KR102422842B1 - 크리스퍼 간섭을 이용한 rna 번역 조절용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 표적 유전자의 RNA를 표적으로 하는 CRIPRi 기술에 관한 것으로, 본 발명에 따른 유전자 발현 저해/억제 기술은 종래의 CRISPR 단백질을 이용한 것과는 다르게 RNA를 표적화하여 그 기능을 억제하거나 번역 방해를 통해 유전자 발현을 저해하기 때문에 오페론 전체를 표적하지 않고 유전자 하나만을 표적으로 삼을 수 있으며, 단백질 결합으로 인한 DNA의 전사 및 복제에 영향을 주지않아, DNA 서열상에서 다른 유전자와 겹쳐있는 경우가 많은 small regulatory RNA를 유전자 억제하기에 효과적이고, 유전체 DNA가 아닌 RNA를 표적으로하기 때문에 안전성이 확보되는 효과가 있다.

Description

크리스퍼 간섭을 이용한 RNA 번역 조절용 조성물{Compositon for regulating translation of RNA using CRISPRi}

본 발명은 표적 유전자의 RNA를 표적으로 하는 CRIPRi 기술에 관한 것이다.

최근 크리스퍼기술의 파급효과로 인해 미래 시장에 관심이 증가추세에 있다. 질병치료 이외에 크리스퍼 기술로서 유전체 교정, 유전공학, 유전자 라이브러리, 유전자 재조합 식품, 크리스퍼 플라스미드, 인간줄기 세포, 세포주 공학 등 활용분야에 크리스퍼 시장규모가 시간이 갈수록 증가추세의 흐름에 따라 세계각국에서 기술의 상용화 및 우의 선점을 하기 위하여 연구개발이 활발이 이루어지고 있다. CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)는 유전자 서열이 밝혀진 박테리아의 대략 40% 및 유전자 서열이 밝혀진 고세균의 90%의 유전체에서 발견되는 여러 짧은 직접 반복을 포함하는 좌위이다. 플라스미드 및 파지 등의 외인성 유전적 요소에 저항성을 부여한다는 점에서, CRISPR는 원핵 면역 시스템으로서 기능한다. CRISPR 시스템은 획득 면역의 한 형태를 제공한다. 스페이서(spacers)라고 불리는 외인성 DNA의 짧은 부분은 CRISPR 반복 사이의 게놈에 편입되고, 과거 노출을 기억하는 역할을 한다. 그때 CRISPR 스페이서는 진핵 유기체에서 RNAi와 유사한 방식으로 외인성 유전적 요소를 인지하고 침묵(silence)시키는데 사용된다. CRISPR-Cas 시스템은 인간을 비롯한 생물체에서 표적 유전자 편집 도구로 개발되어 사용되어 왔다. 뉴클레오타이드 결합 CRISPR-Cas 단백질의 위치 특이성(site specificity)은 디자인 및 합성하기에 더 까다로울수 있는 DNA-결합 단백질 대신 RNA 분자에 의해 통제되기 때문에, CRISPR/Cas 시스템은 징크 핑거 (zinc finger) 및 전사 활성자-유사 반응기 DNA-결합 단백질 (transcription activator-like effector DNA binding protein)에 이점을 제공한다. 또한, 이 중 타입 Ⅱ CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced repeat / CRISPR-associated) 시스템은 원핵생물 획득 면역 시스템으로부터 유래된 것으로 하나의 guide RNA와 하나의 Cas 단백질만으로 작동하여 유용성이 높아 균주 제작 또는 개체의 유전자 조작을 위한 기술로 이미 적용되고 있으며, 의학, 생명공학의 분야에서 널리 쓰이며 최근 지속적으로 발전하고 있는 기술이다. 그러나, CRISPR는 Cas와 sgRNA을 이용하여 표적 위치(target site)에 유전자 삽입 및 변형을 쉽고 빠르게 만들어 낼 수 있으나, CRISPR는 표적 위치가 아닌 자리에 돌연변이를 일으킬 가능성이 있다.

