CN109337851A - 一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，本发明首次同时利用特定的5种不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体将海藻糖合酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，通过基因工程手段将海藻糖合酶TreS基因分别与芽孢衣壳蛋白CotA、CotC、CotE、CotG和CotH编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的基因工程菌，极大地提高了海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率，而在采用其他芽孢衣壳蛋白进行类似展示海藻糖合酶分子时，未发现该现象，这为后续提高海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率提供了新的途径。

Description

一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法

技术领域

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接，并广泛存在于植物、动物和微生物中。自1974年海藻糖作为能量储存物质和细胞壁组成物质被认识后，其功能和应用也逐渐被开发。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻糖在各方面的应用得到不断拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。研究表明，海藻糖的功能主要有以下三点：(1)作为碳源和能量储存物质；(2)作为蛋白和膜结构的稳定和保护物质；(3)作为细菌细胞壁的一种结构组成成分。海藻糖对生物体具有特殊的保护作用，其在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣条件下，能够在细胞表面形成独特的保护膜，有效保护蛋白分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特功能使得海藻糖除了作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保护剂外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品变质、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。

随着海藻糖应用的不断探索，其功能和效果得到认可，这使得海藻糖的市场需求量逐渐增加，目前海藻糖的市场价格仍高于其他双糖，如蔗糖和麦芽糖。由于其生产工艺的复杂性，原材料的限制性以及工业化生产的实用性等方面的因素，使得海藻糖的生产量难以满足市场需求，因此对其生产各方面仍需不断创新和提高。

海藻糖合酶能够将由α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为由α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，且底物专一性强，只作用于麦芽糖生成海藻糖及其逆反应，反应倾向于生成海藻糖方向，转化率约为70％-80％。目前麦芽糖制备工艺已非常纯熟，不仅制备成本低，且麦芽糖溶液纯度高，因此利用海藻糖合酶制备海藻糖具有原料优势，便于海藻糖的生产应用。海藻糖转化法通过一步转化，工艺简单，便于调控，目前被认为是海藻糖工业化生产的最优方法。

芽孢表面展示系统是将目的基因与芽孢衣壳蛋白编码基因进行融合，利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭型质粒或整合型质粒作为载体，将其转化到枯草芽孢杆菌中，诱导菌株产生芽孢后，目的基因能在芽孢衣壳蛋白基因启动子或其他启动子的控制下实现与芽孢衣壳蛋白的融合表达，从而在芽孢衣壳蛋白的锚定作用下使外源蛋白展示在芽孢表面。枯草芽孢杆菌的芽孢作为表面展示系统具有以下优点：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于GRAS分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。

中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。该发明利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。虽然该技术方案中采用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体可以表面展示海藻糖合酶，但展示效率太低，无法满足工业化应用的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法。本发明通过筛选，发现当五种不同的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白同时作为分子载体，在整合型质粒pDG1730的基础上构建一个可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的载体，通过电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。

本发明技术方案如下：

一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730将芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH分别与海藻糖合酶基因treS进行融合获得的融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，即得。

根据本发明优选的，所述融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

上述芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列；以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida P06为模板扩增分别与上述芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列对应的重叠PCR扩增海藻糖合酶treS的基因序列；

所述CotA蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotA-F aaaactggtctgatcggatccCGACCCGATATCCTGCCTTA BamHI

cotA-R gctgggtcatTTTATGGGGATCAGTTATATCCATCG

所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotC-F accaccaccaccactgaGGTGGCGGTGGCTCGGGC

cotC-R ggctgggtcatGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTCTACAA

所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotE-F caccaccaccactgaCGAGCTCGCTCTCTAAACACG

cotE-R tcctgaagaaATGACCCAGCCCGACCCG

所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotG-F accactgaGTTTAAACCGTAAAGCGGTAAATTGGATTGA PmeI

cotG-R cgggctgggtcatTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGC

所述CotH蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotH-F caccaccaccactgaCGAGCTCGCCTTCTTTTTTTG

cotH-R cgggtcgggctgggtcatTAAAATACTTAAATGAT

所述与CotA蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotA-treS-F tccccataaaATGACCCAGCCCGACCCG

cotA-treS-R accTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶Tres基因序列的扩增引物如下所示：

cotC-treS-F aaacactacATGACCCAGCCCGACCCG

cotC-treS-R tttagagagcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotE-treS-F gtttttagtgggagatcctgaagaaATGACCCAGCCCGAC

cotE-treS-R ctgcaggaattcgataagcttGTTTAAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTHindIII、PmeI

所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotG-treS-F atacaaaATGACCCAGCCCGACCCG

cotG-treS-R aaaagaaggcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotH蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotH-treS-F cacaatacctcaaagatcatttaagtattttaATGACCCAGCCCGAC

cotH-treS-R ctgcaggaattcgataagcttTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT HindIII

(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH与其对应的海藻糖合酶基因片段treS分别融合，制得cotA-treS(At)、cotC-treS(Ct)、cotE-treS(Et)、cotG-treS(Gt)和cotH-treS(Ht)五种融合基因片段；所述cotA-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述cotE-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotH-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)将整合型质粒pDG1730经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，同时与步骤(2)中制得的融合基因片段cotA-treS、cotC-treS、cotE-treS进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-At-Ct-Et；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒pDG1730-At-Ct-Et经限制性内切酶PmeI和HindIII双酶切后，同时与骤(2)中制得的融合基因片段cotG-treS和cotH-treS进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht；

(5)将步骤(4)中制得的重组质粒pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌WB800n中，通过壮观霉素平板筛选后，制得芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增Cot蛋白基因序列的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μmol/L上游引物cot-F 2.5μL，浓度10μmol/L下游引物cot-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中PCR扩增对应海藻糖合酶treS基因的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μmol/L上游引物cot-treS-F 2.5μL，浓度10μmol/L下游引物cot-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μL：

Cot蛋白基因片段4μL，对应的海藻糖合酶基因片段treS 4μL，2×Phanta MaxMasterMix 12.5μL，ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cot-F 2μL，下游引物cot-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，电转化的条件如下：

将6μL重组质粒加入60μL枯草芽孢杆菌感受态细胞中，2500V，5ms，电击一次。

上述芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌在制备海藻糖中的应用。

上述应用，步骤如下：

(i)将芽孢表面高效展示海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌在TB培养基中扩大培养，35～38℃发酵45～50h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面固定化的海藻糖合酶；

(ii)将步骤(i)中制得的在芽孢表面固定化的海藻糖合酶用磷酸盐缓冲液重悬，然后加入麦芽糖溶液，在23～27℃条件下，转化3.5～5h，纯化，制得海藻糖。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，TB培养基组份如下：

20g/L葡萄糖，30g/L大豆蛋白胨，2.5g/L MgCl₂，17mM KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、7500rpm的条件下离心10min。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，磷酸盐缓冲液pH8.0，浓度10mM。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，反应体系中麦芽糖的质量百分比浓度为25～40％。

有益效果

1、本发明首次同时利用特定的5种不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体将海藻糖合酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，通过基因工程手段将海藻糖合酶TreS基因分别与芽孢衣壳蛋白CotA、CotC、CotE、CotG和CotH编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的基因工程菌，极大地提高了海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率，而在采用其他芽孢衣壳蛋白进行类似展示海藻糖合酶分子时，未发现该现象，这为后续提高海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率提供了新的途径；

2、本发明所述工程菌直接将外源蛋白展示在芽孢表面，无需对细胞破碎，且芽孢可回收重复利用，所采用的枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，其遗传背景清楚，遗传操作系统完善而精确，可保证最终的表达系统达到食品安全级的标准，为下游海藻糖工业化生产奠定了基础；

3、本发明采用整合型重组质粒芽孢表面展示海藻糖合酶，可以将目的基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中，使其不会在传代过程中丢失，实现了枯草芽孢杆菌中海藻糖合酶的遗传稳定性。

附图说明

图1是pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht载体构建示意图；

图2a是cotA、cotC、cotE、cotG和cotH基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2b是海藻糖合酶基因treS的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是融合基因片段At、Ct、Et、Gt和Ht的琼脂糖凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；

整合型质粒pDG1730购自淼灵生物科技有限公司；

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida P06)购自中国科学院微生物菌种保藏中心(CGMCC)；

