KR20230161244A - 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 - Google Patents
신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230161244A KR20230161244A KR1020220061011A KR20220061011A KR20230161244A KR 20230161244 A KR20230161244 A KR 20230161244A KR 1020220061011 A KR1020220061011 A KR 1020220061011A KR 20220061011 A KR20220061011 A KR 20220061011A KR 20230161244 A KR20230161244 A KR 20230161244A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- amino acid
- ala
- leu
- variant
- glu
- Prior art date
Links
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 78
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 title claims abstract description 78
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 title claims abstract description 78
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 title claims abstract description 68
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 title claims abstract description 68
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 106
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 72
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 187
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 183
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 162
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 45
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 25
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 22
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 17
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 79
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 77
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N Gln-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 16
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 16
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 16
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 16
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 16
- 102220497337 14-3-3 protein zeta/delta_R59A_mutation Human genes 0.000 description 14
- 102220497340 14-3-3 protein zeta/delta_R63A_mutation Human genes 0.000 description 14
- 102220479246 Translation initiation factor eIF-2B subunit delta_R79A_mutation Human genes 0.000 description 14
- 102200089548 rs5030802 Human genes 0.000 description 14
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 13
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 13
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102220026587 rs267607707 Human genes 0.000 description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 10
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PXKLCFFSVLKOJM-ACZMJKKPSA-N Ala-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PXKLCFFSVLKOJM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 8
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 8
- IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- XYTNPQNAZREREP-XQXXSGGOSA-N Ala-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XYTNPQNAZREREP-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 8
- GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N Ala-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 8
- CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 8
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 8
- CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N Ala-Lys-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N CHFFHQUVXHEGBY-GARJFASQSA-N 0.000 description 8
- NLOMBWNGESDVJU-GUBZILKMSA-N Ala-Met-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLOMBWNGESDVJU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 8
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- AUZAXCPWMDBWEE-HJGDQZAQSA-N Arg-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUZAXCPWMDBWEE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 8
- QUBKBPZGMZWOKQ-SZMVWBNQSA-N Arg-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QUBKBPZGMZWOKQ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 8
- BFDDUDQCPJWQRQ-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O BFDDUDQCPJWQRQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 8
- HOIFSHOLNKQCSA-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HOIFSHOLNKQCSA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- GQRDIVQPSMPQME-ZPFDUUQYSA-N Asn-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GQRDIVQPSMPQME-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 8
- CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N Gln-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N 0.000 description 8
- VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O VSXBYIJUAXPAAL-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DOQUICBEISTQHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- WRNAXCVRSBBKGS-BQBZGAKWSA-N Glu-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WRNAXCVRSBBKGS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N Glu-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 8
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 8
- AOCARQDSFTWWFT-DCAQKATOSA-N Glu-Met-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AOCARQDSFTWWFT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 8
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- MLILEEIVMRUYBX-NHCYSSNCSA-N Glu-Val-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O MLILEEIVMRUYBX-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 8
- KYMUEAZVLPRVAE-GUBZILKMSA-N His-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KYMUEAZVLPRVAE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N His-Asp-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 8
- 108700039609 IRW peptide Proteins 0.000 description 8
- MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N Ile-Gly-Ile Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O MQFGXJNSUJTXDT-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 8
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 8
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 8
- UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N Leu-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 8
- VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- GPICTNQYKHHHTH-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GPICTNQYKHHHTH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 8
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N Leu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 8
