CN113462712B - 一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用。所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I‑SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I‑SceI识别位点和FRT位点。实验证明，本发明的同源重组系统的重组效率优于传统λ‑Red系统的双质粒和阿拉伯糖诱导方法，无需任何化学诱导剂，仅通过改变培养温度，即可实现染色体的高效编辑。而且避免了多次电穿孔过程，极大降低了操作复杂度并节省了时间和成本。本发明的提出为基因编辑提供了一种更加快速、简便、经济的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用，本发明属于基因工程技术领域。
背景技术
对基因组进行快速编辑改造具有十分重要的意义。同源重组是应用最广泛的基因编辑手段，基于该原理发展而来的内源性重组系统和λ-Red重组系统已被广泛应用于微生物染色体的各种修饰，如沙门氏菌和大肠杆菌。内源性同源重组大多需要RecA蛋白参与，通常需要在负责打靶的自杀质粒中插入数百碱基甚至更长的同源序列。RecA介导的反应是一个费时费力的过程，而且重组效率很低。另外，RecA系统的重组功能总是处在激活状态，会导致意外重排的现象发生。经典λ-Red重组系统包含来自于λ噬菌体的三种重要重组相关蛋白(统称为Red重组酶)：exo、beta和gam。Exo是一种核酸外切酶，可产生单链DNA，参与DNA链的入侵和同化反应。Beta是一种单链DNA退火蛋白，并促进互补ssDNA的复性，还可以促进链交换。Gam蛋白可以与RecBCD蛋白结合并抑制它们与双链DNA末端的结合。这三种蛋白协同作用，来实现细菌基因组的同源重组。该方法最早被应用于大肠杆菌K-12的基因敲除，操作流程是首先将pKD46质粒转化宿主菌，诱导表达Red重组酶；再以pKD3或pKD4为模板进行PCR扩增，将得到的带有侧翼同源序列(一般为30-50bp)的PCR产物转入宿主细胞，筛选阳性克隆；最后将pCP20质粒电穿孔入宿主细胞，产生FLP重组酶，消除抗性基因。该系统的重组效率优于内源性同源重组系统，但操作过程涉及L-阿拉伯糖诱导和多次转化细胞，较为繁琐耗时，而且用线性DNA片段进行打靶时，转化效率很低，有一些基因很难被敲除。此外，同源臂的长度较短也会降低重组效率。
最近报道了一种基于I-SceI的λ-Red重组系统，I-SceI是一种核酸内切酶，其识别的18bp独特序列仅存在于酵母线粒体中。该系统由供体质粒和辅助质粒组成，供体质粒中的打靶片段两侧带有I-SceI位点；辅助质粒则带有阿拉伯糖操纵子和编码Red重组酶和I-SceI核酸内切酶基因。当L-阿拉伯糖存在时，辅助质粒表达I-SceI核酸酶，切割供体质粒以释放打靶片段，同时Red重组酶促进了宿主染色体双链断裂和同源序列的重组，实现基因编辑。该系统使用较长的同源臂并在体内产生线性DNA打靶片段，因而其重组效率优于经典λ-Red重组系统，但涉及到多种质粒的协助、L-阿拉伯糖的诱导以及需要多次转化宿主细胞，操作环节依旧较多。
本发明将温控元件、Red重组酶基因、I-SceI内切酶基因和打靶片段区集成到单一质粒中，构建了一种新颖的温控自剪切单质粒同源重组系统。该质粒在基因编辑中能够发挥多种作用，一方面具有辅助质粒的功能，I-SceI识别位点两侧均带有多克隆位点，方便同源臂序列的插入，可以作为打靶片段区；另一方面具有工具质粒的功能，当温度升至42℃时，温控元件启动I-SceI内切酶和Red重组酶的顺序表达，并进行严谨控制，I-SceI内切酶识别并切割质粒上的独特位点，释放线性打靶片段，Red重组酶促进了打靶片段与基因组同源区域的交换，从而实现高效的同源重组。该系统无需任何昂贵的化学诱导剂，只需改变培养温度，即可实现染色体的高效编辑。而且避免了多次电穿孔过程，极大减少了操作环节，降低了实验成本。
发明内容
针对使用同源重组系统进行基因编辑过程中容易出现的问题，本发明的目的在于提供一种更加快速、简便和经济的同源重组系统及其构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的一种温控自剪切单质粒同源重组系统，所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒，所述的质粒命名为pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I-SceI识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)。
其中，优选的，所述的筛选标记为抗生素抗性基因或其他符合目的的筛选标记。
其中，优选的，所述的筛选标记为氯霉素，所述的其他符合目的的筛选标记包括蔗糖、荧光蛋白。
其中，优选的，所述的pKID220质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述的同源重组系统的方法，包括以下步骤：
1)以pDC质粒为骨架，所述的pDC质粒携带的氯霉素抗性基因盒两侧有I-SceI内切酶识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)，所述的pDC质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以pBV220质粒为模板，用pDCprpL-F和pDCprpL-R引物扩增得到1483bp的温控元件CIts857-PRPL片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该片段通过Nhe I位点克隆到pDC质粒中，得到重组质粒，命名为pDC-CItsPRPL；引物序列如下：
pDCprpL-F：GAGTAAACTTGGTCTGACAGTCACATGTTCTTTCCTGCGT
pDCprpL-R：TTTCGGGGAAATGTGGCTAGCCCTCCTTAATTTTTAACCAA
2)通过PCR的方式扩增或者合成出含有编码I-SceI内切酶和Red重组酶的核酸片段，命名为I-SceI-Gam-bet-exo，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过NheⅠ位点将该I-SceI-Gam-bet-exo片段克隆到pDC-CItsPRPL中，最终获得的重组质粒，命名为pKID220。
