WO2013065901A1

WO2013065901A1 - 이중 조효소 특이성을 갖는 리비톨 탈수소화효소 및 그의 용도

Info

Publication number: WO2013065901A1
Application number: PCT/KR2012/000623
Authority: WO
Inventors: 이정걸; 문희정; 티와리마니쉬; 김태수
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-01-27
Publication date: 2013-05-10
Also published as: US20140242642A1; KR101280030B1; US9005937B2; KR20130047086A

Abstract

본 발명은 신규 리비톨 탈수소화효소, 이중의 조효소 특이성을 결정짓는 잔기 및 그를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 희소당을 생산하는 리비톨 탈수소화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 리비톨 탈수소화효소의 돌연변이체 및 상기 리비톨 탈수소화효소를 이용한 L-리불로스의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 자이모모나스 모빌리스 유래 이중의 조효소 특이성을 갖는 리비톨 탈수소화효소는 고가의 희소당 생산에 효율적으로 사용될 수 있으며, 본 리비톨 탈수소화효소에서 조효소 특이성 결정인자의 규명은 기반기술로서 모든 탈수소화효소에 적용된다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

이중 조효소 특이성을 갖는 리비를 탈수소화효소 및 그의 용도

【기술분야】

본 발명은 신규 리비를 탈수소화효소， 이중의 조효소 특이성올 결정짓는 잔 기 및 그를 이용한 L-리불로스의 제조방법에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 희소 당을 생산하는 리비를 탈수소화효소, 이를 코딩하는 핵산 분자， 상기 핵산 분자를 포함하는 백터， 상기 백터를 포함하는 형질전환체， 상기 리비를 탈수소화효소의 돌 연변이체 및 상기 리비를 탈수소화효소를 이용한 L-리불로스의 제조 방법에 관한 것이다.

【배경기술】

산화환원효소는 산업적으로 고부가가치를 지니는 정밀화학제품， 의약품, 식 품첨가물 또는 제초제 등의 합성에 많이 사용되고 있다. 이러한 산화환원효소가 활 성을 가지기 위해서는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 (환원형 및 인산염 포 함， NAD(H), NADP(H)) 등과 같은 조효소를 필요로 한다. 조효소는 저분자의 물질로 효소 반웅에 있어 필수적인 물질이며, 특히 피리딘계열의 조효소는 널리 사용되고 있다. 산화환원효소를 사용하는 반웅에서는 생성물을 만들어내기 위해 지속적인 조 효소의 공급이 필요하지만， 비용이 매우 높다는 문제점을 가지고 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여， 많은 연구자들이 조효소를 재생하기 위한 연구를 수행하 고 있으며， 또한 조효소 특이성에 관련된 잔기를 찾음으로써 효과적으로 조효소를 사용할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하고 있다.

최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크 게 증가하고 있는 가운데 특히, 몇 가지의 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이 러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드， L- 올리고리보뉴클레오사이드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성 하는 중요한 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때， 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사 용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제 및 항암제 등 의약품의 기본이 되는 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-리보오스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구 되고 있다.

상기와 같은 중요성 및 유용성에도 불구하고, D-리보오스와 달리 L-리보오스 는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라， L-리보오스를 생산할 수 있는 방법이 알려 져 있으나 상대적으로 높은 비용 ($l,000/kg)이 소요된다. 따라서， 저비용으로 상업 적으로 L-리보오스를 생산할수 있는 방법이 요구되고 있다.

L-아라비노스， D-글루코스， L-자일로즈， D-갈락토스 및 D-리보오스를 L-리보 오스 유도체로 전환하는 몇몇 화학적 방법이 보고되어 있다 (Matteson, D. S. and Peterson, M. L. (1987) J. Org. Chem. , 52(23), 5116-5121； Yamaguchi , M. and Mukaiyama, T. (1981) Chem. Lett. , 7， 1005-1008). 그러나 이런 방법들은 낮은 수 율, 고가의 출발물질에 대한 요구성, 많은 반웅 단계 및 대량 합성의 어려움 등 단 점을 가지고 있다. 또한， 상기의 방법들은 일련의 화학반웅으로서， 장시간을 요구 하며， 상대적으로 고비용의 화학물질을 필요로 하고 불필요한 부산물이 생성되며, 많은 노동력을 필요로 한다. 따라서， 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-리불로스 로부터 L-리보오스를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Shimonishi, Τ.' Izumori, K., J. (1996) J. Ferment . Bioeng. 81, 493-497) , 이와 같이 생촉매 를 사용하여 L-리보오스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있 을 것으로 기대되고 있다.

