KR101978464B1

KR101978464B1 - 프럭토스 4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조

Info

Publication number: KR101978464B1
Application number: KR1020160115275A
Authority: KR
Inventors: 김민정; 김정민; 최은수; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2019-05-14
Also published as: KR20180027962A

Abstract

본 발명은 D-Fructose-4-epimerase 효소 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 재조합 단백질 및 숙주세포와, 상기 효소 단백질 또는 세포를 이용하여 과당으로부터 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

프럭토스 4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조{D-Fructose-4-epimerase and production of tagatose using the same}

본 발명은 프럭토스4-에피머화 효소 (D-Fructose-4-epimerase)를 이용하여 과당으로부터 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

D-타가토스(D-tagatose)는 자연계에 드물게 존재하는 희소당의 하나로, 설탕과 거의 구분할 수 없는 유사한 단맛을 지니고 있다. 타가토스 섭취 시 거의 대사되지 않아 열량으로 사용되지 않으며 당 알콜이 가지고 있는 설사유발 특징을 가지고 있지 않아 설탕 대체제로 식품에 다양하게 사용할 수 있다. 기능적으로는 혈당억제와 인체의 기능적으로 우수한 몇몇 유산균의 증식을 도와주는 신바이오틱 기능이 있어 정장작용에 기여한다는 보고가 있으며, 비충치성, 저칼로리의 특징이 있어 일반인 뿐만 아니라 비만, 당뇨 등 대사성 질환을 가진 사람에게 유용한 감미료로 이용할 수 있다.

지금까지 알려진 타가토스 생산 방법은 갈락 토스를 원료로 한 화학적 방법(Ca(OH)₂ 촉매를 사용) 및 생물학적 방법(L-아라비노스 이성화 효소(L-arabinose isomerase; EC 5.3.1.5)사용)이 있다. 산업적으로 타가토스 생산에 이용되는 원료인 유당의 가격은 매우 유동적이고 비싸게 공급되고 있어 타가토스 시장 진입 시 높은 가격 형성하기 때문에 산업화에 걸림돌이 되고 있다.

그러므로 타가토스 산업화에 가장 큰 문제인 원료의 가격적 문제 해결 방법은 자연계에서 손 쉽게 구할 수 있는 값싼 포도당이나 과당과 같은 원료로부터 시작하는 것이다.

과당으로부터 타가토스를 생산하는 가장 핵심이 되는 효소는 4-에피머화 효소이며, 현재까지 알려진 당류 4-에피머화 효소로는 핵산 활성형인 UDP 글루코스 4-에피머화 효소와 인산 활성형인 L-리불로스 5-인산 4-에피머화 효소가 있다.

UDP 글루코스 4-에피머화 효소는 UDP 글루코스를 UDP 프락토스로 전환하는 효소로서, 과당에서 타가토스로 전환이 일어나지만 그 전환율이 극히 낮은 수준이어서, 산업적으로 적용하기에 난점이 있다. 이는 UDP 글루코스 4-에피머화 효소의 단백질 구조에서 기질 부착 부위가 넓기 때문에 단당인 과당이 기질 부착 부위에 들어 갔을 때 촉매 반응이 일어나기가 힘들기 때문이다. 분자 진화법을 이용한 효소 개량에 의해서도 약 3배 정도의 활성 증가를 보였으나 산업화에 적합한 활성까지는 미치지 못하였다.

이에 저렴하게 입수 용이한 과당을 원료로 하여 고수율로 타가토스를 생산하는 에피머화 효소를 개발할 필요가 있다.

본 발명은 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화 하여 과당에서 타가토스의 전환이 가능한 유전자를 스크리닝한 후, D-과당 4 에피머화 효소를 개발 함으로써, 과당으로부터 타가토스 제조를 가능하게 한다.

본 발명의 일 예는 과당의 4-에피머화 효소 단백질을 제공한다. 상기 효소 단백질은 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 갖는다.

다른 예는 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 과당의 4 번째 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스를 생산하는 활성을 보유한 효소인 신규한 D-과당 4-에피머화 효소를 개발함으로써, 보편화된 원료인 과당을 사용하여 제조원가를 절감시킴으로써 경제적이면서도 높은 수율의 타가토스의 제조를 가능하게 한다.

따라서, 본 발명에서는 가격 변동이 큰 유당이 아닌, 보편화된 원료인 과당을 사용하여 제조원가를 절감시킴으로 써 경제적이면서도 높은 수율의 타가토스 제조방법을 제공할 수 있다.

