CN108048417B

CN108048417B - 酮还原酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN108048417B
Application number: CN201810060794.9A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 卢江平; 徐幸福; 于文燕; 张娜; 马玉磊; 程逸冰; 牟慧艳
Original assignee: Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Current assignee: Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2038-01-22
Also published as: CN108048417A

Abstract

本发明公开了一种酮还原酶突变体及其应用。该酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第6位、第94位、第96位、第117位、第144位、第156位、第193位、第205位、第224位、第176位、第85位和第108位；或者酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。本发明酮还原酶突变体的稳定性高，尤其是对于丙酮和异丙醇的耐受性，使得它们在手性羟基杂环类物质的制备中，反应体系成分简化，成本降低，制备的手性醇ee值甚至高达99.8％。

Description

酮还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种酮还原酶突变体及其应用。

背景技术

手性醇是一类手性碳上连有羟基的旋光性化合物，广泛用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。传统的化学合成方法存在环境污染大、产物纯度不高、催化条件苛刻或催化剂价格昂贵等诸多问题。酮还原酶因其高效、高立体选择性、条件温和及绿色环保等众多优点而广泛用于光学活性醇的合成。

酮还原酶(Ketoreductase)也称羰基还原酶或醇脱氢酶，是一种普遍存在于自然界中的氧化还原酶，它能将可逆地催化酮或者醛还原为醇。酮还原酶催化酮类的还原需要辅因子向羰基转移氢，常用的辅因子是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。

微生物细胞或者微生物来源的酮还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。然而天然酶对非天然底物的催化时，其反应选择性，催化活性和稳定性并不是很理想，不能很好地满足工业应用的要求。借助蛋白质工程的方法对野生酶进行改造是提高其对非天然底物的酶学性能的有效手段。

R-3-羟基杂环化合物，如R-3-羟基四氢呋喃和R-3-羟基四氢噻吩，是重要的药物中间体。(R)-3-羟基四氢噻吩，它是生产抗生素和蛋白酶抑制剂等多种药物的关键中间体，尤其是抗生素硫培南，及其盐或其溶剂化物和水合物的生产。有报道的以L-天冬氨酸为起始原料，用五步化学反应制得(R)-3-羟基四氢噻吩，这个化学过程对环境的污染较大。

与化学合成法相比，生物催化法更加绿色环保。但是，现有的野生型酶选择性低，稳定性差，导致反应体系复杂，反应后处理程序繁琐，生产成本高。

发明内容

本发明旨在提供一种酮还原酶突变体及其应用，以解决现有技术中野生型酶选择性低，稳定性差的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酮还原酶突变体。该酮还原酶突变体的氨基酸序列是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，且至少包括如下突变位点之一：第6位、第94位、第96位、第117位、第144位、第156位、第193位、第205位、第224位、第176位、第85位和第108位，且第6位的甘氨酸突变为丝氨酸；第94位的丙氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸；第96位的丝氨酸突变为脯氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甲硫氨酸；第117位的甘氨酸突变为丝氨酸；第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸，第193位的脯氨酸突变为甘氨酸，第205位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，第224位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第96位的丝氨酸突变为脯氨酸，第176位的丝氨酸突变为脯氨酸，第85位的天冬氨酸突变为谷氨酸和第108位的精氨酸突变为组氨酸。

进一步地，酮还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或者SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性,更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种酮还原酶突变体。

进一步地，DNA分子的序列为与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：或者SEQ ID NO：86所示序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性,更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的序列。

根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分子。

进一步地，重组质粒为pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。

进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

根据本发明的再一方面，提供了一种生产R-3-羟基杂环化合物的方法。该方法包括酮还原酶对酮类化合物进行催化还原反应的步骤，酮还原酶为权利要求1或2的酮还原酶突变体。