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제 1020090081435호는 '내열성 L-리 보스 아이소머라제 및 그 제조 방법'에 관한 것으로, 분자량 32,000(SDS-PAGE), 최적 온도 45 °C, 최적 ρΗ 9·0(글리신 -NaOH 완충액), 온도 안정성 pH 9.0에서 10분 간 열처리시 45 ^°C까지 안정적인 이화학적 성질을 가지는, L-리보스를 이성화하여 L-리불로스를 제조하거나， 또는 역으로， L-리불로스를 이성화하여 L-리보스를 제조 하는 작용을 가지는 내열성 L-리보스 아이소머라제. 내열성 L-리보스 아이소머라제 는 라을텔라 오르니티놀리티카 (Raoultella ornithinolyt ica) MB426(NITE BP-277) 유래의 효소이고， L-리보스， D-릭소스， D-탈로스, D-만노스， L-알로스 및 L-굴로스 로부터 선택되는 알도스에， 상기한 내열성 효소를 작용시켜， 상기 알도스를 이성화 하여 각각 대응되는 L-리불로스, 으자일를로스, D—타가토스, D-프럭토스， L-프시코 스 및 L-소르보스로부터 선택되는 케토스를 제조하거나， 또는 L-리불로스, D-자일 를로스， D-타가토스, D-프럭토스， L-프시코스 및 L-소르보스로부터 선택되는 케토 스에， 상기 L-리보스 아이소머라제를 작용시켜 상기 케토스를 이성화하여 각각 대 응되는 L-리보스， D-릭소스， D-탈로스， D-만노스， L-알로스 및 L-굴로스로부터 선 택되는 알도스를 제조하는 것을 특징으로 하는 알도스와 케토스와의 변환 방법이 기재되어 있으며,

관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제 1020100053294호는 '신규 L-아라 비노스 이성화효소 및 이를 이용한 L-리불로스의 생산방법 '에 관한 것으로， 아라 비노스 이성화효소 활성을 갖는 바실러스 리체니포미스 (Bacillus 1 icheni formis) 균주로부터 유래한 신규 L-아라비노스 이성화효소의 유전자로부터 발현되는 L-아라 비노스 이성화효소， 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현백터로 형질 전환된 균주 로부터 L—아라비노스 이성화효소를 제조하는 방법 및 상기 효소를 이용한 L-리불로 스의 생산 방법이 기재되어 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<8> 본 발명은 상기의 문제점을 해결하고， 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으 로서 본 발명의 첫 번째 목적은 자이모모나스 모빌리스로부터 유래된 리비를 탈수 소화효소의 유전자를 제공하는 것이다.

<9> 본 발명의 두 번째 목적은 상기 유전자로부터 발현된 리비를 탈수소화효소를 제공하는 것이다.

<10> 본 발명의 세 번째 목적은 상기 리비를 탈수소화효소의 유전자를 포함한 재 조합 발현백터를 제공하는 것이다.

<11> 본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질 전환 균주를 제공하는 것이다.

<12> 본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리 비를 탈수소화효소를 제공하는 것이다.

<13> 본 발명의 여섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 이중의 조효소 특이성을 결정짓는 잔기를 제시하는 것이다.

<14> 본 발명의 일곱 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 리비를로부터 L-리불로스 를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

<15> 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도 면에 의해 보다 명확하게 된다.

【기술적 해결방법]

<16> 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 리비를 탈수소화효소를 제공한다.

<17> 본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 리비를 탈수소화효소는 자이모모나스 모 빌리스에서 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다 .

<18> 또한 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서 상기 리비틀 탈수소화효소는 리비를에 특이적인 것을 특징으로 한다. <19> 본 발명의 일 구현예에 있어서， 상기 리비를 탈수소화효소는 NAD(H) 및

NADP(H)에 대한 이중 조효소 특이적인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

<20> 본 발명의 일 구체예에 있어서， 본 발명의 상기 효소의 분자량은 28 kDa이 고， 상기 효소의 최적 효소반웅 pH는 9.0-10.5인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

<2i> 또한 본 발명의 상기 효소는 Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 존재 시 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.

<22> 또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 리비틀 탈수소화효소 유전 자를 제공한다.

<23> 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나， 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 3에 기재된 서열과 적어도 85% 이 상， 바람직하게는 적어도 90% 이상， 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성올 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

<24> 본 발명은 본 발명의 상기 리비를 탈수소화효소 유전자를 포함하는 재조합 발현백터로 형질전환된 균주를 배양하여 리비를 탈수소화효소를 제조하는 방법을 제공한다.

<25> 또한 본 발명은 a)서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리비를 탈수소화효 소의 156번째 아미노산 세린이 아스파트산으로 치환된 돌연변이체;및 b)서열번호 4 의 아미노산 서열을 가지는 리비를 탈수소화효소의 51번째 아미노산 타이로신이 아 스파트산으로 치환되고， 156번째 아미노산 세린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된 리비를 탈수소화효소 돌연변이체를 제공한다.

<26> 상기 돌연변이체는 각각 서열번호 5 및 6에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

<27> 본 발명은 본 발명의 상기 리비를 탈수소화효소를 이용하여 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기를 제시함으로써， 조효소 특이성 결정인자 규명에 대한 기 반기술을 제공한다.

<28> 또한 본 발명은 본 발명의 상기 야생형 리비를 탈수소화효소 또는 그 돌연변 이체를 이용하여 리비를로부터 L-리불로스를 제조하는 방법을 제공한다.

<29> 이하， 본 발명을 설명한다.

<30> 본 발명에서는 신규 리비를 탈수소화효소 및 이중의 조효소 특이성을 결정짓 는 잔기와 리비틀로부터 L-리불로스를 생산할 수 있는 리비를 탈수소화효소에 관한 것이다. 또한 이와 같은 효소를 이용하여 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기 를 제시함으로써， 조효소 특이성 결정인자 규명에 대한 기반기술올 제공하고자 한 다.

<31> 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 서열번호 4로 표시되는 아미노산서열을 가 진 것을 특징으로 한다. 또， 서열번호 4의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산 서열을 가진 단백질이 표시하는 리비를 탈수소화효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서， 1 이상의 아미노산의 결실， 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 리비를 탈수소화효소도 본 발명에 관한 리비를 탈수소화효소에 포함된다.

<32> 또， 본 발명에는 서열번호 4의 아미노산서열을 가진 리비를 탈수소화효소를 코딩하는 리비틀 탈수소화효소 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호

3으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또， 이들 서열번호 3의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 리비를 탈수소화효소를 코딩하는 변이 리비를 탈수소화효소 유전자도 본 발명에 관한 리비를 탈수소화효소 유전자에 포함된다.

<33> 또， 본 발명에는， 상기 리비를 탈수소화효소 유전자를 함유하는 재조합백터， 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한， 본 발명에는， 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 리비를 탈수소화효소를 분리하 는 것을 특징으로 하는 리비를 탈수소화효소의 제조방법이 포함된다.

<34> 이하， 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

<35> 본 발명의 리비를 탈수소화효소 유전자는 자이모모나스 모빌리스의 균체로부 터 분리된 것이다. 먼저， 리비틀 탈수소화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체

DNA를 취득한다. 염색체 DNA의 분리방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

<36> 백터는， 숙주미생물에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지백터 또는 플 라스미드백터가 사용된다. 파지백터 또는 코스미드백터로서는， 예를 들면 pWE15, M13, EMBL3, EMBL4, FIXII, DASHII, ZAPII, gtlO, gtll, Charon4A,

<37> Charon21A 등을 들 수 있고， 플라스미드백터로서는， 예를 들면 pBR계, pUC 계, pBluescriptll계， pGEM계, pTZ계， ρΕΤ계 등을 들 수 있다. 그 외에， 대장균이 나 슈도모나스속 등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 백터 등의 각 종 셔를백터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 백터에 대해서도 상기와 마찬가지로 적당한 제한효소에 의해 절단함으로써 원하는 단편을 얻을 수 있다.

<38> 숙주미생물에의 재조합백터의 도입은， 공지의 방법에 의해 행한다 . 예를 들 면， 숙주미생물이 대장균인 경우， 염화칼슘법 (Journal of Molecular Biology, 53 권， 159페이지， 1970년)， 염화루비듐법 (Methods in Enzymology, 68권， 253페이지，

<39> 1979년)이나 일렉트로포레이션법 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권， 184페이지， 1994년) 등을 이용할 수 있다. 또, 코스미드백터나 파지백터를 이 용하는 경우의 형질도입에 대해서는 인비트로 패키징법 (Current Protocols in

<40> Molecular Biology, 1권, 5기페이지, 1994년) 등을 사용할 수 있다. 그 외 에， 접합전달에 의한 방법도 이용가능하다.

<41> 다음에, 자이모모나스 모빌리스 균주의 리비를 탈수소화효소 유전자를 함유 하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다. 리비를 탈수소화효소 유전자의 염기 서열은 서열번호 3에 기재된 것과 같은 염기서열로부터 올리고뉴클레오타이드를 설 계한다. 이들 을리고뉴클레오타이드는 예를 들면 아마샴-파머시아 바이오테크의 커 스텀 합성 서비스 등을 이용해서 합성이 가능하다.

<42> 다음에, 설계한 을리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고， 자이모모나스 모 빌리스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반웅 (이하， "PCR"이라 기재)을 행하여， 리비를 탈수소화효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편은 자이모모나스 모빌리스 균주의 리비를 탈수소화효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서， 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에， 하이브리디제이션의 스트린 전시 (stringency)제어를 용이한 것으로 하는 것이 가능하다. 상기의 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고， 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하 이브리디제이션을 행하여， 리비틀 탈수소화효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권， 603페이지， 1994년).

<43> 상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법 (Current

Protocols in Molecular Biology, 1권， 161페이지， 1994년)을 사용해서 플라스미드 를 회수함으로써， 리비를 탈수소화효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있 다. 상기 DNA단편의 염기서열의 결정은, 예를 들면 생거법 (Sanger's sequencing method) (Molecular Cloning, 2권, 133페이지， 1989년) 등에 의해서 행하는 것이 가 능하고， 염기서열 자동분석장치， 예를 들면 DNA시뭔서 377A (퍼킨 엘머) 등을 사용 해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다.

<44> 또한， 상기 방법에 의해 전체 염기서열을 결정한 후에는， 화학합성법, 염색 체 DNA를 주형으로 한 PCR법， 또는 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의 한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈 함으로써， 본 발명의 유전자를 얻는 것이 가능하다.

<45> 서열번호 3에는 본 발명의 리비를 탈수소화효소 유전자의 염기서열은 서열번 호 4에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같 이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 리비를 탈수소화효소 활성을 가지는 한， 몇 가지의， 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실， 치환, 부가 등 의 변이가 있어도 된다. 또， 본 발명의 유전자는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여， 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실， 치환, 부가 등의 변 이는， 부위돌연변이 도입방법 (Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페 이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.

<46> 본 발명의 형질전환된 미생물은， 본 발명의 재조합백터를, 상기 재조합백터 를 제작할 때에 사용한 발현백터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예 를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합백 터는， 그 자신이 숙주 속에서 자율복제가능한 동시에， 프로모터， 리비를 탈수소화 효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것 임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현백터로서는 pGEX-KG를 사용하였으나 상기 의 요건을 만족하는 발현백터이면 어느 것이나사용가능하다.

<47> 프로모터는， 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고， 예를 들면, trp프로모터 , trc프로모터， tac프로모터， lac프로모터， PL프로모터， PR 프로모터， T7프로모터， T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터 를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는， 상기한 염화칼슘법 이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

<48> 또 , 재조합백터에는， 발현의 억제 또는 증폭， 또는 유도를 위한 각종의 기능 을 가진 발현억제용의 단편이나 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대 한 내성유전자， 또는， 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

<49> 본 발명에 관한 리비를 탈수소화효소의 제조는， 예를 들면， 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합백터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하 고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 리비를 탈수소화효소 를 생성축적시켜， 배양물로부터 리비를 탈수소화효소를 취득함으로써 행하여진다.

<50> 본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은， 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

<51> 또， 프로모터가 유도성의 발현백터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하 는 경우는， 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들 면， 이소프로필—D-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 테트라사이클린， 인돌아크릴산 (IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

<52> 리비를 탈수소화효소의 취득 및 정제는， 얻게 되는 배양물중으로부터， 균체 또는 상청액을 원심 회수하여， 균체파쇄， 추출, 친화성크로마토그래피， 양이온 또 는 음이온교환크로마토그래피， 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행 할수 있다.

<53> 얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은， 통상의 방법， 예를 들면

SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

<54> 또한， 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양， 형질전환체에 의한 리 비를 탈수소화효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 리비를 탈수소화 효소의 회수는， 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

<55> 본 발명자는 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기를 제시하고자 자이모모 나스 모빌리스로부터 리비를 탈수소화효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자 를 삽입한 재조합 균주가 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기를 제시함으로써， 조효소 특이성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공할 수 있음을 확인하였다. 전 기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 리비를로부터 L-리불로스를 제조할 수 있을 뿐 만 아니라， 부산물의 생성이 없음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

<56> 본 발명은 산업적으로 유용한 리비를 탈수소화효소를 제조하기 위하여 자이 모모나스 모빌리스의 유전자로부터 리비를 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 클 로닝하고， 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 다.

<57> 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 리비를을 기질로 하여 탈수소화반응을 촉 매하여 L-리불로스를 형성하는 효소로서， 보다 바람직하게는 탈수소화반응을 통하 여 리비를로부터 L-리불로스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 리비를 탈수소화효소 를 의미한다.

<58> 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 다음의 특징을 갖는다: (i) 최적 pH가

9.0-10.5； (ii) 분자량이 약 28kDa; (iii) Mn²⁺ 또는 /⁺ 존재 시 활성의 증가;

(iv) 이중의 조효소 특이성을 가지고 있음

<59> 바람직하게는， 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 최적 pH가 9.0-10.0이고， 보다 바람직하게는 최적 p_H가 약 9.5이다.

<60> 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 10mM Mn²⁺ 또는 Co 존재 시 효소 활성이 최대이다. 본 발명에서 얻어진 자이모모나스 모빌리스 유래 리비를 탈수소화효소의 조효소 NAD에 대한 ΐ 값은 약 0.18 mM, k_cat 값은 약 4.84 sec , k^/Y^ 값은 27.3 sec^_1mM^_1이다. 또한 조효소 NADP에 대한 ΐ 값은 약 0.26 mM, k_cat 값은 약 2.79 sec^" k_cj^ 값은 10.8 sec^{' 1}이다. 다른 탈수소화효소와 다른 이중의 조효소 특이 성을 가지고 있다.

<6i> 보편적으로 산화환원효소가 활성을 가지기 위해서는 NAD(H) 또는 NADP(H) 중 하나의 조효소만을 필요로 하지만, 본 발명의 리비를 탈수소화효소는 NAD(H)와 NADP(H) 모두를 조효소로 사용할 수 있다. 따라서 이중의 조효소 특이성을 나타내 는 본 발명의 효소는 매우 특이하다. 이로부터 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기를 제시함으로 조효소 특이성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공하고자 한 다. 또한 조효소 특이성을 나타내는 여러 변이체를 이용하여 리비를로부터 특이적 으로 L—리불로스로 전환시켜， 당 흔합물로부터 L-리불로스의 생산에 유용하게 적용 될 것이다.

【유리한 효과】

<62> 본 발명의 리비를 탈수소화효소에 의해 생산된 L-리불로스는 L-리보오스 합 성의 중간체이고, L-리보오스는 L-리보뉴클레오사이드， L-올리고리보뉴클레오사이 드 및 다른 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 중요한 핵심 오탄 당이다ᅳ 여기서 유도된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성 을 보이고 있다. 또한 이중의 조효소 특이성을 갖는 몇몇 잔기를 제시함으로써 조 효소 특이성 결정인자 규명에 대한 기반기술의 제공은 모든 탈수소화효소에 적용될 것이다.

【도면의 간단한 설명】

<63> 도 1은 자이모모나스 모빌리스 균주로부터 유래된 리비를 탈수소화효소 유전 자를 포함하는 발현백터의 제조방법을 나타내는 도면이다.

<64> 도 2는 자이모모나스 모빌리스 균주로부터 유래된 리비를 탈수소화효소의

SDS-PAGE 젤 사진이다.

<65> 도 3은 자이모모나스 모빌리스 균주로부터 유래된 리비를 탈수소화효소의 pH 에 따른 반응활성을 나타낸 그래프이다.

<66> 도 4는 NADP(H)를 조효소로 사용하는 산화환원효소와의 다중 서열 정렬 분석 을 한 도면이다.

<67> 도 5는 리비를 탈수소화효소를 사용한 L-리불로스 생산시 부가물의 생성 없 이 리비를 (ribitol)로부터 L-리불로스만이 생산되는 것을 고압 액체 크로마토그래 피 (HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

<68> 도 6은 자이모모나스 모빌리스 균주로부터 얻은 균체를 이용하여 L-리불로스 의 생산량을 타나낸 도이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

<69> 이하， 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<70>

<71> 실시예 1: 리비틀 탈수소화효소의 유전자 클로닝

<72> 자이모모나스 모비리스 (ATCC 31821, 한국생명공학연구원 미생물자원센터， 한국)를 30^°C에서 배양하고 원심분리 (8000g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 전기 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고， 자이모모나스 모빌리스의 탈수소화효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 ZmRDH F-5'ΑΤΤ AGG ATC CAT GAT ACC GCG CCC CGA TCA-3' (서열번호 1) ZmRDH R-5'ΤΑΤ ACT CGA GAA AAA TCT GGG CGC ATC CGG T-3' (서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR산물 즉， 자이모모 나스 모빌리스에서 증폭된 리비를 탈수소화효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 백 터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 3).

<73>

<74> 실시예 2: 재조합 발현 백터 및 재조합 균주 제조

<75> 실시예 1에 따른 리비를 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 이용하여， 전 기 리비틀 탈수소화효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여， 발현 백터 pGEX-KG (Promega, 미국) BamH과 Xho 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.

<76>

<77> 실시예 3: 재조합 리비톨 탈수소화효소의 발현 및 순수 분리

<78> 상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 2).

<79> 상기 실시예 3의 방법으로 발현시킨 재조합 리비를 탈수소화효소를 정제하기 위하여， 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후， 초 음파처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리 하여 침 전물 (균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 이에 상기 상등액을 70^°C에서 15분 간 열처리하고， 20,000x_g에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후， 상등액을 수득한 후， 최종적으로 Glutathione Sepharose 4B 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여， 재조합 리비를 탈수소화효소를 순수 분리 하였다. 또한 Thrombin cleavage kit (Novagen, 독일)를 이용하여 순수 분리한 리 비틀 탈수소화효소로부터 GST-tag을 제거하였다 (도 2).

<80> '

<81> 실시예 4: 리비를 탈수소화효소의 특성 실험

<82> 상기 실시예 4에서 분리된 리비를 탈수소화효소의 물리 화학적 특성을 조사 하였으며, 기질로서 리비를을 사용하였다.

<83> 실시예 4—1: 최적 pH

<84> 리비를 탈수소화효소의 탈수소화 활성에 대한 최적 pH의 측정은 20mM Tris-

HCl 완충액)을 사용하여 실시하였다. 효소 활성은 시료에 NAD(H) 존재하에 리비를 존재 하에서 반웅시키면서 A340에서 흡광도의 분당 변화 수치값으로 측정하였다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 리비를 탈수소화효소의 최적 pH는 9.5이었으며, 최고 수준 활성의 80% 이상이 pH 9.0~10.5에서 유지되었다 (도 3).

<85>

<86> 실시예 4-2: 금속이온의 효과

<87> 순수 정제된 효소에 최종농도 10mM의 EDTA를 처리하여 24시간 이상 방치 후 에 20mM Tris-HCl 완층액으로 투석한 후 본 실험을 위한 효소 용액으로 사용하였 다. 최종농도 10mM의 MgCl₂, MnCl₂, CoCl₂, ZnCl₂, CaCl₂, FeS0₄₎ CuS0₄, KC1, HgCl₂, 또는 BaCl₂와 함께 효소의 잔존 활성을 측정하였다. lOmM 농도에서 다양한 금속의 리비를 탈수소화효소 활성에 대한 영향은 표 1에 나타내었다. Mn²⁺ 또는 Co²⁺ 첨가는 효소 활성을 관찰할 수 있었으나， 다른 금속 이온의 존재시 효소 활성이 나타나지 않았다.

<88> 【표 1】

<89> 심시예 4-4: 조효소에 대한 리비롤 탈수소화효소의 동역학적 매개변수

<90> 다양한 농도의 조효소 NAD(H) 또는 NADP(H) (0.1-2mM)를 이용하여 실시예 4-

1과 같이 효소 반웅을 시킨 후， 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측 정하였다 (표 2). 자이모모나스 모빌리스로부터 유래된 리비를 탈수소화효소의 조 효소 NAD(H)에 대한 ΐ 값은 0.18 mM, k_cat 값은 약 4.83 sec^"1, J Y^ 값은 27.3 sec^_1mM^_1로 결정되었다. 조효소 NADP(H)에 대한 ΐ 값은 0.26 mM, k_cat 값은 약 2/79 sec^"1, _c 값은 10.8 secᅳ¹ mM^_1로 결정되었다. 이는 현재까지 보고된 산화화원효 소 중 이중의 조효소 특이성을 가진 효소에 해당한다.

<91> 【표 2】

실시예 5: 이중의 조효소 특이성을 가진 리비를 탈수소화효소의 변이체 제작 심시예 5-1: 이중의 조효소 특이성을 가진 잔기 확인

상기 실시예 3에서 순수 분리한 리비를 탈수소화효소를 이용하여 이중의 조 효소 특이성을 가진 잔기를 탐색하기 위해 다중 서열 정렬을 통한 분석을 수행하였 다. 도 4에 나타난 바와 같이 NADP(H)를 조효소로 사용하는 산화환원효소와의 다중 서열 정렬 분석을 하였을 때， 156번 위치의 Ser 잔기가 정확하기 일치하는 것을 관 찰할 수 있었다. <95>

<96> 실시예 5-2: Ser 156의 alanine 치환과 효소활성 측정 ^'

<97> 상기 실시예 5-1에서와 같이 NADP(H)를 조효소로 사용하는 산화환원효소와의 다중 서열 정렬 분석시 일치하는 156번 위치의 Ser 잔기를 alanine으로 치환하였 다. S156A 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하 여 제작하였다. 표 3에 나타난 바와 같이 S156A 변이체는 조효소 NADP에 대한 효소 활성이 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다. 따라서 Ser 156 잔기의 변이체를 site- directed mutagenesis 방법을 통하여 확보하기로 하였다.

<98> 【표 3】

<99> 실시예 5-3: Ser 156의 변이체 제작

<ιοο> 상기 실시예 5-1에서와 같이 NADP(H)를 조효소로 사용하는 산화환원효소와의 다중 서열 정렬 분석시 일치하는 156번 위치의 Ser 잔기를 상기예 5-2에서와 같은 방법으로 다른 아미노산 잔기로 치환하였다. Ser 156의 여러 가지 아미노산 변이체 의 발현양은 wild-type과 차이가 없었으며， 이 변이체들을 이용하여 각각의 변이체 의 동역학적 매개변수를 확인하기로 하였다.

<101>

<102> 실시예 5-4: Ser 156 변이체의 동역학적 매개변수

<103> 다양한 농도의 조효소 NAD⁺, NADP⁺ (0.01-3mM)를 이용하여, 실시예 4-1 과 같이 효소를 반웅시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정 하였다. 자이모모나스 모빌리스로부터 유래된 리비를 탈수소화효소의 조효소에 대 한 동역학적 매개변수는 표 4에 나타난 바와 같다. 각각의 변이체들의 kcat/Km ratio를 wild-type과 비교하면， 156번 Ser 잔기를 치환함으로 조효소 특이성을 달 라짐을 관찰 할 수 있었다. 특히， S156D 변이체는 S156H 변이체와 비교하였을 때， 현저한 kcat/Km ratio 차이를 나타내었다. 이는 자이모모나스 모빌리스 유래 리비 를 탈수소화효소의 156번 Ser 잔기가 이중의 조효소 특이성에 관여하는 잔기임을 확인할 수 있게 한다. <104> 【표 4]

K_m, NAD Hi, NAD Km, NADP Hi, NADP

(mM) feat (s ) (s^"1 mM^"1) (mM) (s^" mM^" )

Wild-

0.18 ± 0.02 4.83 ± 0.51 27.3 0.26 ± 0.02 2.79 ± 0.15 10.8 2.36 type

SI 56 A 0.19 ± 0.02 1.93 ± 0.16 10.2 0.39 ± 0.13 1.19 ± 0.07 3.05 3.34

S156G 0.14 ± 0.01 1.04 ± 0.02 7.43 0.34 ± 0.07 0.72 ± 0.08 2.12 3.51

S156T 0.21 ± 0.06 2.85 ± 0.10 13.6 0.22 ± 0.03 1.64 ± 0.22 7.45 1.83

S156C 0.10 ± 0.02 2.00 ± 0.09 20.0 0.17 ± 0.02 2.05 ± 0.10 12.1 1.66

S156Y 0.15 ± 0.01 1.60 ± 0.13 10.7 0.23 ± 0.13 1.42 ± 0.16 6.17 1.73

S156W 0.16 ± 0.02 2.62 ± 0.11 16.4 0.21 ± 0.03 2.05 ± 0.11 9.76 1.68

S156D 0.02 ± 0.002 1.79 ± 0.01 89.5 0.30 ± 0.03 2.46 ± 0.21 8.20 10.9

S156E 0.05 ± 0.003 2.06 ± 0.07 41.2 0.35 ± 0.04 2.39 ± 0.15 6.83 6.03

S156R 0.27 ± 0.02 2.93 ± 0.22 10.9 0.05 ± 0.001 2.75 ± 0.11 55.0 0.20

S156H 0.40 ± 0.05 3.22 ± 0.14 8.05 0.03 ± 0.002 2.29 ± 0.01 76.3 0.11

S156K 0.24 ± 0.03 3.10 ± 0.15 12.9 0.09 ± 0.008 3.10 ± 0.23 34.4 0.37

<105> ^:

<i06> 실시 예 6: 이중의 조효소 특이성을 가진 리비를 탈수소화효소 변이체를 이용한 L— 리불로스 생산방법

<107> 이중의 조효소 특이성을 가진 리 비를 탈수소화효소 변이 체를 이용한 L-리불로스 생 산을 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다 . 상기 실시 예 5-3의 방법으로 제작된 변이 체들을 상기 실시 예 2의 방법으로 발현시 킨 후 , 재조합 균주 배양액을 원심분 리 (8000g, 10분)하여 균체만을 모은 후 , 증류수를 이용하여 2번 세척 한다 . 최종 cel l 0D를 측정하여 , 동일한 양의 cel l을 생산 실험에 이용하였다 . 리비를과 각각 의 재조합 효소 변이체를 20mM 글라이신 버퍼 (pH 9.5)에서 6시간 동안 온도 25^°C 에서 효소 반웅을 수행하였다 . 효소 반웅은 원심분리를 통하여 반응을 정지시 킨 다 음 도 3과 같이 리 비를 탈수소화효소를 사용한 L-리불로스 생산시 리비를로부터 L- 리불로스만을 생산되는 것을 ELSD 검출기와 코스모실 칼럼 이 장착된 고압 액체 크 로마토그래피 (HPLC)를 실시하여 분석하였다. 그 결과， wi ld-type은 8.0 g/1 농도 의 L-리불로스가 생산된 반면 S156E, S156D 변이 체는 각각 9.3 g/1 , 12.1 g/1 농도 의 L-리불로스가 생산되 었다. NAD에 대한 조효소 특이성을 갖는 변이체 S156E와 S156D의 경우 whole cel l level에서의 L-리불로스 전환율이 wi ld-type보다 높다는 것을 의미한다. 반대로 NADP에 대한 조효소 특이성을 갖는 변이체 S156H는 L—리불 로스 전환율이 wild-type보다 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 whole cell level에서의 L-리불로스 전환이 NAD에 대한 조효소 특이성을 갖는 변이체의 경우 효율적으로 진행됨을 의미하는 것이다. 따라서 본 발명의 이중의 조효소 특이 성을 갖는 리비를 탈수소화효소를 이용하여 L-리불로스를 전환하는 방법은 기존의 wild-type만을 이용하여 L-리불로스를 생산하는 방법에 비해 우수한 수율 및 고농 도로 L-리불로스의 생산이 가능하도록 한다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

서열번호 4의 아미노산서열을 가지는 리비를 탈수소화효소.

【청구항 2]

제 1항에 있어서 상기 리비를 탈수소화효소는 자이모모나스 모빌리스에서 유 래한 것을 특징으로 하는 리비를 탈수소화효소.

【청구항 3]

제 1항에 있어서 상기 리비를 탈수소화효소는 NAD(H) 및 NADP(H)에 대한 이 중 조효소 특이적인 것을 특징으로 하는 리비를 탈수소화효소.

【청구항 4】

제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 효소를 코딩하는 리비를 탈수소화효소 유전자.

【청구항 5】

제 4항에 있어서， 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 리비를 탈 수소화효소 유전자.

【청구항 6】

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리비를 탈수소화효소를 이용하여 리비 를로부터 L-리불로스를 제조하는 방법.

【청구항 7】

서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 리비를 탈수소화효소의 156번째 아미 노산 세린이 아스파트산으로 치환된 리비틀 탈수소화효소 돌연변이체.

【청구항 8】

제 7항의 돌연변이체를 이용한 리비를로부터 L-리불로스를 제조하는 방법.