KR101479135B1

KR101479135B1 - 아스페르기루스 플라버스 유래 솔비톨 탈수소화효소와 ｎａｄｈ 산화효소와의 커플링에 의한 ｌ－자일룰로스의 생산

Info

Publication number: KR101479135B1
Application number: KR20130042440A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 이정임
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2015-01-05
Also published as: KR20140124650A

Abstract

본 발명은 신규 솔비톨 탈수소화효소의 유전자로부터 발현되는 솔비톨 탈수소화효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 솔비톨 탈수소화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소와 커플링 반응을 통하여 L-자일룰로즈를 생산하는 방법에 관한 것이다. L-희소당을 생성하는 신규 솔비톨 탈수소화효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소와의 커플링 반응을 통하여 NAD⁺와 같은 조효소를 재생시킴으로서, 고가의 조효소를 절약하여 경제적으로 L-희소당을 생산할 수 있을 뿐만아니라 물을 생성하는 NADH 산화효소를 이용하여 커플링 함으로써 물 이외에 부산물이 생성되지 않아 정제 공정을 간소화할 수 있다.

Description

아스페르기루스 플라버스 유래 솔비톨 탈수소화효소와 ＮＡＤＨ 산화효소와의 커플링에 의한 Ｌ－자일룰로스의 생산{L-Xylulose production by coupling of NADH oxidase and sorbitol dehydrogenase from Aspergillus flavus}

본 발명은 아스페르기루스 플라버스 유래 신규 솔비톨 탈수소화효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소를 커플링시켜 조효소를 재생하고, 그를 이용하여 고효율로 L-자일룰로스를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 솔비톨 탈수소화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 솔비톨 탈수소화효소를 이용하여 물을 생성하는 NADH 산화효소와 커플링 반응을 통하여 L-자일룰로스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 특히 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-자일룰로스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제 및 항암제 등 의약품의 기본이 되는 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 다양한 L-탄수화물에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-자일룰로스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.

상기의 중요성 및 유용성에도 불구하고, 식물재의 가수분해로부터 생산된 L-자일로스는 고가 및 높은 생산 비용 등의 단점이 있다. 식물재의 가수분해 처리는 낮은 수율 및 저순도를 초래하고, 가수분해에 사용된 산과 연료는 가수분해 처리 후 이온 교환 처리에 의해 제거되어야만 한다. 식품용으로 적합한 L-자일룰로스를 수득하기 위해서는 추가 정제가 요구되며, 추가 이온교환 처리 및 결정화처리는 생산 비용의 증가를 가져온다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-아라비톨부터 L-자일룰로스를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Suzuki, T., Tran, L. H., Yoqo, M., Idota, O., Kitamoto, N., Kawai, K., Takamizawa, K.(2005) J. Biosci. Bioeng. 100(4), 493-497), 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

또한, D-자일룰로스와 달리 L-자일룰로스는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라, 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산할 수 있는 방법이 알려져 있으나 효소의 안정성이 낮고 효소활성이 낮아 사업화하는데 어려움이 있다 (Sullivan, R., Zhao, H. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 472-474). 따라서, 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하기 위한 효소적 생산방법은 효소의 안정성과 고활성이 확보되어야 한다.

일반적으로 생화학적 산화환원 반응은 비대칭 반응에서 중요할 뿐만아니라 광학적 순도를 가지는 화학물질이나 의약학에서 주목하고 있는 분야이다. 그러나 이러한 반응에는 NAD(P)⁺ 또는 NAD(P)H와 같은 고가의 조효소가 필요로 하기 때문에 산업적인 응용이 어려운 실정이다. 경제적인 측면을 고려하였을 때 조효소를 재생하여 연속적으로 사용하는 것이 필요하다. NAD(P)⁺ 및 NAD(P)H를 재생하기 위한 방법으로는 formate dehydrogenase와 glucose dehydrogenase를 이용한 방법이 잘 알려져 있으나, 이러한 반응들은 부산물이 생성되어 효소 반응 시 불순물을 생성하게 된다. 그러나 물을 생성하는 NADH 산화효소를 사용하면 부산물로 물만 생성되기 때문에 높은 경제적 가치가 있다.