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 8
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 8
- VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 8
- XMMWDTUFTZMQFD-GMOBBJLQSA-N Met-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC XMMWDTUFTZMQFD-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 8
- MIAZEQZXAFTCCG-UBHSHLNASA-N Met-Phe-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MIAZEQZXAFTCCG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 8
- XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 8
- HGNGAMWHGGANAU-WHOFXGATSA-N Phe-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HGNGAMWHGGANAU-WHOFXGATSA-N 0.000 description 8
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 8
- UPJGUQPLYWTISV-GUBZILKMSA-N Pro-Gln-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UPJGUQPLYWTISV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- IBGCFJDLCYTKPW-NAKRPEOUSA-N Pro-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 IBGCFJDLCYTKPW-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 8
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 8
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- RNMRYWZYFHHOEV-CIUDSAMLSA-N Ser-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RNMRYWZYFHHOEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N Ser-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HBTCFCHYALPXME-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 8
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 8
- OVQZAFXWIWNYKA-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CO)N OVQZAFXWIWNYKA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 8
- GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N Thr-Phe-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 8
- VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)CC1=CC=CC=C1 VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 8
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 8
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- DJEVQCWNMQOABE-RCOVLWMOSA-N Val-Gly-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N DJEVQCWNMQOABE-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 8
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 8
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 8
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 8
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 8
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 8
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 8
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 8
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 8
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 7
- ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N Glu-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 7
- ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ser-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 7
- DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 7
- WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N Val-Phe-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WMRWZYSRQUORHJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 6
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 101100163308 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) argR1 gene Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 101150089004 argR gene Proteins 0.000 description 3
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 3
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 3
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100349264 Caenorhabditis elegans ntr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241001605246 Corynebacterium crudilactis Species 0.000 description 1
- 241000446654 Corynebacterium deserti Species 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 241000291063 Corynebacterium halotolerans Species 0.000 description 1
- 241000024402 Corynebacterium imitans Species 0.000 description 1
- 241000128247 Corynebacterium pollutisoli Species 0.000 description 1
- 241000334675 Corynebacterium singulare Species 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- 241000158523 Corynebacterium striatum Species 0.000 description 1
- 241000960580 Corynebacterium testudinoris Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N Glu-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 출원은 신규한 글루코네이트 리프레서 변이체, 본 출원의 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 본 출원의 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 및 본 출원의 미생물을 이용한 L-아르기닌의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 신규한 글루코네이트 리프레서 변이체, 본 출원의 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 및 본 출원의 미생물을 이용한 L-아르기닌의 생산 방법에 관한 것이다.
L-아르기닌(L-arginine)은 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 종합 아미노산 제제 등의 의약용으로 사용되고 있으며, 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용 등의 식품용으로도 최근 각광받고 있는 물질이다. 산업적으로 이용 가능한 고농도의 아르기닌을 생산하기 위하여 미생물을 이용하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아르기닌의 생산을 위해 코리네박테리움 속 균주에서 주로 L-아르기닌 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 L-아르기닌의 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-1102263호).
그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물, 본 출원의 미생물을 배양한 배지 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물의 L-아르기닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체를 제공한다.
본 출원에서 용어, "글루코네이트 리프레서 변이체"는 글루코네이트 리프레서 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 글루코네이트 리프레서 변이체를 의미한다.
본 출원에서, 용어 "글루코네이트 리프레서(Gluconate repressor, GntR)"는 글루코네이트 대사 또는 당 유입 등에 관여하는 조절 단백질을 의미한다. 상기 글루코네이트 리프레서는 용어 "글루코네이트 리프레서 단백질"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 글루코네이트 리프레서 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 코리네박테리움 속 미생물, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 글루코네이트 리프레서 단백질 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 그 예로 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 글루코네이트 리프레서 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank또는 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코리네박테리움 속 유래 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드/단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 이외에 추가적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "다른 아미노산"은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
아미노산은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 분류할 수 있다.
