JP4391328B2 - 新規グルコン酸脱水酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、アルドン酸から２−ケト−３−デオキシアルドン酸を効率よく生成することのできる新規なグルコン酸脱水酵素、及び該グルコン酸脱水酵素をコードする塩基配列、それを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された形質転換細胞に関する。さらに、本発明は該グルコン酸脱水酵素または該形質転換細胞を用いた２−ケト−３−デオキシアルドン酸および炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸または２−デオキシアルドースの製造方法に関する。
２−ケト−３−デオキシアルドン酸類は医薬品原料として有用な化合物である。例えば、脱炭酸により炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸類や２−デオキシアルドース類が得られる。これらは、抗生物質、抗ウイルス薬、アンチセンス医薬などの原料などとして注目されている。
一方、アルドン酸類を脱水して２−ケト−３−デオキシアルドン酸類を生成する反応を触媒する酵素の存在は知られている。例えば、Ｄ−グルコン酸を脱水して２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を合成する酵素、グルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）の起源として、クロストリジウム・パステリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）株（非特許文献１参照。）、アルカリゲネス・エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）Ｍ２５０株（非特許文献２参照。）、スルホロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）株（非特許文献３参照。）などが知られている。しかしながら、クロストリジウム・パステリアナム株由来のグルコン酸デヒドラターゼは空気酸化を受けやすく、空気の存在下で速やかに失活すると報告されている。また、アルカリゲネス・エスピーM２５０株由来のグルコン酸デヒドラターゼは、熱安定性の低い酵素であり、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、「トリス」と略記する）緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）中において０℃で７日間の保存によりグルコン酸脱水活性が５０％低下すると報告されている。したがって、これらの微生物株又は該微生物株に由来する酵素は、培養や反応の操作中に反応性が低下するなど、取扱いが困難であり、工業的製造に適しているとは言い難い。また、スルホロバス・ソルファタリカス株については、そのグルコン酸デヒドラターゼは酵素の精製がなされておらず、その理化学的性質は明らかとされていない。該微生物株そのものを用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の合成においては、生成物である２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を分解する活性が夾雑するため、収率が低いという問題点がある。
以上のように、産業上実用的なグルコン酸脱水酵素は見出されておらず、効率の良い２−ケト−３−デオキシアルドン酸類の工業的製法は確立されていなかった。
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９７４），６１，２７５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９７５），４１，９９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９８６），８，４９７
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９７４），６１，２７５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９７５），４１，９９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９８６），８，４９７
本発明の課題は、医薬品原料として有用な２−ケト−３−デオキシアルドン酸類に関して、産業上実用的な熱安定性及び保存安定性を有し、アルドン酸から対応する２−ケト−
３−デオキシアルドン酸を効率よく生成することのできる新規なグルコン酸脱水酵素、及びそれを用いた２−ケト−３−デオキシアルドン酸の製造方法を提供することである。
３−デオキシアルドン酸を効率よく生成することのできる新規なグルコン酸脱水酵素、及びそれを用いた２−ケト−３−デオキシアルドン酸の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、このグルコン酸脱水酵素の生産及びグルコン酸脱水酵素を用いた２−ケト−３−デオキシアルドン酸の製造に有用な材料としてのグルコン酸脱水酵素をコードする塩基配列、この塩基配列を組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで宿主細胞を形質転換して得られた形質転換細胞を提供することにある。
この課題に対して鋭意検討を行った結果、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０株が、高いグルコン酸脱水活性を有することを見出した。
前記従来技術におけるアルカリゲネス・エスピーＭ２５０株は、その文献中にＡＴＣＣ９２２０株と同種であると記載されているが、アルカリゲネス・エスピーＭ２５０株に由来するグルコン酸脱水酵素は前記のように不安定であると報告されているのに対して、本発明者等がアクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０菌体をＤ−グルコン酸に作用させたところ、反応温度５０℃においても安定に活性を保持し、効率良く２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成することを見出した。
そこで、該菌体から各種の精製技術を利用してグルコン酸脱水酵素を単離し、該グルコン酸脱水酵素が、５５℃において２時間保持した場合、９５％以上の活性を維持する耐熱性酵素であることを見出した。
さらには、前記アルカリゲネス・エスピーＭ２５０株に由来するグルコン酸脱水酵素が１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）中において０℃で７日間の保存によりグルコン酸脱水活性が５０％低下すると報告されているのに対して、本発明にかかるグルコン酸脱水酵素は同様の条件下で１ヶ月間安定に活性を保持する極めて保存安定性に優れた酵素であることを見出した。
また、前記従来技術におけるアルカリゲネス・エスピーＭ２５０株より精製されたグルコン酸脱水酵素のゲル濾過クロマトグラフィーでの分子量は、２７０，０００±２,５００と記載されているが、本発明のグルコン酸脱水酵素のゲル濾過クロマトグラフィーでの分子量は１８８，０００±２,５００であり分子量的にも異なることを見出した。
さらに、配列表の配列番号１に示される該グルコン酸脱水酵素のアミノ酸配列の決定に成功した。
さらに本発明者等は配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡを獲得することにより、この塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んだプラスミドによる形質転換細胞を取得し、上記のグルコン酸脱水酵素を活性型として産生させること、さらには該形質転換細胞もしくはその処理物をアルドン酸に作用させることにより、効率良く対応する２−ケト−３−デオキシアルドン酸を製造することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の各形態を含むものである。
［１］Ｄ−グルコン酸を脱水し２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成する機能を有し、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中において、５５℃、２時間保持した場合に９５％以上の活性を保持することを特徴とするグルコン酸脱水酵素。
［２］アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来する［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［３］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列で表される［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［４］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列で表される［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［５］［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［６］配列表の配列番号１記載の塩基配列で表される［１］乃至［３］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［７］［５］乃至［６］記載の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で表される、［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［８］［５］乃至［７］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子を含むプラスミド。
