KR102219195B1 - 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 타가토스 전환 활성을 갖는 과당-4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용하여 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법{A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same}

본 출원은 전환 활성 또는 안정성이 향상된 과당-4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용하여 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

타가토스는 설탕과 거의 구별할 수 없는 천연의 단맛을 가지고 있으며, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 타가토스는 우유, 치즈, 카카오 등의 식품, 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료로, 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며 GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕의 맛과 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 여러 제품 적용 시 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 대체감미료로 이용될 수 있다.

종래 알려진 타가토스의 생산 방법으로는 주로 갈락토스를 원료로 한 화학적(촉매 반응)방법과 생물학적(이성화 효소반응) 방법이 있다(대한민국 공개특허 제2009-0082774호 참조). 상기 반응들의 원료인 갈락토스를 경제적으로 수득하기 위하여 갈락토스를 함유하는 다양한 기초 원료 및 이로부터 갈락토스를 수득하여 타가토스를 제조하는 방법에 대한 연구가 선행되어 왔다. 갈락토스를 얻기 위한 대표적인 기초 원료는 유당이나, 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 유당 또는 유당을 함유하는 제품의 가격의 불안정성이 존재하여, 타가토스 생산 원료의 안정적 수급에 한계가 있다. 따라서, 보편화된 일반당(설탕, 포도당, 과당 등)을 사용하여 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.

한편, 타가토스-이인산 알돌레이즈는 D-타가토스 1,6-이인산을 기질로 하여 글리세론 포스페이트와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트를 생산하고, 갈락토스 대사에 관여함이 공지된 바 있으나, 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈가 타가토스를 생산하는 활성을 가지는지에 대한 연구는 전무하였으나, 대한민국 공개특허 제2018-0111678호 타가토스-이인산 알돌레이즈(tagatose-bisphosphate aldolase)가 과당을 타가토스로 전환시키는 기능이 있음을 확인한 바 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 신규한 변이형 단백질을 발굴하고, 상기 변이형 단백질이 서열번호 1의 야생형과 같이 전환활성을 가지거나, 야생형 대비 전환 활성 또는 안정성이 향상되고, 타가토스의 생산능을 증가시킴을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 변이체를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 변이체를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 하나의 목적은 과당-4-에피머화 효소 변이체; 이를 포함하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 하나 이상 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 과당-4-에피머화 효소 변이체; 이를 포함하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜, 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 과당-4-에피머화 효소 변이체를 제공한다.

본 출원에서 용어, "과당-4-에피머화 효소"는 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 과당-4-에피머화 활성을 갖는 효소이다. 본 출원의 목적상 과당을 기질로 하여 타가토스를 생산할 수 있다면 제한없이 포함될 수 있으며, 공지의 데이터 베이스인 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 EC 4.1.2.40 인 타가토스 이인산 알돌레이즈 또는 타가토스-이인산 알돌레이즈 class II 악세서리 단백질(Tagatose-bisphosphate aldolase or tagatose- bisphosphate class II accessory protein)이 과당을 기질로 타가토스로 전환하는 활성을 가진다면 과당-4-에피머화 효소로 포함될 수 있다. 상기 타가토스-이인산 알돌레이즈는 기존에 하기 [반응식 1]과 같이 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 기질로 하여 글리세론 포스페이트(glycerone phosphate)와 D-글리세랄데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)를 생산하는 효소로 공지되어 있다.

[반응식 1]

D-타가토스 1,6-이인산 <=> 글리세론 포스페이트 + D-글리세랄데하이드 3-포스페이트

일례로 타가토스-6-인산 키나아제 (Tagatose 6 phosphate kinase; EC 2.7.1.144)가 과당을 기질로 타가토스로 전환하는 활성을 가진다면 과당-4-에피머화 효소로 포함될 수 있다. 상기 타가토스-6-인산 키나아제는 기존에 하기 [반응식 2]와 같이 ATP와 D-타가토스 6-인산(D-tagatose 6-phosphate)를 기질로 하여 ADP와 D-타가토스 1,6-이인산(D-tagatose 1,6-bisphosphate)를 생산하는 효소로 공지되어 있다.