更进一步的，本发明还提出了所述的同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，优选的，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。
再进一步的，本发明提出了一种用于敲除靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，所述的系统包括在本发明所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲除靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。
再进一步的，本发明提出了一种用于敲入或替换靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，所述的系统包括在本发明所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲入或替换靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲入或替换靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、敲入或替换基因、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。
再进一步的，本发明还提出了所述的用于敲除、敲入或替换靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，优选的，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。
最后，本发明还提出了一种对沙门氏菌菌株基因组进行快速编辑改造的方法，所述的编辑改造包括对沙门氏菌菌株基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换，其包括以下步骤：
(1)将所述的用于敲除、敲入或替换靶基因的温控自剪切质粒通过电转的方法转入沙门氏菌中，提质粒，测序验证；
(2)将含有所述质粒的阳性菌株接种于1mL含25μg/mL氯霉素的液体培养基中，30℃180rpm振荡培养4h；
(3)将培养物置于42℃振荡培养过夜；
(4)划线于含25μg/mL氯霉素的平板上，37℃孵育7～10h；
(5)菌落PCR筛选得到含氯霉素抗性基因的重组菌株；
(6)将pCP20质粒通过电穿孔转化含抗性基因的重组菌株，30℃培养于含100μg/mL氨苄青霉素的平板；
(7)挑取单菌落30℃培养8h后，升温至42℃，培养过夜；
(8)将培养物划线于LB平板，37℃培养；
(9)菌落PCR筛选得到无抗性且基因组经过编辑改造的重组沙门氏菌菌株。
与现有同源重组技术相比较，本发明的有益效果在于：
本发明的同源重组系统相比于其他同源重组系统具有明显优势。例如传统λ-Red系统进行基因编辑费时费力，需要多次电穿孔过程，而且需要以阿拉伯糖作为化学诱导剂，增加了实验成本，此外同源臂长度较短也会降低重组效率；基于I-SceI的Red重组系统虽然重组效率较传统λ-Red系统高，但操作环节依旧较多，如需要多种质粒的协助、L-阿拉伯糖的诱导以及需要多次转化宿主细胞。本发明构建的同源重组系统具有操作简便、快速、经济、高效的优势，其仅由一个质粒组成，兼具辅助质粒和工具质粒的功能，无需任何昂贵的化学诱导剂，只通过改变培养温度，即可完成基因的同源重组编辑过程；打靶片段区可以容纳较长的同源臂，从而提高重组效率；重组酶的表达受到严谨控制，可避免意外重排现象的发生；避免了多次电穿孔过程，极大降低了操作复杂度并节省了时间和成本。
附图说明
图1为本发明实施例1中pKID220质粒构建过程；
骨架质粒pDC的氯霉素抗性基因盒两侧均带有FRT位点和I-SceI识别位点，将pBV220质粒中的温控元件CIts857-PRPL克隆至其下游，得到中间质粒pDC-CItsPRPL；再将pKISa质粒的I-SceI内切酶和Red重组酶(Gam，Beta，Exo)编码序列克隆至温控元件CIts857-PRPL下游；
图2为pKID220的质粒图谱；
其关键元件包括：两侧均带有I-SceI识别位点和FRT位点的氯霉素抗性基因盒，此为打靶片段区；CIts857-PRPL温控元件；I-SceI内切酶基因和Red重组酶基因(Gam，Beta，Exo)
图3为使用pKID-UD质粒敲除pgtE基因的流程图；
图4为PCR鉴定pgtE基因的敲除；
泳道1：SM6ΔpgtE；泳道2：SM6菌株；M：DNAmaker；
图5为使用pKID-INP0862质粒敲入INP0862并替换pgtE基因的流程图；
图6为PCR鉴定pgtE基因的替换；
泳道1：SM6ΔpgtE::INP0862；泳道2：SM6菌株；M：DNAmaker。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：pKID220质粒构建
pKID220质粒带有温控元件CIts857-PRPL，控制I-SceI内切酶和Red重组酶的顺序表达，构建过程如图1所示。具体步骤如下：
1、以pDC质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为骨架，其携带的氯霉素抗性基因盒两侧有I-SceI内切酶识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)。以pBV220质粒为模板，用pDCprpL-F和pDCprpL-R引物扩增得到1483bp的温控元件CIts857-PRPL片段(序列如SEQ IDNO.3所示)，并将PCR产物通过Nhe I位点克隆到pDC质粒中，得到pDC-CItsPRPL质粒。
2、用引物对ISceI-F/R和引物对GBe2-F/R从pKISa质粒(核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)中分别扩增出带有编码I-SceI内切酶和Red重组酶的核酸片段，因为引物ISceI-R和GBe2-F是互补的，所以再通过重叠延伸PCR将两个片段融合生成I-SceI-Gam-bet-exo整合片段(序列如SEQ ID NO.4所示)。通过NheⅠ位点将该I-SceI-Gam-bet-exo整合片段克隆到pDC-CItsPRPL中，最终获得的质粒命名为pKID220，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，质粒图谱如图2所示。打靶片段区的正向测序引物为T7，反向测序引物为T7ter。
本发明所用引物如表1所示。
表1
本发明所用质粒如表2所示。
表2
实施例2：肠炎沙门氏菌pgtE基因的敲除
pKID-UD敲除质粒系将携带pgtE基因的侧翼DNA序列插入pKID220质粒打靶片段区构建而成，用于将pgtE基因从肠炎沙门氏菌中敲除。操作流程如图3所示。
具体操作步骤如下：
1、用HFF1和HFR1引物(表1所示)从肠炎沙门氏菌SM6菌株基因组中扩增871bp的上游同源臂PgtEup(序列如SEQ ID NO.6所示)，然后用HRF1和HRR1引物从SM6基因组中扩增963bp的下游同源臂PgtEdown(序列如SEQ ID NO.7所示)。
2、pKID220质粒经NcoI和SalI双酶切，获得两侧带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段FCF(1041bp)和5121bp的骨架片段CIGBE。通过重叠延伸PCR将PgtEup、PgtEdown和FCF片段融合后，再利用One Step Cloning Kit将其与CIGBE片段连接。将连接产物通过电穿孔转化SM6菌株。具体的，在预先制备的感受态细胞中加入10μL连接产物，然后通过Bio-Rad微脉冲发生器完成电穿孔(参数为12.5kV/cm、200Ω、25μF、4.9ms)。加入800μL LB液体培养基，30℃孵育45min，接种于含25μg/mL氯霉素的LB平板上，30℃培养过夜。提质粒，送测序验证(正向测序引物为T7，反向测序引物为T7ter)。阳性克隆命名为pKID-UD质粒。
3、将阳性菌株接种于1mL含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养4h，然后将培养物置于42℃振荡培养过夜。划线于含25μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃孵育7～10h。以引物对idsm6-F和idsm6-R(表1所示)用PCR方法检测pgtE基因是否被敲除。用引物对idKID220-F/R(表1所示)检测pKID-UD质粒是否被消除。阳性克隆命名为SM6ΔpgtE::cat。
4、将pCP20质粒通过电穿孔转化SM6ΔpgtE::cat菌株，30℃培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落30℃培养8h后，升温至42℃诱导FLP重组酶表达，培养过夜。将培养物划线于无抗性LB平板，37℃培养。挑取单菌落，用idpcp20-F和idpcp20-R(表1所示)引物检测pCP20是否被消除。阳性克隆命名为SM6ΔpgtE。当确定抗性基因已被消除，但pCP20质粒未丢失时，可在42℃继续培养以消除质粒。
图4显示了pgtE基因的敲除结果。以引物对idsm6-F和idsm6-R(表1所示)进行PCR鉴定，SM6亲本菌株扩增条带大小为2100bp，SM6ΔpgtE缺失株扩增条带大小为1046bp，与预期相符，说明pgtE基因被敲除。
实施例3：INP0862基因替换肠炎沙门氏菌pgtE基因
pKID-INP0862敲入(替换)质粒是将携带INP0862基因的侧翼DNA序列插入pKID220质粒打靶片段区构建而成，用于将肠炎沙门氏菌pgtE基因替换为INP0862基因。操作流程如图5所示。具体操作步骤如下：
1、以pET28a-INP0862质粒为模板，用HF0862-F和HF0862-R引物(表1所示)经PCR扩增得到1480bp的INP0862基因片段(序列如SEQ ID NO.8所示)。再利用One Step CloningKit，通过Nco I位点克隆到pKID-UD，将连接产物通过电穿孔转化SM6菌株。具体的，在预先制备的感受态细胞中加入10μL连接产物，然后通过Bio-Rad微脉冲发生器完成电穿孔(参数为12.5kV/cm、200Ω、25μF、4.9ms)。加入800μL LB液体培养基，30℃孵育45min，接种于含25μg/mL氯霉素的LB平板上，30℃培养过夜。提质粒，送测序验证(正向测序引物为T7，反向测序引物为T7ter)。阳性克隆命名为pKID-INP0862质粒。
2、将阳性菌株接种于1mL含25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养4h，然后将培养物置于42℃振荡培养过夜。划线于含25μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃孵育7～10h。以引物对idsm6-F和idsm6-R(表1所示)用PCR方法检测pgtE基因是否被INP0862替换。用引物对idKID220-F/R检测pKID-INP0862质粒是否被消除。阳性克隆命名为SM6ΔpgtE::Cat-INP0862。
3、将pCP20质粒通过电穿孔转化SM6ΔpgtE::INP0862菌株，30℃培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落30℃培养8h后，升温至42℃诱导FLP重组酶表达，培养过夜。将培养物划线于无抗性LB平板，37℃培养。挑取单菌落，用idpcp20-F和idpcp20-R(表1所示)引物检测pCP20是否被消除。阳性克隆命名为SM6ΔpgtE::INP0862。当确定抗性基因已被消除，但pCP20质粒未丢失时，可在42℃继续培养以消除质粒。
图6显示了INP0862基因替换pgtE基因的结果。以引物对idsm6-F和idsm6-R(表1所示)进行PCR鉴定，SM6亲本菌株扩增条带大小为2100bp，SM6ΔpgtE::INP0862菌株扩增条带大小为2526bp，与预期相符，说明pgtE基因已被INP0862基因替换。
对比实验例1
同时使用本发明方法以及根据文献[Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc NatlAcad Sci U SA.97(12):6640-6645，2000.]所述传统λ-Red方法所设计的敲除引物对SM6菌株的PgtE基因进行敲除。引物为：
PgtE-delF：
5’-tgctattgcagtaatgatgatcgccgtattttctgagtcggtttatgcggagcgattgtgtaggctggag-3’；
PgtE-delR：
5’-acatcccgatgtggtctagaagcgatactgcaaccccgcggtaaccgtatttaattaacggctgacatgggaattag-3’
各挑取50个菌落，以引物对idsm6-F和idsm6-R用PCR方法检测PgtE基因是否被敲除，计算重组效率，重组效率＝阳性克隆数/50×100％。
重组效率对比结果如表3所示。
表3
表3显示了采用以上两种方法敲除pgtE基因的重组效率，从该结果可以看出本发明的重组效率可达14％，而传统λ-Red方法的重组效率仅为2％，说明本发明的重组效率优于传统的λ-Red方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用
<130> klpi210301
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6162
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 60
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 120
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 180
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 240
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 300
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 360
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 420
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 480
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 540
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 600
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 660
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 720
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 780
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 840
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 900
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 960
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 1020
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccttatc tttcccttta 1080
tttttgctgc ggtaagtcgc ataaaaacca ttcttcataa ttcaatccat ttactatgtt 1140
atgttctgag gggagtgaaa attcccctaa ttcgatgaag attcttgctc aattgttatc 1200
agctatgcgc cgaccagaac accttgccga tcagccaaac gtctcttcag gccactgact 1260
agcgataact ttccccacaa cggaacaact ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg 1320
gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct atccctgatc agtttcttga aggtaaactc 1380
atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc acctggctca acagcctgct cagggtcaac 1440
gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt 1500
accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc actggctttt ttggttgtgc ttacccatct 1560
ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag cttaggtgag aacatccctg cctgaacatg 1620
agaaaaaaca gggtactcat actcacttct aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata 1680
catctcgtag atttctctgg cgattgaagg gctaaattct tcaacgctaa ctttgagaat 1740
ttttgcaagc aatgcggcgt tataagcatt taatgcattg atgccattaa ataaagcacc 1800
aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc tgcgacagat tcctgggata agccaagttc 1860
atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt 1920
taatggtttc ttttttgtgc tcatacgtta aatctatcac cgcaagggat aaatatctaa 1980
caccgtgcgt gttgactatt ttacctctgg cggtgataat ggttgcatgt actaaggagg 2040
ttgtatggaa caacgcataa ccctgaaaga ttatgcaatg cgctttgggc aaaccaagac 2100
agctaaaaga tctctcacct accaaacaat gcccccctgc aaaaaataaa ttcatataaa 2160
aaacatacag ataaccatct gcggtgataa attatctctg gcggtgttga cataaatacc 2220
actggcggtg atactgagca catcagcagg acgcactgac caccatgaag gtgacgctct 2280
taaaaattaa gccctgaaga agggcagcat tcaaagcaga aggctttggg gtgtgtgata 2340
cgaaacgaag cattggttaa aaattaagga gggctagcat gaaaaacatc aaaaaaaacc 2400
aggtaatgaa cctgggtccg aactctaaac tgctgaaaga atacaaatcc cagctgatcg 2460
aactgaacat cgaacagttc gaagcaggta tcggtctgat cctgggtgat gcttacatcc 2520
gttctcgtga tgaaggtaaa acctactgta tgcagttcga gtggaaaaac aaagcataca 2580
tggaccacgt atgtctgctg tacgatcagt gggtactgtc cccgccgcac aaaaaagaac 2640
gtgttaacca cctgggtaac ctggtaatca cctggggcgc ccagactttc aaacaccaag 2700
ctttcaacaa actggctaac ctgttcatcg ttaacaacaa aaaaaccatc ccgaacaacc 2760
tggttgaaaa ctacctgacc ccgatgtctc tggcatactg gttcatggat gatggtggta 2820
aatgggatta caacaaaaac tctaccaaca aatcgatcgt actgaacacc cagtctttca 2880
ctttcgaaga agtagaatac ctggttaagg gtctgcgtaa caaattccaa ctgaactgtt 2940
acgtaaaaat caacaaaaac aaaccgatca tctacatcga ttctatgtct tacctgatct 3000
tctacaacct gatcaaaccg tacctgatcc cgcagatgat gtacaaactg ccgaacacta 3060
tctcctccga aactttcctg aaatgaatat taatactgaa actgagatca agcaaaagca 3120
ttcactaacc ccctttcctg ttttcctaat cagcccggca tttcgcgggc gatattttca 3180
cagctatttc aggagttcag ccatgaacgc ttattacatt caggatcgtc ttgaggctca 3240
gagctgggcg cgtcactacc agcagctcgc ccgtgaagag aaagaggcag aactggcaga 3300
cgacatggaa aaaggcctgc cccagcacct gtttgaatcg ctatgcatcg atcatttgca 3360
acgccacggg gccagcaaaa aatccattac ccgtgcgttt gatgacgatg ttgagtttca 3420
ggagcgcatg gcagaacaca tccggtacat ggttgaaacc attgctcacc accaggttga 3480
tattgattca gaggtataaa acgaatgagt actgcactcg caacgctggc tgggaagctg 3540
gctgaacgtg tcggcatgga ttctgttgac ccacaggaac tgatcaccac tcttcgccag 3600
acggcattta aaggtgatgc cagcgatgcg cagttcatcg cattactgat cgttgccaac 3660
cagtacggcc ttaatccgtg gacgaaagaa atttacgcct ttcctgataa gcagaatggc 3720
atcgttccgg tggtgggcgt tgatggctgg tcccgcatca tcaatgaaaa ccagcagttt 3780
gatggcatgg actttgagca ggacaatgaa tcctgtacat gccggattta ccgcaaggac 3840
cgtaatcatc cgatctgcgt taccgaatgg atggatgaat gccgccgcga accattcaaa 3900
actcgcgaag gcagagaaat cacggggccg tggcagtcgc atcccaaacg gatgttacgt 3960
cataaagcca tgattcagtg tgcccgtctg gccttcggat ttgctggtat ctatgacaag 4020
gatgaagccg agcgcattgt cgaaaatact gcatacactg cagaacgtca gccggaacgc 4080
gacatcactc cggttaacga tgaaaccatg caggagatta acactctgct gatcgccctg 4140
gataaaacat gggatgacga cttattgccg ctctgttccc agatatttcg ccgcgacatt 4200
cgtgcatcgt cagaactgac acaggccgaa gcagtaaaag ctcttggatt cctgaaacag 4260
aaagccgcag agcagaaggt ggcagcatga caccggacat tatcctgcag cgtaccggga 4320
tcgatgtgag agctgtcgaa cagggggatg atgcgtggca caaattacgg ctcggcgtca 4380
tcaccgcttc agaagttcac aacgtgatag caaaaccccg ctccggaaag aagtggcctg 4440
acatgaaaat gtcctacttc cacaccctgc ttgctgaggt ttgcaccggt gtggctccgg 4500
aagttaacgc taaagcactg gcctggggaa aacagtacga gaacgacgcc agaaccctgt 4560
ttgaattcac ttccggcgtg aatgttactg aatccccgat catctatcgc gacgaaagta 4620
tgcgtaccgc ctgctctccc gatggtttat gcagtgacgg caacggcctt gaactgaaat 4680
gcccgtttac ctcccgggat ttcatgaagt tccggctcgg tggtttcgag gccataaagt 4740
cagcttacat ggcccaggtg cagtacagca tgtgggtgac gcgaaaaaat gcctggtact 4800
ttgccaacta tgacccgcgt atgaagcgtg aaggcctgca ttatgtcgtg attgagcggg 4860
atgaaaagta catggcgagt tttgacgaga tcgtgccgga gttcatcgaa aaaatggacg 4920
aggcactggc tgaaattggt tttgtatttg gggagcaatg gcgatgacac atttccccga 4980
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 5040
cgtatcacga ggctaatacg actcactata gggatattac cctgttatcc ctaccatggg 5100
ccatatggct gcttcgaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac 5160
ttcatttaaa tggcgcgcct tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtattc 5220
attaagcatc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc 5280
ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca ttgtgaaaac gggggcgaag 5340
aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct 5400
gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa 5460
cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc 5520
cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta 5580
tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgta attccggatg agcattcatc 5640
aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc 5700
tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac 5760
tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca 5820
gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgacaa ctcaaaaaat 5880
acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca 5940
acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga 6000
tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtaggc gcgccgaagt tcctatactt 6060
tctagagaat aggaacttcg gaataggaac taaggaggat attgtcgaca agcttctcga 6120
gtagggataa cagggtaatc caccgctgag caataactag ca 6162
<210> 2
<211> 2131
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 60
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 120
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 180
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 240
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 300
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ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 420
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tcatatagat ctggcgggtt tggcgttaag acgtggcaag gaacagtaga gggggacctc 180