［９］［８］記載のプラスミドにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。
［１０］宿主細胞が、大腸菌である［９］記載の形質転換細胞。
［１１］［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素、［９］乃至［１０］記載の形質転換細胞、又はそれらの処理物の何れかを用い、水性媒体中にてアルドン酸を対応する２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する方法。
［１２］以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドン酸の製造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１乃至４の何れか一項記載のグルコン酸
脱水酵素、または９または１０記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れか
を水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸化剤を
作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸を得る
工程。
［１３］以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドースの製
造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１乃至４の何れか一項記載のグルコン酸
脱水酵素、または９または１０記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れか
を水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で還元剤を
作用させ、２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸を得る工程。
ハ）工程ロ）で得られた２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸
化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドース
を得る工程。
［１４］アルドン酸が、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクトン酸、Ｄ−フコン酸、Ｄ−キシロン酸又はＬ−アラボン酸の何れかである請求項１１乃至１３の何れか一項記載の方法。
［１］Ｄ−グルコン酸を脱水し２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成する機能を有し、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中において、５５℃、２時間保持した場合に９５％以上の活性を保持することを特徴とするグルコン酸脱水酵素。
［２］アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来する［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［３］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列で表される［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［４］配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列で表される［１］記載のグルコン酸脱水酵素。
［５］［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［６］配列表の配列番号１記載の塩基配列で表される［１］乃至［３］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［７］［５］乃至［６］記載の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列で表される、［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
［８］［５］乃至［７］記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子を含むプラスミド。
［９］［８］記載のプラスミドにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。
［１０］宿主細胞が、大腸菌である［９］記載の形質転換細胞。
［１１］［１］乃至［４］記載のグルコン酸脱水酵素、［９］乃至［１０］記載の形質転換細胞、又はそれらの処理物の何れかを用い、水性媒体中にてアルドン酸を対応する２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する方法。
［１２］以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドン酸の製造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１乃至４の何れか一項記載のグルコン酸
脱水酵素、または９または１０記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れか
を水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸化剤を
作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸を得る
工程。
［１３］以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドースの製
造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１乃至４の何れか一項記載のグルコン酸
脱水酵素、または９または１０記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れか
を水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で還元剤を
作用させ、２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸を得る工程。
ハ）工程ロ）で得られた２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸
化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドース
を得る工程。
［１４］アルドン酸が、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクトン酸、Ｄ−フコン酸、Ｄ−キシロン酸又はＬ−アラボン酸の何れかである請求項１１乃至１３の何れか一項記載の方法。
本発明により、熱安定性及び保存安定性に優れた新規グルコン酸脱水酵素が提供される。また、このグルコン酸脱水酵素をコードする塩基配列、この塩基配列を組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで形質転換された形質転換細胞が提供される。また、該グルコン酸脱水酵素又は該形質転換細胞を利用することにより、２−ケト−３−デオキシアルドン酸および炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸または２−デオキシアルドースを収率良く製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明にかかるグルコン酸脱水酵素は、Ｄ−グルコン酸に作用して２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成する反応を触媒する酵素であり、耐熱性であることを特徴とする。耐熱性に関しては、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中において、５５℃、２時間保持した場合に、保持前の酵素活性に対して９５％以上の活性を保持すると規定することができる。
本発明にかかるグルコン酸脱水酵素は、上記耐熱性に関する特性のグルコン酸脱水活性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても、もしくは公知のグルコン酸脱水酵素を遺伝子組換えにより改変したものであっても、本発明に包含されるものとする。本発明におけるグルコン酸脱水酵素には、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０株由来のものが含まれる。アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０株は、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から分譲を受けることができる。この株は、かつてはアルカリゲネス・キシロソキシダンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）またはアルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）と表記されていたが、現在はアクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）と表記されている。