보편적으로 과당을 포도당 또는 설탕으로부터 공업적으로 제조 가능함은 매우 널리 알려져 있는 사실이므로, 본 발명에서 제시하는 공정의 원료는 과당 이외에 보다 저렴한 생산을 위하여 과당을 전체에 혹은 일부 함유한 형태로 사용하는 경우까지 확장하여 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 타가토스를 전분질, 원당 또는 설탕으로부터 효소적 전환을 통하여 생산하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 활성을 보유한 효소를 개발함으로써, 저렴한 원료인 과당에서 타가토스를 생산을 가능하게 한다. 본 발명은 과당을 이용하여 타가토스를 제조하여 오늘날 중요한 식품 소재로 각광받고 있는 타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

구체적 일 예에서, 본 발명에 따른 프럭토스 4-에피머화 효소는 터모토가 하이포지아 (Thermotoga hypogea)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 효소 단백질은 과당의 4 번째 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스를 생산하는 활성을 보유한 효소일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 하기 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 효소 단백질:

(a) 단량체의 분자량이 50 내지 60 kDa,

(b) 최적온도가 50 내지 90℃,

(c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0. 및

(d) 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 또는 니켈(Ni)이온에 의한 효소 활성 증가.

상기 효소 단백질은 써모토가 하이포지아 (Thermotoga hypogea) 또는 이의 변이주로부터 유래된 것으로서 야생형 효소 또는 변이형 효소일 수 있다. 예를 들면 상기 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 합성하여 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 효소 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 효소 단백질은, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당을 타가토스로 전환하는 기능을 유지하는 범위에서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산으로 치환되거나, 삽입 또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 효소 단백질은, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당을 타가토스로 전환하는 기능을 유지하면서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예에서, 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화 하는 핵산분자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 암호화되는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 2 또는 서열번호 3의뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자이다. 서열번호 2는 야생형 써모토가 하이포지아 (Thermotoga hypogea)의 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고, 서열번호 3은 서열번호 1의 효소 단백질을 암호화하는 대장균에 최적화된 뉴클레오타이드 서열이다.

상기 핵산 분자의 폴리뉴클레오타이드는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 본 명세서에서 "실질적인 동일성"이라 함은, 상기한 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 98% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 갖는 것을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로 이용되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 추가 일예는, 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

상기 재조합 벡터란 목적한 폴리뉴클레오타이드와, 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현하는데 필요한 발현 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 발현 조절 요소는 전사 및 번역 종결인자(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및/또는 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및/또는 온도 민감성 요소(temperature sensitive element) 등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론, T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, pL 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 벡터 시스템은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421).

상기 벡터에는, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예컨대, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC, pKK 벡터 등을 사용할 수 있으나, 상기 효소 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하고, 도 1의 개열지도에 나타난 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주는 숙주 세포를 상기한 재조합 벡터로 형질전환시킨 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 포함하고, 이를 발현할 수 있는 세포이다. 본 명세서에서 "형질전환"은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA 사슬 조각 또는 플라스미드가 세포에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합하여, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다.

상기 재조합 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물(숙주 세포)로는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 E.coli, 바실러스속 균주, 코리네박테리움속 균주, 또는 살모넬라 속 균주, 세라티아속 균주 또는 슈도모나스속 균주일 수 있다.

구체적인 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli ER2566, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 미생물일 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법으로, 특별한 제한은 없으며, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 바이러스 벡터를 사용한 감염 등과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

다른 예는 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다. 상기 타가토스 생산용 조성물은 과당을 타가토스로 전환하는 활성, 보다 구체적으로 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 균주의 배양물은 세포를 포함하는 배양물 또는 세포를 포함하지 않는(cell-free) 배양물, 또는 상기 배양물의 농축물 또는 건조물일 수 있다. 상기 재조합 균주의 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다.

또한, 상기 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 타가토스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함함으로써 타가토스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 타가토스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 및 니켈(Ni)이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온의 함량은 0.1mM 내지 5mM, 0.1 내지 2mM, 0.5 내지 1.5mM, 또는 약 1mM일 수 있다. 상기 범위는 효소 단백질의 활성 증가 효과를 고려하여 설정한 것이다.

다른 예는 상기 타가토스 생산용 조성물을 사용하는 타가토스의 생산 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 생산 방법은 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하며, 반응 단계 이전에 상기 타가토스 생산용 조성물을 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 사용하는 타가토스의 생산 방법에 있어서, 효소 단백질, 재조합 벡터 및 균주 등은 상술한 바와 같다.

구체적으로, 보다 구체적으로, 상기 생산 방법은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질을 준비하는 단계; 및 상기 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현예에서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 생산 방법은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양단계를 거쳐 얻어진 배양물 (세포 포함 또는 무세포) 또는 상기 배양물로부터 회수된 균체 또는 균체 파쇄물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 세포의 종류 및/또는 특성에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배양 방법, 배양 배지 및/또는 배양조건하에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예컨대, 회분식, 연속식, 유가식 배양 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 예컨대, 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지, TB 배지 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양 조건은 일반적으로 해당 숙주 세포 (예컨대, 대장균)를 배양하는데 적합한 조건일 수 있다.