atccagatgt tataaacttc aattcagaaa gttactttcc atatactttt tgtgggactg 240
cttcaacctt tgggcagata tcggaaatga aaaagataga ccaggcaact attcgctatc 300
agaatatccg gtacaccaac taccaactac caactaccaa ctaccaacaa atcatttagt 360
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taa 963
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agatgcgtta ctgatgctgg ctccgcgatc cgggatagac gatcttgcgc ggctctatct 1080
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gctcctctgc tcacttgcgg gcgagagagt gtacgtcgct gagctgtcga tggaactgga 1440
tacgtttcta cgtgacccgc accaccacca ccaccactga 1480
Claims (10)
1.一种温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒，所述的质粒命名为pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I-SceI识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)。
2.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为抗生素抗性基因或其他符合目的的筛选标记。
3.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为氯霉素，所述的其他符合目的的筛选标记包括蔗糖、荧光蛋白。
4.如权利要求3所述的同源重组系统，其特征在于，所述的pKID220质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种构建权利要求1-4任一项所述的同源重组系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以pDC质粒为骨架，所述的pDC质粒携带的氯霉素抗性基因盒两侧有I-SceI内切酶识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)，所述的pDC质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以pBV220质粒为模板，用pDCprpL-F和pDCprpL-R引物扩增得到1483bp的温控元件CIts857-PRPL片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该片段通过Nhe I位点克隆到pDC质粒中，得到重组质粒，命名为pDC-CItsPRPL；引物序列如下：
pDCprpL-F：GAGTAAACTTGGTCTGACAGTCACATGTTCTTTCCTGCGT pDCprpL-R：TTTCGGGGAAATGTGGCTAGCCCTCCTTAATTTTTAACCAA
2)通过PCR的方式扩增或者合成出含有编码I-SceI内切酶和Red重组酶的核酸片段，命名为I-SceI-Gam-bet-exo，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过NheⅠ位点将该I-SceI-Gam-bet-exo片段克隆到pDC-CItsPRPL中，最终获得的重组质粒，命名为pKID220。
6.权利要求1-4任一项所述的同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。
7.一种用于敲除靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括在权利要求4中所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲除靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。
8.一种用于敲入或替换靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括在权利要求4中所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲入或替换靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲入或替换靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、敲入或替换基因、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。
9.权利要求7或8所述的同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。
10.一种对沙门氏菌菌株基因组进行编辑改造的方法，所述的编辑改造包括对沙门氏菌菌株基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求7或8中所述的质粒通过电转的方法转入沙门氏菌中，提质粒，测序验证；
(2)将含有所述质粒的阳性菌株接种于1mL含25μg/mL氯霉素的液体培养基中，30℃180rpm振荡培养4h；
(3)将培养物置于42℃振荡培养过夜；
(4)划线于含25μg/mL氯霉素的平板上，37℃孵育7～10h；
(5)菌落PCR筛选得到含氯霉素抗性基因的重组菌株；
(6)将pCP20质粒通过电穿孔转化含抗性基因的重组菌株，30℃培养于含100μg/mL氨苄青霉素的平板；
(7)挑取单菌落30℃培养8h后，升温至42℃，培养过夜；
(8)将培养物划线于LB平板，37℃培养；
(9)菌落PCR筛选得到无抗性且基因组经过编辑改造的重组沙门氏菌菌株。
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