进一步地，酮类化合物为

还原反应的产物为

其中，R选自O或S原子。

进一步地，R-3-羟基四氢呋喃的转化率＞99％，ee值为99.6％；R-3-羟基四氢噻吩中的转化率＞99％，ee值为99.8％。

进一步地，酮还原酶为上述酮还原酶突变体的溶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。

进一步地，催化还原反应的反应体系中还包括辅因子，辅因子为异丙醇，不添加其他辅酶。

进一步地，催化还原反应的反应体系中还包括辅因子，辅因子为NAD/NADH和/或NADP/NADPH，辅因子循环系统包括葡萄糖和葡糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、葡糖6-磷酸和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或仲醇和仲醇脱氢酶。

进一步地，催化还原反应的反应体系中酮还原酶的加入量为5mg～0.1g粗酶冻干粉/1g底物。

进一步地，催化还原反应的温度为10～37℃，优选为15～35℃。

进一步地，催化还原反应的时间为3～48h，更优选为6～27h。

进一步地，催化还原反应在pH为6.0～9.5的条件下进行，优选pH为7.0～7.5。

本发明通过蛋白质工程蛋白质工程的手段对野生型酮还原酶acCR进化，获得了酶学性能高度改善的工程酮还原酶，这些酮还原酶突变体的稳定性显著提高，尤其是对于丙酮和异丙醇的耐受性，使得它们在手性羟基杂环类物质的制备中，可以不需添加葡萄糖/葡糖脱氢酶，和甲酸盐/甲酸脱氢酶，或者其它辅酶，只加异丙醇就可以完成辅因子的再生，这使得反应体系成分简化，成本降低。另外，本发明的酮还原酶突变体的具有高度的立体选择性，可制备近乎单一纯度的手性醇，使底物的利用率增加，后处理步骤缩减，提高其工业生产的应用价值。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例6中反应温度优化中的转化率结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

来源于巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus 386B)的野生型酮还原酶acCR可以催化底物I转化为产物II，但是其选择性较差，生成的R-3-羟基杂环化合物的ee值只有54％。本发明力图通过蛋白质工程的方法提高酮还原酶acCR的立体选择性和/或稳定性，获得酶催化特性改善的突变体，在手性化合物生产制备过程中，获得高光学纯度的手性醇。

R选自“O”或“S”原子。

在蛋白质工程中，定点突变和饱和突变技术是酶分子进行改造的有效手段。首先通过全质粒PCR的方式在acCR上引入突变位点，对突变体通过定向筛选的方法，挑选选择性或稳定性提高的突变体。

以acCR为模版，设计了35对定点突变引物(G6S，L38S，K71R，D85E，A94T，A94G，S96P，S101A，L104A，R108H，R108H，V110L，Q111T，G117S，V118I，T122A，M129I，I143L，E144S，L146A，I147V，D149I，P150I，N156T，N156S，N156C，R163K，K167A，S176P，V185I，P193N，P193G，A196E，A203D，A205Q，I224V)利用定点突变手段，以pET-22b(+)为表达载体，获得带有目的基因的突变质粒。

其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

经Dpn I酶消化除去母本模版后，将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。

定点突变菌经测序鉴定正确后，在25℃，0.2mM IPTG诱导过夜的条件下，诱导酮还原酶的表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶，用于反应特性检测。

经反应特性验证后，能使酮还原酶催化特性改善的位点来自：G6，A94，S96，G117，E144，N156，P193，A205，I224，S176，D85和R108。

具体而言，使酮还原酶催化选择性提高的单点突变包括：G6S，A94S，A94T，A94N/P/R/M，S96P，G117S，E144S，N156T，N156C，N156S，N156V/G/F,P193G，A205Q，I224V。而S96P，S176P，D85E，R108H能使酮还原酶稳定性提高。

通过采用软件对酮还原酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现A94S/T/N/P/R/M，E144S，N156T/C/S/V/G/F，N156C位于酶催化中心附近，可能与所需构象的过渡态的结合构型的自由能低有关。S96P，S176P可能与降低蛋白肽链的柔韧性有关。

