JP6988000B2 - ケトレダクターゼ変異体及びその応用 - Google Patents
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Description
さらに、宿主細胞は、原核細胞、酵母または真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞が大腸菌BL21細胞または大腸菌DH5αコンピテントセルである。
さらに、ケトン類化合物は、
さらに、ケトレダクターゼは、上記ケトレダクターゼ変異体の溶液、凍結乾燥粉末、固定化酵素または固定化細胞である。
さらに、触媒還元反応の反応系は、イソプロピルアルコールである補因子をさらに含み、他の補酵素が添加されていない。
さらに、触媒還元反応の反応系において、ケトレダクターゼの添加量は5mg〜0.1g粗酵素凍結乾燥粉末/1g基質である。
さらに、触媒還元反応の温度は10〜37℃であり、好ましくは、15〜35℃である。
さらに、触媒還元反応の時間は3〜48hであり、さらに好ましくは、6〜27hである。
さらに、触媒還元反応は、pHが6.0〜9.5、好ましくはpHが7.0〜7.5である条件で行われる。
本発明の典型的な実施形態によると、ケトン類化合物は
[実施例1:ケトレダクターゼによる部位特異的突然変異、飽和突然変異、組み合わせ突然変異でR−3−ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを調製する反応特性の比較]
5mLの反応管において、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 40mgをイソプロピルアルコール 60ulに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節して、NAD 0.4mg、ケトレダクターゼ1−44号粗酵素凍結乾燥粉末 0.4mg〜4mg、0.1Mリン酸塩緩衝液を添加し、総反応体積は0.4mlで、系のpHが7.0〜7.3であり、30℃±3℃の一定温度で攪拌反応させた。ケトレダクターゼの安定性を検測する場合には、系中にさらに高濃度のイソプロピルアルコールを添加して反応させた。16h後に、系から取り出して、メチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って分析し、触媒特性が改善された変異体の反応特性を表1に示す。
1:Rエナンチオマー50.0−55.99%eeを示す。
+:Rエナンチオマー56.0−74.99%eeを示す。
++:Rエナンチオマー74.99−89.99%eeを示す。
+++:Rエナンチオマー90.0−95.99%eeを示す。
++++:Rエナンチオマー96.0−99.00%eeを示す。
+++++:Rエナンチオマー99.01−100%eeを示す。
ケトレダクターゼの触媒でR−3−ヒドロキシテトラヒドロチオフェンを合成する化学反応について、以下の実験を行った:反応液 10mLで、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 1gをイソプロピルアルコール 1.5mlに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節して、NAD 0.01g、ケトレダクターゼacCR粗酵素凍結乾燥粉末 0.005〜0.1g、0.1M pH7.0のリン酸塩緩衝液 7.68mlを滴下し、系のpHは7.0〜7.3で、30℃±3℃の一定温度で16h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って転化率とee値を検出し、その結果を表2に示す。
10mLの反応液に、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 1g、イソプロピルアルコール終濃度60%、ケトレダクターゼ凍結乾燥粉末質量 0.025g、0.1Mリン酸塩緩衝液で粗酵素液を調製し、NAD 0.01gを添加し、基質混合液を酵素液に滴下し、系のpHは7.0〜7.3で、30℃±3℃の一定温度で40h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って分析し、配列番号32ケトレダクターゼ変異体の転化率は99.3%で、ee値は98.7%であった。一方、野生型ケトレダクターゼ配列番号1は、高濃度のイソプロピルアルコール反応系において、殆どの酵素が変性しており、反応結果は非常に悪かった。
5mLの反応管において、3−ケトンテトラヒドロフラン 0.1gをイソプロピルアルコール 150ulに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節し、NAD 1mg、ケトレダクターゼ凍結乾燥粉末質量 0.02g、0.1Mのリン酸塩緩衝液を添加し、総反応体積は2mlで、系のpHは7.0〜7.3であり、30℃±3℃の一定温度で16h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って転化率とee値を分析した。表1中の一部の変異体の3−ケトンテトラヒドロフランに対する反応特性を表3に示す。
1:Rエナンチオマー50.0−55.99%eeを示す。
+:Rエナンチオマー56.0−69.99%eeを示す。
++:Rエナンチオマー70.0−89.99%eeを示す。
+++:Rエナンチオマー90.0−95.99%eeを示す。
++++:Rエナンチオマー96.0−100%eeを示す。
10mLの反応液において、3−ケトンテトラヒドロフラン 1gをイソプロピルアルコール 1.5mlに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節し、NAD 0.01gを滴下し、SEQ39ケトレダクターゼ乾燥粉末 0.05〜0.1gを0.1Mリン酸塩緩衝液で溶解し、系のpHは7.0〜7.3であり、30℃±3℃の一定温度で24h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って分析した結果、ee値は99.6%で、転化率は98%を超えた。
1.反応温度:
5mLの反応管において、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 0.1gをイソプロピルアルコール 150ulに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節し、NAD 1mg、SEQ18ケトレダクターゼ乾燥粉末 0.005g、0.1Mリン酸塩緩衝液 0.62mlを添加し、総反応体積は1mlで、系のpHは7.0〜7.3であり、30℃±3℃の一定温度で16h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って分析してその結果を図1に示す。温度が低下するほど、ケトレダクターゼの立体選択性は増加する傾向があるが、反応速度は低下し始まった。