따라서, 최근에는 더 진보된 기술로 CRISPRi가 사용되고 있다. CRISPR 간섭(CRISPR interference; CRISPRi)은 표적 유전자 편집 대신 유전자의 발현 조절을 목적으로 CRISPR-Cas 시스템을 사용하기 위하여, Cas의 DNA 절단 효소활성을 결핍(제거)시켜 불활성화된 Cas 단백질(dCas)을 이용하여 유전체의 직접적인 수정, 편집 없이 유전자의 발현 정도를 낮추는 것으로 원하는 유전자의 발현의 정도를 조절할 수 있는 시스템이다. 이 기술의 장점은 돌연변이를 만들지 않고도 표적 위치의 유전자 발현을 억제 또는 조절할 수 있어, 유전자 변형을 일으키지 않고도 유전자 조절이 가능하며, 대사경로의 최적화 과정이 가능하게 유도할 수 있고, 동시에 유전자 결핍을 만드는 것이 아니기에 생존에 있어서 필수적인 유전자들을 목표로 적용하기에 매우 적합해 다양한 생명체에서 유전자 발현의 DNA 서열 특이적 조절을 위한 효율적인 도구로 사용되고 있다. 이러한 크리스퍼 억제 기술은 DNA를 표적으로 하며, 프로모터와 TSS(transcritption start site)에서 효과적이라고 알려져 있다. 이는 DNA 상에서 다른 유전자의 서열과 겹쳐져 있는 유전자를 표적으로 하거나 프로모터나 TSS가 알려져 있지 않은 경우에 기술 적용이 어려워진다는 단점이 있다.

최근 RNA에 특이적으로 결합하는 크리스퍼 단백질인 Cas13 단백질이 발견되었으며 이를 이용해 크리스퍼 억제 기술을 사용하는 것이 연구되었으나, 미생물 상에서 Cas13 단백질이 활성화되었을 때, 주변의 핵산들을 무작위로 분해한다는 단점이 있어왔다.

본 발명의 목적은 불활성화된 Cas13 및 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA를 대장균 균주 내에서 발현하기 위한 벡터를 제공하고, 전사되는 RNA만을 표적으로 하여 RNA의 번역을 방해하거나 기능을 억제함으로써 유전자 발현을 억제/저해하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유전자 발현 억제용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 RNA 번역 조절 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 표적 유전자의 RNA가 억제된 균주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 미생물에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 유전자 발현 저해/억제 기술은 종래의 CRISPR 단백질을 이용한 것과는 다르게 RNA를 표적화하여 그 기능을 억제하거나 번역 방해를 통해 유전자 발현을 저해하기 때문에 오페론 전체를 표적하지 않고 유전자 하나만을 표적으로 삼을 수 있으며, 단백질 결합으로 인한 DNA의 전사 및 복제에 영향을 주지않아, DNA 서열상에서 다른 유전자와 겹쳐있는 경우가 많은 small regulatory RNA를 유전자 억제하기에 효과적이고, 유전체 DNA가 아닌 RNA를 표적으로하기 때문에 안전성이 확보되는 효과가 있다.

도 1은 dCas13 기반 크리스퍼 억제 기술의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 dCas13 기반 크리스퍼 억제 기술을 위해 구축된 플라스미드들을 나타낸 모식도이다:
a: pEcoli-dCas13a 벡터; 및
b: 표적 서열에 대한 프로토스페이서를 포함하는 13pEcoli-crRNA 벡터.
도 3은 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현하는 E.coli에서의 본 발명의 dCas13 기반 크리스퍼 억제 기술이 적색 형광 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인한 도이다.
도 4는 소형 RNA를 표적으로 한 본 발명의 dCas13 기반 크리스퍼 억제 기술로 인한 E.coli 균주의 성장 정도를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

일 측면에서, 본 발명은 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터; 및 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는, 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질은 dCas13a, dCas13b 또는 dCas13c일 수 있으며, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) 유래 Cas13a일 수 있다.

일 구현예에서, 가이드 RNA는 가이드 RNA는 상기 표적 유전자의 RNA에 이중가닥을 형성할 수 있는 약 10 내지 50nt의 길이를 가질 수 있으며, crRNA(CRISPR RNA)일 수 있다.

일 구현예에서, 제 2 벡터는 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 RNA를 암호화하는 프로토스페이서(protospacer)를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 전사 후 표적 유전자의 RNA에 상보적인 프로토스페이서 서열은 10 내지 40bp 길이일 수 있으며, 20 내지 30bp의 길이인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 제 1 벡터가 번역되어 생성된 dCas13a와 제 2 벡터가 전사되어 생성된 crRNA는 표적 유전자가 전사되어 생성된 RNA에 결합하여 리보솜 또는 다른 RNA와 표적 유전자의 RNA의 상호작용을 방해함으로써 번역 또는 기능을 억제할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물일 수 있으며, 상기 미생물은 대장균인 Escherichia coli일 수 있다.