饱和突变是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体的一种方法。此方法不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。饱和突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。而对于定点突变方法不能解决的这些问题，恰恰是饱和突变方法所擅长的独特之处。

目前常用NNK或NNS兼并引物作为饱和突变的引物。NNK/S将产生32种可能的密码子，编码20种氨基酸和一个终止密码子。而NDT产生12种可能的密码子，VHG对应9种密码子，这两种兼并引物加上TGG共对应22种密码子，无终止密码子，可以编码20种AA。与NNK/S兼并引物相比，采用NDT，VHG，TGG三种兼并引物做饱和突变获得覆盖所有氨基酸的突变体库所需样本量大大减少，能够很有效的缩减筛选工作。

基于单点突变的研究，再进行双点饱和突变，这可能产生单点突变无法比拟的效果。对E144S突变体，进行A94和N156位点双点饱和突变。A94和N156位点饱和突变引物均利用兼并引物(NDT，VHG，TGG)，这三种引物的混合方式为12：9：1，用于双点饱和突变。之后采用重叠延伸PCR扩增获得含2点突变的突变基因库，经2端限制性内切酶NdeI，XhoI酶切后，回收连入表达载体如pET22b中，转化至至大肠杆菌细胞内，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜，获得双点突变体库，经定向筛选获得选择性提高的突变体包括E144S+A94N+N156V，E144S+A94N+N156G，E144S+A94P+N156T，E144S+A94R+N156C，E144S+A94M+N156F。

单点突变体的催化特性较母本有提高，但并未达到最理想的效果，突变点的组合可以获得更优的突变体。将上述突变进行任意组合，获得组合突变菌。

具体而言，包括如下组合：E144S+S96P，E144S+A94T/S，E144S+N156T/S/C/V/G/F，E144S+G117S，E144S+G6S，E144S+A205Q，E144S+I224V，E144S+S176P，E144S+D85E，E144S+R108H，A94T/S/N/P/R/M+S96P+E144S，E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F，E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F+S96P，E144S+A94T/S+P193G，E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F+G6S，E144S+A94T/S+G6S，E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F+G6S+S96P，E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F+G6S+S96P+R108H，以及E144S+A94T/S/N/P/R/M+N156T/S/C/V/G/F+G6S+S96P+P193G+R108H，但不仅局限于此。其中，“/”表示“或者”。

组合突变中双点突变的构建方法和单点突变的构建方法一样，采用全质粒PCR法构建。同时突变3个及以上的位点的多点突变采用重叠延伸PCR扩增获得含多点突变的突变基因，经2端限制性内切酶NdeI，XhoI酶切后，回收连入表达载体如pET22b中，转化至至大肠杆菌细胞内，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜，获得组合突变体，测序鉴定。

重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了一小段的重叠链，然后在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。利用重叠延伸法构建多点突变菌株，可以一次性加入若干位点，方法省时有效，具体分为6步：第一步模版质粒准备及引物准备，第二步小片段获得，第三步小片段延伸获得中间片段，第四步含有所有突变位点的全长片段获得，第五步克隆至载体，第六步单克隆鉴定及测序。

经测序正确的酮还原酶突变体进行摇瓶诱导表达，方法：接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在25℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，然后进行反应检测。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种酮还原酶突变体。该酮还原酶突变体的氨基酸序列是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，且至少包括如下突变位点之一：第6位、第94位、第96位、第117位、第144位、第156位、第193位、第205位、第224位、第176位、第85位和第108位，且第6位的甘氨酸突变为丝氨酸；第94位的丙氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸；第96位的丝氨酸突变为脯氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甲硫氨酸；第117位的甘氨酸突变为丝氨酸；第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸，第193位的脯氨酸突变为甘氨酸，第205位的丙氨酸突变为谷氨酰胺，第224位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第96位的丝氨酸突变为脯氨酸，第176位的丝氨酸突变为脯氨酸，第85位的天冬氨酸突变为谷氨酸和第108位的精氨酸突变为组氨酸。

优选的，酮还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或者SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性,更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸序列。