예컨대, 상기 배양은 전 배양액(예컨대, 3ml LB-앰피실린 액체배지가 들어있는 15ml test tube에 한 개의 colony를 접종하여 37℃, 250rpm에서 16시간을 배양한 액)을 본 배양액(예컨대, 50ml LB-앰피실린 액체배지가 들어있는 250ml 플라스크)의 1%(v/v)로 접종 시킨 후, 35℃ 내지 37℃ 및 150 내지 250rpm 조건 하에서 배양하여 O.D600nm에서 0.5 내지 0.8까지 배양 후, 유도제를 첨가하고 16℃ 내지 30℃ 및 150 내지 250rpm 조건 하에서 추가로 배양하여, 단백질 과발현을 유도할 수 있다. 상기 유도제는 단백질의 발현을 유도할 수 있는 물질로, 예컨대 IPTG (Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside), 유당(lactose) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유도제의 첨가량은 0.01 내지 1mM, 0.05 내지 0.5 mM, 또는 약 0.1mM 정도로 할 수 있다.

상기 균체는 상기 재조합 균주의 배양물에 대하여 원심분리, 및/또는 여과 등을 수행하여 수득될 수 있다.

또한, 상기 균체의 파쇄물은 상기 회수된 균체를 균질화시키고 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계, 상기 상등액을 분획화하는 단계, 및/또는 상기 상등액 또는 분획물에 대하여 크로마토그래피 등을 수행하여 효소 단백질을 분리 및/또는 정제하는 단계에 의하여 수득될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 회수된 균체를 소정의 완충용액 (예컨대, 약 10 mM 농도의 이미다졸이 포함된 50mM 인산 완충용액)으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리한 후, 상등액만 취하여 적절한 컬럼 (예컨대, 니켈-NTA 컬럼 (Qiagen))에서 흡착시킨 후, 약 20mM 농도의 이미다졸을 사용하여 약하게 흡착한 대장균 유래 단백질을 씻어낸 뒤 약 200mM 농도의 이미다졸을 사용하여 목적하는 효소 단백질을 회수할 수 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계는 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시킴으로써 과당을 타가토스로 전환하여 과당으로부터 타가토스를 생산할 수 있다.

상기 과당과 반응시키는 단계는 바람직하게는 상기 효소 단백질의 활성화 조건하에 이루어질 수 있다. 예컨대, 상기 과당과 반응시키는 단계는 pH 6 내지 9, pH 6.5 내지 8.5, 또는 약 pH 7.0에서 수행될 수 있으며, 또한 50 내지 90?, 55 내지 85?의 온도 조건하에 수행되는 것일 수 있다. 또한 상기 재조합 균주의 배양물로부터 회수된 균체를 사용할 경우, 상기 과당과 반응시키는 단계 전에, 상기 회수된 균체를 예컨대, 0.1 내지 1.5%(w/v) 또는 0.5 내지 1%(w/v), 예컨대 0.85%(w/v)의 NaCl 등을 사용하여 2회 이상 세척하여 사용할 수 있다. 상기 과당은 상기 효소 단백질의 기질로서, 효율적인 반응을 위하여, 상기 반응 단계에서의 과당의 사용량은 전체 반응 혼합물 기준으로 1 내지 60 %(w/v), 예를 들면 5 내지 60 %(w/v) 범위일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않고 오히려 효소 반응의 저해가 일어날 수 있으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

효율적인 타가토스 생산을 위하여, 상기 과당과 반응시키는 단계에 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.005mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.05mg/ml 내지 0.1mg/ml일 수 있다. 효소 단백질의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 0.1 내지 100mg(dcw)/ml, 0.1 내지 50mg(dcw)/ml, 0.1 내지 10mg(dcw)/ml, 1 내지 100mg(dcw)/ml, 1 내지 50mg(dcw)/ml, 1 내지 10mg(dcw)/ml, 2 내지 100 mg(dcw)/ml, 2 내지 50mg(dcw)/ml, 2 내지 10 mg(dcw)/ml, 3 내지 100mg(dcw)/ml 3 내지 50mg(dcw)/ml, 또는 내지 3 내지 10mg(dcw)/ml 일 수 있다.

또한, 상기 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 타가토스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 따라서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 타가토스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 및 니켈(Ni) 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이다.

상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 내지 5mM, 0.1 내지 2mM, 0.5 내지 1.5mM, 또는 약 1mM 범위로 할 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우 효소 단백질의 활성 증가 효과를 고려하여 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 상기 타가토스 생산용 조성물과 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온은 배양물에 첨가되거나, 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수 있다.

