JP7263557B2 - アミノ基転移酵素突然変異体及びその応用 - Google Patents

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Description

本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的には、アミノ基転移酵素突然変異体及びその応用に関する。
キラルアミンは、自然界に幅広く存在し、天然物又はキラル薬物を合成するための重要な中間体である。キラルアミンの多くは１つ又は複数のキラル中心を含み、キラル薬物によって薬理活性、代謝プロセス、代謝率及び毒性が明らかに異なり、一方のエナンチオマーが効果的であるものの、他方のエナンチオマーは効果が低くあるいは無効であり、毒性すらあることが多い。そのために、どのようにしてキラル中心を含む化合物を効率的に且つ立体選択的に構築するかは、医薬品の研究開発で特に重要である。
キラルアミンは、様々な生体活性化合物や医薬品の有効成分を合成するための重要な構成要素であり、既存の薬物のうち４０％がキラルアミン又はその誘導体であるという試算があり、例えば、神経系薬、心臓血管系薬、降圧薬、抗感染薬又はワクチンなどの合成ではいずれもキラルアミンを中間体としており（Top.Catal.2014,57,284-300）、したがって、製薬業界にとってキラルアミン化合物が重要な構成要素である。
キラルアミンの工業的な生産として多くの方法があるが、主にケトン前駆体からのエナミドの金属触媒水素化で行われ、当該過程では触媒として高価な遷移金属錯体を用いる必要があり、このような遷移金属錯体が限られた資源であるため、持続可能性が課題になる。また、ケトン前駆体からの不斉合成でキラルアミンを得るプロセスではアミンの保護及び脱保護ステップが必要であるため、ステップと廃棄物が増え、収率が低下している。
水素添加還元触媒法によるキラルアミン合成方法では、触媒は製造しにくくしかも高価で、設備面の投資が大きく、生産コストが高く、触媒活性と水素化条件に対する要求がとても高く、その上、触媒に毒性があり、特に水素ガス中の硫化物が原因でスタッフが中毒することが少なくない。
アミノ基転移酵素はピリドキサールリン酸を補因子として、１つのアミノドナー（アミノ酸又はアミン）上のアミノ基を触媒してプロキラルなケトンアクセプターに転移させて、キラルアミン又はその副産物としてケトン又はα－ケト酸を得る酵素の総称である。従来の化学的方法のアミン不斉合成には、非効率、選択性の低さ、深刻な環境汚染など多くの欠点があるのに対し、アミノ基転移酵素によるキラルアミンの触媒合成は立体的選択性と化学選択性に優れ、安全で環境配慮もなされるため、エコで、環境に優しいプロセスとしてグリーンケミストリーと呼ばれる。また酵素触媒は一般的にワンステップで完了するため、化学的方法では比べものにならない利点があり、アミノ基転移酵素によるキラル化合物合成が、１つの肝心な不斉合成技術となった。
アミノ基転移酵素を用いるキラルアミンの生産は大きな注目を集めているが、酵素触媒法は生産への適用拡大に当たり多くの問題がある。
例えば、酵素活性が低く、酵素の大量使用で発酵関連のコストが増えている。また酵素活性が低いゆえの酵素の使用量増加で、酵素触媒反応の産業的用途が大きく制限されている。酵素量が多いため反応体積が大きいから、触媒容器の利用率が低下している。さらに後処理時に反応体積が増えてしまい、抽出溶媒の使用量が多いことで、産物の抽出、濃縮及び取得が難しくなり、産物の収率が低く、酵素触媒の産業的用途が大きく制限されている。活性の高い酵素なら酵素の使用量が減り、反応体積が縮小するため、酵素触媒の産業的用途も可能になろう。
したがって活性の高い酵素を得るのは極めて肝要なことで、それに伴い酵素の基質スペクトルも拡大し、変換率の非常に低いあるいは不活性の酵素触媒反応も順調に行われるようになり、極めて良い変換率を得るとともに産物のキラル純度も極めて高くなる。
また、酵素触媒の場合には、反応系中の有機溶媒の影響で又は高ｐＨや高温などの反応条件の影響で変性して活性を失いやすいため、極端な条件における酵素の耐性向上も極めて肝要なことになる。キラルアミンの工業的な生産においては、従来の基質又はアミノドナーの殆どが水溶性に劣るため、キラルアミン産物の生成を増やすために、反応系の有機溶媒の含有量を増やすか、又はアルカリ性アミノドナー（例えば、イソプロピルアミン）を使用する必要があり、反応条件が一層厳しくなるため、野生型アミノ基転移酵素なら変性して活性を失いやすく、そのために工業的な生産を行うためには有機溶媒と高ｐＨの両方に良好な耐性を有するアミノ基転移酵素が必要である。
本発明は、アミノ基転移酵素の活性を向上させるために、アミノ基転移酵素突然変異体及びその応用を提供することを目的とする。
本発明は、前記目的を達成するためになされたもので、一態様によれば、アミノ基転移酵素突然変異体が提供される。当該アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列に突然変異が起きて得られたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも第３位、第５位、第８位、第２５位、第３２位、第４５位、第５６位、第５９位、第６０位、第８４位、第８６位、第１６４位、第１７６位、第１７８位、第１８０位、第１８７位、第１９７位、第２０６位、第２０７位、第２４２位、第２４５位、第３１９位、第３２４位、第３２６位、第３２８位、第３７０位、第３９７位、第４１４位、第４１６位、第４２４位、第４３６位、第４３７位及び第４４２位のうちの１つの突然変異部位を含む。
さらに、前記アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列に突然変異が起きて得られたアミノ酸配列であり、前記突然変異は、少なくとも、L3S、V5S、I8A、I8S、F25L、F25T、Q32N、I45W、L59V、F56M、C60F、C60Y、F84V、W86H、W86L、W86P、W86N、F164M、F164V、F176Y、F176S、A178L、I180V、S187A、T197P、L206M、K207T、V242A、T245A、T245V、R319C、R324A、R324G、E326M、V328A、V328G、L370A、L370D、L370K、T397A、P414G、Q416A、E424D、E424T、A436S、A436G、A436P、A436N、A436Y、A436Q、A436E、M437S、M437A、R442T、R442S、R442Q及びR442Vのうちの１つの突然変異部位を含み、又はアミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は突然変異が起きたアミノ酸配列の突然変異部位を有し、且つ突然変異が起きたアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、突然変異は、C60Y+F164V、L3S+V5S、L3S+V5S+F164V、L3S+V5S+C60Y、L3S+V5S+C60Y+F164V、I180V+L370A及びL3S+V5S+L59Vのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含み、好ましくは、少なくとも、F164V+C60Y、E424D+A436G、C60Y+F164V+A436P、C60Y+F164V+A436N、W86P+F164V、F25L+L59V、F25T+F164V、C60Y+F164V+A436Y、C60Y+F164V+A436Q、C60Y+F164V+A436E、F164V+M437A、I8A+V328A、I8S+F164V、C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+L370D、C60Y+F164V+L370K、I45W+F164V、C60Y+F164V+F176Y、C60Y+F176S+F164V、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+R442S、C60Y+F164V+R442Q、L3S+V5S+S187A+L370A+E424D、C60Y+F164V+R442T、L3S+V5S+E424D+L370A、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+L370A、L3S+V5S+F164V+T197P+L370A、L3S+V5S+V328A+E424D、L3S+V5S+L59V+L206M+L370A、L3S+V5S+L370A+E424D、L3S+V5S+F164V+K207T+L370A、L3S+V5S+S244A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245V+V328A、L3S+V5S+F164V+L370A+T397A、L3S+V5S+L59V+F164V+R319C+L370A+T397A、L3S+V5S+L59V+F164V+L370A、L3S+V5S+L59V+L370A+A436G+Q416A、L3+V5S+L59V+L370A+A436G+R442Q、L3S+V5S+L59V+V328A+L370A+R442Q、L3S+V5S+L59V+L370A+R442L、L3S+V5S+L59V+C60Y+F164V+L370A+R442V、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+I180V+S187A+L370A+R442Lのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含む。
さらに、突然変異は、少なくとも第７位、第３２位、第９６位、第１６４位、第１７１位、第１８６位、第２５２位、第３８４位、第３８９位、第３９１位、第３９４位、第４０４位、第４１１位、第４２０位、第４２３位、第４２４位、第４４２位、第４５２位及び第４５６位のうちの１つの突然変異部位又は突然変異部位の組み合わせをさらに含み、好ましくは、前記突然変異は、少なくとも、K7N、Q32L、K96R、V164L、E171D、S186G、V252I、Y384F、I389M、I389F、D391E、N394D、L404Q、L404Q、G411D、Q420R、Q420K、M423K、E424R、E424K、E424Q、R442H、R442L、G452S及びK456Rのうちの１つの突然変異部位をさらに含む。
さらに、突然変異は、少なくとも、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Y384F+G452S、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+S186G+Q420R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q420K+E424R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+K7N+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q32L+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389M、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389F+N394D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V164L+K456R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+K96R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q32L+R442H、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+R442L、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+E424K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+E424K