일 구현예에서, dCas13a는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 제 1 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 제 2 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 3에서 n으로 표시된 위치에 프로토스페이서 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, crRNA는 서로 다른 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복될 수 있으며, 상기 프로토스페이서가 서로 상이한 둘 이상의 표적 유전자에 상보적일 수 있고, 다중 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있다.

본 발명에서, 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 표적 RNA와 혼성화하는 핵산을 암호화하는 프로토스페이서를 반복적으로 연결하고, 각각의 반복적인 염기 서열 및/또는 프로토스페이서를 목적하는 유전자에 적합하도록 변형함에 따라 다중 유전자를 억제하는 crRNA를 제작할 수 있다. 상기 crRNA는 표적 RNA와 혼성화될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로토스페이서"는 표적 RNA와 혼성화되는 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "혼성화"는 하나 이상의 핵산이 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 핵산 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "발현"은 핵산이 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 발현 또는 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물은 촉매 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas13a 단백질(dCas13a)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터인 제 1 벡터 및 crRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터인 제 2 벡터의 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas13a 단백질 및 crRNA를 포함하는 혼합물 또는 이들이 복합체를 이루는 리보핵산단백질 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas13a 단백질 및 crRNA를 함께 포함하는 벡터로 세포 또는 유기체에 도입될 수 있다.

본 발명에서, 상기 crRNA의 구체적 서열은 Cas13a 단백질의 종류(유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에서, 상기 Cas13a 단백질 등의 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함된 제 1 벡터 또는 제 2 벡터의 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 발현 카세트는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 염기 서열 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 핵산 분자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 핵산 분자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열; 및/또는 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 유전자 발현 억제용 재조합 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 유전자 발현 억제용 재조합 벡터는 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열과 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 각각 또는 함께 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 유전자 발현 억제용 재조합 벡터는 표적 유전자의 RNA 번역 또는 기능을 억제할 수 있다.

일 구현예에서, 가이드 RNA는 상기 표적 유전자의 RNA에 이중가닥을 형성할 수 있는 약 10 내지 50nt의 길이를 가질 수 있으며, crRNA(CRISPR RNA)일 수 있고, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열은 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 RNA를 암호화하는 프로토스페이서를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 미생물 유전자 발현 억제용일 수 있으며, 상기 미생물은 대장균일 수 있다.

본 발명에서, 핵산 서열은 "외생성"일 수 있으며, 이는 벡터가 유입되는 박테리아에 이종이거나, 서열이 박테리아의 서열과는 상동성이나, 서열이 통상적으로 발현되지 않는 박테리아 세포 핵산내에 위치한다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 크로모좀 (예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 잘 작제할 수 있을 것이다 (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Maniatis et al, 1989 and Ausubel et al, 1994] 참조).

본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 또 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보좀의 생성시 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 박테리아 세포에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열이다. 전사 및 번역을 좌우하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하며, 하기 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.

상기 주지된 바와 같이, 발현될 목적 생성물을 암호화하는 핵산은 각 박테리아 세포에 대한 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 이는 조정 서열 예컨대, 본 명세서에 걸쳐 기술된 조정 서열, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종료 시그날을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 벡터를 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 함유함으로써 실험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 확인가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 확인시켜 줄 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재하에 이의 선택을 가능하게 하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 이의 존재로 인해 이의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선택 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다. 일반적으로, 약물 선택 마커의 유입이 형질전환체의 클로닝 및 확인을 보조하며, 예를 들어, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 젠티마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 제오신 및 카나마이신에 대한 내성을 유여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 영양요구체가 결여된 유전자에 의해 기능적으로 보완되는 보완 방법이 또한 이용된다. 수행 조건에 기초하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 형광 분석을 기초로 하는 GFP 및 YFP와 같은 스트리닝 마커를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려될 수 있다. 또한, 루시퍼라아제를 이용하는 마커가 리포터 유전자로서 이용될 수 있다. 당업자는 또한, 가능하게는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 어떻게 이용할지에 대해 알 고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 그렇게 중요하지 않다. 또한, 선택 및 스크리닝 마커의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 조성물 또는 벡터를 포함하는 RNA 번역 조절 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 키트는 미생물의 유전자 발현 억제용 키트일 수 있다..