또한, 상기 타가토스 생산 방법은 상기 과당과 반응시키는 단계 이후에 생산된(과당으로부터 전환된) 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계는 특별한 제한이 없으며 당업계에 공지된 모든 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계는 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, 상기 기질로 사용되는 과당은, 경제적 측면으로 고려하여, 전환효소에 의해 분해된 설탕에서 얻어지거나 또는 액상과당으로부터 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 활성을 보유한 효소를 개발함으로써, 저렴한 원료인 과당에서 타가토스를 생산을 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 D-프럭토스 4-에피머화 효소 암호화 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET-THTE의 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 생산된 D-프럭토스 4-에피머화 효소를 SDS-PAGE로 전기 영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 금속이온에 따른 D-프럭토스 4-에피머화 효소의 상대적 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 과당 및 타가토스의 스탠다드 분석결과와 THTE 변이 효소의 반응을 HPLC 분석한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. D- 프럭토스 4- 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주 제조

발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 터모토가 하이포지아 (Thermotoga hypogea)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.

합성된 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET-THTE를 제조하였다 (도 1). 상기 재조합 벡터를 heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.

형질 전환된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종, 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 목적 효소의 과 발현을 유도하였다. 이때 과 발현 유도시점부터 배양조건은 16℃, 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

이후 원심분리기 4000rpm에서 20분간 원심 분리하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.

실시예 2. D- 프럭토스 4- 에피머화 효소 정제 및 특성 확인

2-1. D-Fructose 4- 에피머화 효소의 정제

상기 실시예 1에서 회수된 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni- NTA컬럼(Ni-NTA Superflow. Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM imidazol과 250 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려 주었다. 마지막 과정인 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 250 mM imidazol을 흘려 줌으로써 목적 단백질을 정제하였다.

용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM Potassium phosphate pH8.0)으로 전환한 다음 실험에 사용하였다. 또한 부분 정제된 D-프럭토스 4-에피머화 효소는 SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 56.1 kDa인 것을 확인하였다 (도 2). 균주를 1L 배양시, 약 35mg의 정제된 효소를 얻을 수 있었으며, SDS-PAGE상에서 볼 수 있는 순도는 약 95% 이상이다.

2-2. D-Fructose 4- 에피머화 효소 활성 확인

실시예 2-1에서 얻어진 효소의 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 정제한 효소 0.1mg/ml, 1중량%의 과당, 0.01 mM NiSO₄ 또는 CoCl₂염 완충용액 (pH 8.0)에 넣어 반응온도 60℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 효소에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 계산하면, 과당 농도 1 중량%에 대해서 전환율 4.4%를 얻었다. 과당과 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였으며, 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이며, 컬럼 온도를 80 ℃로 하였고, 이동상으로 물을 0.5 ml/분으로 흘려주었다.

지금까지 알려진 D-Furctose 4-epimerase 효소는 기질 농도가 높을수록 전환율이 낮아지는 경향을 보이며, 최대 전환율을 확인하기 위하여 효소양은 0.1mg/ml-0.5mg/ml까지 시험을 수행하였으며, 효소 농도에 관계없이 전환율은 final 약 4.4%를 나타냈다.

2-3. D-Fructose 4- 에피머화 효소 활성 확인

실시예 2-1에서 얻어진 효소에 대해서 역시 금속이온이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다.

상기 실시예 2-1에서 정제된 효소에 CuCl₂, MnCl₂, CaCl₂, ZnSO₄, NiSO₄, CoCl₂를 각각 1 mM씩 처리하고, 아무것도 처리하지 않은 효소(대조군: Non)와 활성을 비교하여 도 3에 나타냈다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 효소는 특히 니켈이온과 코발트 이온 첨가에 의하여 활성이 대조군 대비 10 배 이상 현저히 증가하는 것으로 나타나 기존의 금속 이온 요구성이 있음을 알 수 있었다. 그 실험결과를 도 3에 나타냈으며, 도 3의 상대활성도(%)는 금속을 넣지 않는 경우의 전환율 100을 기준으로 금속을 넣은 경우의 전환율을 퍼센트로 표시한 것이다.

실시예 3. 변이 D- 프럭토스 4- 에피머화 효소 제작

프럭토스 4-에피머화 효소의 활성이 향상된 개량주를 제작하기 위하여 T.hypogea 유래 유전자를 주형으로 하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. 구체적으로, ClonTech사의 Diversify random mutagenesis kit을 이용하여 T.hypogea 에 대해 무작위 돌연변이를 유도하였고, 아래 표 1 조건의 PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자를 pET-21a 벡터에 삽입하여 또 다른 재조합 벡터를 제작한 후, E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 이후 과정은 실시예 1 및 실시예 2와 동일하게 진행되었다. 상기 변이주 라이브러리로부터 활성이 증가한 변이주의 염기서열을 분석 확인하였다.

상기 변이주에서 얻은 변이형 프럭토스 4-에피머화 효소의 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타내고, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5으로 나타내었다.

실시예 4. 변이 효소의 활성 확인

실시예 3에서 얻어진 변이 효소의 활성을 확인하기 위하여, 1중량% 과당, 0.01 mM NiSO₄ 또는 CoSO₄염 완충용액 (pH 8.0)에 넣어 반응온도 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 효소에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 하기의 표 2 에 나타내었다. 과당과 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였으며, 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이며, 컬럼 온도를 80℃로 하였고, 이동상으로 물을 0.5 ml/분으로 흘려주었다. 개량주의 효소는 개량하기 전보다 2배 이상 높은 전환율을 나타내었다(도 4).

