CN105624125B

CN105624125B - 醛酮还原酶及其在合成(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用

Info

Publication number: CN105624125B
Application number: CN201410706195.1A
Authority: CN
Inventors: 罗煜; 丁时澄; 瞿旭东; 李辉; 王海涛
Original assignee: Abiochem Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: CN105624125A

Abstract

本发明提供了一种新的醛酮还原酶突变体及利用重组醛酮还原酶突变体或其冻干粉进行不对称还原的方法。在催化浓度高达1000g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达98％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

Description

醛酮还原酶及其在合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种醛酮还原酶突变体，生产该醛酮还原酶突变体的基因工程菌的构建，及该醛酮还原酶突变体的生产方法及其在生物催化制备(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。

背景技术

属于酮还原酶(KRED)或羰基还原酶类的酶对于从相应的前体立体异构酮底物或相应的外消旋醛底物中合成旋光的醇有用。典型的，KRED将酮和醛底物转化为相应的醇产物，但是也可催化逆反应，将醇底物氧化为相应的酮/醛产物。用如KRED的酶对酮和醛的还原以及醇的氧化需要辅因子，最常见的为还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，以及用于氧化反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADH和NADPH作为电子供体，而NAD和NADP作为电子受体。经常观察到酮还原酶和醇脱氢酶接受磷酸化的或非磷酸化的辅因子(以其氧化的或还原的状态)。

KRED酶可在广泛范围内的细菌和酵母中发现(综述参见：Kraus和Waldman，Enzymecatalysis in organic synthesis(有机合成中的酶催化)第1&2卷；VCH Weinheim 1995；Faber,K.,Biotransformations in organicchemistry(有机化学中的生物转化)，第4版，Springs,Berlin HeidelbergNew York.2000；Hunnel和KuIa,1989,Eur.J.Biochem.184:1-13)。已经报道了一些KRED基因和酶序列，例如，木兰假丝酵母、近平滑假丝酵母、赭色掷孢酵母。

4-乙酰氧基氮杂环丁酮(简称4AA)是一种重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和青霉烯类新型广谱抗生素的重要中间体，如用于合成亚胺培南、法罗培南、美罗培南等。

4AA的化学结构式如式I所示。4AA的分子骨架特征是一个四元内酰胺环，共含有3个手性中心，存在8种立体异构体，如何高选择性地建立手性中心，是合成4AA的关键所在。日本NOyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯为起始原料的路线，各步的收率和立体选择性都很好，总收率高达50％，是一条非常具有工业化前景的路线，该工艺路线如式1所示，其中R是含有1～6个碳原子的饱和低级烷基。在该路线中，乙酰乙酸乙酯首先与卤化后N-羟甲基苯甲酰胺反应，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)，然后利用手性催化剂(R)-BINAP-Ru经过羰基不对称还原反应，生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯(式III)，再经过脱保护基、分子内成酰胺键、叔丁基二甲硅基保护、三氯化钌催化下的乙酰氧基化得到4AA。

在上述路线中，最关键的步骤是手性催化剂(R)-BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯(式II)生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯(式III)，但由于该过程需要使用到贵重金属钌作为催化剂，并且需要在高温高压条件下进行，对反应器要求较高，因此造成该路线生产成本较高，限制了4AA大规模工业化生产。

近年来，利用生物催化进行不对称反应的方法以其高度的化学、区域和立体选择性，受到了越来越广泛的关注。采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物催化还原反应需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的微生物全细胞作为催化剂。

美国专利文献US4927507曾报道一种利用面包酵母还原2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯的方法，得到产物的构型为(2S,3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯和(2R,3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。中国专利文献CN1940079B和CN1940080B也曾研究利用面包酵母细胞不对称合成制备(2S,3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯系列化合物，但获得的主要产物构型为(2S,3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，占总产物的75％以上，少部分副产物为(2R,3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，再利用碱性条件下进行C2位构型翻转，使副产物(2R,3S)-构型转化为(2S,3S)-构型产物，再通过化学方法将(2S,3S)-构型产物进行C3位构型翻转，得到(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，最后脱除3个保护基，最终得到(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸。但是上述已报道的方法中，利用面包酵母羰基不对称还原所得到的产物主要构型均为(2S,3S)-构型产物，需要再经过化学方法进行构型翻转的步骤，操作繁琐，回收率低。