본 발명에서는 자일리톨로부터 L-자일룰로스를 생산할 수 있는 신규 솔비톨 탈수소화효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소를 커플링하여 조효소를 재생시키고, 상기 시스템을 이용하여 효율적으로 L-자일룰로스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, L-자일룰로스를 높은 수율로 저렴하게 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

대한민국특허공개번호 제2000-0020687(2000.04.15) 대한민국특허공개번호 제 1020040010202 (2004.01.31)

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 고활성 솔비톨 탈수소화효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 솔비톨 탈수소화효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 솔비톨 탈수소화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 균주를 이용한 재조합 솔비톨 탈수소화효소 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소를 커플링시켜 조효소를 재생함으로써 L-자일룰로스를 생산하는 최적 조건을 제시하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 아스페르기루스로부터 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다.또한 본 발명은 L-자일룰로스의 생산방법에 있어서, 아스페르기루스 플라버스(Aspergillus flavus) 유래의 솔비톨 탈수소화효소와 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) 균주의 물을 생성하는 NADH 산화효소를 커플링하여 조효소를 재생하는 것을 특징으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 솔비톨 탈수소화효소를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 솔비톨 탈수소화효소는 아스페르기루스 플라버스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 39 kDa인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 상기 효소는 Zn² ⁺ 이온과 NAD⁺, 가장 바람직하게는 0.1 mM Zn²⁺ 그리고 2 mM NAD⁺ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 솔비톨 탈수소화효소를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 아스페르기루스 플라버스(Aspergillus flavus) 유래의 솔비톨 탈수소화효소와 물을 생성하는 NADH 산화효소를 커플링시켜 조효소를 재생함으로써 자일리톨로부터 L-자일룰로스를 고효율로 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소를 유효성분으로 포함하는 L-자일룰로스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 물을 생성하는 NADH 산화효소를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 솔비톨 탈수소화효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 솔비톨 탈수소화효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1 종의 변이가 도입된 변이 솔비톨 탈수소화효소도 본 발명에 관한 솔비톨 탈수소화효소에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 솔비톨 탈수소화효소를 코딩하는 솔비톨 탈수소화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자 서열로서는 서열번호 3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 솔비톨 탈수소화효소를 코딩하는 변이 솔비톨 탈수소화효소 유전자도 본 발명에 관한 솔비톨 탈수소화효소 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 솔비톨 탈수소화효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소화효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 솔비톨 탈수소화효소 유전자는 아스페르기루스 플라버스의 균체로부터 분리된 것이다. 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한 후, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 아스페르기루스 플라버스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 아스페르기루스 플라버스 균주의 솔비톨 탈수소화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA 라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용하여 플라스미드를 회수함으로써, 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA 단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 3에는 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소 유전자의 염기서열을 서열번호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pQE80L을 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 솔비톨 탈수소화효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 솔비톨 탈수소화효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

솔비톨 탈수소화효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명에서 고활성 솔비톨 탈수소화효소를 개발하고자 아스페르기루스 플라버스로부터 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 아스페르기루스 플라버스(Aspergillus flavus) 유래의 솔비톨 탈수소화효소가 물을 생성하는 NADH 산화효소와 커플링 반응을 통해 자일리톨로부터 높은 수율로 L-자일룰로스를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 부산물의 생성을 크게 감소시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 산업적으로 유용한 솔비톨 탈수소화효소를 제조하기 위하여 아스페기루스 플라버스의 유전자로부터 솔비톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다. 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소는 자일리톨을 기질로 하여 탈수소화반응을 촉매하여 L-자일룰로즈를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 탈수소화에 대한 특이성을 갖고 자일리톨을 L-자일룰로즈로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 솔비톨 탈수소화효소를 의미한다.

본 발명의 솔비톨 탈수소화효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 분자량이 약 39 kDa; (ⅱ) NAD⁺와 Zn² ⁺ 존재 시 효소 활성이 나타난다. 기존에 알려진 솔비톨 탈수소화효소는 낮은 L-자일룰로즈 전환율을 보이고 있다. 그러나 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소는 물을 생성하는 NADH 산화효소와 커플링 반응을 통하여 조효소를 재생하고 자일리톨을 이용하여 높은 수율로 L-자일룰로즈를 생산한다. 따라서 자일리톨에서 L-자일룰로즈를 높은 수율로 생산하는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 당 혼합물로부터 L-자이룰로즈의 생산에 유용하게 적용될 것이다.