[반응식 2]

ATP + D-타가토스 6-인산 <=> ADP + D-타가토스 1,6-이인산

상기 과당-4-에피머화 효소의 활성은 기질인 과당으로부터 타가토스로의 전환율(전환율=타가토스 중량/초기 과당 중량 *100)이 0.01% 이상, 구체적으로 0.1% 이상, 더욱 구체적으로 0.3% 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 전환율은 0.01% 내지 100%의 범위, 0.1% 내지 50%의 범위일 수 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 타가토스-이인산 알돌레이즈, 타가토스-6-인산 키나아제는 내열성 미생물 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으며, 예를 들어, 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)(서열번호 1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 과당-4-에피머화 효소, 또는 타가토스-이인산 알돌레이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 상기 서열번호 1은 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 상기 서열번호 1은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank또는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia) 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드/단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산 서열은 서열번호 1 및 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 '이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 출원에서 용어, "타가토스"는 단당류 중 케토헥소스의 일종으로 "D-타가토스"와 혼용되어 사용된다.

본 출원에서 용어, "과당-4-에피머화 효소 변이체"는 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 과당-4-에피머화 효소 변이체를 의미한다.

상기 과당-4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 과당-4-에피머화 효소 변이체를 제공하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 변이체는 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 이외에 추가적으로 158번 위치, 321번 위치, 210번 위치, 239번 위치, 및 318번 위치 중 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 'N번 위치'은 N번 위치 및 N번 위치와 상응(Correspoding)하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 구체적으로 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)에서 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 상기 특정 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다.

상기 N번 위치와 상응하는 아미노산 위치 또는 상기 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드에서의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277])에서 구현되는 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453]), 구체적으로 버전 5.0.0 또는 그 이후를 사용하여 결정될 수 있다. 사용되는 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스일 수 있다.

상기 N번 위치와 상응하는 아미노산 위치 또는 상기 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드에서의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치의 아미노산 잔기의 확인은 비제한적으로 그들 각각의 디폴트 파라미터를 사용하는 MUSCLE(multiple sequence comparison by log-expectation; 버전 3.5 또는 그 이후; 문헌[Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797]), MAFFT(버전 6.857 또는 그 이후; 문헌[Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066]; 문헌[Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518]; 문헌[Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374]; 문헌[Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64]; 문헌[Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900]) 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA(1.83 또는 그 이후; 문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680])를 포함하는 몇몇 컴퓨터 프로그램을 사용한 다중 폴리펩티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다.

그 밖의 폴리펩티드가 특정 아미노산 서열의 성숙 폴리펩티드로부터 벗어나서, 종래의 서열 기반의 비교로 그들의 관계를 검출하지 못하게 되는 경우(문헌[Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615]), 그 밖의 쌍별 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열 기반의 검색에서 보다 큰 감수성은 데이터베이스를 검색하기 위한 폴리펩티드 패밀리(프로파일)의 확률론적 표시를 이용하는 검색 프로그램을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통하여 프로파일을 산출하고 원거리 상동체를 검출할 수 있다(문헌[Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 1개 이상의 표시를 가진다면 훨씬 더 큰 민감성이 달성될 수 있다. GenTHREADER(문헌[Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815]; 문헌[McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881])와 같은 프로그램은 질의 서열(query sequence)에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 신경망에 대한 입력으로서 다양한 공급원(PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조정렬 프로파일 및 용매화 포텐셜)으로부터의 정보를 이용한다. 유사하게는 문헌[Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919]의 방법은 알려지지 않은 구조의 서열과 SCOP 데이터베이스에 존재 하는 슈퍼패밀리 모델을 정렬하기 위해 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성, 유사성, 또는 동일성 모델을 생성하기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.

상기 '다른 아미노산'은 각 위치에 해당되는 아미노산을 제외한 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. '아미노산'은 곁사슬의 성질에 따라 산성, 염기성, 극성(친수성), 비극성(소수성)의 네 가지 종류로 구분된다.

