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 2640

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 2700

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 2760

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 2820

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 2880

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 2940

tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 3000

ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 3060

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 3120

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 3180

attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3235

Claims

1.一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的多基因突变体，其特征在于，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的NopT基因、NopC基因和NopL基因中的三个基因进行突变或者沉默获得的；所述NopT基因的序列如SEQ ID NO.15所示；所述NopC基因的序列如SEQ ID NO.16所示；所述NopL基因的序列如SEQ ID NO.17所示。

2.一种减少大豆根瘤数目的试剂，其特征在于，所述试剂的有效成分是权利要求1所述的根瘤菌HH103的多基因突变体。

3.权利要求2所述的试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，其特征在于，将权利要求2所述的试剂接种野生型大豆幼苗；所述大豆品种为Charleston、东农594、绥农14、ZYD00006、Nattosan、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、黑农44、黑农35或北丰11。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含权利要求1所述的多基因突变体的菌液，接菌数量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

5.权利要求1所述的多基因突变体在大豆种植中的应用，其特征在，所述应用为减少大豆根瘤数目。