이러한 분류의 예로, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산; 비극성 곁사슬(nonpolar side chain)을 갖는 아미노산(비극성 아미노산)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린; 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 곁사슬을 갖는 아미노산(극성 아미노산)은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 속하는 것으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인(electrically charged amino acid) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산과, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산(uncharged amino acid; neutral amino acid로도 지칭)인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산(aromatic amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 발린, 류신, 이소류신은 분지쇄 아미노산(branched amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 20종 아미노산을 크기에 따라 분류하여 상대적으로 부피(volume)가 작은 아미노산 그룹부터 글리신, 알라닌, 세린; 시스테인, 프롤린, 쓰레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴; 발린, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민; 이소류신, 류신, 메치오닌, 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신의 5군으로 분류할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, "서열번호 1에서 36번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었다"고 기재하는 경우, 서열번호 1에서 36번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신 (isoleucine)을 제외한 아스파라긴 (asparagine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글리신(glycine), 알라닌 (alanine), 아르기닌 (arginine), 아스파테이트 (aspartate), 시스테인 (cysteine), 글루탐산 (glutamate), 류신(leucine), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 타이로신 (tyrosine), 리신 (lysine), 트립토판 (tryptophan), 발린 (valine), 메티오닌 (methionine) 또는 트레오닌 (threonine)으로 치환되는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질"이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 출원의 "N번 위치"는 N번 위치 및 N번 위치와 상응(Correspoding)하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 구체적으로 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)에서 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 상기 특정 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번, 59번, 60번, 63번, 79번 및 92번에 상응하는 위치 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산의 아스파라긴으로의 치환, 59번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 60번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환, 63번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 79번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산의 아스파라긴으로의 치환, 59번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 60번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환, 63번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 79번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하고, 추가적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 리신으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산은 극성 아미노산인 세린, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민 중 선택되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 59번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 60번 위치에 상응하는 아미노산이 류신(L)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 63번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌(A)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 92번 위치에 상응하는 아미노산이 류신(L)으로 치환된 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 70번 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 70번 위치에 상응하는 아미노산이 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 글루탐산 및 아스파르트산 중 선택되는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로, 상기 아미노산은 염기성 아미노산인 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘 중 선택되는 아미노산일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 70번 위치에 상응하는 아미노산이 라이신(K)으로 치환된 변이체일 수 있다.
한편, 당업자라면 당업계에 알려진 서열 얼라인먼트를 통해 임의의 아미노산 서열에서 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 70번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산을 파악할 수 있으며, 본 출원에서 별도로 기재하지 않더라도 "특정 서열번호에서 특이적 위치의 아미노산"를 기재하는 경우, 임의의 아미노산 서열에서 그와 "상응하는 위치의 아미노산"까지 포함하는 의미임은 자명하다.
또한 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치, 59번 위치, 60번 위치, 63번 위치, 79번 위치, 92번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하거나, 서열번호 1의 N-말단으로부터 36번 위치, 59번 위치, 60번 위치, 63번 위치, 79번 위치, 92번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 이외에 추가적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 본 출원의 변이체는 서열번호 23 내지 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 또는, 상기 서열번호 23 내지 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트를 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신. 메티오닌, 페닐알라닌. 트립토판, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 글루코네이트 리프레서 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 글루코네이트 리프레서 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 L-아르기닌 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 일 예로, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30 내지 서열번호 36으로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 30 내지 서열번호 36으로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 본 출원의 변이체의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 출원에서 사용된 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 미생물에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 미생물 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 미생물에 도입되어 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체, 상기 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 일 수 있다.