本発明におけるグルコン酸脱水酵素活性は、Ｄ−グルコン酸を基質として２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成する活性として表され、次のようにして確認することができる。トリス緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｍｏｌｅ、Ｄ−グルコン酸ナトリウム４０μｍｏｌｅ、塩化マグネシウム１μｍｏｌｅ及びグルコン酸脱水酵素を含む反応液１ｍｌを、３７℃で１０分間反応させ、１Ｍ塩酸を２００μｌ添加することにより反応を停止する。反応停止後、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の生成量を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（昭和電工製）、カラム温度：４０℃、移動相：５０ｍＭ リン酸ニ水素一ナトリウム、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ）で定量する。１Ｕは１分間に１μｍｏｌｅの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の生成を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、プロテインアッセイキット（バイオラッド製）を用いた色素結合法などにより行なうことができる。
本発明におけるグルコン酸脱水酵素の一態様は、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列に１もしくは２以上、好ましくは数個のアミノ酸がグルコン酸脱水活性を維持し得る範囲で置換、欠失、修飾又は挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する。また、本発明にかかるグルコン酸脱水酵素は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有する蛋白質を含む。蛋白質のホモロジー検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想したアミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍなどを用いて、例えば、インターネット上で行なうことができる。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いたＰｏｓｉｔｉｖｅの相同性の値を示す。
本発明におけるグルコン酸脱水酵素をコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む。配列表の配列番号１に示す塩基配列は、配列表の配列番号１に示すタンパク質をコードする。ただし、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列表の配列番号１記載の塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。さらに適宜置換、欠失、修飾又は挿入又は付加を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることも可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列表の配列番号１に示す塩基配列に対して、これによりコードされるグルコン酸脱水酵素が所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失又は付加を行なって得られるものである。このホモログには、例えば、配列表の配列番号１に示す塩基配列の相補配列を有するポリペプチドをストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なうことができ、市販のシステムとしては、Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅシステム（アマルシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行なうことができる。試験すべきＤＮＡ又はＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキット添付のブロッキング試薬及び２乃至７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌTM４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調整したものを１／２０に希釈して使用することができる。ハイブリダイゼーションの温度は４０乃至８０℃、より好ましくは５０乃至７０℃の範囲であり、数時間乃至一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、さらに好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用して識別することができる。
本発明の新規なグルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。微生物からゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素によって消化した後に得られたＤＮＡを超遠心分離もしくは電気泳動などにより、その長さによって分画する。その分画試料のＤＮＡを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成し、その中からグルコン酸脱水酵素活性を持つクローンを選抜してグルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得する。そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的のグルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が判明し、ＤＮＡの塩基配列からコードされているグルコン酸脱水酵素のアミノ酸配列を推定することができる。
上記のようにして単離された本発明のグルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡを、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣ１８やｐＫＫ２２３−３、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１９、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）、ｐＳＣ１０１などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、グルコン酸脱水酵素発現プラスミドが提供される。なお、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよい。宿主生物の例として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではなく、エシェリヒア属細菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などバチルス属細菌、シュードモナス属細菌などの細菌類、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属などの酵母類、アスペルギルス属などの糸状菌類などが使用できる。
本発明においては、該プラスミドで形質転換して得られた形質転換細胞を公知の情報に基づいて培養することができ、本発明のグルコン酸脱水酵素を産生させることができる。培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことができる。培養条件は、培地の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しグルコン酸脱水酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。
また、２−ケト−３−デオキシアルドン酸の製造方法においては、グルコン酸脱水酵素を、上記のグルコン酸脱水酵素活性を有する菌体の培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離、回収して得られる形質転換細胞、該形質転換細胞の菌体処理物の形で利用することもできる。ここで言う菌体処理物とは、該形質転換細胞の抽出物や破砕物、該抽出物や破砕物のグルコン酸脱水酵素活性画分を分離・精製して得られる分離物、該形質転換細胞や該形質転換細胞の抽出物、破砕物、分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物が含まれる。
本発明に用いられるアルドン酸は、公知の製造方法によって得ることができ、市販されているものも使用できる。アルドン酸は、本発明にかかるグルコン酸脱水酵素の作用により対応する２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換されうるものであれば特に限定されないが、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクトン酸、Ｄ−フコン酸、Ｄ−キシロン酸、Ｌ−アラボン酸などが好適に使用できる。また、アルドン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩なども好適に使用できる。
アルドン酸の濃度は特に制限はないが、通常１乃至５００ｇ／ｌの範囲の濃度で用いられる。反応性や経済性を鑑みれば、好ましくは１００ｇ／ｌ以上である。