实施例1：构建重组质粒

(1)克隆得到芽孢衣壳蛋白基因片段

以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增得到5种芽孢衣壳蛋白的基因片段；

所述CotA蛋白基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotA-F：5’-aaaactggtctgatcggatccCGACCCGATATCCTGCCTTA-3’

cotA-R：5’-gctgggtcatTTTATGGGGATCAGTTATATCCATCG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotA-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotA-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotC蛋白基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotC-F：5’-accaccaccaccactgaGGTGGCGGTGGCTCGGGC-3’

cotC-R：5’-ggctgggtcatGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTCTACAA-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotC-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotC-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotE蛋白基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotE-F：5’-caccaccaccactgaCGAGCTCGCTCTCTAAACACG-3’

cotE-R：5’-tcctgaagaaATGACCCAGCCCGACCCG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotE-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotE-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotG蛋白基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotG-F：5’-accactgaGTTTAAACCGTAAAGCGGTAAATTGGATTGA-3’

cotG-R：5’-cgggctgggtcatTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGC-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotG-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotG-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotH蛋白基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotH-F：5’-caccaccaccactgaCGAGCTCGCCTTCTTTTTTTG-3’

cotH-R：5’-ttttaATGACCCAGCCCGACCCG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotH-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotH-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。

(2)克隆得到海藻糖合酶基因片段

以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida P06为模板，设计分别PCR扩增与5种cot基因重叠的海藻糖合酶treS的基因序列的引物，进行PCR扩增：

与cotA基因重叠的海藻糖合酶Tres基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotA-treS-F：5’-tccccataaaATGACCCAGCCCGACCCG-3’

cotA-treS-R：5’-accTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotA-treS-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotA-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotC基因重叠的海藻糖合酶Tres基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotC-treS-F：5’-aaacactacATGACCCAGCCCGACCCG-3’

cotC-treS-R：5’-tttagagagcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotC-treS-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotC-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotE基因重叠的海藻糖合酶Tres基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotE-treS-F：5’-gctgggtcatTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAAC-3’

cotE-treS-R：5’-ctgcaggaattcgataagcttGTTTAAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotE-treS-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotE-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述与cotG基因重叠的海藻糖合酶Tres基因序列的PCR引物如下：

cotG-treS-F：5’-atacaaaATGACCCAGCCCGACCCG-3’

cotG-treS-R：5’-aaaagaaggcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotG-treS-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotG-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH2O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述与cotH基因重叠的海藻糖合酶Tres基因序列的PCR引物如下：

cotH-treS-F：5’-cacaatacctcaaagatcatttaagtattttaATGACCCAGCCCGAC-3’

cotH-treS-R：5’-ctgcaggaattcgataagcttTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotH-treS-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotH-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR结束后通过质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。

(3)将步骤(1)制得的5种cot片段与步骤(2)制得的对应的海藻糖合酶基因片段分别进行重叠PCR，制得At、Ct、Et、Gt和Ht融合片段；

At融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotA基因重叠的海藻糖合酶序列treS 4μL；cotA蛋白基因序列4μL；2×PhantaMax Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotA-F 2μL，下游引物cotA-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Ct融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotC基因重叠的海藻糖合酶序列treS 4μL；cotC蛋白基因序列4μL；2×PhantaMax Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotC-F 2μL，下游引物cotC-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Et融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotE基因重叠的海藻糖合酶序列treS 4μL；cotE蛋白基因序列4μL；2×PhantaMax Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotE-F 2μL，下游引物cotE-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Gt融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotG基因重叠的海藻糖合酶序列treS 4μL；cotG蛋白基因序列4μL；2×PhantaMax Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotG-F 2μL，下游引物cotG-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Ht融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotH基因重叠的海藻糖合酶序列treS 4μL；cotH蛋白基因序列4μL；2×PhantaMax Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotH-F 2μL，下游引物cotH-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

(4)将整合型质粒pDG1730经BamHI和HindIII双酶切与步骤(3)中制得的At、Ct、Et融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pDG1730-At-Ct-Et。

所述pDG1730质粒酶切体系为：

pDG1730质粒16μL；BamHI 1μL；HindIII 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH₂O 4.5μL；

反应条件：37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pDG1730质粒152ng；cotC-treS 52ng；cotG-treS 56ng；Exnase 2μL；5×CEbuffer4μL；ddH₂O补足至20μL

反应条件：37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

(5)将步骤(4)中制得的重组载体经PmeI和HindIII双酶切与步骤(3)中制得的Gt和Ht融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht。经检测，含有五种芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG和cotH及其与海藻糖合酶融合基因的载体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述重组载体pDG1730-At-Ct-Et的酶切体系为：

pDG1730-At-Ct-Et质粒16μL；PmeI 1μL；HindIII 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH₂O4.5μL；

反应条件：37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pDG1730-At-Ct-Et质粒320ng；cotC-treS 52ng；cotG-treS 56ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH₂O补足至20μL

反应条件：37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

实施例2：枯草芽孢杆菌WB800n电转感受态细胞的制备

挑取新鲜LB固体培养基表面的枯草芽孢杆菌WB800n单菌落于5mL LB培养基中，过夜培养。取1mL过夜培养物接入50mL GM培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体。用20mL预冷的ETM培养基(0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次。将洗涤后的菌体重悬于500μL ETM培养基中，分装与EP管中，每管分装60μL。

实施例3：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800n中

将6μL重组质粒加入到60μL感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含壮观霉素的LB平板上。37℃倒置培养，筛选抗壮观霉素的菌株。

实施例4：阳性重组菌的培养基鉴定

将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含壮观霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA位模板，分别以五种对应的cot-F和cot-treS-R为引物进行PCR扩增。

所述菌落PCR扩增体系为20μL：

上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH₂O 7μL；

所述菌落PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳证明外源片段At-Ct-Et-Gt-Ht已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，将重组菌命名为WB800n/At-Ct-Et-Gt-Ht。

实施例5：阳性重组菌的发酵

将实施例4构建好的重组菌WB800n/At-Ct-Et-Gt-Ht接种于LB液体培养基(含浓度为100μg/mL的壮观霉素)，37℃过夜培养，次日按1％接种量转接与TB培养基中，37℃培养48h，4℃，7500rpm离心10min，用终浓度2mg/mL的溶菌酶37℃处理2h后离心，沉淀即为重组芽孢。

上述LB液体培养基配方为：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，pH7.0。

上述TB培养基每升组分如下：

20g葡萄糖，30g大豆蛋白胨，2.5g MgCl₂，17mmol KH₂PO₄，72mmol K₂HPO₄，pH7.5。

实施例6：海藻糖合酶酶活检测

将菌体沉淀用5mL pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬，加入5mL质量浓度为60％的麦芽糖溶液，25℃条件下反应4h。通过高效液相色谱测定转化体系中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为15min。按照如下公式计算海藻糖合酶的酶活。

根据高效液相色谱中海藻糖的峰面积，计算其的浓度，其中c为转化体系中生成海藻糖的浓度(g/L)，V为转化体积(L)，M为海藻糖的相对分子质量，t为转化时间(h)，m为转化体系中菌体干重(g)。

结果表明，本发明所构建的海藻糖合酶基因工程菌能够实现在枯草芽孢杆菌中高效芽孢表面展示海藻糖合酶。重组芽孢中海藻糖合酶的比酶活可达5238.98U/g，具有广泛的应用前景。

对比例1

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotC-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为974.52U/g。

对比例2

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotG作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotG-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为783.93U/g。

对比例3

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotE作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotE-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为921.69U/g。

对比例4

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotH作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotH-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为763.64U/g。

对比例5

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotA作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotA-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为937.68U/g。

对比例6

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和CotG同时作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotC-treS-cotG-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为2376.16U/g。

对比例7

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC作为分子载体，将海藻糖合酶TreS展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotC-treS重复五次，制备cotC-treS-cotC-treS-cotC-treS-cotC-treS-cotC-treS融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为991.62U/g。

对比例8

如实施例所述的重组菌，不同之处在于，重组质粒为pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Xt。其中cotX及其相连的treS的PCR扩增引物如下：

cotX-F：5’-caccaccaccactgaCGAGCTCGGGAAAAACGATAA-3’

cotX-R：5’-ttttaGAGGACAAGAGTGATAACTAGGATGGCT-3’

cotX-treS-F：5’-gtagccatcctagttatcactcttgtcctcATGACCCAGCCCGAC-3’

cotX-treS-R：5’-ctgcaggaattcgataagcttTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT-3’