본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체 또는 L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물 일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 미생물은 자연적으로 글루코네이트 리프레서 또는 L-아르기닌 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 글루코네이트 리프레서 또는 L-아르기닌 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-아르기닌 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "L-아르기닌"(L-Arginine)은 모든 생물체에 존재하는 조건부 필수 아미노산으로서, C6H14N4O2의 화학식을 갖는 L-아미노산을 의미한다. L-아르기닌은 미생물 중에서도 주로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에 의해 생산되는 것으로 알려져 있으나, 이들은 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의 L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물"은 L-아르기닌을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, L-아르기닌 생산능이 없는 모균주에 L-아르기닌의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로 L-아르기닌 생산능을 갖는 미생물을 포함한다. L-아르기닌 생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 글루코네이트 리프레서 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
상기 비변형 미생물은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물은 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물(예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 미생물(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 미생물은 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물일 수 있다. 또한, 본 출원의 미생물은 본 출원의 변이체를 포함하여 L-아르기닌을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 글루코네이트 리프레서 변이체가 발현되어, L-아르기닌 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-아르기닌 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 글루코네이트 리프레서 비변형 미생물(즉, 야생형 글루코네이트 리프레서를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 변이체를 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-아르기닌 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 L-아르기닌 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모균주 또는 글루코네이트 리프레서 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물의 L-아르기닌 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 10.5% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5%이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상 또는 약 19% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하 또는 약 25% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-아르기닌 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 약 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상 또는 약 1.19배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.3배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물이 L-아르기닌을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 모두 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 천연의 야생형 미생물 자체, L-아르기닌 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 L-아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 L-아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 생산방법을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 L-아르기닌 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-아르기닌은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-아르기닌 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 L-아르기닌을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 L-아르기닌을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-아르기닌 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-아르기닌 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 상기 미생물을 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-아르기닌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물의 L-아르기닌 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 글루코네이트 리프레서 변이체를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 경우, 상기 변이체를 포함하지 않는 미생물에 비하여 고수율의 L-아르기닌 생산이 가능하다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 글루코네이트 리프레서(gntR1) 변이 벡터 제작
각각 서열번호 23 내지 서열번호 29로 표시되는 gntR1(I36N), gntR1(R59A), gntR1(T60L), gntR1(R63A), gntR1(E70K), gntR1(R79A), gntR1(A92L) 변이형을 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주에 삽입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 1의 프라이머 쌍 (서열번호 3 및 5, 서열번호 4 및 6, 서열번호 3 및 7, 서열번호 4 및 8, 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 3 및 11, 서열번호 4 및 12, 서열번호 3 및 13, 서열번호 4 및 14, 서열번호 3 및 15, 서열번호 4 및 16, 서열번호 3 및 17, 서열번호 4 및 18) 들을 이용한 PCR 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용한 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 각각의 gntR1-I36N, R59A, T60L, R63A, E70K, R79A, A92L 변이 서열을 가지는 상동재조합 단편(이하, 각각 "변이 도입 단편 1" 내지 "변이 도입 단편 7")을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
이어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호) 벡터 와 PCR로 증폭된 상기 단편을 염색체 도입용 제한효소 BamHI과 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결하여 각 변이 도입 단편이 삽입된 플라스미드를 제조한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 상기 LB 고체배지에서 상기 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 각각 상기 변이 도입 단편 1 내지 변이 도입 단편 7을 포함하는 벡터(재조합 플라스미드) pDCM2-gntR1(I36N), pDCM2-gntR1(R59A), pDCM2-gntR1(T60L), pDCM2-gntR1(R63A), pDCM2-gntR1(E70K), pDCM2-gntR1(R79A), pDCM2-gntR1(A92L)를 제조하였다.
