CN110628742B - 转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体及其应用。其中，该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I等。本发明的转氨酶突变体获得了对羰基底物的催化活力。

Description

转氨酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。
背景技术
光学纯胺和a-和b-氨基酸在生物体中起着关键作用。这些化合物在医药应用中也非常重要，是合成手性药物和天然产物等的重要中间体。含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异，当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一。
手性胺是合成多种生物活性化合物和活性药物成分的重要组成部分，据估计，目前40％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体(Top.Catal.2014,57,284-300)，使得手性胺化合物成为制药业的重要组成部分。
手性胺的工业生产有多种，主要依赖于烯酰胺从酮前体的金属催化氢化，过程需要昂贵的过渡金属配合物作为催化剂，由于这些过渡金属配合物资源有限，因此难以实现可持续性。同时，从酮前体经不对称合成手性胺的过程需要胺的保护和脱保护步骤，增加步骤和废物，降低收率。催化加氢还原法合成手性胺的方法中催化剂的制备困难而且价格昂贵，设备投资大，生产成本高，对催化剂活性和加氢条件要求很高，而且催化剂有毒性，尤其是氢气中的硫化物，极易发生人员中毒。
转氨酶是一类以蛋白质为主体的生物催化剂。转氨酶是以磷酸吡哆醛为辅因子，能够催化1个氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺或其副产物酮或α-酮酸的酶类的总称。由于传统的不对称合成胺的化学方法存在不同的局限性，例如低效率，低选择性和对环境污染较严重等问题，同时转氨酶催化合成手性胺具有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势，转氨酶合成手性化合物成为一种关键的不对称合成技术。
天然的转氨酶的底物谱往往较窄，只能催化特定类型的底物生成手性胺，而在生物活性化合物或活性药物合成过程中，需要多种类型的手性胺为原料进行合成，因此限制了转氨酶的广泛应用。同时，工业生产过程中往往需要在一定的有机溶剂、压力、pH等易使蛋白质变性的条件，因此需要所用的生物催化剂具有较高的稳定性，以适应工业化生产需要。而野生转氨酶往往在苛刻条件下较易失活，稳定性较差，从而限制了其广泛应用。
尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在制备手性胺化合物的应用中存在很多问题。如对空间位阻大的底物无催化活力；酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；反应体系中稳定性不高易失活等。因此需要对天然转氨酶进行改造，扩大其底物谱，使其获得催化空间位阻较大的底物的能力，同时提高其稳定性，以提高其应用价值。
发明内容
本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中SsTA蛋白对空间位阻较大的羰基底物没有催化活力的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L和F208V；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少还包括如下突变位点之一：T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，D327M和E282K；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，突变至少还包括如下突变位点组合之一：L73A+V77G+T290S，H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+R143P+S207I+T290S+A292G或H70T+L73A+V77G+G144F/Y/W+S207I。
进一步地，突变至少包括如下突变位点组合之一：G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216Q、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216S、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F208R、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+T204N、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F144W+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+A165I+Y130M+163Q+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y198F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+N132T+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148I+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+L151A+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+P180A+A165I+Y130M+L163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130V+K141S+K142T+R143P+G144F+E145D+L148T+L151A+A165I+LL163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+Y130T+L163Q+A165I+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+S207I+T290S+A292G+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+L148A+L151A+T152R+M130V、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+L148A+L151A+P167S+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+R188L+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+L163Q+Y130V+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+G17V+Q40H+T204S、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+T204S、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130V+L163Q+L148A+L151A+T152R+R188L+T204S+S207I+K211H+F208R+