结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为4351.26U/g。

结果分析

如实施例与对比例1-7的比酶活结果可以看出，以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotA、CotC、CotE、CotG和CotH同时作为分子载体所构建的重组菌酶活的显著提高并非是At、Ct、Et、Gt、Ht各自作用的简单效果叠加，比如对比例7中，采用单一作用酶活最高的cotC-treS进行五次重复后，效果显著低于实施例，从对比例6可以看出，cotC-treS-cotG-treS片段也显著高于对比例1和对比例2的结果，也显著高于对比例1与对比例2二者酶活之和。而实施例的酶活也显著高于对比例1-5的酶活之和。而实施例和对比例8的数据可以看出，将cotH-treS替换为一个具有类似功能的cotX-treS后，展示的海藻糖合酶的比酶活显著降低。

序列表

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23020

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gatcccgacc cgatatcctg ccttaatgct gatcaaatcc taaacggcct gccgtttagg 60

attttgttat tttcttcttc gggcgggctg cagcacgaag attttttgta accatcacgt 120

ccttattgtc attaactata gtaccaattt ggaaaattta gataaggaca gatgaaaatg 180

acacttgaaa aatttgtgga tgctctccca atcccagata cactaaagcc agtacagcaa 240

tcaaaagaaa aaacatacta cgaagtcacc atggaggaat gcactcatca gctccatcgc 300

gatctccctc caacccgcct gtggggctac aacggcttat ttccgggacc gaccattgag 360

gttaaaagaa atgaaaacgt atatgtaaaa tggatgaata accttccttc cacgcatttc 420

cttccgattg atcacaccat tcatcacagt gacagccagc atgaagagcc cgaggtaaag 480

actgttgttc atttacacgg cggcgtcacg ccagatgata gtgacgggta tccggaggct 540

tggttttcca aagactttga acaaacagga ccttatttca aaagagaggt ttatcattat 600

ccaaaccagc agcgcggggc tatattgtgg tatcacgatc acgccatggc gctcaccagg 660

ctaaatgtct atgccggact tgtcggtgca tatatcattc atgacccaaa ggaaaaacgc 720

ttaaaactgc cttcagacga atacgatgtg ccgcttctta tcacagaccg cacgatcaat 780

gaggatggtt ctttgtttta tccgagcgca ccggaaaacc cttctccgtc actgcctaat 840

ccttcaatcg ttccggcttt ttgcggagaa accatactcg tcaacgggaa ggtatggcca 900

tacttggaag tcgagccaag gaaataccga ttccgtgtca tcaacgcctc caatacaaga 960

acctataacc tgtcactcga taatggcgga gattttattc agattggttc agatggaggg 1020

ctcctgccgc gatctgttaa actgaattct ttcagccttg cgcctgctga acgttacgat 1080

atcatcattg acttcacagc atatgaagga gaatcgatca ttttggcaaa cagcgcgggc 1140

tgcggcggtg acgtcaatcc tgaaacagat gcgaatatca tgcaattcag agtcacaaaa 1200

ccattggcac aaaaagacga aagcagaaag ccgaagtacc tcgcctcata cccttcggta 1260

cagcatgaaa gaatacaaaa catcagaacg ttaaaactgg caggcaccca ggacgaatac 1320

ggcagacccg tccttctgct taataacaaa cgctggcacg atcccgtcac agaaacacca 1380

aaagtcggca caactgaaat atggtccatt atcaacccga cacgcggaac acatccgatc 1440

cacctgcatc tagtctcctt ccgtgtatta gaccggcggc cgtttgatat cgcccgttat 1500

caagaaagcg gggaattgtc ctataccggt ccggctgtcc cgccgccgcc aagtgaaaag 1560

ggctggaaag acaccattca agcgcatgca ggtgaagtcc tgagaatcgc ggcgacattc 1620

ggtccgtaca gcggacgata cgtatggcat tgccatattc tagagcatga agactatgac 1680

atgatgagac cgatggatat aactgatccc cataaaatga cccagcccga cccgtcatac 1740

gtcaaatggc tcgaagaccg cgccatgctc aaggcctccc aggaccgggc cagcctgtac 1800

tcaggccagt cgcgcctgtg gcagcaaccc tatgccgagg cccagccccg ccgcgccacc 1860

gaaatcgcct cggtgtggct gacggtctac cccgacgcca tcatcgcgcc cgagggttgc 1920

tcggtgctcg gtgccctggc ccacgaagcg ttgtggaagc gcctgtcgga gatcggcgta 1980

cagggcctgc acaccggccc gatcaaactg tccggtggca tccgcggccg cgaactcacc 2040

cccagcgtgg acggcaactt cgaccgcatc agcttcgaca tcgacccact gtacggcagc 2100

gagcaggaac tgatccagat gagccgcatg gccgctgcgc acaatgccgt gaccatcgac 2160

gacctgatcc cctcgcacac cggcaagggc gccgacttcc gcctggccga gctcgcccat 2220

ggcccctacc cggggctgta ccacatggtc gagatccgcg aagaagactg ggcgctgctg 2280

cccgaggtgc ccgccgggcg cgatgcggtc aatctgctgc cagctcagtg tgacgagctg 2340

aaggcgcgcc attacatcgt tggccagctg caacgggtaa tcttcttcga gccgggcgtg 2400

aaggaaaccg actggagcgc cacgccgccg atcacaggcg tcgacggcaa gacccgccgc 2460

tgggtgtacc tgcattactt caaggaaggc cagccctcgc tgaactggct ggaccctacc 2520

ttcgccgccc aacagatgat cattggtgac gcactgcacg cgctggactg cctgggtgca 2580

cgcggcctgc gcctggacgc caacggcttt ctcggcgtgg aaacccgcgc cagcggcacc 2640

gcctggtcgg aaagccaccc gctgtcgctc gtcggcaacc agctgatcgg tggcatgatc 2700

cgcaaggccg gcggtttcag cttccaggag ctgaacctga ccctcgatga cattgcgcag 2760

atgtccaagg gtggtgccga cctgtcctac gatttcatta cccggccggc ctaccagcat 2820

gcgctgctga cgggcgacac cgagttcctg cgcctgatgc tcaaggagat gcacgccttc 2880

ggcatcgacc cggcctcgct catccatgcc ctgcaaaacc atgacgagct gaccgtggag 2940

ctggtgcact tctggacact gcacgcgcac gatatgtacc tgtacaaggg ccaaaccctg 3000

cctggcagca tcctgcgcga acatattcgc gaagagatct acgaacggct gtcgggggaa 3060

catgcgccgt acaacctgcg cttcgtgacc aacggcattg cctgcaccac cgccagcctg 3120

atcgctgctg cactgggtat tcgcgacctc gaacagattg gtgtagcgga tatcgaactg 3180

atcaagaagg tgcacctgct gctggtcatg tacaacgcca tgcagccggg ggtggtcgcc 3240

ttgtccggct gggacctggt cggtgccctg cccttgcccg ccgaagcggt tgccgaacgc 3300

atgctcgatg gcgatacccg ctggattcac cggggcggct atgacctggc cgggcttgac 3360

ccacaggcag aggcttctgt gcggggcatg ccgcgtgccc gggcgctata cggcagcctg 3420

gacaggcagc tggacgagag tgattcattt gcctgcaagg tgaagaaact gctggctgtg 3480

cgccaggcct acggcatcgc caccagccgt caggtgctgg tacctgaggt gagcagcccg 3540

gggctgctgg tgatggtgca tgagctgcca gccgggcgcg gtatccagat cactgcgctg 3600

aacttcggcc aggacgcgat tgccgaggaa ctgctgttga ccgggttcac acctgggccg 3660

gtggtcgaca tgatcaacga gacggtcgaa ggcgatttga ccgaggacgg gcgcctgatg 3720

gtgaacctgg acccgtacga ggcgctgtgc ctgcggatcg tcaacagcag cgggcatgtt 3780

caccaccacc accaccactg aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc ggataaatcg 3840

tttgggccga tgaaaaatcg gctctttatt ttgatttgtt tttgtgtcat ctgtcttttt 3900

ctatcatttg gacagccctt ttttccttct atgattttaa ctgtccaagc cgcaaaatct 3960

actcgccgta taataaagcg tagtaaaaat aaaggaggag tatatatggg ttattacaaa 4020

aaatacaaag aagagtatta tacggtcaaa aaaacgtatt ataagaagta ttacgaatat 4080

gataaaaaag attatgactg tgattacgac aaaaaatatg atgactatga taaaaaatat 4140

tatgatcacg ataaaaaaga ctatgattat gttgtagagt ataaaaagca taaaaaacac 4200

tacggtacca tgacccagcc cgacccgtca tacgtcaaat ggctcgaaga ccgcgccatg 4260

ctcaaggcct cccaggaccg ggccagcctg tactcaggcc agtcgcgcct gtggcagcaa 4320

ccctatgccg aggcccagcc ccgccgcgcc accgaaatcg cctcggtgtg gctgacggtc 4380

taccccgacg ccatcatcgc gcccgagggt tgctcggtgc tcggtgccct ggcccacgaa 4440

gcgttgtgga agcgcctgtc ggagatcggc gtacagggcc tgcacaccgg cccgatcaaa 4500

ctgtccggtg gcatccgcgg ccgcgaactc acccccagcg tggacggcaa cttcgaccgc 4560

atcagcttcg acatcgaccc actgtacggc agcgagcagg aactgatcca gatgagccgc 4620

atggccgctg cgcacaatgc cgtgaccatc gacgacctga tcccctcgca caccggcaag 4680

ggcgccgact tccgcctggc cgagctcgcc catggcccct acccggggct gtaccacatg 4740

gtcgagatcc gcgaagaaga ctgggcgctg ctgcccgagg tgcccgccgg gcgcgatgcg 4800

gtcaatctgc tgccagctca gtgtgacgag ctgaaggcgc gccattacat cgttggccag 4860

ctgcaacggg taatcttctt cgagccgggc gtgaaggaaa ccgactggag cgccacgccg 4920

ccgatcacag gcgtcgacgg caagacccgc cgctgggtgt acctgcatta cttcaaggaa 4980

ggccagccct cgctgaactg gctggaccct accttcgccg cccaacagat gatcattggt 5040

gacgcactgc acgcgctgga ctgcctgggt gcacgcggcc tgcgcctgga cgccaacggc 5100

tttctcggcg tggaaacccg cgccagcggc accgcctggt cggaaagcca cccgctgtcg 5160

ctcgtcggca accagctgat cggtggcatg atccgcaagg ccggcggttt cagcttccag 5220

gagctgaacc tgaccctcga tgacattgcg cagatgtcca agggtggtgc cgacctgtcc 5280

tacgatttca ttacccggcc ggcctaccag catgcgctgc tgacgggcga caccgagttc 5340

ctgcgcctga tgctcaagga gatgcacgcc ttcggcatcg acccggcctc gctcatccat 5400

gccctgcaaa accatgacga gctgaccgtg gagctggtgc acttctggac actgcacgcg 5460

cacgatatgt acctgtacaa gggccaaacc ctgcctggca gcatcctgcg cgaacatatt 5520

cgcgaagaga tctacgaacg gctgtcgggg gaacatgcgc cgtacaacct gcgcttcgtg 5580

accaacggca ttgcctgcac caccgccagc ctgatcgctg ctgcactggg tattcgcgac 5640

ctcgaacaga ttggtgtagc ggatatcgaa ctgatcaaga aggtgcacct gctgctggtc 5700

atgtacaacg ccatgcagcc gggggtggtc gccttgtccg gctgggacct ggtcggtgcc 5760

ctgcccttgc ccgccgaagc ggttgccgaa cgcatgctcg atggcgatac ccgctggatt 5820

caccggggcg gctatgacct ggccgggctt gacccacagg cagaggcttc tgtgcggggc 5880

atgccgcgtg cccgggcgct atacggcagc ctggacaggc agctggacga gagtgattca 5940

tttgcctgca aggtgaagaa actgctggct gtgcgccagg cctacggcat cgccaccagc 6000

cgtcaggtgc tggtacctga ggtgagcagc ccggggctgc tggtgatggt gcatgagctg 6060

ccagccgggc gcggtatcca gatcactgcg ctgaacttcg gccaggacgc gattgccgag 6120

gaactgctgt tgaccgggtt cacacctggg ccggtggtcg acatgatcaa cgagacggtc 6180

gaaggcgatt tgaccgagga cgggcgcctg atggtgaacc tggacccgta cgaggcgctg 6240

tgcctgcgga tcgtcaacag cagcgggcat gttcaccacc accaccacca ctgacgagct 6300

cgctctctaa acacggtgcc tttacaggcc cgtgtttttt tatcatttgt gcggttaaaa 6360

atgaactaaa taatctatgt accaaatgtt caattggttt ttctgtgctc agccgcgtat 6420

aaactttatc gcacttataa gtaaagtttc taggcacccc tgcatacaat ggaacagaaa 6480

ctttgtattt ttatatttta tttataaaaa tgcacactag acaaatgccc agcataagat 6540

aacacgaaga agaacaagga ggcatgccgg aatgtctgaa tacagggaaa ttattacgaa 6600

ggcagtagta gcgaaaggcc gaaaattcac ccaatgcacc aacaccatct cgcctgagaa 6660

aaaaccgagc agcattttgg gtggttggat tattaaccac aagtatgacg ctgaaaaaat 6720

tggaaaaacg gtagaaattg aagggtatta tgatataaac gtatggtact cttacgcgga 6780

caacacaaag acagaggttg tcacagaacg ggtaaaatat gtagatgtca ttaaactcag 6840

atacagagac aataattact tagatgatga gcatgaagtg attgccaaag tgcttcagca 6900

gccaaactgc cttgaagtga ccatttcgcc gaatggaaat aaaatcgttg tgcaggcaga 6960

aagagaattt ttggcggaag tggtagggga aacaaaggta gttgttgagg tcaatcctga 7020

ctgggaagag gatgacgagg aagattggga agatgagctt gatgaagagc ttgaagacat 7080

caacccggag tttttagtgg gagatcctga agaaatgacc cagcccgacc cgtcatacgt 7140

caaatggctc gaagaccgcg ccatgctcaa ggcctcccag gaccgggcca gcctgtactc 7200

aggccagtcg cgcctgtggc agcaacccta tgccgaggcc cagccccgcc gcgccaccga 7260

aatcgcctcg gtgtggctga cggtctaccc cgacgccatc atcgcgcccg agggttgctc 7320

ggtgctcggt gccctggccc acgaagcgtt gtggaagcgc ctgtcggaga tcggcgtaca 7380

gggcctgcac accggcccga tcaaactgtc cggtggcatc cgcggccgcg aactcacccc 7440

cagcgtggac ggcaacttcg accgcatcag cttcgacatc gacccactgt acggcagcga 7500

gcaggaactg atccagatga gccgcatggc cgctgcgcac aatgccgtga ccatcgacga 7560

cctgatcccc tcgcacaccg gcaagggcgc cgacttccgc ctggccgagc tcgcccatgg 7620

cccctacccg gggctgtacc acatggtcga gatccgcgaa gaagactggg cgctgctgcc 7680

cgaggtgccc gccgggcgcg atgcggtcaa tctgctgcca gctcagtgtg acgagctgaa 7740

ggcgcgccat tacatcgttg gccagctgca acgggtaatc ttcttcgagc cgggcgtgaa 7800

ggaaaccgac tggagcgcca cgccgccgat cacaggcgtc gacggcaaga cccgccgctg 7860

ggtgtacctg cattacttca aggaaggcca gccctcgctg aactggctgg accctacctt 7920

cgccgcccaa cagatgatca ttggtgacgc actgcacgcg ctggactgcc tgggtgcacg 7980

cggcctgcgc ctggacgcca acggctttct cggcgtggaa acccgcgcca gcggcaccgc 8040

ctggtcggaa agccacccgc tgtcgctcgt cggcaaccag ctgatcggtg gcatgatccg 8100

caaggccggc ggtttcagct tccaggagct gaacctgacc ctcgatgaca ttgcgcagat 8160

gtccaagggt ggtgccgacc tgtcctacga tttcattacc cggccggcct accagcatgc 8220

gctgctgacg ggcgacaccg agttcctgcg cctgatgctc aaggagatgc acgccttcgg 8280

catcgacccg gcctcgctca tccatgccct gcaaaaccat gacgagctga ccgtggagct 8340

ggtgcacttc tggacactgc acgcgcacga tatgtacctg tacaagggcc aaaccctgcc 8400

tggcagcatc ctgcgcgaac atattcgcga agagatctac gaacggctgt cgggggaaca 8460

tgcgccgtac aacctgcgct tcgtgaccaa cggcattgcc tgcaccaccg ccagcctgat 8520

cgctgctgca ctgggtattc gcgacctcga acagattggt gtagcggata tcgaactgat 8580

caagaaggtg cacctgctgc tggtcatgta caacgccatg cagccggggg tggtcgcctt 8640

gtccggctgg gacctggtcg gtgccctgcc cttgcccgcc gaagcggttg ccgaacgcat 8700

gctcgatggc gatacccgct ggattcaccg gggcggctat gacctggccg ggcttgaccc 8760

acaggcagag gcttctgtgc ggggcatgcc gcgtgcccgg gcgctatacg gcagcctgga 8820

caggcagctg gacgagagtg attcatttgc ctgcaaggtg aagaaactgc tggctgtgcg 8880

ccaggcctac ggcatcgcca ccagccgtca ggtgctggta cctgaggtga gcagcccggg 8940

gctgctggtg atggtgcatg agctgccagc cgggcgcggt atccagatca ctgcgctgaa 9000

cttcggccag gacgcgattg ccgaggaact gctgttgacc gggttcacac ctgggccggt 9060

ggtcgacatg atcaacgaga cggtcgaagg cgatttgacc gaggacgggc gcctgatggt 9120

gaacctggac ccgtacgagg cgctgtgcct gcggatcgtc aacagcagcg ggcatgttca 9180

ccaccaccac caccactgag tttaaaccgt aaagcggtaa attggattga ttcttcatcc 9240

ataatcctcc ttacaaattt taggctttta tttttataag atctcagcgg aacacttata 9300

cactttttaa aaccgcgcgt actatgaggg tagtaaggat cttcatcctt aacatatttt 9360

taaaaggagg atttcaaatt gggccactat tcccattctg acatcgaaga agcggtgaaa 9420

tccgcaaaaa aagaaggttt aaaggattat ttataccaag agcctcatgg aaaaaaacgc 9480

agtcataaaa agtcgcaccg cactcacaaa aaatctcgca gccataaaaa atcatactgc 9540

tctcacaaaa aatctcgcag tcacaaaaaa tcattctgtt ctcacaaaaa atctcgcagc 9600

cacaaaaaat catactgctc tcacaagaaa tctcgcagcc acaaaaaatc gtaccgttct 9660

cacaaaaaat ctcgcagcta taaaaaatct taccgttctt acaaaaaatc tcgtagctat 9720

aaaaaatctt gccgttctta caaaaaatct cgcagctaca aaaagtctta ctgttctcac 9780

aagaaaaaat ctcgcagcta taagaagtca tgccgcacac acaaaaaatc ttatcgttcc 9840

cataagaaat actacaaaaa accgcaccac cactgcgacg actacaaaag acacgatgat 9900

tatgacagca aaaaagaata ctggaaagac ggcaattgct gggtagtcaa aaagaaatac 9960

aaaatgaccc agcccgaccc gtcatacgtc aaatggctcg aagaccgcgc catgctcaag 10020

gcctcccagg accgggccag cctgtactca ggccagtcgc gcctgtggca gcaaccctat 10080

gccgaggccc agccccgccg cgccaccgaa atcgcctcgg tgtggctgac ggtctacccc 10140

gacgccatca tcgcgcccga gggttgctcg gtgctcggtg ccctggccca cgaagcgttg 10200

tggaagcgcc tgtcggagat cggcgtacag ggcctgcaca ccggcccgat caaactgtcc 10260

ggtggcatcc gcggccgcga actcaccccc agcgtggacg gcaacttcga ccgcatcagc 10320

ttcgacatcg acccactgta cggcagcgag caggaactga tccagatgag ccgcatggcc 10380

gctgcgcaca atgccgtgac catcgacgac ctgatcccct cgcacaccgg caagggcgcc 10440

gacttccgcc tggccgagct cgcccatggc ccctacccgg ggctgtacca catggtcgag 10500

atccgcgaag aagactgggc gctgctgccc gaggtgcccg ccgggcgcga tgcggtcaat 10560

ctgctgccag ctcagtgtga cgagctgaag gcgcgccatt acatcgttgg ccagctgcaa 10620

cgggtaatct tcttcgagcc gggcgtgaag gaaaccgact ggagcgccac gccgccgatc 10680

acaggcgtcg acggcaagac ccgccgctgg gtgtacctgc attacttcaa ggaaggccag 10740

ccctcgctga actggctgga ccctaccttc gccgcccaac agatgatcat tggtgacgca 10800

ctgcacgcgc tggactgcct gggtgcacgc ggcctgcgcc tggacgccaa cggctttctc 10860

ggcgtggaaa cccgcgccag cggcaccgcc tggtcggaaa gccacccgct gtcgctcgtc 10920

ggcaaccagc tgatcggtgg catgatccgc aaggccggcg gtttcagctt ccaggagctg 10980

aacctgaccc tcgatgacat tgcgcagatg tccaagggtg gtgccgacct gtcctacgat 11040

ttcattaccc ggccggccta ccagcatgcg ctgctgacgg gcgacaccga gttcctgcgc 11100

ctgatgctca aggagatgca cgccttcggc atcgacccgg cctcgctcat ccatgccctg 11160

caaaaccatg acgagctgac cgtggagctg gtgcacttct ggacactgca cgcgcacgat 11220

atgtacctgt acaagggcca aaccctgcct ggcagcatcc tgcgcgaaca tattcgcgaa 11280

gagatctacg aacggctgtc gggggaacat gcgccgtaca acctgcgctt cgtgaccaac 11340

ggcattgcct gcaccaccgc cagcctgatc gctgctgcac tgggtattcg cgacctcgaa 11400

cagattggtg tagcggatat cgaactgatc aagaaggtgc acctgctgct ggtcatgtac 11460

aacgccatgc agccgggggt ggtcgccttg tccggctggg acctggtcgg tgccctgccc 11520

ttgcccgccg aagcggttgc cgaacgcatg ctcgatggcg atacccgctg gattcaccgg 11580

ggcggctatg acctggccgg gcttgaccca caggcagagg cttctgtgcg gggcatgccg 11640

cgtgcccggg cgctatacgg cagcctggac aggcagctgg acgagagtga ttcatttgcc 11700

tgcaaggtga agaaactgct ggctgtgcgc caggcctacg gcatcgccac cagccgtcag 11760

gtgctggtac ctgaggtgag cagcccgggg ctgctggtga tggtgcatga gctgccagcc 11820

gggcgcggta tccagatcac tgcgctgaac ttcggccagg acgcgattgc cgaggaactg 11880

ctgttgaccg ggttcacacc tgggccggtg gtcgacatga tcaacgagac ggtcgaaggc 11940

gatttgaccg aggacgggcg cctgatggtg aacctggacc cgtacgaggc gctgtgcctg 12000

cggatcgtca acagcagcgg gcatgttcac caccaccacc accactgacg agctcgcctt 12060

ctttttttgc ggatttcacc gcttcttcga tgtcagaatg ggaatagtgg cccaatttga 12120

aatcctcctt ttaaaaatat gttaaggatg aagatcctta ctaccctcat agtacgcgcg 12180

gttttaaaaa gtgtataagt gttccgctga gatcttataa aaataaaagc ctaaaatttg 12240

taaggaggat tatggatgaa gaatcaatcc aatttaccgc tttatcagct gtttgttcat 12300

ccaaaagact tgcgtgaatt aaaaaaggat atatgggacg atgatccggt gccagctgtg 12360

atgaaggtaa atcaaaaaag gctggatatt gatatcgctt atcggggatc acatatcaga 12420

gacttcaaaa agaagtcata ccatatttcc ttttatcagc cgaaaacatt ccgcggcgcg 12480

cgagagattc acttaaatgc ggagtataaa gacccttcct tgatgagaaa caaattgtct 12540

ctggattttt tctcggagct agggacactg tctccaaagg cagagtttgc gtttgtaaag 12600

atgaatggga agaatgaagg ggtttatctt gaacttgaat ccgtagatga atattatttg 12660

gcgaaaagga agctggctga tggcgcgatt ttttatgcgg tggatgatga tgccaacttt 12720

tctctgatga gcgatttaga aagggaaacg aaaacatcgc tggagcttgg atatgaaaag 12780

aaaacaggga ctgaggaaga tgatttttat ttacaagata tgatttttaa aattaatacg 12840

gtccctaaag ctcagtttaa gtcagaagtg acaaaacacg tggatgtcga taagtatttg 12900

cgctggcttg ctggtattgt attcacctcg aactatgacg ggtttgtcca caactacgca 12960

ttatacagaa gcggggaaac cggattattt gaggtgattc cttgggatta tgatgcgact 13020

tggggcaggg atatccatgg agagcggatg gctgccgatt atgtaagaat tcaaggattt 13080

aatacactaa ccgcccggat attggatgaa tccgagtttc gcaagtccta caagcgcctg 13140

ttagaaaaaa cgctccaatc tctttttaca atagaatata tggaaccgaa aatcatggcg 13200

atgtatgaac ggattaggcc gtttgtcctc atggacccgt ataaaaagaa tgatattgag 13260

cgttttgacc gtgagccgga tgtgatctgc gagtatatta aaaaccgttc acaatacctc 13320

aaagatcatt taagtatttt aatgacccag cccgacccgt catacgtcaa atggctcgaa 13380

gaccgcgcca tgctcaaggc ctcccaggac cgggccagcc tgtactcagg ccagtcgcgc 13440

ctgtggcagc aaccctatgc cgaggcccag ccccgccgcg ccaccgaaat cgcctcggtg 13500

tggctgacgg tctaccccga cgccatcatc gcgcccgagg gttgctcggt gctcggtgcc 13560

ctggcccacg aagcgttgtg gaagcgcctg tcggagatcg gcgtacaggg cctgcacacc 13620

ggcccgatca aactgtccgg tggcatccgc ggccgcgaac tcacccccag cgtggacggc 13680

aacttcgacc gcatcagctt cgacatcgac ccactgtacg gcagcgagca ggaactgatc 13740

cagatgagcc gcatggccgc tgcgcacaat gccgtgacca tcgacgacct gatcccctcg 13800

cacaccggca agggcgccga cttccgcctg gccgagctcg cccatggccc ctacccgggg 13860

ctgtaccaca tggtcgagat ccgcgaagaa gactgggcgc tgctgcccga ggtgcccgcc 13920

gggcgcgatg cggtcaatct gctgccagct cagtgtgacg agctgaaggc gcgccattac 13980

atcgttggcc agctgcaacg ggtaatcttc ttcgagccgg gcgtgaagga aaccgactgg 14040

agcgccacgc cgccgatcac aggcgtcgac ggcaagaccc gccgctgggt gtacctgcat 14100

tacttcaagg aaggccagcc ctcgctgaac tggctggacc ctaccttcgc cgcccaacag 14160

atgatcattg gtgacgcact gcacgcgctg gactgcctgg gtgcacgcgg cctgcgcctg 14220

gacgccaacg gctttctcgg cgtggaaacc cgcgccagcg gcaccgcctg gtcggaaagc 14280

cacccgctgt cgctcgtcgg caaccagctg atcggtggca tgatccgcaa ggccggcggt 14340

ttcagcttcc aggagctgaa cctgaccctc gatgacattg cgcagatgtc caagggtggt 14400

gccgacctgt cctacgattt cattacccgg ccggcctacc agcatgcgct gctgacgggc 14460

gacaccgagt tcctgcgcct gatgctcaag gagatgcacg ccttcggcat cgacccggcc 14520

tcgctcatcc atgccctgca aaaccatgac gagctgaccg tggagctggt gcacttctgg 14580

acactgcacg cgcacgatat gtacctgtac aagggccaaa ccctgcctgg cagcatcctg 14640

cgcgaacata ttcgcgaaga gatctacgaa cggctgtcgg gggaacatgc gccgtacaac 14700

ctgcgcttcg tgaccaacgg cattgcctgc accaccgcca gcctgatcgc tgctgcactg 14760

ggtattcgcg acctcgaaca gattggtgta gcggatatcg aactgatcaa gaaggtgcac 14820

ctgctgctgg tcatgtacaa cgccatgcag ccgggggtgg tcgccttgtc cggctgggac 14880

ctggtcggtg ccctgccctt gcccgccgaa gcggttgccg aacgcatgct cgatggcgat 14940

acccgctgga ttcaccgggg cggctatgac ctggccgggc ttgacccaca ggcagaggct 15000

tctgtgcggg gcatgccgcg tgcccgggcg ctatacggca gcctggacag gcagctggac 15060

gagagtgatt catttgcctg caaggtgaag aaactgctgg ctgtgcgcca ggcctacggc 15120

atcgccacca gccgtcaggt gctggtacct gaggtgagca gcccggggct gctggtgatg 15180

gtgcatgagc tgccagccgg gcgcggtatc cagatcactg cgctgaactt cggccaggac 15240

gcgattgccg aggaactgct gttgaccggg ttcacacctg ggccggtggt cgacatgatc 15300

aacgagacgg tcgaaggcga tttgaccgag gacgggcgcc tgatggtgaa cctggacccg 15360

tacgaggcgc tgtgcctgcg gatcgtcaac agcagcgggc atgttcacca ccaccaccac 15420

cactgaaagc ttatcgaatt cctgcagccc tggcgaatgg cgattttcgt tcgtgaatac 15480

atgttataat aactataact aataacgtaa cgtgactggc aagagatatt tttaaaacaa 15540

tgaataggtt tacacttact ttagttttat ggaaatgaaa gatcatatca tatataatct 15600

agaataaaat taactaaaat aattattatc tagataaaaa atttagaagc caatgaaatc 15660

tataaataaa ctaaattaag tttatttaat taacaactat ggatataaaa taggtactaa 15720

tcaaaatagt gaggaggata tatttgaata catacgaaca aattaataaa gtgaaaaaaa 15780

tacttcggaa acatttaaaa aataacctta ttggtactta catgtttgga tcaggagttg 15840

agagtggact aaaaccaaat agtgatcttg actttttagt cgtcgtatct gaaccattga 15900

cagatcaaag taaagaaata cttatacaaa aaattagacc tatttcaaaa aaaataggag 15960

ataaaagcaa cttacgatat attgaattaa caattattat tcagcaagaa atggtaccgt 16020

ggaatcatcc tcccaaacaa gaatttattt atggagaatg gttacaagag ctttatgaac 16080

aaggatacat tcctcagaag gaattaaatt cagatttaac cataatgctt taccaagcaa 16140

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cattttctga tgtgagaaga gccattatgg attcgtcaga ggaattaata gataattatc 16260

aggatgatga aaccaactct atattaactt tatgccgtat gattttaact atggacacgg 16320

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atagggagag aattttgtta gcagttcgta gttatcttgg agagaatatt gaatggacta 16440

atgaaaatgt aaatttaact ataaactatt taaataacag attaaaaaaa ttataaaaaa 16500

attgaaaaaa tggtggaaac acttttttca atttttttgt tttattattt aatatttggg 16560

aaatattcat tctaattggt aatcagattt tagaaaacaa taaacccttg cataggggga 16620

tctcgacatg gatgagcgat gatgatatcc gtttaggctg ggcggtgata gcttctcgtt 16680

caggcagtac gcctcttttc ttttccagac ctgagggagg cggaaatggt gtgaggttcc 16740

cggggaaaag ccaaataggc gatcgcggga gtgctttatt tgaagatcag gctatcactg 16800

cggtcaatag atttcacaat gtgatggctg gacagcctga ggaactctcg aacccgaatg 16860

gaaacaacca gatatttatg aatcagcgcg gctcacatgg cgttgtgctg gcaaatgcag 16920

gttcatcctc tgtctctatc aatacggcaa caaaattgcc tgatggcagg tatgacaata 16980

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ggtctgtagc tgtgctttat cctgatgata ttgcaaaagc gcctcatgtt ttccttgaga 17100

attacaaaac aggtgtaaca cattctttca atgatcaact gacgattacc ttgcgtgcag 17160

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tgttaaaagg aacgaacagt gatggtgtaa cgaggaccga gaaatacagt tttgttaaaa 17340

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atgcttatat ctataaacat gatgggagcc gagtaattga attgaccgga tcttggcctg 17460

gaaaaccaat gactaaaaat gcagacggaa tttacacgct gacgctgcct gcggacacgg 17520

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ttccccattg agggcaaggc tagacgggac ttaccgaaag aaaccatcaa tgatggtttc 17700

ttttttgttc ataaatcaga caaaactttt ctcttgcaaa agtttgtgaa gtgttgcaca 17760

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ataagtaagt taagggatgc ataaactgca tcccttaact tgtttttcgt gtgcctattt 19800

tttgtgaatc gattatgtct tttgcgcagt cggcttaaac cagttttcgc tggtgcgaaa 19860

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tttatatatt cttgaataac atacgccgag ttatcacata aaagcgggaa ccaatcatca 19980

aatttaaact tcattgcata atccattaaa ctcttaaatt ctacgattcc ttgttcatca 20040

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gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tgatagctct 21060

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 21120

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cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 21240

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 21300

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 21360

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 21420

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 21480

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 21540

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 21600

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 21660

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 21720

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 21780

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 21840

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 21900

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga 21960

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 22020

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 22080

tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 22140

ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 22200

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 22260

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 22320

attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa 22380

gaattaacaa aattctccag tcttcacatc ggtttgaaag gaggaagcgg aagaatgaag 22440

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tgtttgcaaa acgattcaaa acctctttac tgccgttatt cgctggattt ttattgctgt 22560

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atacgttaaa acacaatatg aaggatattc atgatgcagg atatacagcc attcagacat 22740

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ttaaagaaat gtgtgcagcc gctgaagaat atggcataaa ggtcattgtt gacgcggtca 22920

tcaatcatac caccagtgat tatgccgcga tttccaatga ggttaagagt attccaaact 22980

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<210> 2

<211> 3796

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cgacccgata tcctgcctta atgctgatca aatcctaaac ggcctgccgt ttaggatttt 60

gttattttct tcttcgggcg ggctgcagca cgaagatttt ttgtaaccat cacgtcctta 120

ttgtcattaa ctatagtacc aatttggaaa atttagataa ggacagatga aaatgacact 180

tgaaaaattt gtggatgctc tcccaatccc agatacacta aagccagtac agcaatcaaa 240

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gattgatcac accattcatc acagtgacag ccagcatgaa gagcccgagg taaagactgt 480

tgttcattta cacggcggcg tcacgccaga tgatagtgac gggtatccgg aggcttggtt 540

ttccaaagac tttgaacaaa caggacctta tttcaaaaga gaggtttatc attatccaaa 600

ccagcagcgc ggggctatat tgtggtatca cgatcacgcc atggcgctca ccaggctaaa 660

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tggttctttg ttttatccga gcgcaccgga aaacccttct ccgtcactgc ctaatccttc 840

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cggtgacgtc aatcctgaaa cagatgcgaa tatcatgcaa ttcagagtca caaaaccatt 1200

ggcacaaaaa gacgaaagca gaaagccgaa gtacctcgcc tcataccctt cggtacagca 1260

tgaaagaata caaaacatca gaacgttaaa actggcaggc acccaggacg aatacggcag 1320

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gcatctagtc tccttccgtg tattagaccg gcggccgttt gatatcgccc gttatcaaga 1500

aagcggggaa ttgtcctata ccggtccggc tgtcccgccg ccgccaagtg aaaagggctg 1560

gaaagacacc attcaagcgc atgcaggtga agtcctgaga atcgcggcga cattcggtcc 1620

gtacagcgga cgatacgtat ggcattgcca tattctagag catgaagact atgacatgat 1680

gagaccgatg gatataactg atccccataa aatgacccag cccgacccgt catacgtcaa 1740

atggctcgaa gaccgcgcca tgctcaaggc ctcccaggac cgggccagcc tgtactcagg 1800

ccagtcgcgc ctgtggcagc aaccctatgc cgaggcccag ccccgccgcg ccaccgaaat 1860

cgcctcggtg tggctgacgg tctaccccga cgccatcatc gcgcccgagg gttgctcggt 1920

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<210> 3

<211> 2493

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

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ctctttattt tgatttgttt ttgtgtcatc tgtctttttc tatcatttgg acagcccttt 120

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agtaaaaata aaggaggagt atatatgggt tattacaaaa aatacaaaga agagtattat 240

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gattacgaca aaaaatatga tgactatgat aaaaaatatt atgatcacga taaaaaagac 360

tatgattatg ttgtagagta taaaaagcat aaaaaacact acggtaccat gacccagccc 420

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

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ttaaaaatga actaaataat ctatgtacca aatgttcaat tggtttttct gtgctcagcc 120

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cagaaacttt gtatttttat attttattta taaaaatgca cactagacaa atgcccagca 240

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tacgaaggca gtagtagcga aaggccgaaa attcacccaa tgcaccaaca ccatctcgcc 360

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<210> 5

<211> 2841

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

cgtaaagcgg taaattggat tgattcttca tccataatcc tccttacaaa ttttaggctt 60

ttatttttat aagatctcag cggaacactt atacactttt taaaaccgcg cgtactatga 120

gggtagtaag gatcttcatc cttaacatat ttttaaaagg aggatttcaa attgggccac 180

tattcccatt ctgacatcga agaagcggtg aaatccgcaa aaaaagaagg tttaaaggat 240

tatttatacc aagagcctca tggaaaaaaa cgcagtcata aaaagtcgca ccgcactcac 300

aaaaaatctc gcagccataa aaaatcatac tgctctcaca aaaaatctcg cagtcacaaa 360

aaatcattct gttctcacaa aaaatctcgc agccacaaaa aatcatactg ctctcacaag 420

aaatctcgca gccacaaaaa atcgtaccgt tctcacaaaa aatctcgcag ctataaaaaa 480

tcttaccgtt cttacaaaaa atctcgtagc tataaaaaat cttgccgttc ttacaaaaaa 540

tctcgcagct acaaaaagtc ttactgttct cacaagaaaa aatctcgcag ctataagaag 600

tcatgccgca cacacaaaaa atcttatcgt tcccataaga aatactacaa aaaaccgcac 660

caccactgcg acgactacaa aagacacgat gattatgaca gcaaaaaaga atactggaaa 720

gacggcaatt gctgggtagt caaaaagaaa tacaaaatga cccagcccga cccgtcatac 780

gtcaaatggc tcgaagaccg cgccatgctc aaggcctccc aggaccgggc cagcctgtac 840

tcaggccagt cgcgcctgtg gcagcaaccc tatgccgagg cccagccccg ccgcgccacc 900

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atcaagaagg tgcacctgct gctggtcatg tacaacgcca tgcagccggg ggtggtcgcc 2280

ttgtccggct gggacctggt cggtgccctg cccttgcccg ccgaagcggt tgccgaacgc 2340

atgctcgatg gcgatacccg ctggattcac cggggcggct atgacctggc cgggcttgac 2400

ccacaggcag aggcttctgt gcggggcatg ccgcgtgccc gggcgctata cggcagcctg 2460

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gggctgctgg tgatggtgca tgagctgcca gccgggcgcg gtatccagat cactgcgctg 2640

aacttcggcc aggacgcgat tgccgaggaa ctgctgttga ccgggttcac acctgggccg 2700

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caccaccacc accaccactg a 2841

<210> 6

<211> 3378

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

cgagctcgcc ttcttttttt gcggatttca ccgcttcttc gatgtcagaa tgggaatagt 60

ggcccaattt gaaatcctcc ttttaaaaat atgttaagga tgaagatcct tactaccctc 120

atagtacgcg cggttttaaa aagtgtataa gtgttccgct gagatcttat aaaaataaaa 180

gcctaaaatt tgtaaggagg attatggatg aagaatcaat ccaatttacc gctttatcag 240

ctgtttgttc atccaaaaga cttgcgtgaa ttaaaaaagg atatatggga cgatgatccg 300

gtgccagctg tgatgaaggt aaatcaaaaa aggctggata ttgatatcgc ttatcgggga 360

tcacatatca gagacttcaa aaagaagtca taccatattt ccttttatca gccgaaaaca 420

ttccgcggcg cgcgagagat tcacttaaat gcggagtata aagacccttc cttgatgaga 480

aacaaattgt ctctggattt tttctcggag ctagggacac tgtctccaaa ggcagagttt 540

gcgtttgtaa agatgaatgg gaagaatgaa ggggtttatc ttgaacttga atccgtagat 600

gaatattatt tggcgaaaag gaagctggct gatggcgcga ttttttatgc ggtggatgat 660

gatgccaact tttctctgat gagcgattta gaaagggaaa cgaaaacatc gctggagctt 720

ggatatgaaa agaaaacagg gactgaggaa gatgattttt atttacaaga tatgattttt 780

aaaattaata cggtccctaa agctcagttt aagtcagaag tgacaaaaca cgtggatgtc 840

gataagtatt tgcgctggct tgctggtatt gtattcacct cgaactatga cgggtttgtc 900

cacaactacg cattatacag aagcggggaa accggattat ttgaggtgat tccttgggat 960

tatgatgcga cttggggcag ggatatccat ggagagcgga tggctgccga ttatgtaaga 1020

attcaaggat ttaatacact aaccgcccgg atattggatg aatccgagtt tcgcaagtcc 1080

tacaagcgcc tgttagaaaa aacgctccaa tctcttttta caatagaata tatggaaccg 1140

aaaatcatgg cgatgtatga acggattagg ccgtttgtcc tcatggaccc gtataaaaag 1200

aatgatattg agcgttttga ccgtgagccg gatgtgatct gcgagtatat taaaaaccgt 1260

tcacaatacc tcaaagatca tttaagtatt ttaatgaccc agcccgaccc gtcatacgtc 1320

aaatggctcg aagaccgcgc catgctcaag gcctcccagg accgggccag cctgtactca 1380

ggccagtcgc gcctgtggca gcaaccctat gccgaggccc agccccgccg cgccaccgaa 1440

atcgcctcgg tgtggctgac ggtctacccc gacgccatca tcgcgcccga gggttgctcg 1500

gtgctcggtg ccctggccca cgaagcgttg tggaagcgcc tgtcggagat cggcgtacag 1560

ggcctgcaca ccggcccgat caaactgtcc ggtggcatcc gcggccgcga actcaccccc 1620

agcgtggacg gcaacttcga ccgcatcagc ttcgacatcg acccactgta cggcagcgag 1680

caggaactga tccagatgag ccgcatggcc gctgcgcaca atgccgtgac catcgacgac 1740

ctgatcccct cgcacaccgg caagggcgcc gacttccgcc tggccgagct cgcccatggc 1800

ccctacccgg ggctgtacca catggtcgag atccgcgaag aagactgggc gctgctgccc 1860

gaggtgcccg ccgggcgcga tgcggtcaat ctgctgccag ctcagtgtga cgagctgaag 1920

gcgcgccatt acatcgttgg ccagctgcaa cgggtaatct tcttcgagcc gggcgtgaag 1980

gaaaccgact ggagcgccac gccgccgatc acaggcgtcg acggcaagac ccgccgctgg 2040

gtgtacctgc attacttcaa ggaaggccag ccctcgctga actggctgga ccctaccttc 2100

gccgcccaac agatgatcat tggtgacgca ctgcacgcgc tggactgcct gggtgcacgc 2160

ggcctgcgcc tggacgccaa cggctttctc ggcgtggaaa cccgcgccag cggcaccgcc 2220

tggtcggaaa gccacccgct gtcgctcgtc ggcaaccagc tgatcggtgg catgatccgc 2280

aaggccggcg gtttcagctt ccaggagctg aacctgaccc tcgatgacat tgcgcagatg 2340

tccaagggtg gtgccgacct gtcctacgat ttcattaccc ggccggccta ccagcatgcg 2400

ctgctgacgg gcgacaccga gttcctgcgc ctgatgctca aggagatgca cgccttcggc 2460

atcgacccgg cctcgctcat ccatgccctg caaaaccatg acgagctgac cgtggagctg 2520

gtgcacttct ggacactgca cgcgcacgat atgtacctgt acaagggcca aaccctgcct 2580

ggcagcatcc tgcgcgaaca tattcgcgaa gagatctacg aacggctgtc gggggaacat 2640

gcgccgtaca acctgcgctt cgtgaccaac ggcattgcct gcaccaccgc cagcctgatc 2700

gctgctgcac tgggtattcg cgacctcgaa cagattggtg tagcggatat cgaactgatc 2760

aagaaggtgc acctgctgct ggtcatgtac aacgccatgc agccgggggt ggtcgccttg 2820

tccggctggg acctggtcgg tgccctgccc ttgcccgccg aagcggttgc cgaacgcatg 2880

ctcgatggcg atacccgctg gattcaccgg ggcggctatg acctggccgg gcttgaccca 2940

caggcagagg cttctgtgcg gggcatgccg cgtgcccggg cgctatacgg cagcctggac 3000

aggcagctgg acgagagtga ttcatttgcc tgcaaggtga agaaactgct ggctgtgcgc 3060

caggcctacg gcatcgccac cagccgtcag gtgctggtac ctgaggtgag cagcccgggg 3120

ctgctggtga tggtgcatga gctgccagcc gggcgcggta tccagatcac tgcgctgaac 3180

ttcggccagg acgcgattgc cgaggaactg ctgttgaccg ggttcacacc tgggccggtg 3240

gtcgacatga tcaacgagac ggtcgaaggc gatttgaccg aggacgggcg cctgatggtg 3300

aacctggacc cgtacgaggc gctgtgcctg cggatcgtca acagcagcgg gcatgttcac 3360

caccaccacc accactga 3378

Claims (10)

1.一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pDG1730将芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH分别与海藻糖合酶基因treS进行融合获得的融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht，然后转化枯草芽孢杆菌WB800n，即得。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述融合基因片段At-Ct-Et-Gt-Ht核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列；以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida P06为模板扩增分别与上述芽孢衣壳蛋白中CotA，CotC，CotE，CotG和CotH蛋白的基因序列对应的重叠PCR扩增海藻糖合酶treS的基因序列；

所述CotA蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotA-F aaaactggtctgatcggatccCGACCCGATATCCTGCCTTA BamHI

cotA-R gctgggtcatTTTATGGGGATCAGTTATATCCATCG

所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotC-F accaccaccaccactgaGGTGGCGGTGGCTCGGGC

cotC-R ggctgggtcatGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTCTACAA

所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotE-F caccaccaccactgaCGAGCTCGCTCTCTAAACACG

cotE-R tcctgaagaaATGACCCAGCCCGACCCG

所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotG-F accactgaGTTTAAACCGTAAAGCGGTAAATTGGATTGA PmeI

cotG-R cgggctgggtcatTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGC

所述CotH蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotH-F caccaccaccactgaCGAGCTCGCCTTCTTTTTTTG

cotH-R cgggtcgggctgggtcatTAAAATACTTAAATGAT

所述与CotA蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotA-treS-F tccccataaaATGACCCAGCCCGACCCG

cotA-treS-R accTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶Tres基因序列的扩增引物如下所示：

cotC-treS-F aaacactacATGACCCAGCCCGACCCG

cotC-treS-R tttagagagcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotE-treS-F gtttttagtgggagatcctgaagaaATGACCCAGCCCGAC

cotE-treS-R ctgcaggaattcgataagcttGTTTAAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT HindIII、PmeI

所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotG-treS-F atacaaaATGACCCAGCCCGACCCG

cotG-treS-R aaaagaaggcgagctcgTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT

所述与CotH蛋白基因PCR重叠扩增的海藻糖合酶treS基因序列的扩增引物如下所示：

cotH-treS-F cacaatacctcaaagatcatttaagtattttaATGACCCAGCCCGAC

cotH-treS-R ctgcaggaattcgataagcttTCAGTGGTGGTGGTGGTGGT HindIII

(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的芽孢衣壳蛋白cotA、cotC、cotE、cotG、cotH与其对应的海藻糖合酶基因片段treS分别融合，制得cotA-treS(At)、cotC-treS(Ct)、cotE-treS(Et)、cotG-treS(Gt)和cotH-treS(Ht)五种融合基因片段；所述cotA-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述cotE-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotH-treS融合基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)将整合型质粒pDG1730经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，同时与步骤(2)中制得的融合基因片段cotA-treS、cotC-treS、cotE-treS进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-At-Ct-Et；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒pDG1730-At-Ct-Et经限制性内切酶PmeI和HindIII双酶切后，同时与骤(2)中制得的融合基因片段cotG-treS和cotH-treS进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht；

(5)将步骤(4)中制得的重组质粒pDG1730-At-Ct-Et-Gt-Ht通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌WB800n中，通过壮观霉素平板筛选后，制得芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增Cot蛋白基因序列的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μmol/L上游引物cot-F 2.5μL，浓度10μmol/L下游引物cot-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增对应海藻糖合酶treS基因的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μmol/L上游引物cot-treS-F 2.5μL，浓度10μmol/L下游引物cot-treS-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min 10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μL：

Cot蛋白基因片段4μL，对应的海藻糖合酶基因片段treS 4μL，2×Phanta MaxMasterMix 12.5μL，ddH2O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min 30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cot-F 2μL，下游引物cot-treS-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中，电转化的条件如下：

将6μL重组质粒加入60μL枯草芽孢杆菌感受态细胞中，2500V，5ms，电击一次。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在制备海藻糖中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(i)将芽孢表面高效展示海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌在TB培养基中扩大培养，35～38℃发酵45～50h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面固定化的海藻糖合酶；

(ii)将步骤(i)中制得的在芽孢表面固定化的海藻糖合酶用磷酸盐缓冲液重悬，然后加入麦芽糖溶液，在23～27℃条件下，转化3.5～5h，纯化，制得海藻糖。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中，TB培养基组份如下：

20g/L葡萄糖，30g/L大豆蛋白胨，2.5g/L MgCl₂，17mM KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄；

优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、7500rpm的条件下离心10min；

优选的，所述步骤(ii)中，磷酸盐缓冲液pH8.0，浓度10mM；

优选的，所述步骤(ii)中，反应体系中麦芽糖的质量百分比浓度为25～40％。