본 발명에서 분리한 아스페르기루스 플라버스(Aspergillus flavus) 유래의 솔비톨 탈수소화효소는 물을 생성하는 NADH 산화효소와 커플링 반응에 의해 재생되는 NAD⁺를 이용하여 L-자일룰로스를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 벡터 pUC-SDH의 벡터맵으로 아스페르기루스 플라버스의 염색체에서 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝한 것이다.
도 2는 아스페르기루스 플라버스로부터 유래된 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 발현벡터의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 아스페르기루스 플라버스로부터 유래된 솔비톨 탈수소화효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다. 1; 사이즈 마커, 2; 솔비톨 탈수소화효소의 불용성 단백질, 3; 솔비톨 탈수소화효소의 수용성 단백질, 4;솔비톨 탈수소화효소.
도 4는 커플링 반응을 통해 L-자일룰로스의 생산을 위한 최적 반응시간을 나타낸 도이다.
도 5는 커플링 반응을 통해 L-자일룰로스의 생산을 위한 최적 pH를 나타낸 도이다.
도 6은 커플링 반응을 통해 L-자일룰로스의 생산을 위한 자일리톨과 조효소 NAD⁺의 최적 비율을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 솔비톨 탈수소화효소 생산균의 선별

솔비톨 탈수소화효소를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 각종 균의 배양액 10 ul를 생리식염수 10 ml에 현탁하고, 현탁액의 10 ul(1×10⁴ cfu ml^-1)를 취하여 3% malt extract가 첨가된 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)에 도말한 후, 37 ℃에서 2일간 배양 하였다. 고체 펩톤배지에서 콜로니가 형성된 후 콜로니를 취하여 자일리톨을 기질로 효소 활성을 가지는 솔비톨 탈수소화효소 활성을 갖는 균들을 선별하는 방법으로 다양한 세균으로부터 고활성의 솔비톨 탈수소화효소를 생산하는 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 균을 선별하였다.

실시예 2: 아스페르기루스 플라버스 ( ATCC 200026)로부터 신규 솔비톨 탈수소화효소 유전자의 클로닝

일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열과 크기가 어느 정도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026)의 솔비톨 탈수소화효소의 유전자도 약 1.1 kb 정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 다른 균의 이미 알려진 솔비톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026)의 솔비톨 탈수소화효소 전체 유전자를 클로닝하였다.

클로닝에는 대장균 XL1-Blue와 pUC18 벡터를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고, 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026)의 배양에는 상기 펩톤한천배지 (Malt extract peptone agar)를 사용하였다. 대장균의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar)와 3～5% 설탕, 0.3～0.5% 쇠고기 추출물, 0.9～1.1% 박토 펩톤, 1.3～1.7% 아가 조성의 아가 플레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin)을 첨가하였다. 배양 방법은 아스페르기루스의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 5일간 배양하였고, 대장균의 경우에는 37℃, 200 rpm 조건에서 16 시간 배양하였다.

대부분의 DNA는 아가로스겔(TAE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QiaXII 겔 추출장치(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(NEB)를 이용하였다. 또한 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026)의 RNA 추출은 Qiagen plant total RNA kit(QIAGEN)을 이용하였으며, cDNA 합성을 위한 역전사 효소는 Oligo-dT RT-mix(intron)를 이용하였다.

솔비톨 탈수소화효소 유전자를 클로닝하기 위하여 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 염색체를 분리하였다. 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 솔비톨 탈수소화효소 유전자의 일부분을 증폭하기 위해 다른 균에서 이미 알려진 솔비톨 탈수소화효소 염기서열을 바탕으로 비특이적 프라이머(degenerated primer), AfSDH F-5'- TGY GGM GAT GTB CAY TAC T -3' (서열번호 1)와 AfSDH R-5'- TAY CGR AAS MYR CYY TTG A -3' (서열번호 2)를 제작하였다. 이를 이용하여 연쇄중합반응에 의해 1100 bp 크기에 해당하는 솔비톨 탈수소화효소 유전자 일부를 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 염색체에서 증폭하였다.