구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 각 위치의 아미노산이 비극성 아미노산인 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 및 프롤린(P); 극성 아미노산인 세린(S), 쓰레오닌(T), 시스테인(C), 티로신(Y), 아스파라긴(N), 및 글루타민(Q); 산성 아미노산인 아스팔트산(D), 및 글루탐산(E); 염기성 아미노산인 라이신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산 잔기가 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 또는 염기성 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 및 염기성 아미노산은 티로신(Y), 트립토판(W), 발린(V) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로 97번 위치의 아스파라긴(N)이 티로신(Y), 124번 위치의 쓰레오닌(T)이 트립토판(W), 367번 위치의 아스파라긴(N)이 발린(V), 및 390번 위치의 쓰레오닌(T)이 아르기닌(R)으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 과당-4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산 잔기가 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 또는 염기성 아미노산으로 치환되고, 추가적으로 158번 위치의 아미노산은 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 산성 아미노산, 또는 염기성 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 메티오닌(M), 쓰레오닌(T), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)으로 치환되는 것일 수 있다. 321번 위치의 아미노산은 비극성 아미노산, 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 이소류신(I), 아스파라긴(N), 및 글루탐산(E), 또는 라이신(K)으로 치환되는 것일 수 있다. 210번 위치의 아미노산은 극성 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 시스테인(C)으로 치환된 것일 수 있다. 318번 위치의 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 글리신(G)으로 치환되는 것일 수 있다. 239번 위치의 아미노산은 염기성 아미노산으로 치환되는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 라이신(K)으로 치환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 변이체는 위에서 설명한 서열번호 서열번호 1의 변이 및/또는 상기 서열번호 1의 변이와 변이 위치 외 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함한다. 상기 서열번호 1의 변이는 N-말단으로부터 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산이 변이된 것을 의미하거나, 97번 위치, 124번 위치, 367번 위치 및 390번 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 이외에 추가적으로 158번 위치, 321번 위치, 210번 위치, 239번 위치, 및 318번 위치 중 어느 하나 이상의 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 과당-4-에피머화 효소 변이체는 특정 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 이외의 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 보존적 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다.

또한, 전술한 특정 위치의 아미노산 이외의 하나 이상의 아미노산이 변이된 변이형은 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 전이 (transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

또한 상기 변이체는 위에서 설명한 서열번호 1의 변이 및/또는 상기 서열번호 1의 변이와 변이 위치 외 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함한다. 상기 서열번호 1의 변이는 전술한 바와 같으며, 이의 상동성 또는 동일성은 전술한 변이 외의 위치에서 상동성 또는 동일성을 가지는 것일 수 있다.

본 출원의 목적상 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체는 전환 활성 또는 안정성이 야생형에 비하여 향상된 것을 특징으로 한다.

상기 용어 "전환 활성"은 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환시키는 것을 의미하며, 상기 용어 "안정성"은 내열성이 높은 효소로서 열 안정성을 갖는 것을 의미한다.

구체적으로, 서열번호 1의 야생형에 비하여 D-프럭토스(과당)의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 활성이 향상되는 것을 특징으로 한다.

일 예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체는 내열성이 높은 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체는 50℃내지 70℃에서 최대 활성의 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100% 또는 75% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체는 55℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 70℃, 55℃, 60℃, 또는 70℃에서 최대 활성의 80% 내지 100% 또는 85% 내지 100%의 활성을 나타낼 수 있다.

상기 과당-4-에피머화 효소 변이체는 그 예로, 그 예로 표 3 내지 표 6에 기재된 바와 같으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 일 예로, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.

상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며, 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드화할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사하게 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 출원에서 사용된 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 변이형 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 변이형 단백질을 포함하거나, 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 타가토스를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 변이형 단백질 및/또는 상기 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 다른 하나의 과당-4-에피머화 효소 변이체, 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.

상기 미생물은 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체 또는 타가토스를 생산하는 미생물일 수 있다.

본 출원에서 사용되는 용어 "과당-4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 미생물"이란, 본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체가 발현되도록 재조합된 미생물을 의미할 수 있다. 예를 들어 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 변이체를 발현할 수 있는 숙주세포 또는 미생물을 의미한다. 본 출원의 목적상 구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 과당-4-에피머화 효소 변이체를 발현하는 미생물로서, 상기 아미노산 치환은 N-말단으로부터 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환되어, 과당-4-에피머화 효소 활성을 갖는, 변이형 단백질을 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체는 본 출원의 상기 효소 또는 이의 변이체를 발현하는 DNA를 E. coli 등의 균주에 형질전환시킨 다음, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제하여 수득한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주는 대장균(Escherichia coli) 외에도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 핵산 또는 본 출원의 재조합 벡터를 포함하여 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 미생물의 배양물은 본 출원의 과당-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 미생물을 배양하는 과정은 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 과당-4-에피머화 효소 변이체; 이를 포함하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 추가로 과당을 포함할 수 있다.