일 구현예에서, 상기 키트는 대장균에서 표적 유전자의 RNA의 번역 또는 기능을 억제하는 키트일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터; 또는 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는, 표적 유전자의 RNA가 억제된 균주에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 균주는 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터로 형질전환된 균주; 또는 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터 및 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터로 형질전환된 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 대장균일 수 있다.

일 구현예에서, 표적 유전자의 RNA는 CRISPRi로 억제될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 미생물에 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는, 미생물에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 제 2 벡터를 형질전환한 뒤 제 1 벡터를 형질전환할 수 있으며, 제 1 벡터와 제 2 벡터가 동시에 형질전환될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 미생물은 대장균일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법을 통해 미생물에서 표적 유전자의 RNA의 번역 또는 기능을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 형질전환은 목적하는 유전자(핵산)를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Escherichia coli 발현용 CRISPRi(크리스퍼 간섭) 벡터 제작

1-1. dCas13a 기반 벡터 제작

도 1과 같은 기작으로 크리스퍼 간섭을 통한 표적 RNA의 번역 또는 기능을 억제하는 크리스퍼 억제 기술을 이용하기 위하여, E.coli에서 불활성화된 Cas13 기반 크리스퍼 억제 (간섭)용 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 불활성화된 Cas13의 시퀀스를 가진 벡터를 addgene (91905)에서 구매하여 해당 유전자 시퀀스를 PCR을 통해 증폭해 DNA를 얻었다. 그 후, BioBrick 벡터인 pBbA2c-rfp 벡터에 제한효소 BglII 및 XhoI 처리하여 rfp 부분을 제거한 후 그 자리에 증폭된 불활성화된 Cas13 유전자 시퀀스를 삽입하여 pEcoli-dCas13a 벡터 (서열번호 2)를 제작하였다 (도 2a). 완성된 pEcoli-dCas13a 벡터를 E.coli K-12 MG1655 야생형 균주에 삽입하여 dCas13a 기반 크리스퍼 억제 기술 능력을 갖춘 균주를 만들었다.

1-2. crRNA 벡터 제작

특정 RNA 서열을 표적으로 할 수 있는 가이드 RNA를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제작한 dCas13a 기반 CRISPRi 벡터가 발현되어 표적으로 할 RNA의 역방향 서열을 암호화하는 염기서열 (n)을 포함하는 13pEcoli-crRNA 벡터 (서열번호 3)를 PCR을 이용하여 하기 표 1의 프라이머로 제작하였다 (도 2b).

		서열 (5'->3')
가이드 RNA 제작용 프라이머	Forward	aaaactagtTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC
	Reverse	AAAACTAGT[20~30bp의 프로토스페이서 서열]GTTTTAGTCCCCTTCGTTTT

상기 실시예들에서 제작한 pEcoli-dCas13a 벡터 및 13pEcoli-crRNA 벡터가 E.coli에서 발현되면 표적 가이드 RNA (crRNA)와 dCas13a 단백질이 표적 RNA와 결합하여 복합체를 형성하게 되고, 이로 인해 표적 RNA가 리보솜과 같은 단백질과의 결합을 방해하여 유전체를 표적으로 하지 않아도 유전자 발현의 억제를 가능하게 하는 크리스퍼 억제/간섭 시스템을 수립하였다.

실시예 2. 크리스퍼 억제/간섭 시스템의 E.coli 에서의 표적 mRNA 억제 검증

2-1. RFP 발현 억제능 확인

적색 형광 단백질을 발현하는 에스케리키아 콜라이(E.coli) 균주를 제작하고 상기 실시예 1에서 제작한 CRISPRi용 벡터인 pEcoli-dCas13a 및 13pEcoli-crRNA 플라스미드를 동시에 도입하여 적색 형광 단백질을 표적화한 뒤, 형광의 양의 감소를 측정함으로써 적색 형광 단백질의 발현 억제를 확인하였다. 구체적으로, 우선, pBbB5k-rfp (Addgene 35354 기반) 플라스미드를 E.coli에 도입하여 적색 형광 단백질을 발현시키고 상기 E.coli에 pEcoli-dCas13a 벡터를 도입하였다. 그 후, RFP의 유전자의 mRNA 서열의 역방향 서열인 프로토스페이서 시퀀스 rfp_1 : 5'-atggcgagtagcgaagacgttatcaaag-3'을 crRNA으로 발현할 수 있도록 13pEcoli-crRNA-rfp 벡터를 상기 실시예 1-2의 프라이머를 이용하여 PCR로 제작하고, 해당 벡터를 pBbB5k-rfp 및 pEcoli-dCas13a 벡터가 삽입된 상기 균주에 도입하였다. 그 후, pBbB5k-rfp로 RFP를 발현하는 E.coli에 13pEcoli-crRNA-rfp 및 pEcoli-dCas13a 벡터가 도입된 상기 균주를 LB 100ul에서 37℃ 및 300rpm에서 8시간 동안 배양하여 흡광도, 형광 및 성장 정도를 확인하였다. 이 때 대조군은 crRNA의 존재 유무가 형광 외에 다른 영향을 끼치지 않는지 확인하기 위해 crRNA가 없는 공벡터인 13pEcoli 벡터를 도입한 균주를 사용하였다. 그 결과, RFP 유전자의 발현이 감소되어 적색 형광량이 매우 낮아진 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