정제효소를 사용하여, 1중량% 과당, 0.01 mM NiSO₄ 또는 CoSO₄염 완충용액 (pH 8.0)에 넣어 반응온도 60 ℃에서 3시간 동안 반응한 경우 타가토스 전환율로 야생형 효소(서열번호 1의 아미노산 서열)는 4.4% 전환율이고, 변이 효소(서열번호 4의 아미노산 서열)는 10.5%로서 효소의 전환율을 현저히 증가하였다.

<110> SAMYANG COPORATION <120> Fructose-4-epimerase and production of tagatose using the same <130> DPP20163083KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 490 <212> PRT <213> Thermotoga hypogea <400> 1 Met Ser Asn Leu Phe Ala Glu Phe Gln His Leu Thr Arg Gly Lys Phe 1 5 10 15 Val Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Lys Ser Thr Asp Ala Thr Phe Phe 20 25 30 Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Val Ile Gly Lys Lys 35 40 45 Gly Ile Cys Glu Leu Phe Glu Gly Gln Lys Ile Gly Glu Ile Asp Arg 50 55 60 Gln Asp Val Val Leu Cys Ala Lys Asn Asp Arg Asn Cys Gln Ser Leu 65 70 75 80 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Lys Pro Gln Ile Cys Asn Ala Lys Leu 85 90 95 Ser Phe Gly Phe Gly Asp Arg Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala His Ala 100 105 110 Gln Cys Val Gln Lys Glu Lys Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser 115 120 125 Val Arg Glu Ile Ser Arg Thr Glu Arg Asn Trp Leu Asp Val Leu His 130 135 140 Ser Ala Val Trp Gly Val Phe Glu Ser Gly Tyr Asp Gly Pro Phe Gly 145 150 155 160 Ala Asp Ala Asp His Val Lys Lys Ile Glu Asp Leu Glu Ser Ala Ala 165 170 175 Arg Ala Gly Tyr Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asp His Val Lys 180 185 190 Asp Pro Ala Lys Phe Asp Lys Arg Glu Leu Val Arg Phe Tyr Glu Glu 195 200 205 His Pro Met Arg Arg Thr Leu Glu Met Lys Tyr Ile Gly Lys Ser Phe 210 215 220 Thr Val Leu Gly Glu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Glu Asn Phe Ala Glu 225 230 235 240 Val Phe Val Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Glu His Val Glu Lys Cys Tyr 245 250 255 Arg Ala Leu Arg Ala Val Cys Lys Thr Ser Phe Asp Leu Glu Val Ser 260 265 270 Ile Asp Glu Thr Ser Val Pro Thr Thr Ser Leu Ala His Ile Phe Phe 275 280 285 Val Gln Glu Leu Val Arg Arg Gly Val Glu Phe Arg Thr Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Phe Pro Gly Glu Trp Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Val Gly Asp Ile 305 310 315 320 Asp Leu Phe Ser Glu Asn Leu Asp Lys His Val Ala Ile Val Lys Met 325 330 335 Phe Thr Gly Tyr Arg Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser 340 345 350 Val Tyr Pro Ile Leu Ala Glu Lys Thr Asp Arg Thr Ile His Val Lys 355 360 365 Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Val Val Ala Lys Phe 370 375 380 Ala Pro Asp Leu Tyr Arg Gln Ile His Lys Tyr Ala Leu Ser Arg Phe 385 390 395 400 Asp Gln Asp Lys Ala Ser Tyr His Val Thr Thr Glu Leu Ser Lys Ile 405 410 415 Pro Asp Val Asp Lys Leu Glu Asp Ser Glu Leu Pro Ser Leu Leu Asp 420 425 430 Gln Pro Asp Ser Arg Gln Leu Ile His Ile Thr Tyr Gly Ser Val Leu 435 440 445 Thr Ala Lys Lys Glu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Asp Arg Ile Met Arg 450 455 460 Val Leu Phe Glu His Glu Ala Glu His Tyr Asp Phe Leu Lys Lys His 465 470 475 480 Leu Gly Lys His Ile Gln Leu Leu Gly Val 485 490 <210> 2 <211> 1473 <212> DNA <213> Thermotoga hypogea <400> 2 atgtccaatc tgtttgccga gtttcaacac ctcacaaggg gcaaattcgt cccttacgcc 60 acctcgctga gaaaaagcac ggatgccacg ttctttctcg tacgcgacga gctcgacaag 120 tatctgatcg tgatcggcaa gaaggggata tgcgaactgt tcgaaggtca aaagattggt 180 gagatcgatc gacaggacgt tgtcctgtgt gccaaaaacg atagaaactg tcaaagtctc 240 atgagtctgt ttccctcact aaaaccacag atttgcaacg cgaaactttc gtttggtttt 300 ggagacaggc ttggtgtggc tacggccgcg cacgctcagt gtgtgcaaaa agaaaaactg 360 ttccccattt ttgcccagca gtcagttcgg gagatatcac gaacggagag aaactggctc 420 gacgtgttac acagcgccgt atggggtgtg ttcgagagtg gctacgacgg gcccttcgga 480 gcggacgcgg accacgtgaa gaagattgaa gatctggaga gcgcggcacg cgcgggctac 540 accatgttca cgatcgaccc