| No. | 명칭 | DNA 서열 (5'-3') |
| 서열번호 3 | gntR1-AF | tcggtacccggggatccAAGCAACCGTCGGCGAG |
| 서열번호 4 | gntR1-BR | tgcaggtcgactctagaTTTCGGGACGCAGTTTC |
| 서열번호 5 | gntR1(I36N)-AR | AGCAACCTTGCCACTGtTGATATCTTGACCGAGC |
| 서열번호 6 | gntR1(I36N)-BF | aCAGTGGCAAGGTTGCTGTCGGAGATACCTTCAAG |
| 서열번호 7 | gntR1(R59A)-AR | TCGCGTGCCACTGTGgcGGAAATACCAAAACGC |
| 서열번호 8 | gntR1(R59A)-BF | gcCACAGTGGCACGCGAAGCAATGCGCGCTTTG |
| 서열번호 9 | gntR1(T60L)-AR | GCTTCGCGTGCCACTagGCGGGAAATACCAAAACG |
| 서열번호 10 | gntR1(T60L)-BF | ctAGTGGCACGCGAAGCAATGCGCGCTTTGGAGCA |
| 서열번호 11 | gntR1(R63A)-AR | GCGCGCATTGCTTCGgcTGCCACTGTGCGGG |
| 서열번호 12 | gntR1(R63A)-BF | gcCGAAGCAATGCGCGCTTTGGAGCAGCTCGGTC |
| 서열번호 13 | gntR1(E70K)-AR | CGAGCTGcttCAAAGCGCGCATTGCTTCGCGTGC |
| 서열번호 14 | gntR1(E70K)-BF | CGCTTTGaagCAGCTCGGTCTTGTCGCTTCTTCAC |
| 서열번호 15 | gntR1(R79A)-AR | GTAATGCCAATGCGAgcTGAAGAAGCGACAAGACC |
| 서열번호 16 | gntR1(R79A)-BF | gcTCGCATTGGCATTACTGTTTTGCCACAGGAAG |
| 서열번호 17 | gntR1(A92L)-AR | GACTTATCAAAAACAagCCACTCTTCCTGTGGC |
| 서열번호 18 | gntR1(A92L)-BF | ctTGTTTTTGATAAGTCCATCATTCGCTGGCGTC |
실시예 2. KCCM10741P 균주 기반 글루코네이트 리프레서(gntR1) 변이체를 포함하는 균주 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가
실시예 2-1. 균주 제작
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P (US 8034602 B2)의 gntR1 유전자에 변이를 도입하기 위해 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 플라스미드(pDCM2-gntR1(I36N), pDCM2-gntR1(R59A), pDCM2-gntR1(T60L), pDCM2-gntR1(R63A), pDCM2-gntR1(E70K), pDCM2-gntR1(R79A), pDCM2-gntR1(A92L))를 이용하여 각각 형질 전환시켰다 (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 이어서, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하고, 2차 재조합이 완료된 형질 전환주를 대상으로 프라이머 쌍 (서열번호 3 및 4)을 이용해 PCR을 수행하여 염색체상 gntR1 유전자에 각각의 변이가 도입되었음을 확인하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.
상기 형질 전환주를 각각 KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(E70K), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L) 라 명명하였다.
실시예 2-2. L-아르기닌 생산능 평가
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, 상기 실시예 2-1에서 제작된 형질 전환주(각gntR1 변이체 도입 균주, KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(E70K), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L))들의 L-아르기닌 생산능을 비교하기 위하여 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-아르기닌의 농도를 분석하였다.
하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P와 상기 실시예 2-1에서 제작된 형질 전환주(각gntR1 변이체 도입 균주)들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종배지와 생산배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.2)>
포도당 20g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.2)>
포도당 60g, 황산암모늄 45g, 황산마그네슘7수염 2g, 제1인산칼륨 2g, 염화암모늄 10g, 비오틴 0.01mg, 티아민-HCl 0.1mg, 판토텐산칼슘 2mg, 니코틴아마이드 3mg, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, 황산아연 0.02mg, 황산구리 0.5mg , 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 사용하여 L-아르기닌의 생산능(농도)을 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 2에 나타내었다.