이를 통해, dCas13a 기반 크리스퍼 억제 기술이 E.coli 균주에서 mRNA를 표적으로 적용 가능함을 확인할 수 있었으며, Cas13과는 달리 독성이 없는 것도 확인할 수 있었으므로, pEcoli-dCas13a을 이용한 E.coli의 mRNA 표적 dCas13a 기반 크리스퍼 억제 기술이 검증되었다.

2-2. 소형 RNA 유전자 기능 억제 확인

E.coli 균주의 sgrS (sugar transport-related sRNA) 유전자를 결핍시키고 LB 배지에 포도당 6-인산의 유사체인 αMG (alpha-D-methylglucoside)을 넣어 배양하면, 균주의 성장이 매우 감소하므로 (Richards, G. R., & Vanderpool, C. K. (2012). Induction of the Pho regulon suppresses the growth defect of an Escherichia coli sgrS mutant, connecting phosphate metabolism to the glucose-phosphate stress response. Journal of bacteriology, 194(10), 2520-2530.), 소형 RNA 유전자인 sgrS를 표적으로하고 배지에 αMG를 첨가하여 배양하여 균주의 성장 감소를 확인함으로써 유전자 기능 억제를 검증하였다. 구체적으로, 소형 RNA sgrS의 상보적인 서열을 이용해 crRNA를 제작하여 (프로토스페이서 서열 sgrS_1:5'-atcatgtgtgactgagtattggtgtaaa-3') 13pEcoli-crRNA-sgrS 벡터를 PCR로 제작하였다. 이 후 상기 벡터를 pEcoli-dCas13a 벡터가 삽입된 E.coli 균주에 도입하고 αMG 0.5%의 LB 100ul에서 37℃ 및 300rpm로 8시간 동안 액체 배양한 뒤 흡광도를 측정하여 균주의 성장 정도를 측정함으로써 pEcoli-dCas13a의 기능을 확인하였다. 이 때 대조군은 E.coli K-12 MG1655 야생형 균주를 사용하였다. 그 결과, 해당 유전자 sgrS의 기능에 방해를 받아 균주의 성장이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

