CN104342411B

CN104342411B - 活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法

Info

Publication number: CN104342411B
Application number: CN201310321129.8A
Authority: CN
Inventors: 丁雪峰
Original assignee: NANJING LANG'EN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING NUOYUN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN104342411A

Abstract

本发明涉及一种活性增强的酮还原酶突变体，其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，具有中E9R、S42Q、T190L、E234M的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2‑20倍；且本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；此外本发明反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。

Description

活性增强的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酮还原酶，本发明涉及酮还原酶突变体及其制备方法，特别涉及一种源于木兰假丝酵母的酮还原酶突变体、编码序列及其制备方法

背景技术

阿托伐他汀钙（商品名LIPITOR由辉瑞公司销售）、罗苏伐他汀钙（商品名CRESTOR由阿斯利康公司销售）以及匹伐他汀（商标名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本销售），是重要的降胆固醇他汀类药物。而手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯是这些重要的他汀类药物的关键的手性中间体。国内2009年该中间体的产量为400吨，预计未来几年内，国内产量将达到1000吨以上，直接经济效益在数亿元。在已知的制备这些手性中间体的诸多途径中，包括化学法和酶法，都具有很多缺点。由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，得率低，成本高，使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。采用酶法制备及手性(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯需要使用具有立体选择性的酮还原酶，但现有的野生型酮还原酶催化活性很较低，使用10g/L粗酶粉 20小时仅可转化 1g/L的酮底物，也使其难以成为用于商品规模合成的理想方法。

木兰假丝酵母(Candida magnoliae)中天然存在的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)。

发明内容

本发明的目的是供一种活性增强的酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-20倍

实现本发明目的的技术方案是：本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与木兰假丝酵母(Candida magnoliae)产生的野生型酮还原酶 (SEQ ID NO：2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮还原酶”指由源自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶基因SEQ ID NO：1编码的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物 (例如S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)转化率增加的酮还原酶。

本发明提供一种酮还原酶突变体，其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能够将4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。所述酮还原酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：E9R，S42Q，T190L，E234M。

上述酮还原酶突变体，优选自序列SEQ ID NO.4。全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的 His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

上述酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-20倍。

本发明提供一种编码酮还原酶酶突变体的基因，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。

本发明提供一种重组质粒，其源自SEQ ID NO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌 lacUV5操纵子、大肠杆菌 trp操纵子、大肠杆菌 tac操纵子等。

本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酮还原酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。

本发明提供一种制备酮还原酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a) 采用木兰假丝酵母构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。

所述步骤（a）为将来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTC 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3'。

类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到改进后的表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

所述步骤（c）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DH1单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-20倍，利用该酶可生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；（2）本发明反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产他汀类药物关键中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯无副产物产生，纯化方便；（3）本发明反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保，因此利用本发明研究开发的节能减排、环境友好的高新生物技术生产药物手性中间体，具有非常广阔的市场前景。

具体实施方式

（实施例1）

野生型及酮还原酶突变体表达载体的构建

将来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的编码野生型酮还原酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1) 进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码酮还原酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型酮还原酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' ATTAAAGAGGAGAAATTAACATATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTC 3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTACGGCAGGGTGTAACCAC 3'。

类似的，将编码酮还原酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达酮还原酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。

酮还原酶突变体的制备

挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DH1单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h。

培养结束后，将培养液于4℃，6000g下离心30min最终得到湿菌体2.6g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4℃，12000g下离心30min，收集上清，预冷至-70℃后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.41g。

酮还原酶活性的测定

由于NADPH在340nm处有吸收峰，而NADP在340nm处无吸收峰，故可通过检测反应过程中NADPH吸光值的变化，而计算酮还原酶的活性。酮还原酶活力测定体系为：2ml反应体系中，依次加入0.5ml 100mM pH7.0 PBS缓冲液，加入终浓度0.2mM NADPH，2mM 4-氯乙酰乙酸乙酯，加双蒸水补至1.9ml ，充分混匀后置于25℃水浴中。将实施2中制备的酮还原酶干粉按适当的比例稀释后，取100ul 加入反应体系中，混匀后于340nm处检测每分钟的吸光度变化值。参照NADPH标准曲线计算酮还原酶的酶活。单位酶活(U)定义为每分钟生成1μmolNADP所需要的酶量。用同样方法检测野生型酮还原酶的酶活。根据检测的结果计算得到改进后的酮还原酶突变体比野生型酮还原酶酶活提升至少12.5倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京朗恩生物科技有限公司

<120> 活性增强的酮还原酮及其编码序列

<130> 2013

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 852

<212> DNA

<213> 木兰假丝酵母(Candida magnoliae)