ttcggaccat gtcaaggatc ctgcaaaatt tgacaagaga 600 gaactcgtca ggttctacga agagcatcca atgagacgca cactcgaaat gaaatacatc 660 ggaaagagct tcacggtcct tggagaaaaa ctcacgttcg acgaagaaaa ctttgcggag 720 gtgttcgtga cctacatcga tgcgatcgaa catgtggaga aatgctacag ggcactgcga 780 gcagtgtgca agacgagctt cgatctggag gtctccatag acgagacgtc tgtaccaaca 840 acgtcccttg cacacatctt cttcgtgcag gaactcgtga ggcgcggtgt ggaattccga 900 accttagcgc tgaggttccc gggagagtgg cagaaaggaa ttgactacgt gggtgacatc 960 gatctcttct ctgagaacct tgacaagcac gtcgctatcg tcaaaatgtt cacaggttac 1020 agattgtctc tgcactccgg tagtgacaag ttcagcgtgt accctatctt agctgagaaa 1080 acagatagaa ccatccacgt caagacagct ggaacgagct atctggaagc catcagggtc 1140 gttgcgaagt tcgctccgga tctgtacaga cagatccata aatacgctct ttcaagattt 1200 gaccaagaca aagcttccta ccacgtcacg acggagcttt cgaagatccc agacgttgat 1260 aaacttgaag attcagagct tccgtcctta ctggatcaac ctgacagtag acaattgata 1320 cacataactt acggttccgt tctgactgcg aaaaaagagg gtagatctct cttcaaagat 1380 cgtataatga gagtgttgtt cgaacacgaa gctgagcact acgattttct caaaaagcac 1440 cttggtaaac atatccagct tttgggtgtt tga 1473 <210> 3 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized nucleotide sequence of fructose-4-epimerase <400> 3 atgtctaacc tgttcgcgga attccagcac ctgacccgtg gtaaattcgt tccgtacgcg 60 acctctctgc gtaaatctac cgacgcgacc ttcttcctgg ttcgtgacga actggacaaa 120 tacctgatcg ttatcggtaa aaaaggtatc tgcgaactgt tcgaaggtca gaaaatcggt 180 gaaatcgacc gtcaggacgt tgttctgtgc gcgaaaaacg accgtaactg ccagtctctg 240 atgtctctgt tcccgtctct gaaaccgcag atctgcaacg cgaaactgtc tttcggtttc 300 ggtgaccgtc tgggtgttgc gaccgcggcg cacgcgcagt gcgttcagaa agaaaaactg 360 ttcccgatct tcgcgcagca gtctgttcgt gaaatctctc gtaccgaacg taactggctg 420 gacgttctgc actctgcggt ttggggtgtt ttcgaatctg gttacgacgg tccgttcggt 480 gcggacgcgg accacgttaa aaaaatcgaa gacctggaat ctgcggcgcg tgcgggttac 540 accatgttca ccatcgaccc gtctgaccac gttaaagacc cggcgaaatt cgacaaacgt 600 gaactggttc gtttctacga agaacacccg atgcgtcgta ccctggaaat gaaatacatc 660 ggtaaatctt tcaccgttct gggtgaaaaa ctgaccttcg acgaagaaaa cttcgcggaa 720 gttttcgtta cctacatcga cgcgatcgaa cacgttgaaa aatgctaccg tgcgctgcgt 780 gcggtttgca aaacctcttt cgacctggaa gtttctatcg acgaaacctc tgttccgacc 840 acctctctgg cgcacatctt cttcgttcag gaactggttc gtcgtggtgt tgaattccgt 900 accctggcgc tgcgtttccc gggtgaatgg cagaaaggta tcgactacgt tggtgacatc 960 gacctgttct ctgaaaacct ggacaaacac gttgcgatcg ttaaaatgtt caccggttac 1020 cgtctgtctc tgcactctgg ttctgacaaa ttctctgttt acccgatcct ggcggaaaaa 1080 accgaccgta ccatccacgt taaaaccgcg ggtacctctt acctggaagc gatccgtgtt 1140 gttgcgaaat tcgcgccgga cctgtaccgt cagatccaca aatacgcgct gtctcgtttc 1200 gaccaggaca aagcgtctta ccacgttacc accgaactgt ctaaaatccc ggacgttgac 1260 aaactggaag actctgaact gccgtctctg ctggaccagc cggactctcg tcagctgatc 1320 cacatcacct acggttctgt tctgaccgcg aaaaaagaag gtcgttctct gttcaaagac 1380 cgtatcatgc gtgttctgtt cgaacacgaa gcggaacact acgacttcct gaaaaaacac 1440 ctgggtaaac acatccagct gctgggtgtt 1470 <210> 4 <211> 490 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mutant fructose-4-epimerase <400> 4 Met Ser Asn Leu Phe Ala Glu Phe Gln His Leu Thr Arg Gly Lys Phe 1 5 10 15 Val Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Lys Ser Thr Asp Ala Thr Phe Phe 20 25 30 Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Val Ile Gly Lys Lys 35 40 45 Gly Ile Cys Glu Leu Phe Glu Gly Gln Lys Ile Gly Glu Ile Asp Arg 50 55 60 Gln Asp Val Val Leu Cys Ala Lys Asn Asp Arg Asn Cys Gln Ser Leu 65 70 75 80 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Lys Pro Gln Ile Cys Asn Ala Lys Leu 85 90 95 Ser Phe Gly Phe Gly Asp Arg Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala His Ala 100 105 110 Gln Cys Val Gln Lys Glu Lys Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Asp 115 120 125 Val Arg