이를 통해, 본 발명의 pEcoli-dCas13a 및 표적 유전자에 대한 13pEcoli-crRNA 벡터를 이용한 dCas13a 기반 크리스퍼 억제 기술이 E.coli 균주에서 sRNA를 표적으로 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Compositon for regulating translation of RNA using CRISPRi <130> R-2020-0412-KR-1 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas13a <400> 1 Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu 1 5 10 15 Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu 20 25 30 Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn 35 40 45 Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu 50 55 60 Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr 85 90 95 Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe 100 105 110 Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn 130 135 140 Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile 145 150 155 160 Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile 165 170 175 Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn 180 185 190 Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu 195 200 205 Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys 210 215 220 Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu 225 230 235 240 Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile 245 250 255 Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser 260 265 270 Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys 275 280 285 Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln 290 295 300 Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp 305 310 315 320 Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu 325 330 335 Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys 340 345 350 Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile 355 360 365 Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val 370 375 380 Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn 385 390 395 400 Glu Asn Gly Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn 405 410 415 Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn 420 425 430 Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser 435 440 445 Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala 450 455 460 Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Ala His Gly Ile Val His Phe 465 470 475 480 Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala 485 490 495 Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys 500 505 510 Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe 515 520 525 Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys 530 535 540 Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys 545 550 555 560 Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp 565 570 575 Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu 580 585 590 Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser 595 600 605 Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln 610 615 620 Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile 625 630 635 640 Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu 645 650 655 Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe 660 665 670 Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn 675 680 685 Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile 690 695 700 Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys 705 710 715 720 Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His 725 730 735 Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys 740 745 750 Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn 755 760 765 His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser 770 775 780 Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu 785 790 795 800 Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala 805 810 815 Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp 820 825 830 Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly 835 840 845 Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly 850 855 860 Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile 865 870 875 880 Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu 885 890 895 Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro 900 905 910 Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys 915 920 925 Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu 930 935 940 Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His 945 950 955 960 Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg 965 970 975 Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn 980 985 990 Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu 995 1000 1005 Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu Lys 1010 1015 1020 Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln Glu Lys 1025 1030 1035 1040 Lys Asp Leu Tyr Ile Ala Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro 1045 1050 1055 His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn Leu Arg Lys Leu 1060 1065 1070 Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile Met Lys Ser Ile Val 1075 1080 1085 Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala Thr Phe Lys Ile Gly Ala 1090 1095 1100 Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile Val His 1105 1110 1115 1120 Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu 1125 1130 1135 Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu 1140 1145 1150 <210> 2 <211> 6039 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEcoli-dCas13a <400> 2 gacgtcttaa gacccacttt cacatttaag ttgtttttct aatccgcata tgatcaattc 60 aaggccgaat aagaaggctg gctctgcacc ttggtgatca aataattcga tagcttgtcg 120 taataatggc ggcatactat cagtagtagg tgtttccctt tcttctttag cgacttgatg 180 ctcttgatct tccaatacgc aacctaaagt aaaatgcccc acagcgctga gtgcatataa 240 tgcattctct agtgaaaaac cttgttggca taaaaaggct aattgatttt cgagagtttc 300 atactgtttt tctgtaggcc gtgtacctaa atgtactttt gctccatcgc gatgacttag 360 taaagcacat ctaaaacttt tagcgttatt acgtaaaaaa tcttgccagc tttccccttc 420 taaagggcaa aagtgagtat ggtgcctatc taacatctca atggctaagg cgtcgagcaa 480 agcccgctta ttttttacat gccaatacaa tgtaggctgc tctacaccta gcttctgggc 540 gagtttacgg gttgttaaac cttcgattcc gacctcatta agcagctcta atgcgctgtt 600 aatcacttta cttttatcta atctagacat cattaattcc taatttttgt tgacactcta 660 tcgttgatag agttatttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagaat tcaaaagatc 720 catgaaagtg accaaggtcg acggcatcag ccacaagaag tacatcgaag agggcaagct 780 cgtgaagtcc accagcgagg aaaaccggac cagcgagaga ctgagcgagc tgctgagcat 840 ccggctggac atctacatca agaaccccga caacgcctcc gaggaagaga accggatcag 900 aagagagaac ctgaagaagt tctttagcaa caaggtgctg cacctgaagg acagcgtgct 960 gtatctgaag aaccggaaag aaaagaacgc cgtgcaggac aagaactata gcgaagagga 1020 catcagcgag tacgacctga aaaacaagaa cagcttctcc gtgctgaaga agatcctgct 1080 gaacgaggac gtgaactctg aggaactgga aatctttcgg aaggacgtgg aagccaagct 1140 gaacaagatc aacagcctga agtacagctt cgaagagaac aaggccaact accagaagat 1200 caacgagaac aacgtggaaa aagtgggcgg caagagcaag cggaacatca tctacgacta 1260 ctacagagag agcgccaagc gcaacgacta catcaacaac gtgcaggaag ccttcgacaa 1320 gctgtataag aaagaggata tcgagaaact gtttttcctg atcgagaaca gcaagaagca 1380 cgagaagtac aagatccgcg agtactatca caagatcatc ggccggaaga acgacaaaga 1440 gaacttcgcc aagattatct acgaagagat ccagaacgtg aacaacatca aagagctgat 1500 tgagaagatc cccgacatgt ctgagctgaa gaaaagccag gtgttctaca agtactacct 1560 ggacaaagag gaactgaacg acaagaatat taagtacgcc ttctgccact tcgtggaaat 1620 cgagatgtcc cagctgctga aaaactacgt gtacaagcgg ctgagcaaca tcagcaacga 1680 taagatcaag cggatcttcg agtaccagaa tctgaaaaag ctgatcgaaa acaaactgct 1740 gaacaagctg gacacctacg tgcggaactg cggcaagtac aactactatc tgcaagtggg 1800 cgagatcgcc acctccgact ttatcgcccg gaaccggcag aacgaggcct tcctgagaaa 1860 catcatcggc gtgtccagcg tggcctactt cagcctgagg aacatcctgg aaaccgagaa 1920 cgagaacggt