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Y384F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+E424K+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+S186G+Q420R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+I180V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+V164L+I389F+E424Q+K96R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V164L+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+I180V+L370A+G411D+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+V164L+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E424Q+K7N、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+I180V+L370A+G411D+R442L、C60Y+F164L+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E171D+I389F+V252I+L404Q、C60Y+F164V+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D、C60Y+F164V+R442Q+G411D、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+G411D、C60Y+F164V+L370A+G411D、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+G411D+Y384F、C60Y+F164V+R442Q+Y384F、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+Y384F、C60Y+F164V+L370A+Y384F、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+Y384F、C60Y+F164V+R442Q+S186G、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+S186G、C60Y+F164V+L370A+S186G、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+S186G、C60Y+F164V+R442Q+D391E、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+D391E、C60Y+F164V+L370A+D391E、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+D391E、C60Y+F164V+R442Q+E171D、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+E171D、C60Y+F164V+L370A+E171D、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+E171D、C60Y+F164V+R442Q+L404Q、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+L404Q、C60Y+F164V+L370A+L404Q、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+L404Qのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含む。
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子が提供される。当該ＤＮＡ分子は前記いずれかのアミノ基転移酵素突然変異体をコードする。
本発明のもう１つの態様によれば、組換えプラスミドが提供される。当該組換えプラスミドは前記ＤＮＡ分子を含有する。
さらに、組換えプラスミドは、pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である。
本発明のさらにもう１つの態様によれば、宿主細胞が提供される。当該宿主細胞は前記いずれかの組換えプラスミドを含有する。
さらに、宿主細胞は、原核細胞、酵母、真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞である。
本発明のまたさらにもう１つの態様によれば、キラルアミンの生産方法が提供される。当該方法はアミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせるステップを含み、アミノ基転移酵素は前記いずれかのアミノ基転移酵素突然変異体である。
さらに、ケトン化合物は
Figure 0007263557000001
であり、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ1、Ｒ2は単独で又は両者が互いに結合して置換された又は非置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ1及びＲ2は炭素原子数が１～２０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基であり、より好ましくは、炭素原子数が１～１０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基であり、
好ましくは、前記アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、前記アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、エテニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基を含み、
好ましくは、前記アリールアルキル基は、ベンジル基であり、
好ましくは、前記置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基によって置換されることである。
好ましくは、前記ケトン化合物は、
Figure 0007263557000002
である。
さらに、アミノドナーは、イソプロピルアミン又はアラニンであり、好ましくはイソプロピルアミンである。
さらに、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系において、ｐＨは７～１１であり、好ましくは８～１０であり、より好ましくは９～１０である。
さらに、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系の温度は、２５℃～６０℃であり、好ましくは３０～５５℃であり、より好ましくは４０～５０℃である。
さらに、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系で、ジメチルスルホキシドの体積濃度は０％～５０％である。
さらに、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系で、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの体積濃度は０％～９０％である。
本発明に記載のアミノ基転移酵素突然変異体は、配列番号１に示すアミノ基転移酵素に対して、部位特異的突然変異導入の方法で突然変異を行って、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質の構造及び機能を変えることを実現し、さらに指向性スクリーニングの方法で、前記突然変異部位を有するアミノ基転移酵素を得たものであり、したがってこれらのアミノ基転移酵素突然変異体は有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性に優れ、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有し、当該突然変異体を用いると反応速度を加速させ、酵素の安定性を向上させることができ、酵素の使用量が減り、後処理の難易度が低減するため、工業的な生産に適用することができる。
本願に組み込まれた図面は、本発明の一層の理解に供するもので、本発明の例示的な実施例及びその説明は本発明を解釈するためのもので、本発明を限定するものではない。
図１は本発明の実施形態に係る、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の発現状況検出の電気泳動図である。
なお、矛盾がない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は互いに組み合わせることができる。次に実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
アミノ基転移酵素はタンパク質を主体とする生体触媒で、工業的な生産プロセスでは一般的に特定の有機溶媒、圧力、ｐＨなどタンパク質を変性させやすい条件が必要であるため、使用する生体触媒には、工業的な生産に応じるために高い耐性が求められる。野生型アミノ基転移酵素は、一般的に工業的な条件に耐性が弱いため、その用途が大きく制限されている。
アルスロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）に由来するアミノ基転移酵素ＡｒＳ－ωＴＡが、ケトン化合物を特異的に触媒してアミノ基産物を生成させることができるが、当該酵素は、有機溶媒に耐性が弱く、高ｐＨにも耐性が弱いだけでなく、原核発現系では可溶性発現が優れず、基質に対する酵素活性が低いため、酵素の使用量が大きく、ケトン化合物の変換が不十分である。また酵素の使用量が多いため、後処理の難易度が上がり、収率が低く、ステップが複雑である。本発明は、アミノ基転移酵素ＡｒＳ－ωＴＡの上記の欠点をめぐって改変を行い、その有機溶媒耐性を改善し、ｐＨ耐性、可溶性発現特性及び活性特性を向上させることで、工業的な生産条件でも適用することができる。
酵素の合理的改変とは、酵素の三次元分子構造に基づいて酵素の基質結合部位、補酵素結合部位、表面及び他の部位に改変を行って、酵素の触媒特性を変え、酵素活性、選択性などの特性を向上させることである。酵素の定向進化とは、１種のタンパク質の非合理的設計であり、人為的に特殊な進化条件を作って、自然選択のメカニズムをシミュレートし、インビトロで遺伝子の改変を行い、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング（DNA shuffling）などの技術を用いて、効率的なスクリーニングシステムと結び付けて所望の特性を有する新規酵素を得ることである。
本発明の技術的解決手段は合理的設計とランダム突然変異を組み合わせた技術でＡｒＳ－ωＴＡタンパク質に合理的改変を行って突然変異体を獲得し、ケトン化合物を使用して活性検証を行うことで、最終的に有機溶媒耐性、高ｐＨ耐性、可溶性発現、活性、選択性がいずれも優れた突然変異株を得る。
合理的設計は、部位特異的突然変異の方法で行うことができる。部位特異的突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法で目的ＤＮＡ断片（ゲノムでもよいし、プラスミドでもよい）に所望の変化（一般的には有利な方向を示す変化）、例えば、塩基の追加、削除、点突然変異などを導入することである。部位特異的突然変異は、ＤＮＡから発現される目的タンパク質の性状及び特性を迅速に且つ効率的に向上させることができ、遺伝子研究分野では特に有用な手法の１つとされている。