그리고 증폭된 상기의 부분 염기서열 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인 BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, XbaI을 이용하여 아스페기루스 플라버스의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 제작하였다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다. 2.5 kb 정도의 EcoRI으로 잘린 조각과 약 5.8 kb정도의 SalI으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 염색체를 EcoRI으로 절단한 후 분리한 2.5 kb 정도 크기의 DNA 조각과 SalI으로 절단한 5.8 kb 정도의 DNA 단편들을 pUC18에 클로닝하고 이를 pUC-SDH라고 명명하였다(도 1).

pUC-SDH 라이브러리에서 앞서 만든 1 kb 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 솔비톨 탈수소화효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 솔비톨 탈수소화효소의 전체 유전자 염기서열 1,100 bp를 밝혔으며 (서열번호 3), 이는 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 균에서 밝혀진 솔비톨 탈수소화효소 유전자와 크기가 비슷하였다. 또한 아스페기루스 플라버스 솔비톨 탈수소화효소는 다른 솔비톨 탈수소화효소에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 지니고 있음을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조

상기 실시예 2에 따른 솔비톨 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 솔비톨 탈수소화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pQE80L(Novagen, 미국)의 BamHⅠ과 SacI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다 (도 2).

실시예 4: 재조합 솔비톨 탈수소화효소의 발현 및 순수 분리

상기 실시예 3에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 3).

상기 실시예 4의 방법으로 발현시킨 재조합 솔비톨 탈수소화효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA His-tag 결합 크로마토그래피(Qiagen, 독일)를 수행하여, 재조합 솔비톨 탈수소화효소를 순수 분리하였다.

실시예 5: 재조합 솔비톨 탈수소화효소의 특성 실험

상기 실시예 4에서 분리된 솔비톨 탈수소화효소의 물리 화학적 특성을 조사하였으며, 기질로서 자일리톨을 사용하였다.

실시예 5-1: 조효소

상기 실시예 4의 방법으로 정제한 솔비톨 탈수소화효소의 조효소 특이성을 확인하기 위하여, 효소 반응실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 자일리톨을 기질로 하여 NAD⁺, NADP⁺ 를 조효소로 첨가한 뒤 효소 활성을 측정하였다. 균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 2과 같이 수행하였으며, 400 mM의 자일리톨 기질 용액, 2 mM NAD⁺, 2 mM NADP⁺의 존재 하 25℃에서 효소와 기질을 반응시켰다. 표1에 나타난 바와 같이, 2 mM NAD⁺존재 시 재조합 솔비톨 탈수소화효소의 활성이 나타났으며, NADP⁺존재 시에는 그 활성이 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소는 조효소로써 NAD⁺를 사용함을 알 수 있었다.

조효소	상대적 활성 (%) (아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026) 솔비톨 탈수소화효소)
NAD⁺	100
NADP⁺	3

실시예 5-2: 금속이온의 효과

순수 정제된 솔비톨 탈수소화효소의 금속 이온이 효소 활성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다. ZnCl₂, MnCl₂, MgCl₂, BaCl₂, CaCl₂, CoCl₂, 또는 HgCl의 최적농도를 측정 후 상기 최적농도를 효소 반응액에 첨가한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 최적농도에서 다양한 금속의 솔비톨 탈수소화효소 활성에 대한 영향은 표 2에 나타내었다. 솔비톨 탈수소화효소는 Zn² ⁺ 존재 시 효소 활성이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 솔비톨 탈수소화효소의 효소 활성은 금속이온, 특히 Zn² ⁺를 필요로 함을 알 수 있었다.

금속이온	상대적 활성 (%)
None	2.5
ZnCl₂	100
MnCl₂	96
MgCl₂	56
BaCl₂	56
CaCl₂	54
CoCl₂	28
HgCl	0

실시예6: 커플링 반응을 통한 L-자일룰로스의 최적 생산 조건 실험

실시예 6-1: 커플링 반응을 통한 L-자일룰로즈 생산을 위한 최적 반응시간

상기 실시예 4에서 제조한 솔비톨 탈수소화효소를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 솔비톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 반응시간을 변화시키면서 L-자일룰로즈의 생산량을 확인하였다.

균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 4와 같이 수행하였으며, 0-24 시간까지 L-자일룰로즈의 생산량을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 반응시간 9 시간에서 L-자일룰로즈의 최고 생산량인 183 mM를 나타내었고 반응 9시간이 지난 후에는 더 이상 생산량이 증가되지 않음을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 최적 반응시간은 9 시간임을 알 수 있었다.