本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的酮还原酶活性。在上述实施方式中，优选酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或者SEQ ID NO：43具有95％以上的同源性并具有或编码具有改进的酮还原酶活性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。

本发明通过蛋白质工程的手段对野生型酮还原酶acCR进化，获得了酶学性能高度改善的工程酮还原酶，这些酮还原酶突变体的稳定性显著提高，尤其是对于丙酮和异丙醇的耐受性，使得它们在手性羟基杂环类物质的制备中，可以不需添加葡萄糖/葡糖脱氢酶，和甲酸盐/甲酸脱氢酶，或者其它辅酶，只加异丙醇就可以完成辅因子的再生，这使得反应体系成分简化，成本降低。另外，本发明的酮还原酶突变体的具有高度的立体选择性，可制备近乎单一纯度的手性醇，使底物的利用率增加，后处理步骤缩减，提高其工业生产的应用价值。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述酮还原酶突变体。优选的，DNA分子的序列为与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：或者SEQ ID NO：86所示序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性,更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的序列。

本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。

虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。

本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产R-3-羟基杂环化合物的方法。该方法包括酮还原酶对酮类化合物进行催化还原反应的步骤，酮还原酶为上述任一种酮还原酶突变体。

本发明通过蛋白质工程的手段对野生型酮还原酶acCR进化，获得了酶学性能高度改善的工程酮还原酶，这些酮还原酶突变体的稳定性显著提高，尤其是对于丙酮和异丙醇的耐受性，使得它们在手性羟基杂环类物质的制备中，可以不需添加葡萄糖/葡糖脱氢酶，和甲酸盐/甲酸脱氢酶，或者其它辅酶，只加异丙醇就可以完成辅因子的再生，这使得反应体系成分简化，成本降低。另外，本发明的酮还原酶突变体的具有高度的立体选择性，可制备近乎单一纯度的手性醇，使底物的利用率增加，后处理步骤缩减，提高其工业生产的应用价值。

根据本发明一种典型的实施方式，酮类化合物为

还原反应的产物为

其中，R选自O或S原子。其中，R-3-羟基四氢呋喃的转化率＞99％，ee值为99.6％；R-3-羟基四氢噻吩中的转化率＞99％，ee值为99.8％。

根据本发明一种典型的实施方式，酮还原酶为权利要求1或2的酮还原酶突变体的溶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。

优选的，催化还原反应的反应体系中还包括辅因子，辅因子为NAD/NADH和/或NADP/NADPH，辅因子循环系统包括葡萄糖和葡糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、葡糖6-磷酸和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或仲醇和仲醇脱氢酶。更优选的，辅因子为异丙醇，不添加其他辅酶。

优选的，催化还原反应的反应体系中酮还原酶的加入量为5mg～0.1g粗酶冻干粉。本发明中酶的用量远远低于现有技术中酶的用量，降低了生产成本。

优选的，催化还原反应的温度为10～37℃，优选为15～35℃；催化还原反应的时间为3～48h，更优选为6～16h；催化还原反应在pH为6.0～9.5的条件下进行，优选pH为7.0～7.5。在此反应条件下，能够更好的发挥酶的催化性能。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例一：酮还原酶定点突变，饱和突变和组合突变制备R-3-羟基四氢噻吩的反应特性比较

5mL的反应管中，将40mg 3-酮四氢噻吩加入到60ul异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加NAD 0.4mg，酮还原酶1-44号粗酶冻干粉为0.4mg～4mg，0.1M磷酸盐缓冲液，总反应体积为0.4ml，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌反应。如检测酮还原酶的稳定性，在体系中另外加入高浓度的异丙醇，进行反应。16h后，取体系，用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析，表1催化特性改善的突变体反应特性如下：

