CN104342410B

CN104342410B - 一种酮还原酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN104342410B
Application number: CN201310319519.1A
Authority: CN
Inventors: 丁雪峰
Original assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN104342410A

Abstract

本发明涉及一种酮还原酶突变体及其制备方法，其源于酿酒酵母的野生型酮还原酶，能够使5‑羟基‑3‑氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5‑二羟基己酸酯，具有I46V、S127N、Q144K中的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2‑100倍，利用该酶可生物催化5‑羟基‑3‑氧代己酸酯以生产对应的顺式3,5‑二羟基己酸酯；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体顺式3,5‑二羟基己酸酯无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

Description

一种酮还原酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及酮还原酶突变体及其制备方法，特别涉及一种源于酿酒酵母的酮还原酶突变体及其高效制备方法。

背景技术

阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而立体异构纯的顺式 3,5-二羟基己酸酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备立体异构纯的顺式 3,5-二羟基己酸酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉 20小时仅可转化 1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶催化活性高的酮还原酶及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)中天然存在的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)产生的野生型酮还原酶 (SEQ ID NO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮还原酶”指由源自酿酒酵母(Saccharomcescerevisiae)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO：1编码的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶能立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物 (例如5-羟基-3-氧代己酸酯)向产物 (例如顺式3,5-二羟基己酸酯 )转化率增加的酮还原酶。

本发明提供一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的野生型酮还原酶，能够立体选择地还原5-羟基-3-氧代己酸酯的3-氧代基因以产生对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变： I46V， S127N，Q144K。

上述酮还原酶突变体，优先自序列SEQ ID NO.4。全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的 His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

本发明提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-100倍。

上述酮还原酶酶基因突变体，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。

本发明提供一种重组质粒，其优选自SEQ ID NO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌 trp操纵子、大肠杆菌 tac操纵子等。

本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。

本发明提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。

所述步骤（a）为将来自酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGTCTTTCCACCAGCAGTTCTTCA 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTAAACTTTCTGAGCAGCGTAGTTG 3'。

类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQ IDNO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

所述步骤（c）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中， 30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。

所述第一培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。

所述第二培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-100倍，利用该酶可生物催化5-羟基-3-氧代己酸酯以生产对应的顺式3,5-二羟基己酸酯；（2）本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体顺式 3,5-二羟基己酸酯无副产物产生，纯化方便；（3）反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

具体实施方式

（实施例1）

野生型及酮还原酶突变体表达载体的构建

将来自酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGTCTTTCCACCAGCAGTTCTTCA 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTAAACTTTCTGAGCAGCGTAGTTG 3'。

类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

酮还原酶突变体的制备

挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DH1单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。

培养结束后，将培养液于4℃，6000g下离心20min最终得到湿菌体2.2g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4℃，12000g下离心30min，收集上清，预冷至-70℃后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.35g。

酮还原酶活性的测定

由于NADPH在340nm处有吸收峰，而NADP在340nm处无吸收峰，故可通过检测反应过程中NADPH吸光值的变化，而计算酮还原酶的活性。酮还原酶活力测定体系为：3ml反应体系中，依次加入1.5ml 100mM pH7.0 PBS缓冲液，加入终浓度0.2mM NADPH，2mM 6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，加双蒸水补至2.9ml ，充分混匀后置于25℃水浴中。将实施2中制备的酮还原酶干粉按适当的比例稀释后，取100ul 加入反应体系中，混匀后于340nm处检测每分钟的吸光度变化值。参照NADPH标准曲线计算酮还原酶的酶活。单位酶活(U)定义为每分钟生成1μmol NADP所需要的酶量。用同样方法检测野生型酮还原酶的酶活。根据检测的结果计算得到改进后的酮还原酶突变体比野生型酮还原酶酶活提升了92.8倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京朗恩生物科技有限公司

<120> 一种酮还原酶突变体及其制备方法

<130> 2013

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)

<400> 1

atgtcatttc accaacagtt ctttaccttg aataatggaa ataaaatccc cgcaatcgcc 60

atcattggga caggtactag atggtataaa aacgaagaaa cggatgctac cttttcgaac 120

agtttggtcg aacagattgt ttatgctctg aagttacctg gcattattca cattgatgct 180

gctgagatct acagaacata tccagaagtt gggaaggcac ttagcctcac cgaaaaacca 240

agaaatgcaa tattcttgac agacaagtac tcacctcaaa tcaagatgtc agattcccca 300

gcggatggac tagatttagc tttgaagaag atgggcactg actatgtcga tctatacctt 360

ttgcatagcc catttgtttc caaagaggtc aacgggttaa gtttggagga agcctggaag 420

gacatggagc aattgtacaa atcaggtaaa gctaaaaata tcggtgtttc caactttgct 480

gtggaagact tgcaaagaat tctgaaagtt gcggaagtca agccccaagt taatcaaatt 540

gagttcagtc ccttcttgca gaatcaaaca ccagggatct acaaattttg ccaagaacat 600

gatatattgg tagaagcata ctcgccacta ggtcccttac aaaagaaaac agcacaagat 660

gactctcaac cgtttttcga atacgtgaaa gagttatccg agaaatatat caaatctgaa 720

gcccaaatta tcctacgttg ggtgaccaaa cgtggcgtgt tgcctgtaac cacctcttcc 780

aaacctcaaa gaatttctga cgcgcaaaat ttattctctt tcgacttgac ggctgaggaa 840

gtcgataaga taacggagtt gggcttggaa catgaaccgc taagattgta ttggaataaa 900

ttgtacggta aatacaacta cgctgctcaa aaagtataa 939

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomces cerevisiae)