실시예 7-2: 커플링 반응을 통한 L-자일룰로즈 생산을 위한 최적 pH

상기 실시예 4에서 제조한 솔비톨 탈수소화효소를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 솔비톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 반응 시 pH를 변화시키면서 L-자일룰로즈의 생산량을 확인하였다.

효소 정제 방법은 실시예 4와 같이 수행하였으며, 150 mM의 기질 용액, 30℃에서, pH 7.0-9.5까지 변화시키면서 L-자일룰로즈로의 생산량을 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, pH를 8.0으로 유지하였을 때, L-자일룰로즈로의 생산량이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 최적 pH는 8.0임을 알 수 있었다.

실시예 7-3: 커플링 반응에 의한 L-자일룰로즈 생산을 위한 자일리톨과 조효소의 최적 비율

상기 실시예 4에서 제조한 솔비톨 탈수소화효소를 이용하여 L-자일룰로즈의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 솔비톨 탈수소화효소를 이용하는 본 발명의 L-자일룰로즈 생산방법에서, 반응 시 자일리톨과 조효소 NAD⁺를 변화시키면서 L-자일룰로즈의 생산량을 확인하였다.

효소 정제 방법은 실시예 4와 같이 수행하였으며, 150 mM의 기질 용액, 30℃에서, 조효소 NAD⁺의 농도를 0.1 - 3 mM까지 변화 시키면서 L-자일룰로즈의 생산량을 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 자일리톨과 조효소 NAD⁺의 비율을 60으로 유지하였을 때, L-자일룰로즈의 생산량이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 L-자일룰로즈 생산 방법에서 자일리톨과 조효소 NAD⁺의 최적비율은 60임을 알 수 있었다.실시예 7-4: 최적 조건에서의 커플링을 통한 자일리톨로부터 L-자일룰로스의 생산실험