发明内容

本发明提供具有还原2-苯甲酰胺基甲基-3-氧丁酸甲酯至(2S,3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯的能力的醛酮还原酶突变体多肽、编码该多肽的多核苷酸和该多肽的使用方法。化合物(2S,3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯是合成(2R,3R)-3-((R)-1-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)乙基)-4-氧氮杂环丁-2-基乙酸酯的中间体，而后者为用于生产不同的碳杂青霉烯类抗生素的中间体。可从(2S,3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯合成碳杂青霉烯类抗生素包括但不局限于亚胺培南、美洛培南、多利培南、厄他培南、比阿培南、帕尼培南和与沙纳霉素类似的其它化合物。

本发明的第一方面提供了一种醛酮还原酶突变体，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由中国专利申请201410541899.8中所述的核苷酸序列(参见本申请序列表SEQ ID NO:1)编码，具有还原酮羰基的功能，是一种新的醛酮还原酶。

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有醛酮还原酶活性的蛋白质。

其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白。根据本发明，在如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持醛酮还原酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有醛酮还原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。

优选地，上述衍生的醛酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

(c)与(a)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有醛酮还原酶活性的蛋白质。

SEQ ID NO:2所示的醛酮还原酶和其他已知醛酮还原酶的氨基酸序列的同一性低于90％，具有显著差异性，例如与吗啡脱氢酶YtbE之间的同一性为85％。

在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。

本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的醛酮还原酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成的。

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于中国专利申请201410541899.8，其可以从含有该核酸的培养基中分离获得，可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明中，SEQ ID NO:1所示的基因命名为BYKY-KRED，全长843bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID NO:1。本发明的醛酮还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQ ID NO:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。

SEQ ID NO:1的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ ID NO:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO:1所示序列的多聚核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的醛酮还原酶基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21分别用NdeI和HindIII酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的醛酮还原酶基因的重组表达质粒BYKY-KRED或其突变体表达质粒。

本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的醛酮还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.Coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒BYKY-KRED或其突变体转化至E.Coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.Coli BL21(DE3)/BYKY-KRED或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。

本发明的第五个方面是提供一种重组醛酮还原酶的制备方法，其包括如下的步骤：培养本发明的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醛酮还原酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并表达本发明的醛酮还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并表达本发明的醛酮还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET21a-BYK-KRED或其突变体)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度CD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～37℃(更佳地是25℃)，即可高效表达本发明所述重组醛酮还原酶。

本发明的第六个方面是提供一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂，其可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的醛酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品，或者通过冻干得到的冻干粉。

本发明的第七方面提供了本发明的醛酮还原酶、重组醛酮还原酶或催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。

所述前手性羰基化合物较佳地为2-取代氨基甲基-3-氧代丁酸酯化合物，即式I所示的化合物：

其中，R为C1～C6烷基，R’为氨基保护基。

优选地，所述的氨基保护剂选自叔丁氧羰基、苄氧羰基、三苯甲基、苯甲酰基、甲酰基、三氟乙酰基。

所述前手性羰基化合物更优选地为2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸甲酯。

本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述应用包括下述步骤：在pH 5.0～8.0的水溶液中，在本发明的醛酮还原酶、重组醛酮还原酶或催化剂的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

在一种具体的实施方式中，在pH 5.0～8.0的水溶液中，在本发明的醛酮还原酶冻干粉催化下，在NADP⁺、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

在另一种具体的实施方式中，在pH 5.0～8.0的水溶液中，在本发明的醛酮还原酶、重组醛酮还原酶或催化剂催化下，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

上述的葡萄糖和葡萄糖脱氢酶可以被异丙醇替代。

其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为10～1000g/L。本发明的醛酮还原酶用量为催化有效量，较佳地为1～20g/L。本发明的葡萄糖用量较佳为1～20g/L，葡萄糖脱氢酶的用量较佳为100～1000U/L。本发明的异丙醇的用量为反应体积的10％。本发明的NADP⁺的用量为催化量的，较佳地为0.02～0.1mmol/L。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20～40℃，更佳地为25～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳地以前手性羰基化合物的含量在反应溶液中低于5％为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性羟基产物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高等问题，提供了一种新的醛酮还原酶突变体及利用重组醛酮还原酶突变体或其冻干粉进行不对称还原的方法。在催化浓度高达1000g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达98％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1是醛酮还原酶基因PCR产物的琼脂凝胶电泳图。泳道M：DNA ladder；泳道1：KRED的PCR。

图2是醛酮还原酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道M：蛋白的分子量标准；泳道1：KRED的蛋白上清液