表1

注：表1对映体选择性(ee值)列中

1：表示R对映体50.0-55.99％ee；

+：表示R对映体56.0-74.99％ee；

++：表示R对映体74.99-89.99％ee；

+++：表示R对映体90.0-95.99％ee；

++++：表示R对映体96.0-99.00％ee；

+++++：表示R对映体99.01-100％ee；

表中稳定性列：1代表稳定性与野生型酮还原的稳定性相当；+代表稳定性提高，++代表稳定性显著提高。

实施例二：酮还原酶突变体在合成R-3-羟基四氢噻吩的应用

酮还原酶的催化合成R-3-羟基四氢噻吩的化学反应进行如下实验：采用10mL的反应液，将1g 3-酮四氢噻吩加入到1.5ml异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，滴加到含0.01gNAD，酮还原酶acCR粗酶冻干粉为0.005～0.1g，0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液7.68ml，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌16h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC检测转化率和ee值，具体结果见表2。

表2

实施例三：

10mL的反应液中3-酮四氢噻吩1g，异丙醇终浓度为60％，酮还原酶冻干粉质量为0.025g用0.1M磷酸盐缓冲液制备成粗酶液，加入0.01g NAD，将底物混合液滴加酶液中，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌40h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析，SEQIDNO：32酮还原酶突变体转化率为99.3％，ee值为98.7％。而野生型酮还原酶SEQ ID NO：1在高浓度的异丙醇反应体系中，绝大多部分酶均变性，反应结果很差。

实施例四：部分酮还原酶突变体制备R-3-羟基四氢呋喃的反应特性比较

5mL的反应管中，将0.1g 3-酮四氢呋喃加入到150ul异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加1mg NAD，酮还原酶冻干粉质量为0.02g，0.1M的磷酸盐缓冲液，总反应体积为2ml，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌16h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析转化率和ee值，表1中的部分突变体对3-酮四氢呋喃的反应特性如下(表3)：

表3

注：表3.对映体选择性列中

1：表示R对映体50.0-55.99％ee

+:表示R对映体56.0-69.99％ee

++:表示R对映体70.0-89.99％ee

+++:表示R对映体90.0-95.99％ee

++++:表示R对映体96.0-100％ee

实施例五：酮还原酶突变体制备R-3-羟基四氢呋喃10mL的反应液中，将1g 3-酮四氢呋喃加入到1.5ml异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，滴加到含0.01g NAD，SEQ39酮还原酶干粉0.05～0.1g用0.1M磷酸盐缓冲液溶解，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌24h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析结果ee值为99.6％，转化率大于98％。

实施例六：酮还原酶制备R-3-羟基四氢噻吩的反应优化

1.反应温度：

5mL的反应管中，将0.1g 3-酮四氢噻吩加入到150ul异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加1mg NAD，SEQ18酮还原酶干粉为0.005g，0.1M磷酸盐缓冲液0.62ml，总反应体积为1ml，体系pH为7.0～7.3，30℃±3℃恒温搅拌16h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析，结果见图1，随着温度的降低，酮还原酶的立体选择性有增加的趋势，而反应速度开始变慢。

2.全细胞催化：

5mL的反应管中，将0.1g 3-酮四氢噻吩加入到150ul异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加1mg NAD，SEQ42酮还原酶全细胞0.05g，溶于0.62ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，总反应体积为1ml，体系pH为7.0～7.5，30℃±3℃恒温搅拌16h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC分析结果ee值大于99％，转化率大于98％。

实施例七：酮还原酶制备R-3-羟基四氢噻吩中的应用

采用10mL的反应液，将1g 3-酮四氢噻吩加入到4ml异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加0.01g NAD，SEQ43酮还原酶粗酶冻干粉为0.01g～0.05g，溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，体系pH为7.0～7.3，30℃反应16h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC检测转化率99％，ee值为99.7％。

采用10mL的反应液，将1g 3-酮四氢噻吩加入到4ml异丙醇中，混匀，调pH为7.0～7.3，加0.01g NAD，SEQ43酮还原酶粗酶冻干粉为0.02g～0.1g，溶于0.1M磷酸盐缓冲液制备成粗酶液，体系pH为7.0～7.3，25℃恒温搅拌16h，将温度升至30℃继续反应7h到10h。体系用甲基叔丁基醚萃取，有机相送GC检测转化率大于99％，ee值为99.8％。