커플링 반응기에서 최적화 한 조건에서 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) 균주의 물을 생성하는 NADH 산화효소와 아스페르기루스 플라버스 (ATCC 200026, Aspergillus flavus) 유래 솔비톨 탈수소화효소를 이용한 커플링 실험을 수행하였다. 커플링 반응액 내의 탈수소화효소 20μg, 물을 생성하는 NADH 산화효소 200μg, 자일리톨과 조효소 NAD⁺의 비율은 60, pH는 8.0 및 반응온도는 30℃로 조절하였다. 최적화 된 조건에서 실험한 결과 기질 농도별 (50-150 mM) 9시간 반응시켰을 때 97% 이상의 최대 전환율을 나타내었다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> L-Xylulose production by coupling of NADH oxidase and sorbitol dehydrogenase from Aspergillus flavus <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tgyggmgatg tbcaytact 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 taycgraasm yrcyyttga 19 <210> 3 <211> 1110 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 3 atggctacag atactcatcc cacgatcaac aaagcttccg tactccgcaa aggcggctca 60 ttttactatg aagatagaga gaaaccttca ttagaatctg atgtagatgt gatagtacga 120 gttgtcgcca ccggtctctg tggctccgat gtccattact ggcaacacgg tcgcatcggt 180 cgctatgttg ttgaaaaccc catagttctc ggccacgagt cctccggcat agttgtatcc 240 cgcggtgcca aagcatccgg cattgaagtt ggcgaccgcg tcgcgatcga gcccggaatc 300 gcctgcaaca cctgcaaccc atgtcgcagt ggtcggtata acctatgcaa ggacatgcgt 360 tttgccgcga ctcccccata tgacggaacg ctgtccacat actaccgcgt gcccgttgaa 420 tgctgctaca agttgccgga gcatatctcg ctgcgtgatg gcgcgctggt cgaaccgctc 480 ggagttgcgg tgcatggatg ccgactggca ggggatctgc aggataagtc ggtcattgtt 540 ttcggcgcgg ggccagtcgg actgctttgc tgcgctgttg cgagtgcgtt cggtgcgtcg 600 acggtcgtcg ccgtggatat cgtggctgct cgactcgagt ccgcaaggaa gtacggggct 660 acacatacat accagatgag cgcggagaag tctcccgcgc tcaacgccga tgccctagca 720 gctacagcgg gactcatgga tggcgctgat gttgtcctcg atgcttcagg tgctgagccc 780 tgtatcaact gtggaattca tgcgctggcg catggtggaa ccttcgtgca agtcggactt 840 ggaagaccga atctgtcctt acccgttgga caaatctgcg acaaagaggc tgtgttcaag 900 ggtagcttcc gatacgggcc aggagatttc aaactggctg ttggcttgct gaactcgcgg 960 cgggtccggg tcgatgggtt ggtcactcat gaattctctt tctcgcaggt cgaggaagcg 1020 ttcaagcatg ttgctggcaa ggggggtatc aagagtgtga tttacggacc ggacgtcgat 1080 gtcgaagctg caccgcaagc ttcagtatag 1110 <210> 4 <211> 369 <212> PRT <213> Aspergillus flavus <400> 4 Met Ala Thr Asp Thr His Pro Thr Ile Asn Lys Ala Ser Val Leu Arg 1 5 10 15 Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Pro Ser Leu Glu 20 25 30 Ser Asp Val Asp Val Ile Val Arg Val Val Ala Thr Gly Leu Cys Gly 35 40 45 Ser Asp Val His Tyr Trp Gln His Gly Arg Ile Gly Arg Tyr Val Val 50 55 60 Glu Asn Pro Ile Val Leu Gly His Glu Ser Ser Gly Ile Val Val Ser 65 70 75 80 Arg Gly Ala Lys Ala Ser Gly Ile Glu Val Gly Asp Arg Val Ala Ile 85 90 95 Glu Pro Gly Ile Ala Cys Asn Thr Cys Asn Pro Cys Arg Ser Gly Arg 100 105 110 Tyr Asn Leu Cys Lys Asp Met Arg Phe Ala Ala Thr Pro Pro Tyr Asp 115 120 125 Gly Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr Arg Val Pro Val Glu Cys Cys Tyr Lys 130 135 140 Leu Pro Glu His Ile Ser Leu Arg Asp Gly Ala Leu Val Glu Pro Leu 145 150 155 160 Gly Val Ala Val His Gly Cys Arg Leu Ala Gly Asp Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Ser Val Ile Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Cys Cys Ala 180 185 190 Val Ala Ser Ala Phe Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Val Asp Ile Val 195 200 205 Ala Ala Arg Leu Glu Ser Ala Arg Lys Tyr Gly Ala Thr His Thr Tyr 210 215 220 Gln Met Ser Ala Glu Lys Ser Pro Ala Leu Asn Ala Asp Ala Leu Ala 225 230 235 240 Ala Thr Ala Gly Leu Met Asp Gly Ala Asp Val Val Leu Asp Ala Ser 245 250 255 Gly Ala Glu Pro Cys Ile Asn Cys Gly Ile His Ala Leu Ala His Gly 260 265 270 Gly Thr Phe Val Gln Val Gly Leu Gly Arg Pro Asn Leu Ser Leu Pro 275 280 285 Val Gly Gln Ile Cys Asp Lys Glu Ala Val Phe Lys Gly Ser Phe Arg 290 295 300 Tyr Gly Pro Gly Asp Phe Lys Leu Ala Val Gly Leu Leu Asn Ser Arg 305 310 315 320 Arg Val Arg Val Asp Gly Leu Val Thr His Glu Phe Ser Phe Ser Gln 325 330 335 Val Glu Glu Ala Phe Lys His Val Ala Gly Lys Gly Gly Ile Lys Ser 340 345 350 Val Ile Tyr Gly Pro Asp Val Asp Val Glu Ala Ala Pro Gln Ala Ser 355 360 365 Val

Claims

서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 신규 솔비톨 탈수소화효소.
제 1항에 있어서, 상기 효소는 아스페르기루스 플라버스 (Aspergillus flavus)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소화효소.
제 1항에 있어서, 상기 효소는 Zn²⁺ 금속이온 또는 NAD⁺ 존재 시 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소화효소.
제 1항의 효소를 코딩하는 솔비톨 탈수소화효소 유전자.
제 4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 솔비톨 탈수소화효소 유전자.
제 4항 또는 제5항의 솔비톨 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 6항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 솔비톨 탈수소화효소를 제조하는 방법.
물을 생성하는 NADH 산화효소와 제 1항의 솔비톨 탈수소화효소의 커플링 반응을 통해 L-자일룰로스를 생산하는 방법.
제 1항의 솔비톨 탈수소화효소를 유효성분으로 포함하는 L-자일룰로스 생산용 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 물을 생성하는 NADH 산화효소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 L-자일룰로스 생산용 조성물.