全プラスミドＰＣＲを利用して部位特異的突然変異を導入するという方法は簡単で効果的であり、目下よく利用される手法である。原理は、突然変異部位を含む１対のプライマー（順方向、逆方向）及び鋳型プラスミドにアニーリングを行った後に、ポリメラーゼで「繰り返し伸長」させることである。繰り返し伸長とは、ポリメラーゼが鋳型に則ってプライマーを伸長させ、１サイクルが終わったらプライマーの５’末端に戻って停止し、さらに伸長部分の加熱とアニーリングを繰り返すというサイクルである。当該反応は、ローリングサークル増幅と違って、複数のタンデムコピーは形成されない。順方向・逆方向プライマーからの伸長産物はアニーリングした後に、ペアリングしてノッチを備える開環状のプラスミドになる。Ｄｐｎ Ｉで伸長産物を消化し、鋳型プラスミドが通常の大腸菌に由来し、ｄａｍメチル基化修飾を含んでいるため、Ｄｐｎ Ｉに敏感で切断され、インビトロで合成した突然変異配列を備えるプラスミドはメチル基化されていないため切断されないから、後続の変換プロセスで変換を成功させて、突然変異プラスミドのクローンを得る。
前記突然変異プラスミドを大腸菌細胞に導入して、大腸菌において過度に発現させる。次に超音波細胞破砕の手法で粗酵素を得る。アミノ基転移酵素の誘導発現の最適条件は２５℃で０.１mMのＩＰＴＧで一晩誘導することである。
ソフトウェアを用いてアミノ基転移酵素の三次元構造のコンピュータシミュレーション分析を行ったところ、ＡｒＳ－ωＴＡタンパク質は５－ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を補因子とするＳ型アミノ基転移酵素であることが判明し、酵素の活性中心近くのアミノ酸に改変を行う場合に、その酵素化学的性質を向上させることができ、例えば、遷移状態を安定させ、酵素の反応遷移状態分子との結合状態における自由エネルギーを低減することで、基質が活性中心に一層入りやすく、基質への立体障害などが緩和される。活性中心から遠いアミノ酸に改変を行う場合に、安定性を促す化学結合が増え、例えば、水素結合、ジスルフィド結合、塩橋、疎水性基が増えると、タンパク質の安定性を改善し、タンパク質の半減期を延長することができる。
本発明ではＡｒＳ－ωＴＡタンパク質（配列番号１）に合理的改変を行って、アミノ酸突然変異（L3S、V5S、I8A、I8S、I45W、F25L、F25T、Q32N、L59V、F56M、C60F、C60Y、F84V、W86H、W86L、W86P、W86N、Y89F、F164M、F164V、F164Y、F176Y、F176S、A178L、I180V、S187A、T197P、L206M、K207T、T245A、T245V、R319C、V242A、V328A、V328G、T397A、P414G、E424D、E424T、L370A、L370D、L370K、R324A、R324G、E326M、Q416A、A436S、A436G、A436P、A436N、A436Y、A436Q、A436E、M437S、M437A、R442T、R442S、R442Q、R442V、R442A）及び前記突然変異の組み合わせを導入し、好ましくはｐＥＴ２２ｂを発現ベクターとして、突然変異遺伝子を含有するプラスミドを獲得し、好ましくはＢＬ２１（ＤＥ３）を発現株として、ＩＰＴＧ誘導下で突然変異体タンパク質を得る。
構築した突然変異体タンパク質の活性検証を行い、結果を表１に示す。
Figure 0007263557000003
上述したように部位特異的突然変異でアミノ基転移酵素突然変異体の触媒活性を向上させられる複数の部位が得られ、１０wt細胞湿重量、０.０２g/mLの基質濃度で活性検証を行い、最適な突然変異体を得て原種なるＡｒＳ－ωＴＡと比べて活性が４５倍向上しているものの、出発株ＡｒＳ－ωＴＡの活性が非常に低いため、４５倍向上していた突然変異体でも１６時間の変換後はアミノ基産物に変換していない基質が多く残っており、そのために、有益な部位の組み合わせ及び新規な突然変異部位の導入を含めさらなる改変を行い、改変後の突然変異体に対して５wt～０.５wt細胞湿重量、０.１g/mLの基質濃度で活性検証を行い、結果を表２に示す。
Figure 0007263557000004
上述した改変により、アミノ基転移酵素突然変異体の触媒活性を向上させられる複数の部位が得られるとともに、有益な突然変異の組み合わせを行って、活性が向上している複数の突然変異部位の組み合わせが得られ、最良株はＡｒＳ－ωＴＡと比べて活性が３４５５倍向上している。最良突然変異株に対して、０.５wt細胞湿重量、０.１g/mLの基質濃度の反応系（体積が非常に小さく、１０Ｖである）において活性検証を行い、１６時間の変換後、変換率が９５％以上に達している。
突然変異株には触媒活性が大きく改善されていることが分かり、野生型株では触媒活性がほぼない（１０wt細胞湿重量、０.０２g/mLの基質濃度、０.１％の変換率）ことから、非常に少量の酵素（０.５wt）と非常に小さい反応体積（１０Ｖ）で９５％の変換効果を得るという極めて良い触媒活性に改善されている。
本発明では、また前記合理的改変から得た突然変異体タンパク質に定向進化を行って、ケトン基質に対する活性が大幅に向上している（質的に向上している）突然変異体タンパク質を得る。当該突然変異体タンパク質を出発株とし、エラープローンＰＣＲを技術的手段としてランダム突然変異を行って、活性や有機溶媒耐性、高ｐＨ耐性などの特性を一層向上させる。また部位特異的突然変異技術、スタッガードエクステンションＰＣＲランダム組換え技術を組み合わせて、エラープローンＰＣＲから得た有益な突然変異を継続的に積み重ねる。このように得た突然変異体で、ランダム突然変異を含む突然変異体ライブラリーを構築して、継続的に有機溶媒の濃度を高め、継続的にスクリーニング及び反応系のｐＨを上げ、スクリーニング圧力を設定することで、目的特性突然変異体を得る。突然変異体はｐＥＴ２２ｂを発現ベクターとし、ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現株として、ＩＰＴＧ誘導下で突然変異体タンパク質を得る。目的タンパク質を含む誘導突然変異体菌体に対して超音波破砕で細胞を溶解して目的タンパク質を放出させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的タンパク質の発現状況を検出する。
なお、エラープローンＰＣＲとは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて目的遺伝子の増幅を行う時に、反応条件を調整して増幅中の突然変異頻度を変え、ポリメラーゼ固有の配列突然変異傾向を緩和して、突然変異スペクトルの多様性を向上させることで、間違った塩基を一定の頻度でランダムに増幅遺伝子に組み込ませて、ランダム突然変異ＤＮＡ集団を得る。
本発明は、前記ランダム突然変異と指向性スクリーニングを組み合わせた方法で様々な突然変異を獲得し、活性検証を経て突然変異体の有機溶媒耐性が向上し、ｐＨ耐性が向上し、基質に対する活性が向上し、目的タンパク質の可溶性が向上している。
耐性検証：エラープローンＰＣＲから得た突然変異部位の３５％ジメチルスルホキシドにおける耐性向上率。
Ｍ７６（L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A）を出発株として得た有益な突然変異部位の３５％ジメチルスルホキシドにおける耐性検証結果を表３に示す。
Figure 0007263557000005
耐性検証：エラープローンＰＣＲから得た突然変異部位の５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける耐性向上率。
Ｍ７６（L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A）を出発株として得た有益な突然変異部位の５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける耐性検証結果を表４に示す。
Figure 0007263557000006
得られた有益な突然変異に対して反復（iteration）－エラープローンＰＣＲ－指向性スクリーニングという方法と、部位特異的突然変異技術を併用して、突然変異株の活性及び有機溶媒耐性を継続的に向上させる。
以下のとおりに異なる突然変異株を出発株として耐性部位検証を行った。
異なる突然変異株からプラスミドを抽出し、部位特異的突然変異技術で突然変異株を構築して、突然変異株を獲得し、３５％ジメチルスルホキシドにおいて耐性部位検証を行い、結果を表５に示す。
Figure 0007263557000007
+は３５％ジメチルスルホキシドにおける酵素耐性向上率が１％～１００％であることを表し、++は３５％ジメチルスルホキシドにおける酵素耐性向上率が１００％～３００％であることを表し、+++は３５％ジメチルスルホキシドにおける耐性向上率が４００％～６００％であることを表す。
ランダム突然変異＋指向性スクリーニングから得た突然変異部位は有機溶媒（ジメチルスルホキシド）における株の耐性を向上させる上で明らかな効果があることが分かる。
耐性検証：エラープローンＰＣＲから得た突然変異部位の４０％ジメチルスルホキシドにおける耐性向上率。
Ｍ７６（L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A）を出発株として得た有益な突然変異部位の４５％ジメチルスルホキシドにおける耐性検証結果を表６に示す。
Figure 0007263557000008
耐性検証：エラープローンＰＣＲから得た突然変異部位の７０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける耐性向上率。
Ｍ７６（L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A）を出発株として得た有益な突然変異部位の７０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける耐性検証結果を表７に示す。
Figure 0007263557000009
改変後の突然変異体タンパク質の溶媒ジメチルスルホキシド及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける耐性がいずれも大幅に向上しており、また高ｐＨ下の突然変異体の活性を検証した。
高ｐＨ耐性検証：得られた突然変異体に対してｐＨ＝１０.０という条件で４０％ジメチルスルホキシド及び７０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルにおける活性を検証し、１６時間後に、ほぼ全ての変異体基質は変換され、結果を表８に示す。
Figure 0007263557000010
得られた突然変異体に対して超音波破砕を行って破砕し、遠心分離して上清酵素液及び沈殿酵素液を獲得し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行ってタンパク質の発現状況を検出し、一般的に可溶性発現タンパク質は上清において溶解した状態で存在し、異常に折り畳まれたタンパク質は封入体、即ちタンパク質沈殿物として存在する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、結果を図１に示す（注：レーン１：マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、レーン２：ＡｒＳ－ωＴＡ可溶性タンパク質、レーン３：ＡｒＳ－ωＴＡタンパク質封入体、レーン４：マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、レーン５：突然変異体Ｍ１１５可溶性タンパク質、レーン６：突然変異体Ｍ１１５タンパク質封入体）。最良の突然変異体タンパク質は出発株と比べて可溶性発現が４倍超向上している。