| 균주명 | L-아르기닌 (g/L) | ||||
| 배치1 | 배치2 | 배치3 | 평균 | ||
| 대조군 | KCCM10741P | 2.9 | 3.0 | 3.1 | 3.0 |
| 실험군 | KCCM10741P-gntR1(I36N) | 3.4 | 3.6 | 3.5 | 3.5 |
| KCCM10741P-gntR1(R59A) | 3.6 | 3.3 | 3.5 | 3.5 | |
| KCCM10741P-gntR1(T60L) | 3.4 | 3.5 | 3.5 | 3.5 | |
| KCCM10741P-gntR1(R63A) | 3.6 | 3.5 | 3.0 | 3.4 | |
| KCCM10741P-gntR1(E70K) | 3.6 | 3.8 | 3.2 | 3.5 | |
| KCCM10741P-gntR1(R79A) | 3.4 | 3.7 | 3.5 | 3.5 | |
| KCCM10741P-gntR1(A92L) | 3.6 | 3.5 | 3.3 | 3.5 | |
그 결과, 상기 형질 전환주(각 gntR1 변이체 도입 균주, KCCM10741P-gntR1(I36N), KCCM10741P-gntR1(R59A), KCCM10741P-gntR1(T60L), KCCM10741P-gntR1(R63A), KCCM10741P-gntR1(E70K), KCCM10741P-gntR1(R79A), KCCM10741P-gntR1(A92L))들 모두에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 약 17% 증가함을 확인하였다.
실시예 3. CJ1R 균주 기반 글루코네이트 리프레서(gntR1) 변이체를 포함하는 균주 제작 및 L-아르기닌 생산능 평가
실시예 3-1. CJ1R 균주 제작
L-아르기닌 생산능을 가지는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서도 L-아르기닌 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주(ATCC13869)에 1종의 변이(△argR)를 도입하여 L-아르기닌을 생산능을 가진 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 CJ1R을 추가 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 클루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 표 3의 프라이머 쌍 (서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22) 들을 이용한 PCR 및 서열번호 19 및 22의 프라이머 쌍을 이용한 오버랩핑 (overlapping) PCR을 수행하여 argR 결손 변이 서열을 가지는 상동재조합 단편을 수득하였다. 이때 PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다.제작된 벡터(재조합 플라스미드)는 pDCM2-△argR 이라 명명하였다.
| No. | 명칭 | DNA 서열 (5’-3’) |
| 서열번호 19 | argR-AF | tcggtacccggggatccAGCAGGCCTTAAGGGTAAG |
| 서열번호 20 | argR-AR | AGGGGCGCTGTCTTACCTCGGCTGGTGGGCCAGC |
| 서열번호 21 | argR-BF | GGTAAGACAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATC |
| 서열번호 22 | argR-BR | tgcaggtcgactctagaACCGTTGAACTGCTTGCCAG |
이어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13869)에 상기 제작된 pDCM2-△argR을 형질 전환시켰으며(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), 이어, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하고, 2차 재조합이 완료된 형질 전환주를 대상으로 프라이머 쌍(서열번호 19 및 22)을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 argR이 결손된 균주를 확인하였다. 이때, PCR 반응은 95 ℃, 30 초 변성; 55 ℃, 30 초 어닐링; 및 72 ℃, 1 분 신장 과정을 30 회 반복하여 수행하였다. 상기 형질 전환주를 CJ1R라 명명하였다.
실시예 3-2. CJ1R 균주 기반 글루코네이트 리프레서(gntR1) 변이체를 포함하는 균주 제작
CJ1R 균주에 gntR1 변이를 도입하기 위해 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 실시예 1에서 제작한 벡터가 각각 도입된 변이주를 제작하고, 상기 변이주를 각각 CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(E70K), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L) 라 명명하였다.
실시예 3-3. L-아르기닌 생산능 평가
L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1R, 상기 실시예 3-2에서 제작된 변이주(각 gntR1 변이체 도입 균주, CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(E70K), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L))들의 L-아르기닌 생산능을 비교하기 위하여 실시예 2-2와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-아르기닌의 농도를 분석하였다.