Glu Ile Ser Arg Thr Glu Arg Asn Trp Leu Asp Val Leu His 130 135 140 Ser Ala Val Trp Gly Val Phe Glu Ser Gly Tyr Asp Gly Pro Phe Gly 145 150 155 160 Ala Asp Ala Asp His Val Lys Lys Ile Glu Asp Leu Glu Ser Ala Ala 165 170 175 Arg Ala Gly Tyr Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asp His Val Lys 180 185 190 Asp Pro Ala Lys Phe Asp Lys Arg Glu Leu Val Arg Phe Tyr Glu Glu 195 200 205 His Pro Met Arg Arg Thr Leu Glu Met Lys Tyr Ile Gly Lys Ser Phe 210 215 220 Thr Val Leu Gly Glu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Glu Asn Phe Ala Glu 225 230 235 240 Val Phe Val Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Glu His Val Glu Lys Cys Tyr 245 250 255 Arg Ala Leu Arg Ala Val Cys Lys Thr Ser Phe Asp Leu Glu Val Ser 260 265 270 Ile Asp Glu Thr Ser Val Pro Thr Thr Ser Leu Ala His Ile Phe Phe 275 280 285 Val Gln Glu Leu Val Arg Arg Gly Val Glu Phe Arg Thr Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Phe Pro Gly Glu Trp Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Val Gly Asp Ile 305 310 315 320 Asp Leu Phe Ser Glu Asn Leu Asp Lys His Val Ala Ile Val Lys Met 325 330 335 Phe Thr Gly Tyr Arg Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser 340 345 350 Val Tyr Pro Ile Leu Ala Glu Lys Thr Asp Arg Thr Ile His Val Lys 355 360 365 Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Val Val Ala Lys Phe 370 375 380 Ala Pro Asp Leu Tyr Arg Gln Ile His Lys Tyr Ala Leu Ser Arg Phe 385 390 395 400 Asp Gln Asp Lys Ala Ser Tyr His Val Thr Thr Glu Leu Ser Lys Ile 405 410 415 Pro Asp Val Asp Lys Leu Glu Asp Ser Glu Leu Pro Ser Leu Leu Asp 420 425 430 Gln Pro Asp Ser Arg Gln Leu Ile His Ile Thr Tyr Gly Ser Val Leu 435 440 445 Thr Ala Lys Lys Glu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Asp Arg Ile Met Arg 450 455 460 Val Leu Phe Glu His Glu Ala Glu His Tyr Asp Phe Leu Lys Lys His 465 470 475 480 Leu Gly Lys His Ile Gln Leu Leu Gly Val 485 490 <210> 5 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of mutant fructose-4-epimerase <400> 5 atgtctaacc tgttcgcgga attccagcac ctgacccgtg gtaaattcgt tccgtacgcg 60 acctctctgc gtaaatctac cgacgcgacc ttcttcctgg ttcgtgacga actggacaaa 120 tacctgatcg ttatcggtaa aaaaggtatc tgcgaactgt tcgaaggtca gaaaatcggt 180 gaaatcgacc gtcaggacgt tgttctgtgc gcgaaaaacg accgtaactg ccagtctctg 240 atgtctctgt tcccgtctct gaaaccgcag atctgcaacg cgaaactgtc tttcggtttc 300 ggtgaccgtc tgggtgttgc gaccgcggcg cacgcgcagt gcgttcagaa agaaaaactg 360 ttcccgatct tcgcgcagca ggatgttcgt gaaatctctc gtaccgaacg taactggctg 420 gacgttctgc actctgcggt ttggggtgtt ttcgaatctg gttacgacgg tccgttcggt 480 gcggacgcgg accacgttaa aaaaatcgaa gacctggaat ctgcggcgcg tgcgggttac 540 accatgttca ccatcgaccc gtctgaccac gttaaagacc cggcgaaatt cgacaaacgt 600 gaactggttc gtttctacga agaacacccg atgcgtcgta ccctggaaat gaaatacatc 660 ggtaaatctt tcaccgttct gggtgaaaaa ctgaccttcg acgaagaaaa cttcgcggaa 720 gttttcgtta cctacatcga cgcgatcgaa cacgttgaaa aatgctaccg tgcgctgcgt 780 gcggtttgca aaacctcttt cgacctggaa gtttctatcg acgaaacctc tgttccgacc 840 acctctctgg cgcacatctt cttcgttcag gaactggttc gtcgtggtgt tgaattccgt 900 accctggcgc tgcgtttccc gggtgaatgg cagaaaggta tcgactacgt tggtgacatc 960 gacctgttct ctgaaaacct ggacaaacac gttgcgatcg ttaaaatgtt caccggttac 1020 cgtctgtctc tgcactctgg ttctgacaaa ttctctgttt acccgatcct ggcggaaaaa 1080 accgaccgta ccatccacgt taaaaccgcg ggtacctctt acctggaagc gatccgtgtt 1140 gttgcgaaat tcgcgccgga cctgtaccgt cagatccaca aatacgcgct gtctcgtttc 1200 gaccaggaca aagcgtctta ccacgttacc accgaactgt ctaaaatccc ggacgttgac 1260 aaactggaag actctgaact gccgtctctg ctggaccagc cggactctcg tcagctgatc 1320 cacatcacct acggttctgt tctgaccgcg aaaaaagaag gtcgttctct gttcaaagac 1380 cgtatcatgc gtgttctgtt cgaacacgaa gcggaacact acgacttcct gaaaaaacac 1440 ctgggtaaac acatccagct gctgggtgtt 1470