또한, 본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 당해 타가토스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 금속이온 또는 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속이온 또는 금속염의 금속은 2가 양이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 금속은 니켈(Ni), 철(Fe), 코발트(Co), 마그네슘(Mg) 또는 망간(Mn)일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 금속염은 NiSO₄, NiCl₂, FeSO₄, MgSO₄, MgCl₂, CoSO₄, MnCl₂ 또는 MnSO₄일 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체; 상기 과당-4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 미생물; 이의 배양물; 또는 이들로부터 유래한 과당-4-에피머화 효소를 과당과 접촉시켜, 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 과당-4-에피머화 효소를 과당-4-에피머화 효소로 사용하여 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일 예로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 pH 9.0 조건에서, 30℃내지 80℃온도 조건에서, 및/또는 0.5시간 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 pH 9.0 조건 또는 pH 7.0 내지 pH 9.0 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 35℃내지 80℃, 40℃ 내지 80℃, 45℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 65℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 60℃ 또는 55℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 0.5시간 내지 36시간 동안, 0.5시간 내지 24시간 동안, 0.5시간 내지 12시간 동안, 0.5시간 내지 6시간 동안, 1시간 내지 48시간 동안, 1시간 내지 36시간 동안, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 12시간 동안, 1시간 내지 6시간 동안, 3시간 내지 48시간 동안, 3시간 내지 36시간 동안, 3시간 내지 24시간 동안, 3시간 내지 12시간 동안, 3시간 내지 6시간 동안, 6시간 내지 48시간 동안, 6시간 내지 36시간 동안, 6시간 내지 24시간 동안, 6시간 내지 12시간 동안, 12시간 내지 48시간 동안, 12시간 내지 36시간 동안, 12시간 내지 24시간 동안, 18시간 내지 48시간 동안, 18시간 내지 36시간 동안 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

또한, 본 출원의 접촉은 금속이온 또는 금속염 존재하에서 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 금속은 전술한 양태에서와 같다.

본 출원의 제조방법은 제조된 타가토스를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및/또는 정제는 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며. 비제한적인 예로, 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 이온교환 크로마토그래피 및 분별 결정 등을 사용할 수 있다. 상기 정제는 하나의 방법만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다.

또한, 본 출원의 제조방법은 상기 분리 및/또는 정제하는 단계 이전 또는 이후에 탈색 및/또는 탈염을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 보다 품질이 우수한 타가토스를 얻을 수 있다.

다른 예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 타가토스로 전환하는 단계, 분리 및/또는 정제하는 단계, 또는 탈색 및/또는 탈염하는 단계 이후 타가토스를 결정화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결정화는 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 사용하여 결정화를 수행할 수 있다.

또한, 본 출원의 제조 방법은 상기 결정화하는 단계 이전에 타가토스를 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 결정화 효율을 높일 수 있다.

다른 예로, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 분리 및/또는 정제하는 단계 이후 미반응된 과당을 본 출원의 효소, 상기 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물과 접촉시키는 단계, 본 출원의 결정화하는 단계 이후 결정이 분리된 모액을 상기 분리 및/또는 정제 단계에 재사용하는 단계, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가 단계를 통해 타가토스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 과당의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

본 출원의 과당-4-에피머화 효소 변이체는 특성이 우수한 타가토스 생산이 산업적으로 가능하고, 보편화된 당인 과당을 타가토스로 전환하는 바 경제성이 높은 효과가 있다.

도 1은 본 출원의 일 실시예들에서 제조된 타가토스-이인산 알돌레이즈 효소(CJ_KO_F4E)이 과당-4-에피머화 효소 활성을 가짐을 보여주는 HPLC 크로마토그래피 결과이다.
도 2 및 도 3은 선별된 변이체들의 열 안정성을 60℃에서 시간에 따라 측정한 결과이다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 과당-4-에피머화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

실시예 1-1. 과당-4-에피머화 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터의 제조

과당-4-에피머화 효소는 대한민국 공개특허(제2018-0111678호)에서 과당으로부터 타가토스로 전환하는 활성이 있는 것으로 알려진 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)에서 유래한 서열을 이용하였다.