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+E145S+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+K146R+E145G+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130M+163Q+L148A+L151E+T152R+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T204S+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130M+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151E+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+Y198F+T204S+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66Q+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F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根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述转氨酶突变体。
根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21-DE3细胞或大肠杆菌Rosetta-DE3细胞。
根据本发明的再一方面，提供了一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述转氨酶突变体。
进一步地，酮类化合物为
Figure BDA0002248460370000081
转氨基反应产物为
Figure BDA0002248460370000082
其中，R1和R2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；R1和R2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；
优选的，R1和R2为碳原子数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基，更优选的为碳原子数1～10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；
优选的，所述芳基包括苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、噁二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基和吡咯基氧基；
优选的，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基和环庚基；
优选的，所述芳烷基为苄基；
优选的，所述取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。
优选的，酮类化合物为
Figure BDA0002248460370000091
Figure BDA0002248460370000092
进一步地，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
进一步地，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10，更优选为9～10；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25℃～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃。本发明的转氨酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的转氨酶(SsTA蛋白)的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶，因此改造后的SsTA蛋白突变体获得了对羰基底物的催化活力，且催化效果较好，在此基础上进一步进行改造，获得的突变体进一步验证对西他列汀前体酮的催化活力，后续进一步改造，提高了酶稳定性和耐受性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
SsTA是来源于Sciscionella sp.的转胺酶，可以催化羰基底物生成手性胺，但是其不能催化具有较大空间位阻的底物，如西他列汀前体酮。西他列汀前体酮由于其较大的空间位阻使得自然界中的天然酶及改造后的酶均无催化活力，目前只有默克公司开发的ATA-117RD11具有此催化能力。因此，开发SsTA突变体，使其获得大结构底物的催化能力，如西他列汀前体酮等，是极具挑战的开发。
酶的理性改造是基于酶的三维分子结构对酶的底物结合部位、辅酶结合部位、表面及其他部位进行改造，以改变酶的催化特性，提高酶活力、选择性等特性。酶的定向进化是一种蛋白质的非理性设计，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，应用易错PCR、DNA改组(DNA shuffling)等技术，结合高效筛选系统获得具有预期特性的新酶。
本发明技术方案通过理性设计和随机突变相结合的技术对SsTA蛋白进行理性改造，获得的突变体扩大了底物谱，获得了对大结构底物的催化能力；同时其稳定性增强，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应。
理性设计可以通过定点突变的手段进行。其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。转氨酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
通过采用软件对转氨酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L，F208V位于底物活性中性附近，其改变可有效扩增SsTA的底物结合口袋，从而使酶对底物的亲和性提高。T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，E282K，D327M可提高酶的稳定性。
本发明对SsTA蛋白进行改造，通过理性设计和定向进化的方式对蛋白进行氨基酸突变，通过(G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L，F208V)等突变来不断提高酶的催化活力，通过定向进化的方法对T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，E282K，D327M等位点进行改造，不断提高酶的稳定性。
为了扩大SsTA的底物谱及催化活力，选取如下底物为验活底物对获得的突变体进行活力验证，反应式如下：
Figure BDA0002248460370000111
菌株信息及实验结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002248460370000112
Figure BDA0002248460370000121
N.D.表示未检测到产品生成，+表示使用10wt湿细胞获得产品转化率<50％，-表示使用10wt湿细胞获得产品转化率<10％，++表示使用10wt湿细胞获得产品转化率>80％，+++表示使用3wt湿细胞获得产品转化率<70％，++++表示使用3wt湿细胞获得产品转化率>70％。