<400> 2

Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys Ile

1 5 10 15

Pro Ala Ile Ala Ile Ile Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu

20 25 30

Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Ile Val Tyr

35 40 45

Ala Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys Pro

65 70 75 80

Arg Asn Ala Ile Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln Ile Lys Met

85 90 95

Ser Asp Ser Pro Ala Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met Gly

100 105 110

Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Ser Lys

115 120 125

Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Gln

130 135 140

Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala

145 150 155 160

Val Glu Asp Leu Gln Arg Ile Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln

165 170 175

Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly

180 185 190

Ile Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp Ile Leu Val Glu Ala Tyr Ser

195 200 205

Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro

210 215 220

Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Ile Lys Ser Glu

225 230 235 240

Ala Gln Ile Ile Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val

245 250 255

Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg Ile Ser Asp Ala Gln Asn Leu Phe

260 265 270

Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys Ile Thr Glu Leu Gly

275 280 285

Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys

290 295 300

Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val

305 310

<210> 3

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtctttcc accagcagtt cttcaccctg aacaacggta acaaaatccc ggctatcgct 60

atcatcggta ccggtacccg ttggtacaaa aacgaagaaa ccgacgctac cttctctaac 120

tctctggttg aacaggttgt ttacgctctg aaactgccgg gtatcatcca catcgacgct 180

gctgaaatct accgtaccta cccggaagtt ggtaaagctc tgtctctgac cgaaaaaccg 240

cgtaacgcta tcttcctgac cgacaaatac tctccgcaga tcaaaatgtc tgactctccg 300

gctgacggtc tggacctggc tctgaaaaaa atgggtaccg actacgttga cctgtacctg 360

ctgcactctc cgttcgttaa caaagaagtt aacggtctgt ctctggaaga agcttggaaa 420

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gaattctctc cgttcctgca gaaccagacc ccgggtatct acaaattctg ccaggaacac 600

gacatcctgg ttgaagctta ctctccgctg ggtccgctgc agaaaaaaac cgctcaggac 660

gactctcagc cgttcttcga atacgttaaa gaactgtctg aaaaatacat caaatctgaa 720

gctcagatca tcctgcgttg ggttaccaaa cgtggtgttc tgccggttac cacctcttct 780

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gttgacaaaa tcaccgaact gggtctggaa cacgaaccgc tgcgtctgta ctggaacaaa 900

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<210> 4

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys Ile

1 5 10 15

Pro Ala Ile Ala Ile Ile Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu

20 25 30

Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Val Val Tyr

35 40 45

Ala Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

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65 70 75 80

Arg Asn Ala Ile Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln Ile Lys Met

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115 120 125

Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Lys

130 135 140

Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala

145 150 155 160

Val Glu Asp Leu Gln Arg Ile Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln

165 170 175

Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly

180 185 190

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195 200 205

Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro

210 215 220

Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Ile Lys Ser Glu

225 230 235 240

Ala Gln Ile Ile Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val

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Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys Ile Thr Glu Leu Gly

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Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys

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305 310

<210> 5

<211> 3390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatatgtgga 60

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ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt 1020

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gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 1500

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 1560

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 1620

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 1680

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ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 1920

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ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 2520

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 2580

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 2640

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 2700

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 2760

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 2820

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 2880

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 2940

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 3000

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 3060

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 3120

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 3180

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 3240

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 3300

cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 3360

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac 3390

Claims

1.一种酮还原酶突变体，其源于酿酒酵母的野生型酮还原酶，能够使5-羟基-3-氧代己酸酯转化为对应的顺式3,5-二羟基己酸酯，其序列为SEQ ID NO.4。

2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的酮还原酶突变体。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其序列为SEQ ID NO.3。

4.一种重组质粒，其包括表达载体连接权利要求3所述的多核苷酸，所述载体序列为SEQ ID NO.5。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。

7.一种如权利要求1所述酮还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(a)构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因，所述宿主细胞为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。

8.根据权利要求7所述酮还原酶突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中， 30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养15h。

9.一种生产他汀类药物的关键的手性中间体的方法，包括在与权利要求1所述的酮还原酶突变体的存在下，使5-羟基-3-氧代己酸酯还原成对应的顺式3,5-二羟基己酸酯。