本発明の典型的な一実施形態によれば、アミノ基転移酵素突然変異体が提供される。当該アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１（配列番号１：MGLTVQKINWEQVKEWDRKYLMRTFSTQNEYQPVPIESTEGDYLITPGGTRLLDFFNQLCCVNLGQKNQKVNAAIKEALDRYGFVWDTYATDYKAKAAKIIIEDILGDEDWPGKVRFVSTGSEAVETALNIARLYTNRPLVVTREHDYHGWTGGAATVTRLRSFRSGLVGENSESFSAQIPGSSCSSAVLMAPSSNTFQDSNGNYLKDENGELLSVKYTRRMIENYGPEQVAAVITEVSQGVGSTMPPYEYVPQIRKMTKELGVLWISDEVLTGFGRTGKWFGYQHYGVQPDIITMGKGLSSSSLPAGAVVVSKEIAAFMDKHRWESVSTYAGHPVAMAAVCANLEVMMEENLVEQAKNSGEYIRSKLELLQEKHKSIGNFDGYGLLWIVDIVNAKTKTPYVKLDRNFRHGMNPNQIPTQIIMEKALEKGVLIGGAMPNTMRIGASLNVSRGDIDKAMDALDYALDYLESGEWQQS）に示すアミノ酸配列に突然変異が起きて得られたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも、第３位、第５位、第８位、第２５位、第３２位、第４５位、第５６位、第５９位、第６０位、第８４位、第８６位、第１６４位、第１７６位、第１７８位、第１８０位、第１８７位、第１９７位、第２０６位、第２０７位、第２４２位、第２４５位、第３１９位、第３２４位、第３２６位、第３２８位、第３７０位、第３９７位、第４１４位、第４１６位、第４２４位、第４３６位、第４３７位及び第４４２位のうちの１つの突然変異部位を含む。
好ましくは、突然変異は、少なくとも、L3S、V5S、I8A、I8S、F25L、F25T、Q32N、I45W、L59V、F56M、C60F、C60Y、F84V、W86H、W86L、W86P、W86N、F164M、F164V、F176Y、F176S、A178L、I180V、S187A、T197P、L206M、K207T、V242A、T245A、T245V、R319C、R324A、R324G、E326M、V328A、V328G、L370A、L370D、L370K、T397A、P414G、Q416A、E424D、E424T、A436S、A436G、A436P、A436N、A436Y、A436Q、A436E、M437S、M437A、R442T、R442S、R442Q及びR442Vのうちの１つの突然変異部位を含み、又は前記アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は前記突然変異が起きたアミノ酸配列の前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異が起きたアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
本発明に記載のアミノ基転移酵素突然変異体は、配列番号１に示すアミノ基転移酵素ＡｒＳ－ωＴＡに対して、部位特異的突然変異の方法で突然変異を行って、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質の構造及び機能を変えることを実現したものであり、高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有し、当該突然変異体を用いると反応速度を加速させ、酵素の安定性を向上させることができ、酵素の使用量が減り、後処理の難易度が低減するため、工業的な生産に適用することができる。
本明細書で使用される用語「相同性」は、本分野の通常の意味を有し、当業者が異なる配列間の相同性測定のルール、基準を熟知している。本発明の異なる相同性で限定された配列においてはアミノ基転移酵素の有機溶媒耐性も改善されなければならない。前記実施形態では、好ましくは、アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は前記相同性を有し且つ有機溶媒耐性を改善させるアミノ酸配列を有し又はそれをコードする。当業者は本願の開示内容の教示からこのような配列突然変異体を得ることができる。
好ましくは、突然変異は、少なくとも、C60Y+F164V、L3S+V5S、L3S+V5S+F164V、L3S+V5S+C60Y、L3S+V5S+C60Y+F164V、I180V+L370A及びL3S+V5S+L59Vのうちの1つの突然変異部位の組み合わせを含み、より好ましくは、突然変異は、少なくともF164V+C60Y、E424D+A436G、C60Y+F164V+A436P、C60Y+F164V+A436N、W86P+F164V、F25L+L59V、F25T+F164V、C60Y+F164V+A436Y、C60Y+F164V+A436Q、C60Y+F164V+A436E、F164V+M437A、I8A+V328A、I8S+F164V、C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+L370D、C60Y+F164V+L370K、I45W+F164V、C60Y+F164V+F176Y、C60Y+F176S+F164V、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A、C60Y+F164V+R442S、C60Y+F164V+R442Q、L3S+V5S+S187A+L370A+E424D、C60Y+F164V+R442T、L3S+V5S+E424D+L370A、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+L370A、L3S+V5S+F164V+T197P+L370A、L3S+V5S+V328A+E424D、L3S+V5S+L59V+L206M+L370A、L3S+V5S+L370A+E424D、L3S+V5S+F164V+K207T+L370A、L3S+V5S+S244A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245A+L370A、L3S+V5S+F164V+T245V+V328A、L3S+V5S+F164V+L370A+T397A、L3S+V5S+L59V+F164V+R319C+L370A+T397A、L3S+V5S+L59V+F164V+L370A、L3S+V5S+L59V+L370A+A436G+Q416A、L3+V5S+L59V+L370A+A436G+R442Q、L3S+V5S+L59V+V328A+L370A+R442Q、L3S+V5S+L59V+L370A+R442L、L3S+V5S+L59V+C60Y+F164V+L370A+R442V、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+I180V+S187A+L370A+R442Lのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含む。
本発明の典型的な一実施形態によれば、突然変異は、少なくとも、第７位、第３２位、第９６位、第１６４位、第１７１位、第１８６位、第２５２位、第３８４位、第３８９位、第３９１位、第３９４位、第４０４位、第４１１位、第４２０位、第４２３位、第４２４位、第４４２位、第４５２位及び第４５６位のうちの１つの突然変異部位又は突然変異部位の組み合わせをさらに含み、好ましくは、前記突然変異は、少なくともK7N、Q32L、K96R、V164L、E171D、S186G、V252I、Y384F、I389M、I389F、D391E、N394D、L404Q、L404Q、G411D、Q420R、Q420K、M423K、E424R、E424K、E424Q、R442H、R442L、G452S及びK456Rのうちの１つの突然変異部位をさらに含む。部位特異的突然変異の方法で突然変異を行って、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質の構造及び機能を変えることを実現し、さらに指向性スクリーニングの方法で、前記突然変異部位を有するアミノ基転移酵素を得たものであり、したがってこれらのアミノ基転移酵素突然変異体は有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性に優れ、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有し、当該突然変異体を用いると反応速度を加速させ、酵素の安定性を向上させることができ、酵素の使用量が減り、後処理の難易度が低減するため、工業的な生産に適用することができる。
より好ましくは、突然変異は、少なくともG411D+S186G、G411D+S186G+Y384F、G411D+S186G+Y384F+V164L、G411D+S186G+Y384F+V164L+I389F及びG411D+S186G+Y384F+V164L+I389F+V252Iのうちの1つの突然変異部位の組み合わせを含み、さらに好ましくは、突然変異は、少なくとも、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Y384F+G452S、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+S186G+Q420R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q420K+E424R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+K7N+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q32L+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389M、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389F+N394D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V164L+K456R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+K96R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Q32L+R442H、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+R442L、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+E424K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+E424K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+Y384F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+E424K+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+S186G+Q420R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+I180V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+V164L+I389F+E424Q+K96R、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+V164L+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+I180V+L370A+G411D+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+V164L+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q+M423K、L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E424Q+K7N、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+I180V+L370A+G411D+R442L、C60Y+F164L+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E171D+I389F+V252I+L404Q、C60Y+F164V+I180V+L370A+G411D