SsTA具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：1MTTTEFANSNLVAVEPGAIREPTPPGSVIQYSEYELDRSQPLAGGVAWIEGEYVPADEARISIFDTGFGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLEDHLDRLLHGAARLKLETGMSREELAGIAKRCVSLSQLREAYVNITITRGYGKKRGEKDLTKLTHQVYVYAIPYLWAFPPEEQIFGTSVIVPRHVRRAGRNTIDPTIKNYQWGDLTAASFEAKDRGARSAVLLDADNCVAEGPGFNVVLVKDGALVSPSRNALPGITRKTVYEIAAAKGIETMLRDVTSSELYEADELMAVTTAGGVTPITSLDGEQVGNGEPGPITVAIRDRFWALMDEPSSLIEAIDY。
经改造后的SsTA蛋白突变体获得了对具有一定空间位阻的羰基底物的催化活力，且催化效果较好，在此基础上进一步进行改造，选取空间位阻极大的西他列汀前体酮为验活底物，通过定点突变、饱和突变、定向进化等方法，不断扩大SsTA的催化活力。在活力验证前，对包括SsTA在内的300种天然转氨酶及突变体进行西他列汀前体酮的活力验证，发现均无催化活力，说明西他列汀前体酮由于位阻极大使得天然的转氨酶对其均无催化活力，即使本实验室已有的突变体仍无催化活力。经改进一步造获得的SsTA突变体验证对西他列汀前体酮的催化活力。反应式如下：
Figure BDA0002248460370000122
菌株信息及实验结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002248460370000123
Figure BDA0002248460370000131
Figure BDA0002248460370000141
Figure BDA0002248460370000151
ND表示使用>10wt的湿细胞进行催化反应未检测到产品生成，-表示使用10wt湿细胞获得产品转化率<10％，+表示使用10wt湿细胞获得产品转化率10％～30％，++表示使用10wt湿细胞获得产品转化率40％～70％，+++表示使用10wt湿细胞获得产品转化率70％～90％，++++表示使用10wt湿细胞获得产品转化率>90％，+++++表示使用5wt湿细胞获得产品转化率>90％，++++++表示使用3wt湿细胞获得产品转化率>90％。“MTTTEFANREFH”和“MTTTEFANREIH”在SEQ ID NO：1的N端增加的氨基酸序列。
经过定点突变和定向进化改造的突变体获得了对具有较大空间位阻的底物的催化能力，且活力不断逐步提高。为了进一步提升突变体的稳定性性能，通过易错PCR和定向筛选的方法对突变体的耐受性进行改造。
经易错PCR构建获得随机突变基因，将含随机突变的基因构建到pET22b载体上，转化入BL21(DE3)宿主菌中，构建突变体菌株库。经测序鉴定调整突变频率使其保持在每个目的蛋白有约1～3个氨基酸突变。突变体库经诱导获得蛋白，以西他列汀前体酮为筛选底物，设置不同的温度和溶剂耐受条件对突变体进行筛选。筛选获得的菌株经测序及再次验证确认有益突变体，具体见表3。
表3
Figure BDA0002248460370000152
Figure BDA0002248460370000161
Figure BDA0002248460370000171
+1经45℃，25％DMSO耐受处理1h后，残余活力提高0.1～1倍，++1表示经45℃，25％DMSO耐受处理1h后，残余活力提高1～2倍，+2表示经55℃，25％DMSO耐受处理1h后，残余活力提高1～2倍，++2表示经55℃，25％DMSO耐受处理1h后，残余活力提高2～3倍，+++2表示经55℃，25％DMSO耐受处理1h后，残余活力提高3～4倍。突变体经选择性测定ee值为95％～99％
经过耐受性改造的突变体以西他列汀前体酮为底物验证，M19最适反应温度为30℃，M38，M41等突变体的最适反应温度提升到35℃，M57，M58，M60，M72，M76最适反应温度提升到55℃。同时突变体在溶剂中稳定性也有显著提高，最适反应DMSO浓度由5％提升到30％。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：G17V，L36P，Q40H，G69Y，H70T，L73A，V77G，V77S，V77T，A78I，Y130M，Y130V，Y130T，N132I，N132T，K141S，K142S，K142T，R143P，G144F，G144W，G144Y，E145D，E145S，E145G，K146R，L148A，L148I，L148T，L151A，L151H，L151E，L151V，L151Q，T152R，H153P，H153G，Y158S，I160C，L163Q，L163R，A165I，P167S，E170R，T175A，P180A，Y198F，S207I，T290S，T290G，A292G，Y198M，R216Q，R216E，R216S，S217N，W200A，F208R，F208L和F208V。优选地，突变至少包括如下突变位点之一：T66M，T66A，T66Q，T66S，E105D，T134A，K150N，G187S，R188L，Y158N，I160F，I160L，I160V，Y162F，T204N，T204S，K211H，K211Q，L237Q，A242T，V244M，V244S，V244D，V244N，V244H，V244E，V244A，Y260F，Y260N，E261D，T270A，R273S，R273C，R273T，S278R，E282K，D327M；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
本发明的转氨酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的转氨酶(SsTA蛋白)的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶，因此改造后的SsTA蛋白突变体获得了对羰基底物的催化活力，且催化效果较好，在此基础上进一步进行改造，获得的突变体进一步验证对西他列汀前体酮的催化活力，后续进一步改造，提高了酶稳定性和耐受性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的转氨酶对有机溶剂的耐受性。在上述实施方式中，优选转氨酶突变体的氨基酸序列具有以上的同源性并具有或编码具有改进的有机溶剂的耐受性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：L73A+V77G+T290S，H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+R143P+S207I+T290S+A292G或H70T+L73A+V77G+G144F/Y/W+S207I.
更优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216Q、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216S、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F208R、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+T204N、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F144W+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+A165I+Y130M+163Q+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y198F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+N132T+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148I+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+L151A+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+P180A+A165I+Y130M+L163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130V+K141S+K142T+R143P+G144F+E145D+L148T+L151A+A165I+LL163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+Y130T+L163Q+A165I+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+S207I+T290S+A292G+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+L148A+L151A+T152R+M130V、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+L148A+L151A+P167S+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+R188L+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+L163Q+Y130V+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+G17V+Q40H+T204S、MTTTEFANREFH+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151A+T152R+R188L+A165I+Y130V+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G+T204S、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130V+L163Q+L148A+L151A+T152R+R188L+T204S+S207I+K211H+F208R+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+E145S+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141T+K142S+R143P+G144Y+K146R+E145G+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+A165I+Y130M+163Q+L148A+L151E+T152R+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T204S+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+Y130M+K141S+K142T+R143P+G144Y+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151E+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREFH+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+Y198F+T204S+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G、MTTTEFANREIH+G17V+Q40H+T66Q+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130V+L148A+L151A+T152R+L163Q+A165I+R188L+T204S+K211H+F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根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述转氨酶突变体。该DNA分子编码的上述转氨酶突变体获得了对羰基底物的催化活力，且催化效果较好，其中一些突变体还获得了对西他列汀前体酮的催化活力，并且提高了酶稳定性和耐受性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。由于本发明的上述转氨酶突变体具有获得了对羰基底物的催化活力，且催化效果较好，其中一些突变体还获得了对西他列汀前体酮的催化活力，并且提高了酶稳定性和耐受性，减少了酶用量，降低了后处理的难度。
进一步地，酮类化合物为
Figure BDA0002248460370000241
转氨基反应产物为
Figure BDA0002248460370000242
其中，其中，R1和R2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；R1和R2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；
优选的，R1和R2为碳原子数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基，更优选的为碳原子数1～10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；
优选的，所述芳基包括苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、噁二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基和吡咯基氧基；
优选的，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基和环庚基；
优选的，所述芳烷基为苄基；
优选的，所述取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。
优选的，酮类化合物为
Figure BDA0002248460370000251
Figure BDA0002248460370000252
在本发明一种典型的实施方式中，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
应用本发明的转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10，更优选为9～10，也就是说pH的取值可以任选为7～11中的值，例如7、7.5、8、8、8.6、9、10、10.5等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃，也就是说温度的取值可以任选为25～60℃中的值，例如30、31、32、35、37、38、39、40、42、45、48、50、51、52、55等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％，例如选10％、15％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中甲基叔丁基醚体积浓度为0％～90％，例如选10％、16％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％、55％、60％、70％、80％、90％等。
本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例1
SsTA野生酶及突变体对西他列汀前体酮的催化活力
Figure BDA0002248460370000261
100mL反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5’-磷酸吡哆醛，加入3.7mM异丙胺盐酸盐，加入1.5mLSsTA突变体或野生酶的粗酶液(0.2g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，pH＝8.0)，加入100mM PB8.0使体系终体积为5mL，与45℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200uL加入2mL乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送HPLC检测产品转化率和ee值。表4结果可见SsTA野生菌对底物的无催化活力，而SsTA突变体可生成90％以上的手性胺产品，经ee值检测手性纯度>98％。经过本发明的改造后，SsTA突变体的获得了对空间位阻较大的底物西他列汀前体酮的催化活力，且部分突变体活力极大提高，扩大了底物谱。
表4
Figure BDA0002248460370000262
Figure BDA0002248460370000271
实施例2
SsTA野生酶及突变体催化酮化合物生成手性胺
Figure BDA0002248460370000272
100mL反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5’-磷酸吡哆醛，加入3.7mM异丙胺盐酸盐，加入5mLSsTA突变体或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，pH＝8.0)，加入100mM PB8.0使体系终体积为7mL，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200uL加入2mL乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送HPLC检测产品转化率。表5结果可见SsTA野生菌对底物的无催化活力，而SsTA突变体可生成40％以上的手性胺产品。经过本发明的改造后，SsTA突变体扩大了催化底物谱。
表5
Figure BDA0002248460370000273
Figure BDA0002248460370000281
ND表示未检测到产品生成，+表示检测到1％～10％产品生成，++表示检测到10％～20％产品生成，+++表示检测到20％～30％产品生成，++++表示检测到40％～50％产品生成。
实施例3
SsTA野生酶及突变体催化酮化合物生成手性胺
Figure BDA0002248460370000282
100mL反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5’-磷酸吡哆醛，加入3.7mM异丙胺盐酸盐，加入5mLSsTA突变体或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，pH＝8.0)，加入100mM PB8.0使体系终体积为7mL，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200uL加入2mL乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送HPLC检测产品转化率。表6结果可见SsTA野生菌对底物的无催化活力，而SsTA突变体可生成40％以上的手性胺产品。经过本发明的改造后，SsTA突变体扩大了催化底物谱。
表6
Figure BDA0002248460370000291
ND表示未检测到产品生成，+++表示检测到30％～40％产品生成，++++表示检测到40％～50％产品生成。
实施例4
SsTA野生酶及突变体催化酮化合物生成手性胺
Figure BDA0002248460370000292
100mL反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5’-磷酸吡哆醛，加入3.7mM异丙胺盐酸盐，加入5mLSsTA突变体或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，pH＝8.0)，加入100mM PB8.0使体系终体积为7mL，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200uL加入2mL乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送HPLC检测产品转化率。表7结果可见SsTA野生菌对底物的无催化活力，而SsTA突变体可生成40％以上的手性胺产品。经过本发明的改造后，SsTA突变体扩大了催化底物谱。
表7
Figure BDA0002248460370000293
Figure BDA0002248460370000301
ND表示未检测到产品生成，+++表示检测到30％～40％产品生成，++++表示检测到40％～50％产品生成。
实施例5
SsTA野生酶及突变体催化酮化合物生成手性胺
Figure BDA0002248460370000302
100mL反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5’-磷酸吡哆醛，加入3.7mM异丙胺盐酸盐，加入5mLSsTA突变体或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，pH＝8.0)，加入100mM PB8.0使体系终体积为7mL，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200uL加入2mL乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送HPLC检测产品转化率。表8结果可见SsTA野生菌对底物的无催化活力，而SsTA突变体可生成90％以上的手性胺产品，且手性纯度极高99％。经过本发明的改造后，SsTA突变体扩大了催化底物谱。
表8
Figure BDA0002248460370000303
Figure BDA0002248460370000311
ND表示未检测到产品生成，+++表示检测到30％～40％产品生成，++++表示检测到40％～50％产品生成。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：现有技术SsTA野生菌对底物无催化活力，经过改造后的突变体扩大的底物谱。同时改进了酶的稳定性，使其最适反应温度显著提高，溶剂耐受性提高，能适用于苛刻的反应条件。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司
<120> 转氨酶突变体及其应用
<130> PN116544KLY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 338
<212> PRT
<213> Sciscionella sp.
<400> 1
Met Thr Thr Thr Glu Phe Ala Asn Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Arg Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser
20 25 30
Glu Tyr Glu Leu Asp Arg Ser Gln Pro Leu Ala Gly Gly Val Ala Trp
35 40 45
Ile Glu Gly Glu Tyr Val Pro Ala Asp Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe
50 55 60
Asp Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val
65 70 75 80
Trp His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Glu Asp His Leu Asp Arg Leu Leu
85 90 95
His Gly Ala Ala Arg Leu Lys Leu Glu Thr Gly Met Ser Arg Glu Glu
100 105 110
Leu Ala Gly Ile Ala Lys Arg Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu
115 120 125
Ala Tyr Val Asn Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Lys Arg Gly
130 135 140
Glu Lys Asp Leu Thr Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Val Tyr Ala Ile
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Glu Glu Gln Ile Phe Gly Thr Ser
165 170 175
Val Ile Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Ile Asp
180 185 190
Pro Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe
195 200 205
Glu Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Ser Ala Val Leu Leu Asp Ala Asp
210 215 220
Asn Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Val Leu Val Lys Asp
225 230 235 240
Gly Ala Leu Val Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg
245 250 255
Lys Thr Val Tyr Glu Ile Ala Ala Ala Lys Gly Ile Glu Thr Met Leu
260 265 270
Arg Asp Val Thr Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Ala Asp Glu Leu Met Ala
275 280 285
Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Thr Ser Leu Asp Gly Glu
290 295 300
Gln Val Gly Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ile Thr Val Ala Ile Arg Asp
305 310 315 320
Arg Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Ser Ser Leu Ile Glu Ala Ile
325 330 335
Asp Tyr

Claims (16)

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体在SEQ ID NO：1所示的序列基础上发生氨基酸突变，所述氨基酸突变为：L73A+V77G。
2.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体在SEQ ID NO：1所示的序列基础上发生氨基酸突变，所述氨基酸突变为：L73A+V77G+T290S，H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+R143P+S207I+T290S+A292G或H70T+L73A+V77G+G144F/Y/W+S207I。
3.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体在SEQ ID NO：1所示的序列基础上发生氨基酸突变，所述氨基酸突变为：G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198M、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216Q、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+R216S、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F208R、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+T204N、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+T290S+A292G+A165I+F144W+Y198F、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144W+S207I+T290S+A292G+A165I+Y198F+K211H、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+S207I+A165I+Y130M+163Q+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y198F+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+N132T+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+Y158S+I160C+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G 、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+L148I+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+A165I+Y130M+L163Q+L151A+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142S+R143P+G144F+P180A+A165I+Y130M+L163Q+F208R+S207I+K211H+T290S+A292G 、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163Q+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144F+L148A+L151A+A165I+Y130M+L163R+K211H+F208R+S207I+T290S+A292G、MTTTEFANREFH 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ID NO：1的N端增加的氨基酸序列。
4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求4所述的DNA分子。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21-DE3细胞或大肠杆菌Rosetta-DE3细胞，所述真核细胞为酵母。
10.一种生产手性胺的方法，包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1至3中任一项所述的转氨酶突变体，所述酮类化合物为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure DEST_PATH_IMAGE010
或
Figure DEST_PATH_IMAGE012
；所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7~11。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为8~10。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为9~10。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25℃~60℃。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为30~55℃。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为40~50℃。
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