２−ケト−３−デオキシアルドン酸生成反応における反応温度は、グルコン酸脱水酵素がその活性を維持できる温度範囲であればよく、好ましくは５０乃至６０℃の範囲である。
また、反応におけるｐＨはグルコン酸脱水酵素がその活性を維持できる範囲であればよく、好ましくはｐＨ７乃至９の範囲である。反応中にｐＨが変動する場合は、適宜調整すればよい。
反応に用いる媒体としては、水あるいは各種緩衝液からなる水性媒体を用いることができる。緩衝液としては、リン酸、トリス、クエン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、３−シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸などから適宜一種又は二種以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を挙げることができる。
また、反応効率や収率をさらに向上させるために各種の添加剤を必要に応じて用いることができる。グルコン酸脱水酵素には金属イオン、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオンなどで活性化されるものもあるため、これらニ価金属を反応液に添加することもできる。
本発明による2−デオキシアルドン酸の製造方法は、上記のようにして2−ケト−3−デオキシアルドン酸を生成する工程、次いで、得られた2−ケト−3−デオキシアルドン酸に酸化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない炭素数が1減少した2−デオキシアルドン酸を生成する工程からなる。
脱炭酸反応に用いられる酸化剤としては、次亜塩素酸またはその塩や過酸化水素などが挙げられるが、中でも次亜塩素酸またはその塩が好ましい。次亜塩素酸塩としては、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸カルシウム、次亜塩素酸リチウムなどを挙げることができるが、水酸化ナトリウムのような金属水酸化物と塩素により反応系内で調整したものを使用することもできる。
脱炭酸反応に用いられる溶媒は反応が進行するものであれば特に限定されることはないが、原料を溶解するものが好ましく、水、酢酸などが挙げられる。
脱炭酸反応における反応温度は溶媒が凍らない温度以上、溶媒の沸点以下、好ましくは２０℃〜５０℃である。
脱炭酸反応における反応温度は溶媒が凍らない温度以上、溶媒の沸点以下、好ましくは２０℃〜５０℃である。
脱炭酸反応における反応液のｐＨとしては４〜６、好ましくは４．５〜６である。また、本発明においては、次亜塩素酸塩水溶液の添加と同時に、反応液のｐＨを前記ｐＨに調整するため酸を添加することが好ましい。酸としては、特に限定されることはないが、例えば塩酸、硫酸、リン酸などの鉱酸、および酢酸、蟻酸などの低級脂肪族カルボン酸などが挙げられる。
また、前工程で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸を単離精製することなく、同一反応器内で逐次反応させることにより、２−デオキシアルドン酸を製造することも可能である。
本発明による２−デオキシアルドースの製造方法は、前記のようにして２−ケト−3−デオキシアルドン酸を生成する工程、得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に還元剤を作用させ２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸を生成する工程、得られた2−ヒドロキシ−3−デオキシアルドン酸に酸化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない1炭素減炭した2−デオキシアルドースを生成する工程からなる。
還元剤としては反応が進行するものであれば特に限定されないが、水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。また、還元反応としてはパラジウムなどの金属触媒存在下での接触水素化法にて行なうこともできる。
還元反応に用いられる溶媒は反応が進行するものであれば特に限定されることはないが、原料を溶解するものが好ましく、水などが挙げられる。
還元反応における反応温度は溶媒が凍らない温度以上、溶媒の沸点以下、好ましくは０℃〜2０℃である。
脱炭酸反応は、前記の２−デオキシアルドン酸の製造方法の場合と同様の条件でおこなうことができる。
また、各工程において得られる反応生成物を単離精製することなく、同一反応器内で逐次反応させることにより、２−デオキシアルドースを製造することも可能である。
生成する２−ケト−３−デオキシアルドン酸、２−デオキシアルドン酸および２−デオキシアルドースの反応液中からの分離・回収は、金属塩として沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィーなどの、通常行われる分離・回収方法を用いることができる。
生成する２−ケト−３−デオキシアルドン酸、２−デオキシアルドン酸および２−デオキシアルドースの反応液中からの分離・回収は、金属塩として沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィーなどの、通常行われる分離・回収方法を用いることができる。
以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、反応で用いられるアルドン酸及び生成する２−ケト−３−デオキシアルドン酸は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（昭和電工製）、カラム温度：４０℃、移動相：５０ｍＭ リン酸ニ水素一ナトリウム、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ）により定量した。
［実施例１］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０の培養
Ｄ−グルコン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ポリペプトン５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ／ｌから成る液体培地（ｐＨ７．０に調整）に、あらかじめブイヨン培地に生育させたアクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０菌体を接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養し、遠心分離によって菌体を回収し、グルコン酸脱水酵素活性を有する菌体を得た。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０の培養
Ｄ−グルコン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ポリペプトン５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ／ｌから成る液体培地（ｐＨ７．０に調整）に、あらかじめブイヨン培地に生育させたアクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ９２２０菌体を接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養し、遠心分離によって菌体を回収し、グルコン酸脱水酵素活性を有する菌体を得た。
［実施例２］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０による２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の合成
実施例１に示した方法で得られたアクロモバクター・キシロソキシダンスの湿菌体１２０ｇを２００ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１ｍＭ及び塩化マグネシウム１ｍＭを含有する）に懸濁した後、超音波菌体破砕機にて破砕し、粗酵素液を得た。この粗酵素液を、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１２０．０ｇ、塩化マグネシウム１ｍｍｏｌｅを６００ｍｌの水に溶解した水溶液に加え、６Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調整した後、５０℃で反応を行なった。反応中、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加することにより、ｐＨが８．５となるように調整した。反応４０時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、９５ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０による２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の合成
実施例１に示した方法で得られたアクロモバクター・キシロソキシダンスの湿菌体１２０ｇを２００ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１ｍＭ及び塩化マグネシウム１ｍＭを含有する）に懸濁した後、超音波菌体破砕機にて破砕し、粗酵素液を得た。この粗酵素液を、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１２０．０ｇ、塩化マグネシウム１ｍｍｏｌｅを６００ｍｌの水に溶解した水溶液に加え、６Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調整した後、５０℃で反応を行なった。反応中、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加することにより、ｐＨが８．５となるように調整した。反応４０時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、９５ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
反応終了後、遠心分離により反応液から菌体由来固形物を除去し、上清を限外ろ過膜（バイオマックス−１０、ミリポア製）によりろ過した。ろ液をダウエックス１×８（２００−４００メッシュ、ＯＨ型、ダウ・ケミカル製）を用いたイオン交換カラムを通過させ、５０ｍＭ塩酸により溶出させた。溶出画分を集め、減圧濃縮した後、水酸化カリウムにより中和し、７３．８ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カリウムを含む水溶液３４６．７ｇを得た。
［実施例３］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の精製とＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例１に示した方法で得られた菌体を１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０、以下バッファーと表記する）に懸濁し、超音波菌体破砕機により破砕した後、冷却遠心機により上清を回収し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液に硫酸ストレプトマイシンを１％となるように添加し、３０分間攪拌して生じた沈殿を遠心分離により除去した後、遠心上清に硫酸アンモニウムを添加し、２０から６０％飽和画分を集めた。硫酸アンモニウム画分を限外ろ過膜（ミリポア製ウルトラフリー１５、分子量１０万カット）により脱塩濃縮した後、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、バッファーと１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを１Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを添加したバッファーで溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを０．５Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを通過させ、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを０．５Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを通過させ、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なったところ、約６０ｋＤａの位置に単一のバンドとして確認された。この活性画分について、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行ない、緩衝液を置換した。この酵素溶液を精製グルコン酸脱水酵素溶液とした。精製総括表を表１に示した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の精製とＮ末端アミノ酸配列の決定
実施例１に示した方法で得られた菌体を１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０、以下バッファーと表記する）に懸濁し、超音波菌体破砕機により破砕した後、冷却遠心機により上清を回収し、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液に硫酸ストレプトマイシンを１％となるように添加し、３０分間攪拌して生じた沈殿を遠心分離により除去した後、遠心上清に硫酸アンモニウムを添加し、２０から６０％飽和画分を集めた。硫酸アンモニウム画分を限外ろ過膜（ミリポア製ウルトラフリー１５、分子量１０万カット）により脱塩濃縮した後、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、バッファーと１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを１Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラム（アマルシャムバイオサイエンス製）を通過させ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを添加したバッファーで溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを０．５Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを通過させ、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的な濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを０．５Ｍとなるように添加した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムを通過させ、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーとバッファーとの直線的濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なったところ、約６０ｋＤａの位置に単一のバンドとして確認された。この活性画分について、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行ない、緩衝液を置換した。この酵素溶液を精製グルコン酸脱水酵素溶液とした。精製総括表を表１に示した。
この約６０ｋＤａのタンパク質について、Ｎ末端アミノ酸配列の分析を行なったところ、配列表の配列番号２に示したようにＴｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐと決定された。
［実施例４］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の熱安定性
実施例３に示した方法で得られた、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解している精製グルコン酸脱水酵素溶液を、４、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５又は７０℃で、３０分間、２時間又は１２時間放置した。また、４℃では７日間及び３０日間放置した。次いで、これらの熱処理を施した酵素溶液と、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｍｏｌｅ、Ｄ−グルコン酸ナトリウム４０μｍｏｌｅ、塩化マグネシウム１μｍｏｌｅを含む反応液１ｍｌを、３７℃で反応した。１０分後、１Ｍ塩酸を２００μｌ添加することにより反応を停止した。反応停止後、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の生成量を高速液体クロマトグラフィーで定量し、反応速度を算出した。結果は、熱処理前の酵素活性を１００とした相対活性値で表２に示した。５５℃では２時間の保持の後、１００％の活性を保持しており、また、４℃では３０日間、活性は安定に保持されていた。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の熱安定性
実施例３に示した方法で得られた、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを添加した３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解している精製グルコン酸脱水酵素溶液を、４、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５又は７０℃で、３０分間、２時間又は１２時間放置した。また、４℃では７日間及び３０日間放置した。次いで、これらの熱処理を施した酵素溶液と、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｍｏｌｅ、Ｄ−グルコン酸ナトリウム４０μｍｏｌｅ、塩化マグネシウム１μｍｏｌｅを含む反応液１ｍｌを、３７℃で反応した。１０分後、１Ｍ塩酸を２００μｌ添加することにより反応を停止した。反応停止後、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の生成量を高速液体クロマトグラフィーで定量し、反応速度を算出した。結果は、熱処理前の酵素活性を１００とした相対活性値で表２に示した。５５℃では２時間の保持の後、１００％の活性を保持しており、また、４℃では３０日間、活性は安定に保持されていた。
［実施例５］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の内部アミノ酸配列の決定
実施例３に示した方法で得られた精製グルコン酸脱水酵素溶液（タンパク質として１２４μｇ）を凍結乾燥した後、６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌに溶解し、３７℃で１５分間保温した。この溶液に、０．２Ｍジチオスレイトール及び６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０μｌを添加し、６０℃で１時間保温した。次いで、この溶液に０．４Ｍヨード酢酸及び６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０μｌを添加し、３７℃で１５分間保温した。得られた溶液を、あらかじめ８Ｍ尿素を含む０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ７．８）で平衡化しておいたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０の充填されたクイックスピンカラム（ロシュ・ダイアグノスティックス製）に供して脱塩し、４００μｌの溶液を得た。次に、この溶液に、２ｍｇ／ｍｌのＶ８プロテアーゼ（和光純薬製）溶液を１μｌ加え、３０℃で２３時間反応させた。反応液を、Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４ＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４カラム（アジレント製）を用いた逆相高速液体クロマトグフィーに供し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液との濃度勾配により、生成したペプチドを分離し、そのうちのひとつのペプチドを分取した。分取したペプチドのＮ末端アミノ酸配列の分析を行なったところ、配列表の配列番号３に示したようにＡｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇと決定された。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素の内部アミノ酸配列の決定
実施例３に示した方法で得られた精製グルコン酸脱水酵素溶液（タンパク質として１２４μｇ）を凍結乾燥した後、６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌに溶解し、３７℃で１５分間保温した。この溶液に、０．２Ｍジチオスレイトール及び６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０μｌを添加し、６０℃で１時間保温した。次いで、この溶液に０．４Ｍヨード酢酸及び６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０μｌを添加し、３７℃で１５分間保温した。得られた溶液を、あらかじめ８Ｍ尿素を含む０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液（ｐＨ７．８）で平衡化しておいたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０の充填されたクイックスピンカラム（ロシュ・ダイアグノスティックス製）に供して脱塩し、４００μｌの溶液を得た。次に、この溶液に、２ｍｇ／ｍｌのＶ８プロテアーゼ（和光純薬製）溶液を１μｌ加え、３０℃で２３時間反応させた。反応液を、Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５４ＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４カラム（アジレント製）を用いた逆相高速液体クロマトグフィーに供し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液との濃度勾配により、生成したペプチドを分離し、そのうちのひとつのペプチドを分取した。分取したペプチドのＮ末端アミノ酸配列の分析を行なったところ、配列表の配列番号３に示したようにＡｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇと決定された。
［実施例６］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０のグルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡの取得
実施例１に示した方法で得られたアクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０菌体から、「基礎生化学実験法２ 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例３にて決定したＮ末端アミノ酸配列に基づいて合成した配列表の配列番号４記載のオリゴヌクレオチド及び実施例５にて決定した内部アミノ酸配列に基づいて合成した配列表の配列番号５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ゲノムＤＮＡを代表的な制限酵素で消化し、ＰＣＲにより得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をラベル化して作製したプローブを用いたトータルサザンハイブリダイゼーションを実施した結果、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで完全消化した場合に約４ｋｂの断片に陽性シグナルが見出された。ゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで完全消化して得られるＤＮＡ断片を長さによって分画するために濃度勾配超遠心分離に供し、４ｋｂのＤＮＡ断片を主に含む画分を回収した。その画分と制限酵素ＰｓｔＩで消化して５’末端を脱リン酸化したベクターｐＵＣ１１８とをＤＮＡ連結反応に供し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５αを形質転換したものを５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ（Luria-Bertani）アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。上記の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をラベル化して作製したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行ない、陽性シグナルを示すコロニーを単離した。陽性のコロニーからプラスミドを回収し、得られたプラスミドの塩基配列の解析を行なった。塩基配列の解析はApplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製GeneticAnalyzer 310にて行った。プラスミドの塩基配列情報に基づいて二種のプライマー、配列表の配列番号６及び配列番号７記載のオリゴヌクレオチドを設計した。配列表の配列番号６記載のプライマーには制限酵素ＨｉｎｄIII部位を、配列表の配列番号７記載のプライマーには制限酵素ＸｂａＩ部位を加えた。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーによりＰＣＲを行ない、グルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡが含まれる領域を増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的とする移動度のバンドを切り出し、キアクイック（キアゲン製）によりゲルからＤＮＡを抽出した。この抽出物と制限酵素ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化して５’末端を脱リン酸化したベクターｐＭＷ１１９とをＤＮＡ連結反応に供し、グルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０のグルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡの取得
実施例１に示した方法で得られたアクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０菌体から、「基礎生化学実験法２ 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例３にて決定したＮ末端アミノ酸配列に基づいて合成した配列表の配列番号４記載のオリゴヌクレオチド及び実施例５にて決定した内部アミノ酸配列に基づいて合成した配列表の配列番号５記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ゲノムＤＮＡを代表的な制限酵素で消化し、ＰＣＲにより得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をラベル化して作製したプローブを用いたトータルサザンハイブリダイゼーションを実施した結果、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで完全消化した場合に約４ｋｂの断片に陽性シグナルが見出された。ゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで完全消化して得られるＤＮＡ断片を長さによって分画するために濃度勾配超遠心分離に供し、４ｋｂのＤＮＡ断片を主に含む画分を回収した。その画分と制限酵素ＰｓｔＩで消化して５’末端を脱リン酸化したベクターｐＵＣ１１８とをＤＮＡ連結反応に供し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５αを形質転換したものを５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ（Luria-Bertani）アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。上記の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をラベル化して作製したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行ない、陽性シグナルを示すコロニーを単離した。陽性のコロニーからプラスミドを回収し、得られたプラスミドの塩基配列の解析を行なった。塩基配列の解析はApplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製GeneticAnalyzer 310にて行った。プラスミドの塩基配列情報に基づいて二種のプライマー、配列表の配列番号６及び配列番号７記載のオリゴヌクレオチドを設計した。配列表の配列番号６記載のプライマーには制限酵素ＨｉｎｄIII部位を、配列表の配列番号７記載のプライマーには制限酵素ＸｂａＩ部位を加えた。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーによりＰＣＲを行ない、グルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡが含まれる領域を増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、目的とする移動度のバンドを切り出し、キアクイック（キアゲン製）によりゲルからＤＮＡを抽出した。この抽出物と制限酵素ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化して５’末端を脱リン酸化したベクターｐＭＷ１１９とをＤＮＡ連結反応に供し、グルコン酸脱水酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。
［実施例７］
グルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列の決定
実施例６により得られたプラスミドの物理的地図を調べたところ、図１の様であることが判明した。さらにその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定はApplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製GeneticAnalyzer 310にて行った。その結果、配列表の配列番号１に示すグルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡの全塩基配列が得られた。該グルコン酸脱水酵素遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列表の配列番号１に示した。そのＮ末端のアミノ酸配列は実施例３に示したＮ末端アミノ酸配列と一致した。
グルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列の決定
実施例６により得られたプラスミドの物理的地図を調べたところ、図１の様であることが判明した。さらにその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定はApplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製GeneticAnalyzer 310にて行った。その結果、配列表の配列番号１に示すグルコン酸脱水酵素遺伝子をコードするＤＮＡの全塩基配列が得られた。該グルコン酸脱水酵素遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列表の配列番号１に示した。そのＮ末端のアミノ酸配列は実施例３に示したＮ末端アミノ酸配列と一致した。
［実施例８］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．３ｇ、Ｄ−グルコン酸ナトリウム６．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）２．５ｍｍｏｌｅを含む反応液５０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、４．８ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．３ｇ、Ｄ−グルコン酸ナトリウム６．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）２．５ｍｍｏｌｅを含む反応液５０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、４．８ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
［実施例９］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．６ｇ、Ｄ−ガラクトン酸ナトリウム６．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）２．５ｍｍｏｌｅを含む反応液５０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−ガラクトン酸は残存せず、４．５ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトン酸が生成した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．６ｇ、Ｄ−ガラクトン酸ナトリウム６．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）２．５ｍｍｏｌｅを含む反応液５０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−ガラクトン酸は残存せず、４．５ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトン酸が生成した。
［実施例１０］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．７ｇ、Ｄ−キシロン酸アンモニウム塩１３．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）５．５ｍｍｏｌｅを含む反応液１１０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−キシロン酸は残存せず、９．９ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸が生成した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．７ｇ、Ｄ−キシロン酸アンモニウム塩１３．０ｇ、塩化マグネシウム５０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）５．５ｍｍｏｌｅを含む反応液１１０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−キシロン酸は残存せず、９．９ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸が生成した。
［実施例１１］
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−アラボン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．７ｇ、Ｌ−アラボン酸ナトリウム１．０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）５００μｍｏｌｅを含む反応液１０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＬ−アラボン酸は残存せず、０．７ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−アラボン酸が生成した。
アクロモバクター・キシロソキシダンスＡＴＣＣ９２２０由来グルコン酸脱水酵素遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−アラボン酸の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０．７ｇ、Ｌ−アラボン酸ナトリウム１．０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅ、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）５００μｍｏｌｅを含む反応液１０．０ｇを、５０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＬ−アラボン酸は残存せず、０．７ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｌ−アラボン酸が生成した。
［実施例１２］
アルドン酸としてグルコン酸ナトリウムを用いた２−デオキシリボースの合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体３.３ｇを、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１３０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液４００ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、１０６ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
アルドン酸としてグルコン酸ナトリウムを用いた２−デオキシリボースの合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体３.３ｇを、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１３０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液４００ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、１０６ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
この２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を含む反応液を攪拌しつつ１０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム６.０ｇを発泡に気をつけながら徐々に添加した。水素化ホウ素ナトリウム添加終了後、１０℃で２時間反応を継続した。反応液には、１００ｇの２−ヒドロキシ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
この２−ヒドロキシ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を含む反応液を３５％塩酸でｐＨ５.０に調整した。反応温度を３５℃に調整しながら、１３％次亜塩素酸ナトリウム水溶液３７７ｇを１時間かけて滴下し脱炭酸反応を行なった。このとき反応液のｐＨは酢酸でｐＨ５から６になるようコントロールした。次亜塩素酸ナトリウム水溶液滴下終了後、１時間反応を行なったところ、反応液には６９ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成した。Ｄ−グルコン酸ナトリウムからの収率は、８６.３％であった。
［実施例１３］
アルドン酸としてグルコン酸ナトリウムを用いた２−デオキシ−D−リボノラクトンと２−デオキシ−D−リボン酸ナトリウムとの混合物の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体３.３ｇを、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１３０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液５３０ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、１０６ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
アルドン酸としてグルコン酸ナトリウムを用いた２−デオキシ−D−リボノラクトンと２−デオキシ−D−リボン酸ナトリウムとの混合物の合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体３.３ｇを、Ｄ−グルコン酸ナトリウム１３０ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液５３０ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−グルコン酸は残存せず、１０６ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸が生成した。
この２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の水溶液を、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ９．０に調製した後、濃塩酸を用いてｐＨ５．０に調製し、水冷下、濃塩酸でｐＨ４．５〜５．０に調整しながら次亜塩素酸ナトリウム水溶液（１２．２重量％品）４７３ｇを１時間かけて滴下した。反応終了後、重曹を加えｐＨ８．０に調製し、得られた反応液を５０℃にて減圧濃縮した後、残渣にメタノールを加え、無機塩を晶析除去し、濾液を回収した。本操作を２回繰り返した後、濾液の溶媒を濃縮除去し、２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンと２−デオキシ−Ｄ−リボン酸ナトリウムとの混合物１０６ｇを得た。得られた混合物２．７ｇを水２７ｇに溶解し、陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０ｐｌｕｓ）により脱塩した後、１２ＮＨＣｌにてｐＨ０．９に調製し、室温下１２時間攪拌した。得られた反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液組成：クロロホルム/メタノール＝１０/１〜５/１）にて精製し、２−デオキシ−Ｄ−リボノラクトンシロップ２．０ｇを定量的に得た。
［実施例１４］
アルドン酸としてキシロン酸ナトリウムを用いた３，４−ジヒドロキシブタン酸ナトリウムの合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０.５ｇを、Ｄ−キシロン酸ナトリウム１３ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液５３ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−キシロン酸は残存せず、９.８ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸が生成した。
アルドン酸としてキシロン酸ナトリウムを用いた３，４−ジヒドロキシブタン酸ナトリウムの合成
実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ液体培地で、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた湿菌体０.５ｇを、Ｄ−キシロン酸ナトリウム１３ｇ、塩化マグネシウム１０μｍｏｌｅを含み、水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調製した反応液５３ｇに添加し４０℃で反応を行なった。反応２４時間後、反応液中にＤ−キシロン酸は残存せず、９.８ｇの２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸が生成した。
この２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸の水溶液を、濃塩酸を用いてｐＨ５．０に調製し、水冷下、濃塩酸でｐＨ４．５〜５．０に調整しながら次亜塩素酸ナトリウム水溶液（１２．２重量％品）５３ｇを１時間かけて滴下した。反応終了後、重曹を加えｐＨ８．０に調製し、得られた反応液を５０℃にて減圧濃縮した後、残渣にメタノールを加え、無機塩を晶析除去し、濾液を回収した。本操作を２回繰り返した後、濾液の溶媒を濃縮除去し、３，４−ジヒドロキシブタン酸ナトリウム９.４ｇを得た。
Claims (10)
- Ｄ−グルコン酸を脱水し２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸を生成する機能を有し、１ｍＭ Ｄ−グルコン酸ナトリウム及び１ｍＭ塩化マグネシウムを含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中において、５５℃、２時間保持した場合に９５％以上の活性を保持し、配列表の配列番号８記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とするグルコン酸脱水酵素。
- アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来する請求項１記載のグルコン酸脱水酵素。
- 配列表の配列番号１記載の塩基配列で表される請求項１または２に記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子。
- 請求項３に記載のグルコン酸脱水酵素をコードする遺伝子を含むプラスミド。
- 請求項４に記載のプラスミドにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換細胞。
- 宿主細胞が大腸菌である請求項５に記載の形質転換細胞。
- 請求項１または２に記載のグルコン酸脱水酵素、請求項５または６に記載の形質転換細胞、又はそれらの処理物の何れかを用い、水性媒体中にてアルドン酸を対応する２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する方法。
- 以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドン酸の製造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１または２に記載のグルコン酸脱水酵素、または請求項５または６に記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れかを水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドン酸を得る工程。 - 以下の工程からなることを特徴とする２−デオキシアルドースの製造方法。
イ）アルドン酸類またはそれらの塩に、請求項１または２に記載のグルコン酸脱水酵素、または請求項５または６に記載の形質転換細胞またはそれらの処理物の何れかを水性媒体中で作用させ、２−ケト−３−デオキシアルドン酸に変換する工程。
ロ）工程イ）で得られた２−ケト−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で還元剤を作用させ、２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸を得る工程。
ハ）工程ロ）で得られた２−ヒドロキシ−３−デオキシアルドン酸に、水性媒体中で酸化剤を作用させ脱炭酸反応を行ない、炭素数が１減少した２−デオキシアルドースを得る工程。 - アルドン酸が、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−ガラクトン酸、Ｄ−フコン酸、Ｄ−キシロン酸又はＬ−アラボン酸の何れかである請求項７乃至９の何れか一項記載の方法。
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