+A178L+S186G+S187A+Y384F+E424Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D、C60Y+F164V+R442Q+G411D、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+G411D、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+G411D、C60Y+F164V+L370A+G411D、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+G411D+Y384F、C60Y+F164V+R442Q+Y384F、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+Y384F、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+Y384F、C60Y+F164V+L370A+Y384F、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+Y384F、C60Y+F164V+R442Q+S186G、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+S186G、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+S186G、C60Y+F164V+L370A+S186G、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+S186G、C60Y+F164V+R442Q+D391E、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+D391E、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+D391E、C60Y+F164V+L370A+D391E、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+D391E、C60Y+F164V+R442Q+E171D、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+E171D、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+E171D、C60Y+F164V+L370A+E171D、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+E171D、C60Y+F164V+R442Q+L404Q、L3S+V5S+F164V+C60Y+I180V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+L370A+L404Q、L3S+V5S+C60Y+F164V+Q420R+L370A+L404Q、C60Y+F164V+L370A+L404Q、L3S+V5S+F164V+C60Y+L370A+G452S+L404Qのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含む。
指向性スクリーニングという方法で、前記突然変異部位を有するアミノ基転移酵素を獲得し、これらのアミノ基転移酵素突然変異体は有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性に優れ、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有し、当該突然変異体を用いると反応速度を加速させ、酵素の安定性を向上させることができ、酵素の使用量が減り、後処理の難易度が低減するため、工業的な生産に適用することができる。
本発明の典型的な一実施形態によれば、ＤＮＡ分子が提供される。当該ＤＮＡ分子は前記耐有機溶媒アミノ基転移酵素突然変異体をコードする。当該ＤＮＡ分子によってコードされる前記アミノ基転移酵素変異体は有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性に優れ、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有する。
本発明に記載のＤＮＡ分子は「発現カセット」として存在してもよい。「発現カセット」とは線状又は環状の核酸分子であり、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現をガイドできるＤＮＡ及びＲＮＡ配列をカバーしている。一般的には、目的ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターを含み、それは任意に終結シグナル及び／又は他の調節エレメントに有効に連結される。発現カセットは、ヌクレオチド配列を正しく翻訳するために必要な配列をさらに含んでもよい。コード領域は、一般的に目的タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向においては目的機能ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡをコードする。目的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、少なくとも１つの成分が少なくとも１つの他の成分と異種である、いわゆるキメラされたものであってもよい。発現カセットは天然物として存在してもよいが、異種発現のための有効な組換えから形成されたものである。
本発明の典型的な一実施形態によれば、組換えプラスミドが提供される。当該組換えプラスミドは前記いずれかのＤＮＡ分子を含有する。前記組換えプラスミドにおけるＤＮＡ分子は、前記ＤＮＡ分子が正しく、順調に複製、転写又は発現されるように組換えプラスミドの適切な位置に配置される。
本発明では前記ＤＮＡ分子を限定する時に「含有」という用語を使用しているが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関係ない他の配列を任意に加えてもよいというわけではない。当業者が周知しているように、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼ消化部位を追加するか、又は開始コドン、停止コドンなどを追加する必要があり、そのためにクローズド式の表現で限定するとこれらの状況をカバーし切れない恐れがある。
本発明で使用される用語「プラスミド」は二本鎖又は一本鎖の線状又は環状の任意のプラスミド、コスミド、ファージ、アグロバクテリウム二元核酸分子を含み、好ましくは、組換え発現プラスミドは原核発現プラスミドでもよいし真核発現プラスミドでもよく、好ましくは原核発現プラスミドであり、特定の実施形態では、組換えプラスミドはpET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18、pUC-19から選ばれる。より好ましくは、前記組換えプラスミドはpET-22b(+)である。
本発明の典型的な一実施形態によれば、宿主細胞が提供される。前記宿主細胞は前記いずれかの組換えプラスミドを含有する。本発明に適する宿主細胞は、原核細胞、酵母、真核細胞を含み、但し、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は真正細菌であり、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞である。
本発明の典型的な一実施形態によれば、キラルアミンの生産方法が提供される。当該方法は、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせるステップを含み、アミノ基転移酵素は前記いずれかの耐有機溶媒アミノ基転移酵素突然変異体である。本発明に記載のアミノ基転移酵素突然変異体がとても良い有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性を有し、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有するため、本発明のアミノ基転移酵素突然変異体を用いて製造したキラルアミンは、反応速度を加速させ、酵素の安定性を向上させ、酵素の使用量を減らし、後処理の難易度を低減することができる。
さらに、ケトン化合物は
Figure 0007263557000011
であり、但し、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ1、Ｒ2は単独で又は両者が互いに結合して置換された又は非置換の環を形成することができ、
好ましくは、Ｒ1及びＲ2は、炭素原子数が１～２０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基であり、より好ましくは炭素原子数が１～１０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基であり、
好ましくは、前記アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基を含み、
好ましくは、前記アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、エテニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基を含み、
好ましくは、前記アリールアルキル基は、ベンジル基であり、
好ましくは、前記置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基によって置換されることである。
好ましくは、前記ケトン化合物は、
Figure 0007263557000012
である。
本発明の典型的な一実施形態によれば、ケトン化合物は
Figure 0007263557000013
であり、アミノ基転移反応産物は
Figure 0007263557000014
であり、反応式は
Figure 0007263557000015
である。
本発明の典型的な一実施形態では、アミノドナーは、イソプロピルアミン又はアラニンであり、好ましくはイソプロピルアミンである。
本発明のアミノ基転移酵素を用いてケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系において、ｐＨは、７～１１であり、好ましくは８～１０であり、より好ましくは９～１０であり、つまりｐＨの値は７～１１の任意の値であってもよく、例えば７、７.５、８、８、８.６、９、１０、１０.５などである。アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系の温度は、２５～６０℃であり、より好ましくは３０～５５℃であり、さらに好ましくは４０～５０℃であり、つまり温度の値は２５～６０℃の任意の値であってもよく、例えば３０、３１、３２、３５、３７、３８、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５２、５５などである。アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系でジメチルスルホキシドの体積濃度は、０％～５０％であり、例えば１０％、１５％、１８％、２０％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４８％、４９％などである。アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系でメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの体積濃度は、０％～９０％であり、例えば１０％、１６％、１８％、２０％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４８％、４９％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％などである。
