CN114686413B - 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用 - Google Patents

一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，以EC01工程菌(SthA基因敲除工程菌)作为出发菌株，通过代谢途径模块化策略将重组质粒pS0和pS7的基因元件作为两个模块，利用基于复制子的代谢途径平衡策略，使用不同拷贝数的质粒表达上述两个模块，减少中间代谢物3‑羟基丙醛，提高联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的产率；此外，还通过敲除副产物途径消除或减少副产物乳酸、乙醇、甲酸和醋酸的生成，进而提高联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的产率。

Description

一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法 和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用。
背景技术
3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。
从甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，首先，经甘油脱水酶将甘油脱水生成中间代谢物3-羟基丙醛；后经NAD+依赖型醛脱氢酶和NAD(P)H依赖型1,3-丙二醇氧化还原酶/同工酶分别生成3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
目前，积累毒性中间代谢物3-羟基丙醛以及生成乳酸、乙醇、甲酸和醋酸等副产物是工业发酵甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的主要瓶颈。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用。在本发明中，以EC01工程菌(SthA基因敲除工程菌)作为出发菌株，通过代谢途径模块化策略将重组质粒pS0和pS7的基因元件作为两个模块，利用基于复制子的代谢途径平衡策略，使用不同拷贝数的质粒表达上述两个模块，减少中间代谢物3-羟基丙醛，提高联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率；此外，还通过敲除副产物途径消除或减少副产物乳酸、乙醇、甲酸和醋酸的生成，进而提高联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产率。
本发明中首先提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌敲除出发菌株EC01工程菌中的乳酸脱氢酶(LdhA)、乙醇脱氢酶(AdhE)、丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)、丙酮酸氧化酶(PoxB)、磷酸乙酰转移酶-醋酸激酶(PTA-AckA)基因后表达不同拷贝数的模块1和模块2得到；
所述EC01工程菌为SthA基因敲除工程菌；
所述模块1为重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因元件；
所述模块2为重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因元件。
其中，所述重组质粒pS0的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述重组质粒pS7的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
所述不同拷贝数为：将pCLOADuet-1、pCDFDuet-1或pETDuet-1线性化质粒与模块1组装，将pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1线性化质粒模块2组装来实现。
本发明中还提供了上述联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)含不同拷贝数的模块1重组质粒构建：
PCR扩增模块1，并将其分别与pCLOADuet-1、pCDFDuet-1和pETDuet-1线性化质粒进行吉布森组装，经过转化E.coli DH5α、筛选阳性克隆、质粒提取、测序确认后分别获得含不同拷贝数的模块1重组质粒，记为pS0X、pS0Y和pS0Z，其中X表示相对低拷贝，Y表示相对中拷贝，Z表示相对高拷贝；
所述模块1为重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因元件；
(2)含不同拷贝数的模块2重组质粒构建：
PCR扩增模块2，并将其与pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1线性化质粒进行吉布森组装，经过转化E.coli DH5α、筛选阳性克隆、质粒提取、测序确认后分别获得含不同拷贝数的模块2重组质粒，记为pS7X、pS7Y和pS7Z，其中X表示相对低拷贝，Y表示相对中拷贝，Z表示相对高拷贝；
所述模块2为重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因元件；
(3)副产物基因敲除基因工程菌的构建
使用CRIPSR CAS9工具质粒逐一敲除EC01工程菌中的乳酸脱氢酶(LdhA)基因、乙醇脱氢酶(AdhE)基因、丙酮酸甲酸裂解酶(PflB)基因、丙酮酸氧化酶(PoxB)基因和磷酸乙酰转移酶-醋酸激酶(PTA-AckA)基因，在PCR验证及测序验证后，得到副产物基因敲除基因工程菌，记为EC06；
(4)联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建：
将获得含不同拷贝数的模块1重组质粒和含不同拷贝数的模块2重组质粒分别转化进入EC06中，得到联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌；
其中，步骤(1)～(3)不分先后顺序。
进一步的，步骤(1)～(3)中，PCR反应参数均为：预变性98℃2min；变性98℃15s；退火55℃10s；延伸72℃2min；终延伸72℃5min，33个循环。
进一步的，步骤(4)中，将模块1与pCDFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS0Y和模块2与pRSFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS7Z转化至EC06中，得到联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌。
本发明中，还提供了上述基因工程菌在联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇中的应用。
进一步的，所述应用为发酵甘油高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本技术通过代谢工程和合成生物学设计，构建了可以高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，通过基于复制子的代谢途径平衡策略，消除3-羟基丙醛积累，提高3-羟基丙酸联产；通过敲除副产物途径基因，消除或最小化副产物积累，进一步提高3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量。所构建的基因工程菌可以以生物柴油产物废弃物甘油为底物，高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
本发明中，通过代谢途径平衡，消除了中间代谢物积累抑制效应；敲除副产物途径，最小化副产物积累，具有重要的理论和实践意义。并且，本发明中通过研究发现，将模块1与pCDFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS0Y和模块2与pRSFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS7Z转化至EC06中得到的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌EC06 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量提高了6.83％，达到15.01g/L，可高效生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，且仅积累较少副产物，具有大规模工业生产潜力。
附图说明
图1为代谢途径平衡的基因工程菌的基因及质粒组合示意图。
图2为含不同拷贝数模块1和模块2组合的基因工程菌的中间代谢物3-羟基丙醛的积累量对比图。
图3为含不同拷贝数模块1和模块2组合的基因工程菌的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量比图。
图4为副产物敲除的联产工程菌的基因型以及主要代谢产物分布图。
图5为基因工程菌EC06 S7G的基因改造策略概况图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。实施例中，pACYCDuet-1、pCDFDuet-、pRSFDuet-1、pCOLADuet-1、pCDFDuet-1和pETDuet-1质粒(购自淼灵生物科技公司，CRISPR CAS9工具质粒购自Addgene平台。
实施例1：
(1)根据重组质粒pS0(SEQ ID No:1)上DhaB123-GdrAB基因以及质粒pCLOADuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1序列，利用Oligo7.0软件设计引物：
DhaB F：GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCatgaaaagatcaaaacgatttgcagtactg(SEQID No:3)；
GrdB R：TTATGCGGCCGCAAGCTTGTCGACtcagtttctctcacttaacggcaggac(SEQ ID No:4)；
Backbone3 F：ggtatatctccttattaaagttaaac(SEQ ID No:5)；
Backbone3 R：gtcgacaagcttgcgg(SEQ ID No:6)；
(2)使用DhaB F和GdrB R引物对扩增重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因，并将其作为模块1；
使用Backbone3 F和Backbone3 R引物对分别将质粒pCLOADuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1线性化，获得pCLOADuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1线性化质粒。
PCR反应参数：预变性，98℃3min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃1.5min；终延伸，72℃5min；33个循环。
(3)将DhaB123-GdrAB基因(模块1)分别与pCLOADuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1线性化质粒使用2×MultiF Seamless Assembly Mix进行吉布森组装，反应条件为：50℃下反应30min，获得含不同拷贝数的模块1重组质粒。
通过标准热激法将上述得到的含不同拷贝数的模块1重组质粒转化进入E.coliDH5α感受态中，转化步骤具体如下所示：
将E.coli DH5α感受态冰浴5min后分别加入含不同拷贝数的模块1重组质粒，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后，分别涂布含25μg/mL的卡那霉素、50μg/mL壮观霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。
分别挑取适量单菌落培养并提取含不同拷贝数的模块1重组质粒，送苏州金唯智测序验证，将验证正确的重组质粒分别命名为pS0X、pS0Y和pS0Z。
实施例2：含不同拷贝数的模块2重组质粒的构建：
(1)根据重组质粒pS7(SEQ ID No:2)上DhaB123-GdrAB基因以及质粒pCLOADuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1序列，利用Oligo7.0软件设计引物：
QPY F：CAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGtaagacgaaaagaaggagattagaa(SEQ ID No:7)；
QPY R：TGGCAGCAGCCTAGGTTAAttagcgggcggcttcgtat(SEQ ID No:8)
Backbone4 F：caaaattatttctacaggggaattg(SEQ ID No:9)
Backbone4 R：ttaacctaggctgctgcca(SEQ ID No:10)
(2)使用QPY F和QPY R引物对扩增重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因片段，并将其作为模块2。
使用Backbone4 F和Backbone4 R引物对分别将质粒pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1进行线性化，获得pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1线性化质粒。
PCR反应参数：预变性，98℃3min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃1.5min；终延伸，72℃5min；33个循环。
(3)将上述GabD4、YqhD和PntAB基因片段(模块2)分别与pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1线性化质粒使用2×MultiF Seamless Assembly Mix进行吉布森组装，反应条件为：50℃下反应30min，获得含不同拷贝数的模块2重组质粒。
通过标准热激法将上述得到的含不同拷贝数的模块2重组质粒转化进入E.coliDH5α感受态中，转化步骤具体如下所示：
将E.coli DH5α感受态冰浴5min后分别加入含不同拷贝数的模块2重组质粒，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入1mL无抗生素LB培养基，37℃培养1h后，分别涂布含25μg/mL的卡那霉素、50μg/mL壮观霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。
分别挑取适量单菌落培养并提取含不同拷贝数的模块1重组质粒，送苏州金唯智测序验证，将验证正确的重组质粒分别命名为pS7X、pS7Y和pS7Z。
实施例3：含不同拷贝数模块1和模块2组合的基因工程菌的构建：
(1)将重组质粒pS0X、pS0、pS0Y、pS0Z分别与pS7X、pS7Y、pS7、pS7Z两两组合，按图1所示，用电击转化入EC01菌株，电击参数为：电转杯1mm，电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，获得8株含不同拷贝数模块1和模块2组合的基因工程菌，命名为EC01 S7A、EC01 S7B、EC01S7C、EC01 S7D、EC01 S7E、EC01 S7F、EC01 S7G和EC01 S7H，其具体质粒类型如图1所示。
(2)将上述基因工程菌EC S1、EC S2、EC S3和EC S4在LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠)中过夜活化(37℃、220rpm)，按1％v/v接种量接种于改良MR培养基(甘油10g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，(NH4)2HPO4 4.0g/L，KH2PO4 6.67g/L，citric acid0.8g/L，酵母粉1.0g/L，pH 7.0)中培养(37℃、220rpm)4小时后，OD600达到约0.8，加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续培养36h(35℃、220rpm)，使用高效液相色谱法测量3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量，液相色谱条件为：Aminex HPX-87H column色谱柱、0.4mL/min、65℃、RID检测器35℃、UV检测器210nm，测量结果如图2和图3所示.
从图2和图3中可以看出，工程菌EC01 S7G几乎没有检测到3-羟基丙醛积累(0.03g/L)，且EC01 S7G生产的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量最高，达到14.09g/L，相比原始工程菌提高了47.73％，这说明了模块1适宜pCDFDuet-1质粒进行表达(即pS0Y)。相应的，模块2适宜使用pRSFDuet-1质粒进行表达(即pS7Z)。
实施例4：基因缺陷工程菌的构建：
1.LdhA敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌的获得：
(1)根据乳酸脱氢酶(LdhA)基因序列，使用sgRNAcas9选择合适靶点生成合适的sgRNA序列；根据上述基因序列和pTargetF质粒的序列特性使用Oligo7.0软件设计用于LdhA基因敲除的引物：
sgRNA-ldhA F：CGACAAGAAGTACCTGCAACgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:11)；
sgRNA-ldhA R：GTTGCAGGTACTTCTTGTCGactagtattatacctaggac(SEQ ID No:12)；
ldhA-up F：tttaactttttcgccctga(SEQ ID No:13)；
ldhA-up R：GCAGGGGAGCGGCAAGATTAcataagactttctccagtgatg(SEQ ID No:14)；
ldhA-down F：TCACTGGAGAAAGTCTTATGtaatcttgccgctcccctgc(SEQ ID No:15)；
ldhA-down R：taaaagcgtcgatgtccagt(SEQ ID No:16)；
(2)以pTargetF质粒为模板，使用引物对sgRNA-ldhA F和sgRNA-ldhA R扩增获得靶向LdhA基因的pTargetF骨架；使用吉布森组装使其自连，获得重组质粒pTargetF-LdhA。
(3)使用大肠杆菌EC01基因组为模板，使用引物对ldhA-up F和ldhA-up R扩增LdhA基因上游序列；使用引物对ldhA-down F和ldhA-down R扩增LdhA基因下游序列；并以LdhA基因上游序列和LdhA基因下游序列为模板，使用引物对ldhA-up F和ldhA-down R扩增获得LdhA基因上下游同源臂。
(4)将pCas9质粒转化进入EC01中；将含有pCas9质粒的EC01经过0.1M的L-阿拉伯糖诱导后制作成为电转感受态；同时将100ng的pTargetF-LdhA质粒和400ng的LdhA基因上下游同源臂使用电转仪转化进入含有pCas9质粒的EC01中，具体电转参数为：电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，电转杯1mm，点击时间1.5ms；之后30℃培养2h后涂布含有50μg/mL壮观霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养24-48h。
挑取适量单菌落使用引物对ldhA up F和ldhA down R进行菌落PCR验证，将疑似基因缺陷的工程菌送苏州金唯智测序验证，得到验证正确的LdhA基因敲除工程菌，保存备用。
(5)将LdhA基因敲除工程菌在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，使用0.5mM IPTG进行诱导(30℃12h)，除去重组质粒pTargetF-LdhA，接着将除去重组质粒pTargetF-LdhA的工程菌进行过夜培养(37℃)除去pCas9质粒，得到成功除去重组质粒pTargetF-LdhA和pCas9的LdhA基因敲除工程菌，命名为EC02。
(6)将重组质粒pS0Y和pS7Z经电击法转入EC02中，电击参数为：电转杯1mm，电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，获得LdhA敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC02 S7G，其基因型见图4。
2.LdhA和AdhE敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌的获得：
根据1中步骤(1)～(6)的方法，采用不同的引物，同理获得LdhA和AdhE敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC03 S7G，其基因型见图4，具体引物如下所示：
sgRNA-adhE F：TCGAATCCCACTCGCGAAAAgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:17)；
sgRNA-adhE R：TTTTCGCGAGTGGGATTCGAactagtattatacctaggac(SEQ ID No:18)；
adhE-up F：taccaaaaagttgtagaatcgtg(SEQ ID No:19)；
adhE-up R：CCAGACAGCGCTACTGATTAcataatgctctcctgataatgt(SEQ ID No:20)；
adhE-down F：ATTATCAGGAGAGCATTATGtaatcagtagcgctgtctgg(SEQ ID No:21)；
adhE-down R：cagcacagtttcgctctg(SEQ ID No:22)。
3.LdhA、AdhE和PflB敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌的获得：
根据1中步骤(1)～(6)的方法，采用不同的引物，同理获得LdhA、AdhE和PflB敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC04 S7G，其基因型见图4，具体引物如下所示：
sgRNA-pflB F：ATGAAAAGTTAGCCACAGCCgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:23)；
sgRNA-pflB R：GGCTGTGGCTAACTTTTCATactagtattatacctaggac(SEQ ID No:24)；
pflB-up F：atttgcttctctctggggctga(SEQ ID No:25)；
pflB-up R：ATTTCAGTCAAATCTAATTAcatgtaacacctaccttct(SEQ ID No:26)；
pflB-down F：AAGAAGGTAGGTGTTACatgtaattagatttgactgaaatcgt(SEQ ID No:27)；
pflB-down R：cgtagcggatccacaccttc(SEQ ID No:28)。
4.LdhA、AdhE、PflB和PoxB敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌的获得：
根据1中步骤(1)～(6)的方法，采用不同的引物，同理获得LdhA、AdhE、PflB和PoxB敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC05 S7G，其基因型见图4，具体引物如下所示：
sgRNA-poxB F：TATCGCCAAAACACTCGAATgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:29)；
sgRNA-poxB R：ATTCGAGTGTTTTGGCGATAactagtattatacctaggac(SEQ ID No:30)；
poxB-up F：aaccgtccacaggccgatgt(SEQ ID No:31)；
poxB-up R：GGGAAATGCCACCCTTTTTAcatggttctccatctcctga(SEQ ID No:32)；
poxB-down F：TCAGGAGATGGAGAACCATgtaaaaagggtggcatttcccgtc(SEQ ID No:33)；
poxB-down R：ccagcgaatggcacgtt(SEQ ID No:34)。
5.LdhA、AdhE、PflB、PoxB和Pta-AckA敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌的获得：
根据1中步骤(1)～(6)的方法，采用不同的引物，同理获得LdhA、AdhE、PflB、PoxB和Pta-AckA敲除的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇生产基因工程菌，命名为EC06 S7G，其基因型见图4，具体引物如下所示：
sgRNA-pta-ackA F：AATAAACAGGAAGCGGCTTTgttttagagctagaaatagc(SEQ ID No:35)；
sgRNA-pta-ackA R：AAAGCCGCTTCCTGTTTATTactagtattatacctaggac(SEQ ID No:36)；
pta-ackA-up F：aacacctgtccagactcct(SEQ ID No:37)；
pta-ackA-up R：TGCGGATGATGACGAGATTAcatggaagtacctataattga(SEQ ID No:38)；
pta-ackA-down F：CAATTATAGGTACTTCCATgtaatctcgtcatcatccgcag(SEQ ID No:39)；
pta-ackA-down R：ttctcccataccaaataccg(SEQ ID No:40)。
将1～5中得到的基因工程EC02 S7G、EC03 S7G、EC04 S7G、EC05 S7G和EC06 S7G分别在LB培养基中过夜活化(37℃、220rpm)，分别按1％v/v接种量接种于改良MR培养基中培养(37℃、220rpm)4小时后，OD600达到约0.8，分别加入0.05mM IPTG和25μM维生素B12，继续培养36h(35℃、220rpm)，结果如图4所示。
从图4中可以看出，敲除LdhA、AdhE和PflB尽管没有提高3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量，但完全消除了副产物乳酸、乙醇和甲酸的生成；敲除PoxB的工程菌副产物醋酸积累降低了19.92％，进一步敲除Pta-AckA的工程菌EC06 S7G的工程菌醋酸积累降低了72.23％，仅有0.4g/L，且3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量提高了6.83％，达到15.01g/L。
综上，基因改造概况如图5所示工程菌EC06 S7G的3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量提高了6.83％，达到15.01g/L，可高效生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇，且仅积累较少副产物，具有大规模工业生产潜力。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌、构建方法和应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8845
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca 120
ggacgggctg attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga 180
cccggtctct tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gaactggacg gcaaacgccg 240
ggaccagttt gacatgatcg accggtttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac 300
agagcaggca atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt 360
cagccgggag gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt 420
gatggcgcag atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg 480
gaccccctcc aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgccgc 540
tgacgccgcc gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc 600
gcgctatgcg ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgtcccgg 660
cgtgttgacg cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt 720
aaccagctac gccgagacgg tgtcggtcta cggcacggaa gcggtattta ccgacggcga 780
tgatactccg tggtcaaagg cgttcctcgc ttcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat 840
gcgctacacc tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat 900
gctctacctc gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca 960
aaacggcgcg gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt 1020
gctggcggaa aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca 1080
gactttctcc cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg 1140
caccgacttt attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg 1200
ctcgaacttc gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt 1260
tgacggcggc ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc 1320
gcgggcgatc caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt 1380
ggaggccgcc acctacgcgc acggcagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga 1440
tctgagtgcg gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc 1500
gctgagccgc agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg 1560
ggtcaccggc gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag 1620
tgcggtcaac gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga 1680
acgctgggcg gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ttgaataagg 1740
cggtattcct gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga 1800
gggcggggta gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc 1860
cttcgataaa caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga 1920
gctgattgcc ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac 1980
gtccgacgtc tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat 2040
cggtatccag tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa 2100
cctggagctg ttctcccagg cgccgctgct gacgctggag acctaccggc agattggcaa 2160
aaacgccgcg cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca 2220
gatggtgcgg ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca 2280
tgtggtgcag gacgccgagc ccgtcaccct gcacgtcgac ttagtaaggg agtgaccatg 2340
agcgagaaaa ccatgcgcgt gcaggattat ccgttagcca cccgctgccc ggagcatatc 2400
ctgacgccta ccggcaaacc attgaccgat attaccctcg agaaggtgct ctctggcgag 2460
gtgggcccgc aggatgtgcg gatctcccgt cagacccttg agtaccaggc gcagattgcc 2520
gagcagatgc agcgccatgc ggtggcgcgc aatttccgcc gcgcggcgga gcttatcgcc 2580
attcctgacg agcgcattct ggctatctat aacgcgctgc gcccgttccg ctcctcgcag 2640
gcggagctgc tggcgatcgc cgacgagctg gagcacacct ggcatgcgac agtgaatgcc 2700
gcctttgtcc gggagtcggc ggaagtgtat cagcagcggc ataagctgcg taaaggaagc 2760
taagcggagg tcagcatgcc gttaatagcc gggattgata tcggcaacgc caccaccgag 2820
gtggcgctgg cgtccgacga cccgcaggcg agggcgtttg ttgccagcgg gatcgtcgcg 2880
acgacgggca tgaaagggac gcgggacaat atcgccggga ccctcgccgc gctggagcag 2940
gccctggcga aaacaccgtg gtcgatgagc gatgtctctc gcatctatct taacgaagcc 3000
gcgccggtga ttggcgatgt ggcgatggag accatcaccg agaccattat caccgaatcg 3060
accatgatcg gtcataaccc gcagacgccg ggcggggtgg gcgttggcgt ggggacgact 3120
atcgccctcg ggcggctggc gacgctgccg gcggcgcaat atgccgaggg gtggatcgta 3180
ctgattgacg acgccgtcga tttccttgac gccgtgtggt ggctcaatga ggcgctcgac 3240
cgggggatca acgtggtggc ggcgatcctc aaaaaggacg acggcgtgct ggtgaacaac 3300
cgcctgcgta aaaccctgcc ggtggtagat gaagtgacgc tgctggagca ggtccccgag 3360
ggggtgatgg cggcggtgga agtggccgcg ccgggccagg tggtgcggat cctgtcgaat 3420
ccctacggga tcgccacctt cttcgggcta agcccggaag agacccaggc catcgtcccc 3480
atcgcccgcg ccctgattgg caaccgttca gcggtggtgc tcaagacccc gcagggggac 3540
gtgcagtcgc gggtgatccc ggcgggcaac ctctacatta gcggcgaaaa gcgccgcgga 3600
gaggccgatg tcgccgaggg cgcggaagcc atcatgcagg cgatgagcgc ctgcgctccg 3660
gtacgcgaca tccgcggcga accgggcact cacgccggcg gcatgcttga gcgggtgcgc 3720
aaggtaatgg cgtccctgac cggccatgag atgagcgcga tatacatcca ggatctgctg 3780
gcggtggata cgtttattcc gcgcaaggtg cagggcggga tggccggcga gtgcgccatg 3840
gagaatgccg tcgggatggc ggcgatggtg aaagcggacc gtctgcaaat gcaggttatc 3900
gcccgcgaac tgagcgcccg actgcagacc gaggtggtgg tgggcggcgt ggaggccaac 3960
atggccatcg ccggggcgtt aaccactccc ggctgtgcgg cgccgctggc gatcctcgat 4020
ctcggcgccg gctcgacgga tgcggcgatc gtcaacgcgg aggggcagat aacggcggtc 4080
catctcgccg gggcggggaa tatggtcagc ctgttgatta aaaccgagct gggtctcgag 4140
gatctttcgc tggcggaagc gataaaaaag tacccgctgg ccaaagtgga aagcctgttc 4200
agtattcgtc acgagaatgg cgcggtggag ttctttcggg aagccctcag cccggcggtg 4260
ttcgccaaag tggtgtacat caaggagggc gaactggtgc cgatcgataa cgccagcccg 4320
ctggaaaaaa ttcgtctcgt gcgccggcag gcgaaagaga aagtgtttgt caccaactgc 4380
ctgcgcgcgc tgcgccaggt ctcacccggc ggttccattc gcgatatcgc ctttgtggtg 4440
ctggtgggcg gctcatcgct ggactttgag atcccgcagc ttatcacgga agccttgtcg 4500
cactatggcg tggtcgccgg gcagggcaat attcggggaa cagaagggcc gcgcaatgcg 4560
gtcgccaccg ggctgctact ggccggtcag gcgaattaag tgttaacgag ggggccgtca 4620
tgtcgctttc accgccaggc gtacgcctgt tttacgatcc gcgcgggcac catgccggcg 4680
ccatcaatga gctgtgctgg gggctggagg agcagggggt cccctgccag accataacct 4740
atgacggagg cggtgacgcc gctgcgctgg gcgccctggc ggccagaagc tcgcccctgc 4800
gggtgggtat cgggctcagc gcgtccggcg agatagccct cactcatgcc cagctgccgg 4860
cggacgcgcc gctggctacc ggacacgtca ccgatagcga cgatcatctg cgtacgctcg 4920
gcgccaacgc cgggcagctg gttaaagtcc tgccgttaag tgagagaaac tgagtcgaca 4980
agcttgcggc cgcataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tcgtattgta cacggccgca 5040
taatcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttccccatct 5100
tagtatatta gttaagtata agaaggagat atacatatgg cagatctcaa ttggatatcg 5160
gccggccacg cgatcgctga cgtcggtacc ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg 5220
aaatttgaac gccagcacat ggactcgtct actagcgcag cttaattaac ctaggctgct 5280
gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 5340
tttttgctga aacctcaggc atttgagaag cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat 5400
aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac gaccctgccc tgaaccgacg 5460
accgggtcga atttgctttc gaatttctgc cattcatccg cttattatca cttattcagg 5520
cgtagcacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg 5580
ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca 5640
gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata 5700
tttgcccata gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa 5760
actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt 5820
agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa 5880
ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg 5940
gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc 6000
catacggaac tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata 6060
aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt 6120
ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca 6180
ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc 6240
tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg 6300
aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg 6360
cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgtcac 6420
aggtatttat tcggcgcaaa gtgcgtcggg tgatgctgcc aacttactga tttagtgtat 6480
gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt ctgtttctat cagctgtccc tcctgttcag 6540
ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa gcaccgccgg acatcagcgc tagcggagtg 6600
tatactggct tactatgttg gcactgatga gggtgtcagt gaagtgcttc atgtggcagg 6660
agaaaaaagg ctgcaccggt gcgtcagcag aatatgtgat acaggatata ttccgcttcc 6720
tcgctcactg actcgctacg ctcggtcgtt cgactgcggc gagcggaaat ggcttacgaa 6780
cggggcggag atttcctgga agatgccagg aagatactta acagggaagt gagagggccg 6840
cggcaaagcc gtttttccat aggctccgcc cccctgacaa gcatcacgaa atctgacgct 6900
caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt cccctggcgg 6960
ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc ggtgtcattc cgctgttatg 7020
gccgcgtttg tctcattcca cgcctgacac tcagttccgg gtaggcagtt cgctccaagc 7080
tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 7140
gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact ggcagcagcc actggtaatt 7200
gatttagagg agttagtctt gaagtcatgc gccggttaag gctaaactga aaggacaagt 7260
tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca aagagttggt agctcagaga 7320
accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt cagagcaaga gattacgcgc 7380
agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga taaaatattt ctagatttca 7440
gtgcaattta tctcttcaaa tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata taagttgtaa 7500
ttctcatgtt agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca 7560
agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc 7620
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 7680
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt 7740
gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg 7800
tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata 7860
taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc accaacgcgc 7920
agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc 7980
atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg 8040
gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta 8100
tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg 8160
atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg 8220
gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca 8280
ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc 8340
agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg 8400
cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc 8460
gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc 8520
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atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg 8640
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ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag 8760
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gagattagaa atgtaccaag atctggcact gtatatcgac ggcgaattca ttaaaggcgg 120
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<400> 21
attatcagga gagcattatg taatcagtag cgctgtctgg 40
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagcacagtt tcgctctg 18
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgaaaagtt agccacagcc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggctgtggct aacttttcat actagtatta tacctaggac 40
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atttgcttct ctctggggct ga 22
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atttcagtca aatctaatta catgtaacac ctaccttct 39
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagaaggtag gtgttacatg taattagatt tgactgaaat cgt 43
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgtagcggat ccacaccttc 20
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tatcgccaaa acactcgaat gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attcgagtgt tttggcgata actagtatta tacctaggac 40
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaccgtccac aggccgatgt 20
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gggaaatgcc acccttttta catggttctc catctcctga 40
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcaggagatg gagaaccatg taaaaagggt ggcatttccc gtc 43
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccagcgaatg gcacgtt 17
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aataaacagg aagcggcttt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaagccgctt cctgtttatt actagtatta tacctaggac 40
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aacacctgtc cagactcct 19
<210> 38
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgcggatgat gacgagatta catggaagta cctataattg a 41
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caattatagg tacttccatg taatctcgtc atcatccgca g 41
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttctcccata ccaaataccg 20

Claims (6)

1.一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除出发菌株EC01工程菌中的乳酸脱氢酶（LdhA）、乙醇脱氢酶（AdhE）、丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）、丙酮酸氧化酶（PoxB）、磷酸乙酰转移酶-醋酸激酶（PTA-AckA）基因后表达模块1和模块2得到；
所述EC01工程菌为SthA基因敲除的大肠杆菌 E. coli W3110 (DE3)；
所述模块1为重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因元件，所述重组质粒pS0的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，将pCDFDuet-1线性化质粒与模块1组装；
所述模块2为重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因元件，所述重组质粒pS7的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，将pRSFDuet-1线性化质粒与模块2组装。
2.权利要求1所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
（1）模块1重组质粒构建：
PCR扩增模块1，并将其与pCDFDuet-1线性化质粒进行吉布森组装，经过转化E. coliDH5α、筛选阳性克隆、质粒提取、测序确认后获得模块1重组质粒；
所述模块1为重组质粒pS0上的DhaB123-GdrAB基因元件；
（2）模块2重组质粒构建：
PCR扩增模块2，并将其与pRSFDuet-1线性化质粒进行吉布森组装，经过转化E. coliDH5α、筛选阳性克隆、质粒提取、测序确认后获得模块2重组质粒；
所述模块2为重组质粒pS7上的GabD4、YqhD和PntAB基因元件；
（3）副产物基因敲除基因工程菌的构建
使用CRIPSR CAS9工具质粒逐一敲除EC01工程菌中的乳酸脱氢酶（LdhA）基因、乙醇脱氢酶（AdhE）基因、丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）基因、丙酮酸氧化酶（PoxB）基因和磷酸乙酰转移酶-醋酸激酶（PTA-AckA）基因，在PCR验证及测序验证后，得到副产物基因敲除基因工程菌，记为EC06；
（4）联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建：
将获得模块1重组质粒和模块2重组质粒分别转化进入EC06中，得到联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌；
其中，步骤（1）~（3）不分先后顺序。
3. 根据权利要求2所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）~（3）中，PCR反应参数均为：预变性98 ℃ 2 min；变性 98 ℃ 15 s；退火55℃ 10 s；延伸72 ℃ 2 min；终延伸72 ℃ 5 min，33个循环。
4.根据权利要求2所述的联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，将模块1与pCDFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS0Y和模块2与pRSFDuet-1线性化质粒组装的重组质粒pS7Z转化至EC06中，得到联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌。
5.权利要求1所述的基因工程菌在联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为发酵甘油高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106350476A (zh) * 2016-08-31 2017-01-25 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的基因工程菌及构建方法和应用
CN107881186A (zh) * 2017-10-18 2018-04-06 华东理工大学 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用
CN111100832A (zh) * 2019-12-28 2020-05-05 江南大学 合成丙酮酸与d-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106350476A (zh) * 2016-08-31 2017-01-25 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的基因工程菌及构建方法和应用
CN107881186A (zh) * 2017-10-18 2018-04-06 华东理工大学 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用
CN111100832A (zh) * 2019-12-28 2020-05-05 江南大学 合成丙酮酸与d-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conversion of Glycerol to 3-Hydroxypropanoic Acid by Genetically Engineered Bacillus subtilis;Aida Kalantari等;《Frontiers in Microbiology》;20170418;第8卷;第1-11页 *
Ye Zhang等.Development of a plasmid stabilization system in Vibrio natriegens for the high production of 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionate.《 Bioresources and Bioprocessing 》.2021,第8卷第1-11页. *
杨苗苗等.基于甘油的 1,3-丙二醇生物合成的代谢局限及其改造 策略.《生物工程学报》.2018,第34卷(第7期),第1069-1080页. *

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