atcaccggcc ggatgcgggg caagaccgtg aagaacaaca agggcgaaga 1980 gaaatacgtg tccggcgagg tggacaagat ctacaatgag aacaagcaga acgaagtgaa 2040 agaaaatctg aagatgttct acagctacga cttcaacatg gacaacaaga acgagatcga 2100 ggacttcttc gccaatatcg atgaggccat ctctagtatt gctcacggca tcgtgcattt 2160 caacctggaa ctggaaggca aggacatctt cgccttcaag aatatcgccc ccagcgagat 2220 ctccaagaag atgtttcaga acgaaatcaa cgaaaagaag ctgaagctga aaatcttcaa 2280 gcagctgaac agcgccaacg tgttcaacta ctacgagaag gatgtgatca tcaagtacct 2340 gaagaatacc aagttcaact tcgtgaacaa aaacatcccc ttcgtgccca gcttcaccaa 2400 gctgtacaac aagattgagg acctgcggaa taccctgaag tttttttgga gcgtgcccaa 2460 ggacaaagaa gagaaggacg cccagatcta cctgctgaag aatatctact acggcgagtt 2520 cctgaacaag ttcgtgaaaa actccaaggt gttctttaag atcaccaatg aagtgatcaa 2580 gattaacaag cagcggaacc agaaaaccgg ccactacaag tatcagaagt tcgagaacat 2640 cgagaaaacc gtgcccgtgg aatacctggc catcatccag agcagagaga tgatcaacaa 2700 ccaggacaaa gaggaaaaga atacctacat cgactttatt cagcagattt tcctgaaggg 2760 cttcatcgac tacctgaaca agaacaatct gaagtatatc gagagcaaca acaacaatga 2820 caacaacgac atcttctcca agatcaagat caaaaaggat aacaaagaga agtacgacaa 2880 gatcctgaag aactatgaga agcacaatcg gaacaaagaa atccctcacg agatcaatga 2940 gttcgtgcgc gagatcaagc tggggaagat tctgaagtac accgagaatc tgaacatgtt 3000 ttacctgatc ctgaagctgc tgaaccacaa agagctgacc aacctgaagg gcagcctgga 3060 aaagtaccag tccgccaaca aagaagaaac cttcagcgac gagttggaac tgatcaacct 3120 gctgaacctg gacaacaaca gagtgaccga ggacttcgag ctggaagcca acgagatcgg 3180 caagttcctg gacttcaacg aaaacaaaat caaggaccgg aaagagctga aaaagttcga 3240 caccaacaag atctatttcg acggcgagaa catcatcaag caccgggcct tctacaatat 3300 caagaaatac ggcatgctga atctgctgga aaagatcgcc gataaggcca agtataagat 3360 cagcctgaaa gaactgaaag agtacagcaa caagaagaat gagattgaaa agaactacac 3420 catgcagcag aacctgcacc ggaagtacgc cagacccaag aaggacgaaa agttcaacga 3480 cgaggactac aaagagtatg agaaggccat cggcaacatc cagaagtaca cccacctgaa 3540 gaacaaggtg gaattcaatg agctgaacct gctgcagggc ctgctgctga agatcctgca 3600 ccggctcgtg ggctacacca gcatctggga gcgggacctg agattccggc tgaagggcga 3660 gtttcccgag aaccactaca tcgaggaaat tttcaatttc gacaactcca agaatgtgaa 3720 gtacaaaagc ggccagatcg tggaaaagta tatcaacttc tacaaagaac tgtacaagga 3780 caatgtggaa aagcggagca tctactccga caagaaagtg aagaaactga agcaggagaa 3840 gaaagacctg tatattgcaa actacatcgc tcactttaat tatattcctc atgccgagat 3900 tagcctgctg gaagtgctgg aaaacctgcg gaagctgctg tcctacgacc ggaagctgaa 3960 gaacgccatc atgaagtcca tcgtggacat tctgaaagaa tacggcttcg tggccacctt 4020 caagatcggc gctgacaaga agatcgaaat ccagaccctg gaatcagaga agatcgtgca 4080 cctgaagaat ctgaagaaaa agaaactgat gaccgaccgg aacagcgagg aactgtgcga 4140 actcgtgaaa gtcatgttcg agtacaaggc cctggaatag ctcgagtaag gatctccagg 4200 catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 4260 tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt 4320 tatacctagg gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac 4380 tgcggcgagc ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga 4440 tacttaacag ggaagtgaga gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc 4500 tgacaagcat cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata 4560 aagataccag gcgtttcccc ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg 4620 gtttaccggt gtcattccgc tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca 4680 gttccgggta ggcagttcgc tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg 4740 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag 4800 caccactggc agcagccact ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc 4860 ggttaaggct aaactgaaag gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct 4920 cggttcaaag agttggtagc tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt 4980 tcgttttcag agcaagagat tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt 5040 aatcagataa aatatttcta gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt agcacctgaa 5100 gtcagcccca tacgatataa gttgttacta gtgcttggat tctcaccaat aaaaaacgcc 5160 cggcggcaac cgagcgttct gaacaaatcc agatggagtt ctgaggtcat tactggatct 5220 atcaacagga gtccaagcga gctcgatatc aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca 5280 gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa cggcatgatg 5340 aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatggt 5400 gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact 5460 cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc 5520 caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc 5580 gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta 5640 acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacgaaattc 5700 cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt 5760 atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt 5820 acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc 5880 aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct 5940 cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc 6000 tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccagatatc 6039 <210> 3 <211> 2565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13pEcoli-crRNA <400> 3 gaattctaaa gatctttgac agctagctca gtcctaggta taatgctagc gatttagact 60 accccaaaaa cgaaggggac taaaacnact agtttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 120 tcggtgcttt ttttgaagct tgggcccgaa caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat 180 agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttaaa cggtctccag cttggctgtt 240 ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 300 tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 360 actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 420 ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 480 atctgttgtt tgtcggtgaa ctggatcctt actcgagtct agactgcagg cttcctcgct 540 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 600 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 660 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 720 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 780 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 840 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 900 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 960 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 1020 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 1080 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 1140 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 1200 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1260 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 1320 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 1380 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 1440 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 1500 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 1560 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 1620 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 1680 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 1740 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 1800 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 1860 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 1920 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 1980 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 2040 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 2100 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 2160 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 2220 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 2280 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 2340 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 2400 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 2460 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggcagaa 2520 tttcagataa aaaaaatcct tagctttcgc taaggatgat ttctg 2565