当業者が周知しているように、本発明の趣旨を逸脱していなければ、本発明に様々な変更を行うことができ、このような変更も本発明の範囲に含まれる。下記の実験方法では特段の声明がなければ、いずれも通常の方法で行われ、使用する実験材料は特段の声明がなければ、いずれもメーカーから入手できる。
実施例１
有機溶媒のない系におけるＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素の基質１に対する触媒活性：
Figure 0007263557000016
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、２５０μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然突然変異体又は野生型酵素の粗酵素液（０.０５ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８.５）を加え、そして１００mMのＰＢ８.５を０.４１mL加えて系の最終体積を１mLとし、３０℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。突然変異体情報及び結果を表９に示す。
Figure 0007263557000017
表９の結果から分かるように、ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体は野生型株と比べて基質１に対する触媒活性が大幅に向上している。本発明の改変を受けた後、ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体の触媒活性が大幅に向上し、本来なら触媒できない基質にも触媒活性が得られるため、基質スペクトルが拡大しており、非常に小さい反応体積でも変換されるため、反応装置の利用率が向上している。
実施例２
有機溶媒系（４０％）ＤＭＳＯにおけるＡｒＳ－ωＴＡ野生型酵素及び突然変異体の基質１に対する触媒活性：
１０mL反応フラスコに１００mgの（実施例１と同じ）原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、２５０μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体又は野生型酵素の粗酵素液（０.０５ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８.５）を加え、１００mMのＰＢ８.５を０.０１mL加え、そして０.４mLのジメチルスルホキシドを加えて系の最終体積を１mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。突然変異体情報及び結果を表１０に示す。
Figure 0007263557000018
 ＮＤ：産物の生成が検出されなかった。
実施例３
７０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル溶媒系における、耐有機溶媒ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素の基質に対するキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000019
１０mL反応フラスコに１００mgの（実施例１と同じ）原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、２５０μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体又は野生型酵素の粗酵素液（０.０５ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８.５）を加え、そして１.４mLのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加えて系の最終体積を２mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、窒素ブローでメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを除去し、余剰物から１００μLのサンプルを取得し、２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出し、ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体による変換率は９５％であり、ＡｒＳ－ωＴＡ野生型酵素には産物の生成が検出されなかった。突然変異体情報及び結果を表１１に示す。
Figure 0007263557000020
突然変異体Ｍ７６には基質１に対する触媒活性（実施例３）が得られるものの、４０％ジメチルスルホキシドにおいては有機溶媒耐性が弱いため、大部分のタンパク質が変性して活性を失い、触媒活性が大幅に低減しており、突然変異体Ｍ１１３及びＭ１１５の方は高い触媒活性が保持されたため、進化後の突然変異体は高い触媒活性を有するだけでなく、有機溶媒ジメチルスルホキシドに対する耐性が極めて大幅に向上している。
実施例４
異なる温度及びｐＨ条件下におけるＡｒＳ－ωＴＡ変異体及び野生型酵素の触媒活性検証：
Figure 0007263557000021
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５００μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体Ｍ５２もしくはＭ１１５（０．１ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝１１）、又は野生型酵素の粗酵素液（１ｇの原種なるＡｒＳ－ωＴＡ湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝１１）を加え、そして１００mMのｐＨ＝１１のリン酸緩衝液を加えて系の最終体積を５.５mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
結果に示すように、極端なｐＨ条件下では、ＡｒＳ－ωＴＡの方は大量の酵素（１ｇ湿細胞）を使用しても、触媒した後は産物の生成が検出されず、突然変異体Ｍ５２は産物の生成が検出されず、一方突然変異体Ｍ１１５は少ない酵素（０.１ｇ）を使用しても＞８０％の産物生成が検出されたことから、改変後の突然変異体には極めて良い高ｐＨ耐性が得られ、酵素の触媒空間が向上し、高活性及び高ｐＨ耐性という二重の優れた特性により工業的な生産に適用することができる。
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５００μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体Ｍ５２もしくはＭ１１５（０.１ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８）、又は野生型酵素の粗酵素液（１ｇの原種なるＡｒＳ－ωＴＡ湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８）を加え、そして１００mMのｐＨ＝８のリン酸緩衝液を加えて系の最終体積を５.５mLとし、６０℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
結果に示すように、極端な温度条件下では、ＡｒＳ－ωＴＡの方は大量の酵素（１ｇ湿細胞）を使用しても、触媒した後は産物の生成が検出されず、突然変異体Ｍ５２は産物の生成が検出されず、一方突然変異体Ｍ１１５は少ない酵素（０.１ｇ）を使用しても＞８０％の産物生成が検出されたことから、改変後の突然変異体には極めて良い高温耐性が得られ、酵素の触媒空間が向上し、高活性及び高温耐性という二重の優れた特性により工業的な生産に適用することができる。
実施例５
ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素による基質からのキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000022
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５mL～２５０μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体（１ｇ～０.０５ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝７.０及びｐＨ＝１０.５）、又は野生型酵素の粗酵素液（１ｇの原種なるＡｒＳ－ωＴＡ湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝７.０及びｐＨ＝１０.５）を加え、そして１００mMのｐＨ＝７.０のリン酸緩衝液（又はｐＨ＝１０.５のリン酸緩衝液）を０.４１mL加えて系の最終体積を３mLとし、３０℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
突然変異体情報及び結果を表１２に示す。結果に示すように、ｐＨ７.０及びｐＨ１０.５の２つの系においてＡｒＳ－ωＴＡ野生型酵素の方は産物の生成が検出されず、一方複数の突然変異体は２つのｐＨ系のいずれにおいても産物の生成が検出され、しかも一部の突然変異体は優れた活性を示した。例えば、突然変異体Ｍ１１５は極めて少量の酵素（０.０５ｇ、条件ｐＨ＝１０.５）を使用しても変換率が＞９５％で、しかも産物のキラル純度は＞９９％で極めて高かった。ＡｒＳ－ωＴＡを改変して得た突然変異体には優れた触媒活性が得られ、しかも高ｐＨにおいてキラルアミンを触媒生成することができ、触媒効果に優れることから、突然変異体は触媒活性及び耐性において質的突破を実現していることが分かる。
Figure 0007263557000023
「ＮＤ」は１ｇの湿細胞を使用して触媒して産物の生成が検出されなかったことを表し、「-」はｐＨ＝７の条件下で、＜５％の産物生成を検出したことを表し、「+」はｐＨ＝７の条件下で、５％～２０％の産物生成を検出したことを表し、「++」はｐＨ＝７の条件下で、２０％～５０％の産物生成を検出したことを表し、「+++」はｐＨ＝７の条件下で、５０％～８０％の産物生成を検出したことを表し、「++++」はｐＨ＝７の条件下で、８０％～９０％の産物生成を検出したことを表し、「+++++」はｐＨ＝７の条件下で、８０％～９５％の産物生成を検出し、且つｐＨ＝１０.５の条件下で、０.０５ｇの湿細胞を使用して触媒して９０％～１００％の産物生成を検出したことを表す。
実施例６
ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素による基質からのキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000024
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、１００μLのＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体（０.０２ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８.５）、又は１０００μLの野生型酵素の粗酵素液（０.２ｇのＡｒＳ－ωＴＡ湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８.５）を加え、そして１００mMのＰＢ８.５を０.４１mL加えて系の最終体積を３mLとし、３０℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
突然変異体情報及び結果を表１３に示す。結果に示すように、ＡｒＳ－ωＴＡ野生型酵素の方は突然変異体の１０倍の酵素量を使用しても少量の産物だけが生成し（＜２０％）、突然変異体Ｍ１１８、Ｍ１１５などは極めて少量の酵素を使用しただけで変換率が＞９０％で、しかも産物のキラル純度は＞９９％極めて高かった。また複数の突然変異体は原種なるＡｒＳ－ωＴＡと比べて活性が極めて大幅に向上しており、極めて優れた触媒効果を得た。
Figure 0007263557000025
「-」は、出発株は突然変異体の１０倍の酵素量（０.２ｇ）で触媒して変換率が２０％未満であること、又は突然変異体は出発株と同じ酵素量（０.２ｇ）で触媒して変換率が低下し又は増加しないことを表し、「+」は、突然変異体は極めて少量の酵素（０.０２ｇ）を使用しただけで変換率が０.２～１倍向上していることを表し、「++」は突然変異体は極めて少量の酵素（０.０２ｇ）を使用しただけで変換率が１～２倍向上していることを表し、「+++」は突然変異体は極めて少量の酵素（０.０２ｇ）を使用しただけで変換率が２～４倍向上していることを表し、「++++」は突然変異体は極めて少量の酵素（０.０２ｇ）を使用しただけで変換率が４倍超向上していることを表す。
実施例７
ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素による基質からのキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000026
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５mLの原種なるＡｒＳ－ωＴＡ及び突然変異体粗酵素液（１ｇの突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８）を加え、そして１００mMのｐＨ＝８のリン酸緩衝液を加えて系の最終体積を５．５mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
突然変異体情報及び結果を表１４に示す。改変後の突然変異体は開始株ＡｒＳ－ωＴＡと比べて活性が明らかに向上していることが分かり、産物のキラル純度は＞９９％で極めて高かった。
Figure 0007263557000027
「+」は変換率が２０％未満であることを表し、「++」は変換率が２０％～３０％であることを表し、「+++」は変換率が３０％～４０％であることを表し、「+++」は変換率が４０％～５０％であることを表す。
実施例８
ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体及び野生型酵素による基質からのキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000028
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５mL又は５００μLの粗酵素液（１ｇのＡｒＳ－ωＴＡ又は突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８）を加え、そして１００mMのｐＨ＝８のリン酸緩衝液を加えて系の最終体積を５.５mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して、ＮａＯＨでｐＨを１０に調整し、２mLのＭＴＢＥを加えて抽出し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物変換率を検出した。
突然変異体情報及び結果を表１５に示す。改変後の突然変異体は開始株ＡｒＳ－ωＴＡと比べて活性が明らかに向上していることが分かり、複数の突然変異体は１６時間以内に全ての基質を産物に変換することができ、しかも産物のキラル純度は＞９９％で極めて高かった。
Figure 0007263557000029
「++」は目的アミノ基転移酵素を含有する湿細胞を１ｇ使用して変換率が５０％未満であることを表し、「+++」は目的アミノ基転移酵素を含有する湿細胞を１ｇ使用して変換率が７０％～９０％であることを表し、「+++」は目的アミノ基転移酵素を含有する湿細胞を０.１ｇ使用して変換率が９０％～１００％であることを表す。
実施例９
ＡｒＳ－ωＴＡ突然変異体（Ｍ５２、Ｍ１１８及びＭ１１１）及び野生型酵素による基質からのキラルアミン触媒生成：
Figure 0007263557000030
１０mL反応フラスコに１００mgの原料を入れ、１mgの５’－ピリドキサールリン酸を加え、２mMのイソプロピルアミン塩酸塩を加え、５mLの粗酵素液（１ｇのＡｒＳ－ωＴＡ又は突然変異体湿細胞を超音波破砕して調製した２０％粗酵素液、ｐＨ＝８）を加え、そして１００mMのｐＨ＝８のリン酸緩衝液を加えて系の最終体積を５.５mLとし、３５℃恒温で１６時間攪拌し、１２０００rpmで系を５分間遠心分離した後、２００μLのサンプルを取得して２mLのアセトニトリルを加えて溶解し、１２０００rpmで５分間遠心分離してＨＰＬＣに送液して産物の生成を検出した。検出した結果、出発株ＡｒＳ－ωＴＡ触媒系では産物の生成が検出されず、Ｍ５２、Ｍ１１８及びＭ１１１突然変異体はいずれも産物の生成が検出された。改変後の突然変異体には基質に対する触媒活性が得られることが分かる。
実施例１０
目的アミノ基転移酵素をコードする各プラスミドを含む大腸菌の単一の微生物コロニーを、５０μg/mLのアンピシリンを含む５０mLのルリア・ベルターニ（Luria Bertani）培地に接種した。２００rpmと３７℃の恒温振盪機において細胞を培養して一晩（約１６時間）成長させた。２Ｌフラスコ内の５０μg/mLのアンピシリンを含有する５００mLのルリア・ベルターニ（Luria Bertani）培地に５mLの培養液を接種し、２００rpmと３７℃の恒温振盪機においてＯＤが０.６～０.８になるまで培養すると、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて最終濃度の０.０６mMとすることでアミノ基転移酵素遺伝子の発現を誘導し、次に２００rpmと２５℃の恒温振盪機において培養液を持続的に約１６時間培養した。遠心分離（６０００rpm、１５分間、４℃）を行って細胞を収集し、上清液を捨てた。細胞をｐＨ７．０の１００mMのリン酸緩衝液に再懸濁し、超音波破砕で細胞を溶解して粗酵素を獲得し、粗酵素に対する遠心分離（１２０００rpm、３分間、４℃）で上清と沈殿物（封入体タンパク質を含む）を分離し、沈殿物を得て等体積のｐＨ７.０で１００mMのリン酸緩衝液で再懸濁した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで上清及び沈殿物における可溶性タンパク質と封入体タンパク質の発現状況を検出した。
ＡｒＳ－ωＴＡ及び各突然変異体の発現結果を表１６に示す。突然変異部位の導入により突然変異体タンパク質の可溶性発現がますます好調になり、開始株ＡｒＳ－ωＴＡでは少量のタンパク質だけが上清に発現されており、大量のタンパク質は沈殿物において発現されている。突然変異体Ｍ５２は上清におけるタンパク質の発現量が１倍向上し、最終的に突然変異体Ｍ１１５などではほぼ全てのタンパク質が上清に発現されるようになり、沈殿物における発現が極めて少なかった。突然変異体の発現状況極めて明らかに改善されている。
Figure 0007263557000031
「-」は原種なるＡｒＳ－ωＴＡの可溶性発現量として、上清には少量が発現されており、殆どが沈殿物において発現されていることを表す。「+」は可溶性発現が１倍向上していることを表し、「++」は可溶性発現が２倍向上していることを表す。「＋＋＋」は可溶性発現が３倍超向上していることを表す。「++++」は可溶性発現が４倍超向上していることを表す。
前述した内容から、本発明に記載の実施例は次の技術的効果を実現することが分かる。本発明に記載のアミノ基転移酵素突然変異体は、とても良い有機溶媒耐性及び高ｐＨ耐性を有し、且つ高可溶性発現の特性及び高活性の特性を有する。
上述したのが本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者は本発明に様々な変更又は変化を行うことができる。本発明の精神と原則内で行われるいかなる修正、均等置換、改良などは、いずれも本発明の範囲に含まれるべきである。

Claims (20)

  1. アミノ基転移酵素突然変異体であって、前記アミノ基転移酵素突然変異体のアミノ酸配列は配列番号１に示すアミノ酸配列に突然変異が起きて得られたアミノ基転移酵素の機能を有するアミノ酸配列であり、前記突然変異は少なくとも、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ及びＬ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含むことを特徴とする、アミノ基転移酵素突然変異体。
  2. 前記突然変異は少なくとも、Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ、Ｅ４２４Ｄ＋Ａ４３６Ｇ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ４３６Ｐ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ４３６Ｎ、Ｗ８６Ｐ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｆ２５Ｌ＋Ｌ５９Ｖ、Ｆ２５Ｔ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ４３６Ｙ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ４３６Ｑ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ４３６Ｅ、Ｆ１６４Ｖ＋Ｍ４３７Ａ、Ｉ８Ａ＋Ｖ３２８Ａ、Ｉ８Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ｋ、Ｉ４５Ｗ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｆ１７６Ｙ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１７６Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｓ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ４２４Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｔ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｅ４２４Ｄ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｔ１９７Ｐ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｖ３２８Ａ＋Ｅ４２４Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｌ２０６Ｍ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ４２４Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｋ２０７Ｔ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｓ２４４Ａ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｔ２４５Ａ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｔ２４５Ｖ＋Ｖ３２８Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｔ３９７Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ３１９Ｃ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｔ３９７Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ａ４３６Ｇ＋Ｑ４１６Ａ、Ｌ３＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ａ４３６Ｇ＋Ｒ４４２Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｖ３２８Ａ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｒ４４２Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｒ４４２Ｌ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｌ５９Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｒ４４２Ｖ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｒ４４２Ｌのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載のアミノ基転移酵素突然変異体。