当酶的立体选择性提高到一定程度时，特别是手性醇ee值达到99％以上，如果想突破这个值，继续提高是很困难的，ee值提高0.1％所需要付出的努力可能是之前(例如，从85％提高至86％，从89％提高至90％，从97％提高至98％等)的几倍乃至几十倍。本发明的发明人通过不懈的努力，获得了意想不到的效果，改造后得到的部分突变体的酶催化反应，获得的手性醇ee值高达99.8％，可以说是巨大的进步。

实施例八

本发明中3个突变体在制备R-3-羟基四氢噻吩的比较，反应体系中含有：3-酮四氢噻吩1g，酮还原酶重组粗酶干粉，异丙醇终浓度30％～50％，0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液。反应pH为7.0～7.5，30℃±3℃反应。采用的反应体积和各物料用量，及反应结果见下表4：

表4

上述反应采用的反应体积数很小，使得反应批次数减少，提高了反应釜的利用率，同时后处理有机溶剂的用量减少，大大缩减了生产成本。

本发明通过进化手段获得的突变体在高温度(如30℃，31℃，32℃，或更高的温度)下反应，即可获得ee值高达99.8％，甚至ee值更高的手性醇，优于现有技术。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1)本发明显著提高了酮还原酶的稳定性，尤其是对于丙酮和异丙醇有机溶剂的耐受性，酮还原酶突变体在高浓度的异丙醇环境下仍能保持高的催化活性。另外，这也使得它们在手性羟基杂环类物质的制备中，只加异丙醇就可以完成辅因子的再生，反应体系成分简化，成本降低。

2)本发明的酮还原酶突变体的具有高度的立体选择性，可制备近乎单一纯度的手性醇，使底物的利用率增加，生产后处理步骤缩减，部分酮还原酶突变体催化反应获得的手性醇ee值高达99.8％，远远优于现有技术。

3)本发明中酶的用量远远低于现有技术中酶的用量，降低了生产成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林凯莱英医药化学有限公司

<120> 酮还原酶突变体及其应用

<130> PN78562KLY

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> 巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus 386B)

<400> 1

Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala

35 40 45

Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val

50 55 60

Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu

65 70 75 80

Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser

100 105 110

Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala

115 120 125

Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu

130 135 140

Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly

145 150 155 160

Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser

165 170 175

Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr

180 185 190

Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys

195 200 205

Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile

210 215 220

Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr

225 230 235 240

Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

Claims

1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或者SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的酮还原酶突变体。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的起始质粒为pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母。

8.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

9.一种生产R-3-羟基杂环化合物的方法，包括酮还原酶对酮类化合物进行催化还原反应的步骤，其特征在于，所述酮还原酶为权利要求1所述的酮还原酶突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为

还原反应的产物为

其中，R选自O或S原子。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，R-3-羟基四氢呋喃的转化率＞99％，ee值为99.6％；R-3-羟基四氢噻吩中的转化率＞99％，ee值为99.8％。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酮还原酶为由权利要求1所述的酮还原酶突变体制备得到的以溶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞形式存在的酮还原酶。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的反应体系中还包括辅因子，所述辅因子为异丙醇，不添加其他辅酶。

14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的反应体系中还包括辅因子，所述辅因子为NAD/NADH和/或NADP/NADPH，辅因子循环系统包括葡萄糖和葡糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸脱氢酶、葡糖6-磷酸和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或仲醇和仲醇脱氢酶。

15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的反应体系中所述酮还原酶的加入量以粗酶冻干粉计为5mg～0.1g粗酶冻干粉/1g底物。

16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的温度为10～37℃。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的温度15～35℃。

18.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的时间为3～48h。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应的时间为6～27h。

20.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应在pH为6.0～9.5的条件下进行。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应在pH为7.0～7.5的条件下进行。