Claims (22)

1. 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)을 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터; 및
   표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) 유래 Cas13a인, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA)인, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 제 2 벡터는 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 RNA를 암호화하는 프로토스페이서(protospacer)를 포함하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 프로토스페이서는 10 내지 40bp의 길이인, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 표적 유전자의 RNA의 번역 또는 기능을 억제하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 미생물에서 표적 유전자의 발현을 억제하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 대장균에서 표적 유전자의 발현을 억제하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 조성물.
10. 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열; 및
    표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열;을 포함하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
11. 제 10항에 있어서, 표적 유전자의 RNA 번역 또는 기능을 억제하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
12. 제 10항에 있어서, 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA)인, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
13. 제 10항에 있어서, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열은 표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 RNA를 암호화하는 프로토스페이서를 포함하는, small regulatory RNA 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
14. 삭제
15. 제 1항의 조성물 또는 제 10항의 벡터를 포함하는, RNA 번역 조절 키트.
16. 촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터; 및/또는
    표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터로 형질전환된, 표적 유전자의 small regulatory RNA가 억제된 균주.
17. 제 16항에 있어서, 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA)인, 표적 유전자의 small regulatory RNA가 억제된 균주.
18. 제 16항에 있어서, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열은 표적 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 RNA를 암호화하는 프로토스페이서를 포함하는, 표적 유전자의 small regulatory RNA가 억제된 균주.
19. 제 16항에 있어서, 대장균인, 표적 유전자의 small regulatory RNA가 억제된 균주.
20. 다음의 단계를 포함하는, 미생물에서 표적 유전자의 small regulatory RNA 발현을 억제하는 방법:
    촉매적으로 비활성인 Cas13 단백질(dCas13)를 암호화하는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 제 1 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계; 및
    표적 유전자의 RNA 서열에 혼성화하여 RNA 이중가닥을 형성할 수 있는 가이드 RNA를 암호화하는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 제 2 벡터를 미생물에 형질전환하는 단계.
21. 제 20항에 있어서, 표적 유전자의 RNA의 번역 또는 기능을 억제하는, 미생물에서 표적 유전자의 small regulatory RNA 발현을 억제하는 방법.
22. 제 20항에 있어서, 미생물은 대장균인, 미생물에서 표적 유전자의 small regulatory RNA 발현을 억제하는 방법.

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