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

实施例1 随机突变

以来源于中国专利申请201410541899.8的醛酮还原酶基因BYKY-KRED(其核苷酸序列如本申请SEQ ID NO:1所示)为模板，以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为引物，对BYKY-KRED进行随机突变。随机突变PCR程序如下：10×Mutazyme II reaction buffer 5μL，40mMdNTP mix 1μL(终浓度200μM)，正向引物和反向引物各250ng/μL，Mutazyme II DNA聚合酶2.5U/μL，DNA模板1ng，ddH₂O补足50μL。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性2min；(2)95℃，变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收800～900bp区间的目标条带(见图1)，获得完整的ORF序列，经DNA测序，全长843bp。PCR产物切胶回收后，用NdeI/HindIII酶切后连接到pET21原核表达载体，并转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌，涂布到含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板培养，得到突变体文库，文库效价大于10000cfu。

实施例2 醛酮还原酶基因分离

挑选阳性菌落，加入到含有1mL LB培养基(含100μg/mL氨苄西林)的深孔96孔板培养，即得到BYKY-KRED突变体基因工程大肠杆菌，接种到100mL液体LB培养基中进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB液体培养基，培养到OD₆₀₀达0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为100μM诱导重组蛋白表达，降温至 30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗一次，菌体重悬于500μL含有1mg/mL溶菌酶和1U/mL Benzonase核酸酶的PBS裂解缓冲液(pH 7.2)中，-80℃冻融3次以破菌，10000rpm离心10min，取粗酶液上清50μL，加入一个新的96孔板，加入1mM底物、0.2mM NADPH，总体积200μL，340nm下用酶标仪检测吸光度变化。5min内吸光度变化最大的菌落即为酶活最高，提取质粒并测序，读码框序列见SEQ ID NO:3，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

实施例3 高密度发酵

将按照实施例2获得的BYKY-KRED突变体基因工程大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子培养液按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中，在20～30℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含50％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD₆₀₀达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导10～20h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。将菌体用5倍体积的PBS(pH7.2)悬浮，高压均质机破碎菌体，均质后的全菌裂解液可以作为粗酶液用于实施例4中的反应；亦可于10000rpm离心30min收集上清液，冻干机冻干得到冻干粉。

实施例4 前手性羰基底物的不对称还原反应(2％底物投料)

20g表1中的前手性羰基底物溶于200mL水，用1M的NaOH调pH为约6.0，加入酶冻干粉2g，加入500mL水，加入葡萄糖7g和葡萄糖脱氢酶500U(购自sigma)，0.1mM NADP⁺，30℃搅拌反应16小时，用1M的NaOH水溶液控制反应pH在6.5～7.5之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH 9.0，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度，纯度95.0～97.0％，摩尔收率88～92％，产物为2S,3R-异构体，e.e.值>99％，d.e.值>99％。

表1 醛酮还原酶催化前手性羰基化合物发生不对称还原反应的结果

实施例5 前手性羰基底物的不对称还原反应(2％底物投料)

20g表2中前手性羰基底物溶于200mL水，用1M的NaOH调pH为约6.0，加入200mL的粗酶液和500mL水，20mL的异丙醇，pH约为8.0，30℃搅拌反应16小时，用1M的NaOH水溶液控制反应pH在6.5～7.5之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH为约9.0，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度，纯度95.0～97.0％，摩尔收率88～92％，产物为2S，3R-异构体，e.e.值>99％，d.e.值>99％。

表2 醛酮还原酶催化前手性羰基化合物发生不对称还原反应的结果

实施例6 前手性羰基底物的不对称还原反应(100g/L投料)

500g 2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸甲酯溶于1L水，用1M的NaOH调pH为约7.0，加入全菌裂解液1L，加入3L水，加入0.4L异丙醇，0.1mM NADP⁺，30℃搅拌反应16小时，用1M NaOH控制反应pH在6.5～7.5之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH 9.0，加热50℃使蛋白质变性，加硅藻土助滤除去变性蛋白质，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得到产物，测定光学纯度，纯度95.0～97.0％，摩尔收率93％，e.e.值>99％。

实施例7 酶活测定方法

酶活的定义为每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为1U。

酶活测定方法是：在2mL反应液中，加入2mM苯乙酮为底物，0.1mMNADPH为辅因子，再加入20μL粗酶液，测定2分钟内OD₃₄₀的降低速度为ΔA₃₄₀。每mL酶液的比酶活U＝ΔA₃₄₀×1000/(6220×20)，即每mL裂解液的比酶活力。