5mLの反応管において、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 0.1gをイソプロピルアルコール 150ulに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調節し、NAD 1mgを添加し、SEQ42ケトレダクターゼ全細胞 0.05gを0.1Mリン酸塩緩衝液 0.62mlに溶解させ、総反応体積は1mlで、系のpHは7.0〜7.5であって、30℃±3℃の一定温度で16h攪拌した。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って分析した結果、ee値は99%を超えていて、転化率は98%を超えていた。
10mLの反応液で、3−ケトンテトラヒドロチオフェン 1gをイソプロピルアルコール 4mlに添加して均一に混合し、pHを7.0〜7.3に調製し、NAD 0.01gを添加し、SEQ43ケトレダクターゼ粗酵素凍結乾燥粉末 0.01g〜0.05gを0.1Mリン酸塩緩衝液に溶解させ、系のpHは7.0〜7.3であり、30℃で16h反応させた。系をメチルtert-ブチルエーテルで抽出し、有機相をGCに送って検出した結果、転化率は99%で、ee値は最大99.7%であった。
反応系に3−ケトンテトラヒドロチオフェン 1g、ケトレダクターゼ組換え粗酵素乾燥粉末、イソプロピルアルコール終濃度30%〜50%、0.1M pH7.0のリン酸塩緩衝液を含有する。反応系のpHは7.0〜7.5であって、30℃±3℃で反応させた。用いられた反応体積、各原料の使用量、反応結果を表4に示す。
以上の説明からわかるように、本発明の上記実施例によると以下の技術効果を実現できる:
3)本発明において、酵素の使用量が既存技術における酵素の使用量より大幅に低減され、生産コストを低減した。
Claims (21)
- アミノ酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42または配列番号43に示すアミノ酸配列であることを特徴とするケトレダクターゼ変異体。
- 請求項1に記載のケトレダクターゼ変異体をコードすることを特徴とするDNA分子。
- 配列が、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85または配列番号86に示す配列であることを特徴とする請求項2に記載のDNA分子。
- 請求項3に記載のDNA分子を含有することを特徴する組換えプラスミド。
- pET−22b(+)、pET−3a(+)、pET−3d(+)、pET−11a(+)、pET−12a(+)、pET−14b(+)、pET−15b(+)、pET−16b(+)、pET−17b(+)、pET−19b(+)、pET−20b(+)、pET−21a(+)、pET−23a(+)、pET−23b(+)、pET−24a(+)、pET−25b(+)、pET−26b(+)、pET−27b(+)、pET−28a(+)、pET−29a(+)、pET−30a(+)、pET−31b(+)、pET−32a(+)、pET−35b(+)、pET−38b(+)、pET−39b(+)、pET−40b(+)、pET−41a(+)、pET−41b(+)、pET−42a(+)、pET−43a(+)、pET−43b(+)、pET−44a(+)、pET−49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET−A、pRSET−B、pRSET−C、pGEX−5X−1、pGEX−6p−1、pGEX−6p−2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232−18、pUC−18またはpUC−19であることを特徴する請求項4に記載の組換えプラスミド。
- 請求項4または5に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
- 原核細胞または真核細胞を含むことを特徴とする請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記原核細胞が大腸菌BL21細胞または大腸菌DH5αコンピテントセルであり、前記真核細胞が酵母であることを特徴とする請求項7に記載の宿主細胞。
- ケトレダクターゼがケトン類化合物に対して触媒還元反応を行う工程を含むR−3−ヒドロキシ複素環式化合物を生産する方法であって、
前記ケトレダクターゼが、請求項1に記載のケトレダクターゼ変異体であることを特徴とするR−3−ヒドロキシ複素環式化合物を生産する方法。 - R−3−ヒドロキシテトラヒドロフランの転化率>99%であり、ee値が99.6%であり、R−3−ヒドロキシテトラヒドロチオフェン中の転化率>99%であり、ee値が99.8%であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ケトレダクターゼが、請求項1に記載のケトレダクターゼ変異体の溶液、凍結乾燥粉末、固定化酵素または固定化細胞であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の反応系に、イソプロピルアルコールである補因子をさらに含み、他の補酵素は添加されていないことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の反応系に、NAD/NADH及び/またはNADP/NADPHである補因子をさらに含み、補因子循環系は、グルコースとグルコース脱水素酵素、ギ酸塩とギ酸脱水素酵素、グルコース6−リン酸とグルコース6−リン酸脱水素酵素、または第二級アルコールと第二級アルコール脱水素酵素を含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の反応系において、前記ケトレダクターゼの添加量は5mg〜0.1g粗酵素凍結乾燥粉末/1g基質であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の温度は10〜37℃であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の温度は15〜35℃であることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の時間は3〜48hであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応の時間は6〜27hであることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記触媒還元反応が、pHが6.0〜9.5である条件で行われることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記触媒還元反応が、pHが7.0〜7.5である条件で行われることを特徴とする請求項20に記載の方法。
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