  3. 前記突然変異は少なくともＧ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｖ１６４Ｌ、Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｉ３８９Ｆ及びＧ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉのうちの１つの突然変異部位の組み合わせを含む、ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のアミノ基転移酵素突然変異体。
  4. 前記突然変異は少なくとも、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｇ４５２Ｓ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｑ４２０Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｍ４２３Ｋ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｑ４２０Ｋ＋Ｅ４２４Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｋ７Ｎ＋Ｅ４２４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｑ３２Ｌ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｉ３８９Ｍ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｎ３９４Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｋ４５６Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｋ９６Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｑ３２Ｌ＋Ｒ４４２Ｈ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｒ４４２Ｌ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｖ２５２Ｉ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ４２４Ｋ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｅ４２４Ｋ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ４２４Ｋ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｑ４２０Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｅ４２４Ｑ＋Ｋ９６Ｒ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｍ４２３Ｋ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｖ１６４Ｌ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｅ４２４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｅ４２４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｌ４０４Ｑ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｅ４２４Ｑ＋Ｍ４２３Ｋ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｌ４０４Ｑ＋Ｅ１７１Ｄ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｅ４２４Ｑ＋Ｋ７Ｎ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｒ４４２Ｌ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｅ１７１Ｄ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｅ４２４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｙ３８４Ｆ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｓ１８６Ｇ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｄ３９１Ｅ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｅ１７１Ｄ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｒ４４２Ｑ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｑ４２０Ｒ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｌ４０４Ｑ、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｆ１６４Ｖ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４５２Ｓ＋Ｌ４０４Ｑのうちの１つの突然変異部位の組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のアミノ基転移酵素突然変異体。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のアミノ基転移酵素突然変異体をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ分子。
  6. 請求項５に記載のＤＮＡ分子を含有することを特徴とする、組換えプラスミド。
  7. 前記組換えプラスミドの発現ベクターは、ｐＥＴ－２２ａ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９であることを特徴とする、請求項６に記載の組換えプラスミド。
  8. 請求項６又は７に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする、宿主細胞。
  9. 原核細胞、又は真核細胞を含む、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 前記原核細胞は大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３細胞又は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ＤＥ３細胞であり、前記真核細胞は酵母を含むことを特徴とする、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせるステップを含むキラルアミンの生産方法であって、前記アミノ基転移酵素は請求項１から４のいずれか１項に記載のアミノ基転移酵素突然変異体であることを特徴とする、キラルアミンの生産方法。
  12. 前記ケトン化合物は
    Figure 0007263557000032
    であり、アミノ基転移反応の産物は
    Figure 0007263557000033
    であり、但し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ１、Ｒ２は単独で又は両者が互いに結合して置換された又は非置換の環を形成することができる、ことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. Ｒ１及びＲ２は炭素原子数が１～２０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基であり、ことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. Ｒ １ 及びＲ ２ は炭素原子数が１～１０で任意に置換されたもしくは非置換のアルキル基、任意に置換されたもしくは非置換のアリールアルキル基、又は任意に置換されたもしくは非置換のアリール基である、ことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基を含み、
    前記アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、エテニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘプチル基を含み、
    前記アリールアルキル基は、ベンジル基であり、
    前記置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基又はメチレンジオキシ基によって置換されることである、ことを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記ケトン化合物は、
    Figure 0007263557000034
    であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記アミノドナーは、イソプロピルアミン又はアラニンである、ことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  18. アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系において、ｐＨは７～１１であり、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系の温度は、２５℃～６０℃であり、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系で、ジメチルスルホキシドの体積濃度は０％～５０％であり、アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系で、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの体積濃度は０％～９０％であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  19. アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系において、ｐＨは８～１０であり、
    アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系の温度は、３０～５５℃であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  20. アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系において、ｐＨは９～１０であり、
    アミノ基転移酵素がケトン化合物及びアミノドナーを触媒してアミノ基転移反応を行わせる反応系の温度は、４０～５０℃であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
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