<400> 1

atggctaaga acttctccaa cgtcgagtac cccgccccgc ctccggccca caccaagaac 60

gagtcgctgc aggtccttga cctgttcaag ctgaatggca aggttgccag catcactggc 120

tcgtccagcg gtattggcta cgctctggct gaggccttcg cgcaggtcgg cgctgacgtc 180

gccatctggt acaacagcca cgacgctact ggcaaggctg aggccctcgc caagaagtac 240

ggcgtcaagg tcaaggccta caaggcgaac gtgagcagct ctgacgccgt gaagcagacg 300

atcgagcagc agatcaagga cttcggccac ctcgacattg tcgtggcgaa cgccggcatt 360

ccctggacga agggtgccta catcgaccag gacgacgaca agcacttcga ccaggtcgtt 420

gacgtcgatc tgaagggtgt tggatacgtc gcgaagcacg ctggccgtca cttccgcgag 480

cgcttcgaga aggagggcaa gaagggcgcc cttgtgttca cggcctccat gtctggccac 540

attgtgaacg tgccccagtt ccaggccacg tacaacgcgg ccaaggctgg cgtgcgccac 600

ttcgcgaagt cgctggccgt cgagttcgcg ccgttcgcgc gcgtgaactc tgtgtcgccg 660

ggctacatca acacggagat ctcggacttc gtgccccagg agacgcagaa caagtggtgg 720

tcgctcgtgc cccttggccg cggcggagag acggccgagc tcgttggcgc ctacctgttc 780

cttgcatctg acgccggctc gtacgccact ggtacggaca tcattgttga cggtggctac 840

acgcttccct aa 852

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 木兰假丝酵母(Candida magnoliae)

<400> 2

Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala

1 5 10 15

His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn

20 25 30

Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Ala

35 40 45

Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr

50 55 60

Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp

100 105 110

Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile

115 120 125

Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu

130 135 140

Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu

145 150 155 160

Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser

165 170 175

Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Tyr Asn

180 185 190

Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu

195 200 205

Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn

210 215 220

Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp

225 230 235 240

Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly

245 250 255

Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr

260 265 270

Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu

275 280

<210> 3

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctaaaa acttctctaa cgttcgttac ccggctccgc cgccggctca caccaaaaac 60

gaatctctgc aggttctgga cctgttcaaa ctgaacggta aagttgcttc tatcaccggt 120

tctcagtctg gtatcggtta cgctctggct gaagctttcg ctcaggttgg tgctgacgtt 180

gctatctggt acaactctca cgacgctacc ggtaaagctg aagctctggc taaaaaatac 240

ggtgttaaag ttaaagctta caaagctaac gtttcttctt ctgacgctgt taaacagacc 300

atcgaacagc agatcaaaga cttcggtcac ctggacatcg ttgttgctaa cgctggtatc 360

ccgtggacca aaggtgctta catcgaccag gacgacgaca aacacttcga ccaggttgtt 420

gacgttgacc tgaaaggtgt tggttacgtt gctaaacacg ctggtcgtca cttccgtgaa 480

cgtttcgaaa aagaaggtaa aaaaggtgct ctggttttca ccgcttctat gtctggtcac 540

atcgttaacg ttccgcagtt ccaggctctg tacaacgctg ctaaagctgg tgttcgtcac 600

ttcgctaaat ctctggctgt tgaattcgct ccgttcgctc gtgttaactc tgtttctccg 660

ggttacatca acaccgaaat ctctgacttc gttccgcaga tgacccagaa caaatggtgg 720

tctctggttc cgctgggtcg tggtggtgaa accgctgaac tggttggtgc ttacctgttc 780

ctggcttctg acgctggttc ttacgctacc ggtaccgaca tcatcgttga cggtggttac 840

accctgccgt aa 852

<210> 4

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Arg Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala

1 5 10 15

His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn

20 25 30

Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Gln Ser Gly Ile Gly Tyr Ala

35 40 45

Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr

50 55 60

Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp

100 105 110

Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile

115 120 125

Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu

130 135 140

Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu

145 150 155 160

Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser

165 170 175

Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Leu Tyr Asn

180 185 190

Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu

195 200 205

Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn

210 215 220

Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Met Thr Gln Asn Lys Trp Trp

225 230 235 240

Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly

245 250 255

Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr

260 265 270

Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro

275 280

<210> 5

<211> 3390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatatgtgga 60

attgtgagcg ctcacaattc cacagaattc attaaagagg agaaattaac atatgaagct 120

taattagctg agcttggact cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg 180

gatttgttca gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccaagctag 240

cttggcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac 300

caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc 360

tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa 420

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tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca 900

acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc 960

ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt 1020

cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga 1080

caaatccgcc ctctagagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 1140

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 1200

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 1260

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 1320

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gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 1500

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 1560

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 1620

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 1680

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 1740

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 1800

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 1860

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 1920

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 1980

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 2040

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 2100

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 2160

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 2220

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acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 2700

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 2760

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 2820

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 2880

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 2940

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 3000

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 3060

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 3120

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 3180

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 3240

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 3300

cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 3360

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac 3390

Claims

1.一种活性增强的酮还原酶突变体，其源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其序列为SEQID NO.4，编码该酮还原酶突变体的多核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.一种重组质粒，其包括连接权利要求1中的多核苷酸的表达载体，所述载体序列为SEQ ID NO.5。

3.一种宿主细胞，其包含权利要求2所述的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110、DH1、和JM109中的一种。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于：所述重组质粒的密码子已经为在所述宿主细胞中表达而进行了优化。

6.一种如权利要求1所述活性增强的酮还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(a)采用木兰假丝酵母构建表达酮还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酮还原酶突变体基因，所述宿主细胞为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酮还原酶突变体。

7.根据权利要求6所述活性增强的酮还原酶突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中，30℃，250rpm过夜培养；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的第二培养基中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h。

8.一种生产他汀类药物的关键的手性中间体的方法，包括在与权利要求1所述的酮还原酶突变体的存在下，将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。