Claims

서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지며,
하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖고, 써모토가 하이포지아(Thermotoga hypogea)로부터 유래되며, D-프럭토스의 4번 탄소를 에피머화하여 프럭토스와 타가토스의 전환반응을 촉매하는, D-프럭토스 4-에피머화 효소 단백질:
(a) 단량체의 분자량이 50 내지 60 kDa,
(b) 최적온도가 50 내지 90℃,
(c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0, 및
(d) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 효소 단백질 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환율이 2배 이상임.
제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 아연(Zn) 이온에 의한 활성이 저해되는 것인 효소 단백질.
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제 1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 서열번호 5로 이루어지는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화되는 것인 효소 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 효소 단백질은 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 및 니켈(Ni)이온에 의해 활성이 증가되는 것인 효소 단백질.
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 핵산분자.
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제6항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것인 핵산분자.
제6항에 따른 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것인 재조합 발현벡터.
제6항에 따른 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환되며, D-프럭토스 4-에피머화 효소 단백질을 발현하는 재조합 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주는 E. coli, 바실러스속 균주, 코리네박테리아속 균주 또는 살모넬라 속 균주인 재조합 균주.
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지며,
하기 (a) 내지 (d)의 특성을 가지고, D-프럭토스의 4번 탄소를 에피머화하여 프럭토스와 타가토스의 전환반응을 촉매하는 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 배양물 또는 파쇄물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당으로부터 타가토스를 생산하는 타가토스 제조용 조성물:
(a) 단량체의 분자량이 50 내지 60 kDa,
(b) 최적온도가 50 내지 90℃,
(c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0, 및
(d) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 효소 단백질 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환율이 2배 이상임.
제 13 항에 있어서, 상기 타가토스 제조용 조성물은 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 및 니켈(Ni) 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는 조성물.
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지며,
하기 (a) 내지 (d)의 특성을 가지고, D-프럭토스의 4번 탄소를 에피머화하여 프럭토스와 타가토스의 전환반응을 촉매하는 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 배양물 또는 파쇄물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 타가토스를 생산하는 방법:
(a) 단량체의 분자량이 50 내지 60 kDa,
(b) 최적온도가 50 내지 90℃,
(c) 최적 pH가 6.0 내지 9.0, 및
(d) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 효소 단백질 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환율이 2배 이상임.
제15항에 있어서, 상기 반응은 온도 50 내지 90℃ 및 pH 6.0 내지 9.0범위에서 수행하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 과당-함유 원료의 과당 농도는 1 내지 60 %(w/w) 인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 반응은 코발트(Co), 칼슘(Ca), 망간(Mn), 및 니켈(Ni) 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온과 함께 수행하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 효소 단백질은 아연(Zn) 이온에 의한 활성이 저해되는 것인 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 효소 단백질은 서열번호 5로 이루어지는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화되는 것인 조성물.