배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)를 사용하여 L-아르기닌의 생산능(농도)을 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 4에 나타내었다.
| 균주명 | L-아르기닌 (g/L) | ||||
| 배치1 | 배치2 | 배치3 | 평균 | ||
| 대조군 | CJ1R | 2.0 | 2.2 | 2.1 | 2.1 |
| 실험군 | CJ1R-gntR1(I36N) | 2.5 | 2.7 | 2.5 | 2.6 |
| CJ1R-gntR1(R59A) | 2.3 | 2.6 | 2.8 | 2.6 | |
| CJ1R-gntR1(T60L) | 2.6 | 2.5 | 2.4 | 2.5 | |
| CJ1R-gntR1(R63A) | 2.4 | 2.4 | 2.6 | 2.5 | |
| CJ1R-gntR1(E70K) | 2.7 | 2.4 | 2.5 | 2.5 | |
| CJ1R-gntR1(R79A) | 2.5 | 2.6 | 2.7 | 2.6 | |
| CJ1R-gntR1(A92L) | 2.5 | 2.5 | 2.3 | 2.4 | |
그 결과, 상기 변이주(각 gntR1 변이체 도입 균주, CJ1R-gntR1(I36N), CJ1R-gntR1(R59A), CJ1R-gntR1(T60L), CJ1R-gntR1(R63A), CJ1R-gntR1(E70K), CJ1R-gntR1(R79A), CJ1R-gntR1(A92L))들 모두에서 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 약 19% 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Novel gluconate repressor variant and a method for producing
L-arginine using the same
<130> KPA211923-KR
<160> 36
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor
<400> 1
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor
<400> 2
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tcggtacccg gggatccaag caaccgtcgg cgag 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tgcaggtcga ctctagattt cgggacgcag tttc 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
agcaaccttg ccactgttga tatcttgacc gagc 34
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
acagtggcaa ggttgctgtc ggagatacct tcaag 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
tcgcgtgcca ctgtggcgga aataccaaaa cgc 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gccacagtgg cacgcgaagc aatgcgcgct ttg 33
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gcttcgcgtg ccactaggcg ggaaatacca aaacg 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ctagtggcac gcgaagcaat gcgcgctttg gagca 35
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gcgcgcattg cttcggctgc cactgtgcgg g 31
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
gccgaagcaa tgcgcgcttt ggagcagctc ggtc 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
cgagctgctt caaagcgcgc attgcttcgc gtgc 34
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
cgctttgaag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcac 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
gtaatgccaa tgcgagctga agaagcgaca agacc 35
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
gctcgcattg gcattactgt tttgccacag gaag 34
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
gacttatcaa aaacaagcca ctcttcctgt ggc 33
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
cttgtttttg ataagtccat cattcgctgg cgtc 34
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
tcggtacccg gggatccagc aggccttaag ggtaag 36
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
aggggcgctg tcttacctcg gctggtgggc cagc 34
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
ggtaagacag cgcccctagt tcaaggcttg ttaatc 36
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
tgcaggtcga ctctagaacc gttgaactgc ttgccag 37
<210> 23
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 23
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Asn Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 24
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 24
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Ala Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 25
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 25
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Leu Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 26
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 26
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 27
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 27
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Lys Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 28
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 28
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 29
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 29
Met Pro Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly
20 25 30
Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu
35 40 45
Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu
50 55 60
Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Leu Val Phe Asp Lys
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala
115 120 125
Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala
145 150 155 160
Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu
165 170 175
Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro
195 200 205
Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu
210 215 220
Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
245 250
<210> 30
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 30
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcaacag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 31
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 31
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttccgccaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 32
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 32
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgccta 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 33
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 33
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcagccg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 34
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 34
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttgaag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 35
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 35
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcagctcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
<210> 36
<211> 753
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gluconate repressor variant
<400> 36
atgcccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60
aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120
gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggtat ttcccgcaca 180
gtggcacgcg aagcaatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240
attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tggcttgttt ttgataagtc catcattcgc 300
tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360
attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420
gagaaaatcc gcgcgctggc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480
tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcacc ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540
aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600
ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660
gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720
gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753
Claims (12)
- 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산, 59번째 위치에 상응하는 아미노산, 60번째 위치에 상응하는 아미노산, 63번째 위치에 상응하는 아미노산, 79번째 위치에 상응하는 아미노산 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 변이체는 추가적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 글루코네이트 리프레서 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 36번째 위치에 상응하는 아미노산의 아스파라긴으로의 치환, 59번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 60번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환, 63번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환, 79번째 위치에 상응하는 아미노산의 알라닌으로의 치환 및 92번째 위치에 상응하는 아미노산의 류신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 것인, 글루코네이트 리프레서 변이체.