TLC条件：EA:PE＝1:3，碘缸显色。

GC检测反应进度，GC条件为：初始温度100℃，每分钟升高10℃，终温280℃；

ee值测定：Chiralpak IA柱(4.6×150mm)，庚烷:乙醇＝92:8，40℃，1.5mL/min，254nm，Agilent1260。保留时间：2S,3R-异构体：6.5min；2R,3S-异构体：8.7min； 2R,3R-异构体：9.1min；2S,3S-异构体：9.9min。底物：11.3min和13.1min。

实施例8 产物转化为4-AA

a)将式II的(2S,3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯用10～25％的盐酸水溶液在100℃搅拌反应5小时，反应溶液冷却至室温，依次用二氯甲烷和乙酸乙酯洗涤，水溶液浓缩得到固体，将该固体用3～20倍体积的乙醇溶解，加入氢氧化钠溶液搅拌1小时，将反应液减压浓缩得到白色固体，即式A化合物。

b)将上步的式A化合物中加入等当量的三苯基膦和二吡啶基二硫化物，当量的三乙胺，加入80当量的乙腈，在80℃搅拌反应15小时，反应结束后将反应液浓缩，残余油状物柱层析分离得到式B化合物。

c)将上述的式B化合物用二氯甲烷溶解，加入2当量的三乙胺，然后加入1.5当量的二甲基叔丁基硅基氯，室温搅拌反应4小时，反应结束后，将反应液用饱和食盐水洗涤，有机相浓缩得到式C化合物。

d)将上述式C化合物溶于乙腈中，加入0.1当量的RuCl₃，在-5～0℃滴加含有1.5当量的过氧乙酸的乙酸溶液，滴加完毕搅拌反应2小时，减压蒸除溶剂，残余物用柱层析分离得到4-AA。总收率为65～70％。

4-AA的核磁数据：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ0.08(s,6H),1.0(s,9H),1.32(d,3H),2.01(s,3H),3.61(q,1H),3.74(s,1H).

Claims

1.一种分离的醛酮还原酶，其是由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的醛酮还原酶的分离的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成的。

4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET系列质粒。

7.包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。

8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌E.coli。

9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E.Coli BL21(DE3)。

10.一种制备重组醛酮还原酶的方法，包括如下的步骤：培养权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醛酮还原酶。

11.一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂，其选自权利要求7-9任一项所述的重组转化体的培养物，或通过该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。

12.根据权利要求11所述的催化剂，其特征在于：所述的制品是由所述转化体得到的提取物、或通过对提取物中的醛酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或通过固定化转化体细胞或提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品、或者通过冻干得到的冻干粉。

13.权利要求1所述的醛酮还原酶、权利要求10所述的方法制备的重组醛酮还原酶、或权利要求11所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：式I所示的2-取代氨基甲基-3-氧代丁酸酯化合物在权利要求1所述的醛酮还原酶、权利要求10所述的方法制备的重组醛酮还原酶、或权利要求11所述的催化剂催化下发生还原反应，生成式II所示的羟基化合物；

其中，

R为C1～C6烷基；

R’为氨基保护基。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：R为甲基、乙基或叔丁基。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：R’为叔丁氧羰基、苄氧羰基、三苯甲基、苯甲酰基、甲酰基或三氟乙酰基。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：式I为2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸甲酯；式II为(2S,3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯。

18.根据权利要求13-17任一项所述的应用，其特征在于所述的还原反应在含有氢氧化钠溶液的pH 5.0～8.0的水溶液中进行。

19.根据权利要求13-17任一项所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为10～1000g/L；所述的醛酮还原酶用量为催化有效量，较佳地为1～20g/L；所述的不对称还原反应在振荡或搅拌条件下进行；反应温度为20～40℃。

20.一种合成(2S,3R)-2-取代胺基甲基-3-羟基丁酸酯的方法，包括：在pH 5.0～8.0的水溶液中，在权利要求11中所述的醛酮还原酶冻干粉催化下，在NADP+、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

21.一种合成(2S,3R)-2-取代胺基甲基-3-羟基丁酸酯的方法，包括：在pH 5.0～8.0的水溶液中，在权利要求1所述的醛酮还原酶、权利要求10所述的方法制备的重组醛酮还原酶、或权利要求11所述的催化剂催化下，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。