구체적으로, 상기 유전자를 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록된 코스모토가 오엘리아 유전자 서열을 대상으로 과당-4-에피머화 효소 유전자 서열을 선발하였고, 코스모토가 오엘리아의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 염기 서열 (서열번호 2)를 바탕으로 대장균 발현 가능 벡터인 pBT7-C-His에 삽입하여 재조합 발현벡터 pBT7-C-His-KO를 바이오니아에 합성 의뢰하여 제작하였다.

실시예 1-2. 과당-4-에피머화 효소 개량주 라이브러리 제작 및 활성이 개량된 변이체의 스크리닝

코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)에서 유래한 과당-4-에피머화 효소 유전자를 주형으로 하여 무작위 돌연변이를 통하여 과당-4-에피머화 효소의 변이체 라이브러리를 구성하였다. 구체적으로, Diversify random mutagenesis kit(ClonTech사)을 이용하여 과당-4-에피머화 효소 유전자를 1000개의 염기쌍 당 2 내지 3개의 변이가 일어나게 하는 무작위 돌연변이를 유도하였고, PCR 반응 조건은 아래 표 1 및 표 2에 나타냈다. 과당-4-에피머화 효소의 변이체를 코딩하는 유전자 라이브러리를 구성한 다음, 이를 E.coli BL21(DE3)에 삽입하였다.

반응용액 조성	첨가량 (μl)
PCR Grade Water	36
10X TITANIUM Taq Buffer	5
MnSO4 (8 mM)	4
dGTP (2 mM)	1
50X Diversify dNTP Mix	1
Primer mix	1
Template DNA	1
TITANIUM Taq Polym.	1

단계	온도 (℃)	시간(초)	사이클
Initial Denaturation	94	30	1
Denaturation	94	30	25
Annealing/ Extension	68	60
Final Extension	68	60	1
soak	4	-

상기 과당-4-에피머화 효소의 변이체 유전자를 포함하고 있는 pBT7-C-His 플라스미드를 가지고 있는 E.coli BL21(DE3)을, 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 0.2 mL를 포함하는 deep well rack에 접종하고, 37℃진탕 배양기에서 16시간 이상 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 deep well rack에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 4,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하여 활성 테스트를 진행하였다.

제작된 무작위 돌연변이 라이브러리에서 활성개량 변이효소를 대량으로 고속 스크리닝 하기 위해 D-과당을 특이적으로 정량화 할 수 있는 발색 측정법을 이용하였다. 구체적으로, 70% 폴린-치오칼토 용액(folin-ciocalteu reagent, SIGMA-ALDRICH)과 기질반응 완료액을 15 : 1 비율로 혼합한 후 80도에서 5분간 반응하여 900nm에서 측정하여 OD 값으로 야생형 효소(서열번호 1)와 상대활성 비교 시 활성(D-과당으로부터 D-타가토스 전환)이 있는 변이체들을 선발하였다. 이중 가장 활성이 높게 측정된 10개의 콜로니를 선별하여 이들을 시퀀싱하여 염기서열을 확인한 결과, 97번째, 124번째, 158번째, 210번째, 239번째, 318번째, 321번째, 367번째, 및 390번째가 변이되어 있음을 확인하였다. 무작위 돌연변이 스크리닝을 통해 활성이 가장 우수한 변이체 T124W_N97Y_N367V를 확보하였다.

실시예 2. 변이효소 제작 및 활성 비교 평가

상기 실시예 1-2에서 확보한 재조합 변이체의 과당-4-에피머화의 전환활성을 평가하기 위하여, 변이 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 각각의 정제효소를 확보하였다.

확보한 정제 효소의 과당-4-에피머화 활성을 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 3 mM MnSO4 및 각 2 mg/mL 를 첨가하여 온도별(50℃, 60℃) 조건에서 최대 2시간 동안 반응시켰다. 그 결과, 야생형(KO)은 120분에 50℃와 60℃의 반응조건에서 각각의 전환 활성은 4.7%, 5.2%이며, 변이효소의 전환활성은 17.3%, 23.7% 이다. 즉, 야생형 보다 활성이 증가하였으며, 구체적인 결과는 하기 표 3 과 같다.

Time (min)	WT		T124W_N97Y_N367V
	50℃	60℃	50℃	60℃
0	0.3	0.3	0.5	0.5
30	1.4	2.1	8.4	13.3
60	1.8	3.5	11.9	18.6
120	4.1	5.2	17.3	23.7

실시예 3. 추가 변이효소 제작 및 활성개량 변이효소 선별

실시예 3-1. 위치-특이적 변이 유발 돌연변이 (site-directed mutagenesis)

실시예 1-2에서 선발된 변이체를 이용하여 코스모토가 오엘리아 (Kosmotoga olearia)에서 유래한 과당-4-에피머화 효소의 390번째 쓰레오닌을 특정 프라이머를 이용한 위치-특이적 변이유발 (site-directed mutagenesis) 방법으로 알지닌으로 치환하였다.

돌연변이를 가진 두 개의 상보적인 염기서열의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)인 N-말단 프라이머(서열번호 3: AAAGAAATCCCGTTAAGACTTATAAGCCAGTTC)와 C-말단 프라이머(서열번호 4: GAACTGGCTTATAAGTCTTAACGGGATTTCTTT)를 프라이머로 사용하였다. 플라스미드 상태의 DNA를 주형으로 사용하여 새로운 변이를 가진 플라스미드를 튜브에서 증폭, 합성한 다음, 원래의 주형 DNA는 Dpn I 제한 효소로 절단하여 제거하였다. 즉, 주형으로 사용한 실시예 1-2에서 선발된 변이 DNA는 대장균에서 분리된 DNA로서 Gm6 ATC를 인식하여 절단하는 Dpn I에 의하여 절단되지만, 튜브에서 합성한 변이 DNA는 절단되지 않는다. 이를 대장균 DH5alpha에 형질전환시켜 변이주를 얻은 다음, 변이 유전자의 염기서열을 분석하여 변이가 제대로 일어났음을 확인하였다. 즉, 총 4개의 아미노산 서열이 변이된 T124W_N97Y_N367V_T390R 변이주를 제작하였다. 이 변이주를 발현균주인 E.coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 재조합 균주를 제조하였다.

실시예 3-2. 활성개량 변이효소 제작 및 활성 비교 평가

실시예 3-1에서 제작한 변이 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH2PO4(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 정제효소를 확보하였다.

확보한 재조합 변이효소의 과당-4-에피머화 활성 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 3 mM MnSO4 및 각 2 mg/mL 를 첨가하여 60℃에서 0.5시간 동안 반응시켰다.

그 결과, 제작 변이주 모두는 야생형 보다 최대 8배 이상 높은 전환율을 보였다. 구체적인 결과는 하기 표 4와 같다.

	0.5H
WT	2.1
T124W_N97Y_N367V	13.7
T124W_N97Y_N367V_T390R	17.8

실시예 3-3. 포화 돌연변이 (saturation mutagenesis)

실시예 3-1에서 제작한 변이체를 이용하여 추가적으로 과당-4-에피머화 전환반응의 단위활성이 향상된 변이효소를 개발하기 위해, 실시예 1-2에서 선별된 활성 개량 부위 2곳 (158번째, 321번째)의 추가 변이주 라이브러리 제작을 위한 포화돌연변이법의 주형(template)으로 사용하였다. 변이분포 다양성 및 변이체 수율 등을 고려하여 역방향(inversed) PCR 기반 포화 돌연변이법을 사용하였고(2014. Anal. Biochem. 449:90-98), 제작된 변이주 라이브러리의 스크리닝 규모를 최소화(포화돌연변이 시 도입되는 코돈 수를 최소화함)하기 위해 종결코돈을 배제하고, 대장균의 희귀코돈(rare codons)이 최소화된 NDT/VMA/ATG/TGG 혼합 프라이머를(2012. Biotechniques 52:149-158) 디자인하여 사용하였다. 구체적으로, 각각의 부위의 앞쪽염기 15bp와 치환염기3bp, 뒤쪽염기 15bp로 총 길이는 33bp로 하여 프라이머를 제작 이용하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 10분 신장을 30회 반복한 후, 72℃에서 60분간 신장반응을 수행하였다. 선정 아미노산 부위별로 포화돌연변이 라이브러리를 제작 후 라이브러리별 변이주를 무작위 선발(<변이 11개)하고 염기서열을 분석하여 아미노산 변이분포를 평가하였다. 이의 분석결과를 기반으로 라이브러리별 서열 범위(sequence coverage) 90% 이상의 스크리닝 규모를 설정하였다(2003. Nucleic Acids Res. 15;31:e30).

상기 포화 돌연변이를 통하여 고 활성 보유 후보 변이주를 제작하고 염기서열 분석하여 변위부위를 확인하였다. 이를 통해 총 18개의 변이체를 확보하였다(표 5).

변이위치	치환 아미노산 종류
C158	Q	H	A	V	G	T	E	M	R	L
C321	L	E	N	I	K	A	G	V

실시예 3-4. 활성개량 변이효소 제작

다중부위에 대한 변이효소에 대해 과당-4-에피머화의 전환활성을 비교평가하기 위하여, 상기 실시예 3-3에서 제조한 포화돌연변이 라이브러리 유전자를 E. coli BL21(DE3) 에 형질전환한 후 각각의 형질전환 미생물을 앰피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 액체배지 5 mL를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 상기 종균 배양결과 얻은 배양액을 LB와 단백질 발현조절인자인 유당이 함유된 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반속도 180 rpm 및 37℃조건에서 실시하였다. 다음, 상기 배양액을 8,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 50 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충용액으로 2회 세척하고, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어 있는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액에 재현탁하였다. 상기 재현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고, 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 His-taq 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 20 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0) 완충용액을 충진제의 10배의 액량으로 흘려주어 비특이적 결합 가능 단백질을 제거하였다. 이어서, 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH₂PO₄(pH8.0) 완충용액을 추가로 흘려주어 용출 정제한 다음, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)완충용액으로 투석하여 효소 특성 분석을 위하여 각각의 정제효소를 확보하였다.

실시예 4. 활성, 안정성 개량 변이효소 특성 비교 평가

상기 실시예 3-4에서 확보한 재조합 변이효소들의 과당-4-에피머화 활성 측정하기 위하여, 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 3 mM MnSO4 및 각 2 mg/mL 를 첨가하여 60℃에서 0.5시간 동안 반응시켰다. 아울러 확보한 재조합 변이효소들의 열안정성 측정하기 위하여, 각 5 mg/mL 의 농도로 정제된 효소를 첨가하여 60℃에서 최소 19시간에서 최대 90시간 동안 놓아둔 후, ice에 5분간 방치한 후, 시간별로 샘플링한 효소액에 30 중량% 과당에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 3 mM MnSO₄ 를 첨가하여 효소반응을 수행하여 효소의 잔존 활성을 측정하였다.

그 결과, 제작 변이주 모두는 야생형 보다 최대 8배 이상 높은 전환율을 보였다. 구체적인 결과는 하기 표 6과 같다. 아울러 열안정성 조사한 결과, 도 2 및 도 3과 같이 과당-4-에피머화 효소 변이체들은 60℃에서 시간이 따라 잔존활성이 감소함을 보이나, 야생형 보다는 열안정성이 우수함을 확인할 수 있었다.

	0.5H
WT	2.5
T124W_N97Y_N367V	13.9
T124W_N97Y_N367V_T390R	17.9
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158Q	18
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158H	13.3
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158A	17.3
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158V	19
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158G	20
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158T	16.9
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158E	18.9
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158M	19.6
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158R	17.1
T124W_N97Y_N367V_T390R+C158L	20.1
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321L	19.5
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321E	15.9
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321N	18.0
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321I	15.7
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321K	13.7
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321A	17.1
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321G	16.9
T124W_N97Y_N367V_T390R+C321V	16.3

본 발명자들은 E.coil BL21(DE3) 균주에 형질전환하여 E.coil BL21(DE3)/CJ_KO_F4E_WRVY라 명명된 형질전환체(형질전환 미생물)을 제조하고, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2019년 07월 24일자에 기탁하여 수탁번호 KCCM12567P(E.coil BL21(DE3)/CJ_KO_F4E_WRVY)로 기탁하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12567P 20190724

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A Novel Fructose C4 epimerases and Preparation Method for producing Tagatose using the same <130> KPA190672-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 435 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Kosmotoga olearia <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(435) <223> Tagatose-bisphosphate aldolase <400> 1 Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile 35 40 45 Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met 50 55 60 Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro 85 90 95 Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile 100 105 110 Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu 115 120 125 Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro 130 135 140 Leu Asn Pro Glu Val Ile Ala Glu Arg Thr Ala Leu Leu Cys Leu Glu 145 150 155 160 Ala Glu Arg Ala Phe Lys Glu Ser Ala Gly Ser Leu Arg Pro Val Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Asn Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Ile His Val Thr Ser Val Gln Asp Phe Glu Arg Thr Val Glu 195 200 205 Leu Thr Lys Lys Ala Phe Phe Asp His Gly Leu Tyr Glu Ala Trp Gly 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Glu 225 230 235 240 His Ile Phe Glu Tyr Asp Arg Asn Arg Ala Arg Glu Leu Thr Glu Ala 245 250 255 Ile Lys Lys His Pro Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Ala Lys Ala Leu Lys Glu Met Val Glu Asp Gly Val Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Phe Phe 290 295 300 Ala Leu Ser Ser Ile Glu Lys Glu Leu Phe Tyr Asp Thr Pro Gly Leu 305 310 315 320 Cys Ser Asn Phe Val Glu Val Val Glu Arg Ala Met Leu Asp Asn Pro 325 330 335 Lys His Trp Glu Lys Tyr Tyr Gln Gly Glu Glu Arg Glu Asn Arg Leu 340 345 350 Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Trp Asn Leu 355 360 365 Pro Glu Val Arg Thr Ala Val Asn Lys Leu Ile Thr Asn Leu Glu Thr 370 375 380 Lys Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Met Gln Tyr 385 390 395 400 Gln Lys Ile Arg Asn Gly Leu Leu Arg Lys Asp Pro Ile Ser Leu Ile 405 410 415 Lys Asp Arg Ile Thr Leu Val Leu Asp Asp Tyr Tyr Phe Ala Thr His 420 425 430 Pro Glu Cys 435 <210> 2 <211> 1308 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Kosmotoga olearia <220> <221> gene <222> (1)..(1308) <223> Tagatose-bisphosphate aldolase <400> 2 atgaaaaaac atcctcttca ggacattgtt tcattgcaaa aacagggaat acccaaaggg 60 gttttctctg tatgtagtgc caatagattt gttattgaaa ccactctgga atatgcgaag 120 atgaaaggga caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180 tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240 ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300 ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360 gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420 gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480 gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540 gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600 caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660 gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720 catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780 ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840 atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900 gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960 tgttcaaact ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa 1020 aaatattacc agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat 1080 cgcttgaggt attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc 1140 aaccttgaaa caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac 1200 caaaaaatca gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt 1260 acccttgttc ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1308 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 3 gaccatcttg gcccataccc ctggaagggt cag 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 4 ctgacccttc caggggtatg ggccaagatg gtc 33

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 과당-4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 97번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 극성 아미노산으로, 124번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 비극성 아미노산으로, 367번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 비극성 아미노산으로, 및 390번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 염기성 아미노산으로 치환된 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 극성 아미노산이 세린(S), 쓰레오닌(T), 시스테인(C), 티로신(Y), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)이고,
   상기 비극성 아미노산이 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 또는 프롤린(P)이고,
   상기 염기성 아미노산이 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H)인 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 극성 아미노산이 티로신(Y)이고, 상기 비극성 아미노산이 트립토판(W) 또는 발린(V)이고, 상기 염기성 아미노산이 아르기닌(R)인 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 추가적으로 158번 위치 또는 321번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 글루타민(Q), 히스티딘(H), 알라닌(A), 발린(V), 글리신(G), 쓰레오닌(T), 글루탐산(E), 메티오닌(M), 아르기닌(R), 류신(L) 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 이소류신(I), 라이신(K)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 추가적으로 210번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 극성 아미노산으로, 239번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 염기성 아미노산으로, 또는 318번 위치에 상응하는 아미노산 잔기가 비극성 아미노산으로 치환된 것인, 과당-4-에피머화 효소 변이체.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
   
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 과당-4-에피머화 효소 변이체 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 과당-4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물.
   
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 과당-4-에피머화 효소 변이체; 이를 포함하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 과당을 추가로 포함하는 것인, 타가토스 생산용 조성물.
    
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 과당-4-에피머화 효소 변이체; 이를 포함하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 과당과 접촉시켜, 과당을 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법.

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