- 제2항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 리신인 것인, 글루코네이트 리프레서 변이체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글루코네이트 리프레서 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글루코네이트 리프레서 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물은 L-아르기닌 생산능을 가지는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열의 70번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 글루코네이트 리프레서 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물로서,
상기 코리네박테리움 속 미생물은 L-아르기닌 생산능을 가지는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
- 제9항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
- 제6항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌의 생산 방법.
- 제9항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아르기닌의 생산 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220061011A KR20230161244A (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
| PCT/KR2022/016417 WO2023224183A1 (ko) | 2022-05-18 | 2022-10-26 | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220061011A KR20230161244A (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230161244A true KR20230161244A (ko) | 2023-11-27 |
Family
ID=88835429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220061011A KR20230161244A (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230161244A (ko) |
| WO (1) | WO2023224183A1 (ko) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| EP1362866A1 (en) * | 2002-05-16 | 2003-11-19 | Basf Aktiengesellschaft | Use of the repressor glxR for the synthesis of lysine in Corynebacterium glutamicum |
| KR101640711B1 (ko) * | 2015-04-20 | 2016-07-19 | 씨제이제일제당 (주) | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
-
2022
- 2022-05-18 KR KR1020220061011A patent/KR20230161244A/ko not_active Application Discontinuation
- 2022-10-26 WO PCT/KR2022/016417 patent/WO2023224183A1/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023224183A1 (ko) | 2023-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102277408B1 (ko) | 신규한 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
| KR102634303B1 (ko) | 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 | |
| KR102284731B1 (ko) | 신규한 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 | |
| KR102277410B1 (ko) | 신규한 이중기능성 pyr 오페론 전사조절자/우라실 포스포리보실 전달 효소 변이체 및 이를 이용한 IMP 생산 방법 | |
| KR102273638B1 (ko) | 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
| KR102525073B1 (ko) | 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
| KR102273640B1 (ko) | 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 감마 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
| KR102279696B1 (ko) | 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법 | |
| KR102267931B1 (ko) | 신규한 5-(카르복시아미노)이미다졸리보뉴클레오티드합성효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
| KR20230161244A (ko) | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 | |
| KR102673796B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
| KR102688095B1 (ko) | 변이형 SpoT 단백질 및 이를 이용한 L-아미노산을 생산하는 방법 | |
| KR102619598B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
| KR102419166B1 (ko) | 신규한 글루타민 가수분해 gmp 합성효소 변이체 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 | |
| CN114269909B (zh) | 新型可溶性吡啶核苷酸转氢酶变体及使用其生产l-色氨酸的方法 | |
| RU2792640C1 (ru) | Новый вариант глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и способ получения l-валина с его применением | |
| RU2793436C1 (ru) | Новый вариант сахарофосфат-изомеразы/эпимеразы и способ получения l-лизина с его применением | |
| KR20230161245A (ko) | 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 | |
| KR102279137B1 (ko) | 신규한 아데닌 포스포리보실기 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 | |
| KR102281371B1 (ko) | 신규한 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
| KR102527102B1 (ko) | 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 | |
| RU2793368C1 (ru) | Новый вариант регулятора транскрипции и способ получения L-валина с его применением | |
| EP4098658B1 (en) | Novel protein variant and method for producing l-lysine using same | |
| RU2793429C1 (ru) | Новый вариант дигидролипоамидацетилтрансферазы и способ получения l-валина с его применением | |
| EP4092114B1 (en) | Novel 2-isopropylmalate synthase variant and method for producing l-valine using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |