KR101640711B1

KR101640711B1 - 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법

Info

Publication number: KR101640711B1
Application number: KR1020150055495A
Authority: KR
Inventors: 박상희; 김형준; 김남현; 문준옥; 오정석; 유송기; 최향
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2016-07-19
Also published as: CN107849094A; JP6465997B2; WO2016171392A1; US10253339B2; HUE045394T2; EP3287469A4; JP2018512877A; EP3287469A1; ES2745561T3; CN107849094B; PL3287469T3; BR112017022528A2; US20180100173A1; DK3287469T3; EP3287469B1; RU2681475C1; MY176584A

Abstract

본 발명은 신규 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신 생산방법에 관한 것이다.

Description

글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신 생산방법{A gluconate repressor variant, a microorganism comprising the same and a method for producing L-lysine using the microorganism}

아미노산 등 유용 산물의 대량 생산을 위하여 코리네박테리움 균주에서 당 유입과 오탄당 인산화 경로의 조절은 매우 중요하다(Handbook of Corynebacterium glutamicum. 2005. 215-240).

글루코네이트 리프레서(Gluconate repressor, 이하 GntR)는 당 유입 및 오탄당 인산화 경로를 통한 탄소 흐름을 조절하는 중요한 조절 단백질로서, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에는 2개의 글루코네이트 리프레서(GntR1 및 GntR2)가 알려져 있다. GntR1 및 GntR2는 글루코네이트(gluconate) 대사에 관련된 글루코네이트 퍼미에이즈(gluconate permease, gntP), 글루코네이트 카이네이즈(gluconate kinase, gntK), 6-포스포글루코네이트 디하이드로지네이즈(6-phosphogluconate dehydrogenase, gnd)를 암호화하는 유전자의 발현을 강하게 억제하고, 오탄당 인산화경로의 주요 유전자인 tkt-tal-zwf-opcA-devB 오페론의 발현을 약하게 억제하는 역할을 한다. 한편, 코리네박테리움 균주의 주요 당유입 대사 경로인 포스포트란스퍼레이즈 시스템(Phospho-Transferase System, PTS)의 포도당 특이적 트랜스포터 효소 II(glucose-specific transpoter enzyme II, ptsG) 및 원당 특이적 트랜스포터 효소 II(sucrose-specific transpoter enzyme II, ptsS)를 암호화하는 유전자의 발현을 촉진하여 당 유입에도 중요하게 관여한다(Julia Frunzke, Verena Engels, Sonja Hasenbein, Cornelia Gatgens and Michael Bott, Molecular Microbiology (2008) 67(2), 305-322).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 L-라이신 생산성에 유효한 효과를 주는 유전자를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 신규 변이형 글루코네이트 리프레서 1(Gluconate repressor, GntR1)을 개발하였고, 이를 포함하는 L-라이신을 생산하는 미생물의 경우, 야생형 글루코네이트 리프레서 1을 포함하는 미생물에 비하여 당 소모 속도 및 L-라이신 생산성이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 글루코네이트 리프레서 단백질의 신규한 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 발현하는, L-라이신을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 L-라이신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 구현하는 하나의 양태는, 글루코네이트 리프레서 단백질의 신규한 변이체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "글루코네이트 리프레서 단백질"은 글루코네이트 대사 또는 당 유입 등에 관여하는 조절 단백질을 의미한다. 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 코리네박테리움 속 미생물, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 글루코네이트 리프레서 단백질일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 GntR1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 그 예로 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 GntR1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열 및 이와 80%이상, 구체적으로는 90%이상, 더욱 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99%이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 글루코네이트 리프레서 단백질은 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 gntR1 유전자에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 서열번호 3의 염기 서열 및 이와 80%이상, 구체적으로는 90%이상, 더욱 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99%이상의 상동성을 갖는 염기 서열일 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 102번째 아미노산인 알지닌(arginine, R)이 알지닌 이외의 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드일 수 있다. 구체적으로 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체는 102번째 위치의 알지닌이 시스테인(cysteine, C)으로 치환되어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

이러한 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드뿐만 아니라, 이와 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 변이체로서, 실질적으로 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명의 또 하나의 양태는 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다.

상기 글루코네이트 리프레서 단백질 및 이의 변이체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 예로 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일한 아미노산 서열을 코딩하는, 다양한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 또한, 숙주세포의 종류에 따라 발현을 최적화하기 위하여 코돈-최적화된 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주세포로의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ (한국 등록특허 제10-0924065호; 본원 발명에서 전체로서 인용되어 포함된다.)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "형질전환"은 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다.

상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 발현 카세트의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 하나의 양태는 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 발현하는, L-라이신을 생산하는 미생물이다.

본 발명에서 용어, "L-라이신"은 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며, 화학식은 NH₂(CH₂)₄CH(NH₂)COOH인 L-아미노산의 일종을 의미한다. L-라이신은 옥살아세트산으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다. 1 분자의 L-라이신 생합성 과정에서 3분자의 NADPH가 당 효소들에 의해 직접적으로 소모되며, 1분자의 NADPH가 간접적으로 이용된다.

상기 미생물은 돌연변이에 의해 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 포함하거나, 상기 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

상기 미생물은 당해 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체 활성을 가지는 단백질을 포함하거나 당해 당백질이 발현되도록 형질전환이 된다면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이고, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 글루코네이트 리프레서 단백질의 변이체 단백질이 L-라이신을 생산하는 미생물에 포함되는 경우, 야생형 글루코네이트 리프레서 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 당을 효과적으로 소모하여 L-라이신의 생산능을 높일 수 있다.

상기 L-라이신을 생산하는 미생물은 L-라이신 생산능을 갖는다면 미생물의 종류에 대해 제한없이 포함하며, 천연형 균주 및 재조합 균주의 형태를 모두 포함한다.

L-라이신 생산능을 가질 수 있는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신 유사체에 내성을 갖는 변이주가 될 수도 있다. L-라이신 유사체는 코리네 미생물의 생육을 저해하지만, 이러한 저해는 L-라이신이 배지에 공존할 때에는 완전히 또는 부분적으로 해제된다. L-라이신 유사체의 예로서는, 옥사 L-라이신, L-라이신하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸 L-라이신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 L-라이신 유사체에 대하여 내성을 갖는 변이주는, 코리네박테리움 속 미생물에 통상의 인공변이처리로 처리함으로써 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대한 비제한적인 예로, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(대한민국 등록특허 제10-0159812호, 대한민국 등록특허 제10-0397322호), 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P(대한민국 등록특허 제10-0073610호)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

또한, L-라이신 생산능을 가질 수 있는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신 생합성 관련 단백질의 활성이 비변이 균주에 비하여 강화되도록 변형된 것일 수 있다. 즉, L-라이신 생합성 관련 유전자 1종 이상의 발현을 향상시키는 경우를 들 수 있다. 이러한 발현 향상은 유전자 증폭, 프로모터 또는 개시코돈과 같은 서열의 교체 혹은 변형, 발현이 향상되도록 변이의 도입 등으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대한 비 제한적인 예로, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

또한, L-라이신 생합성 관련 유전자의 예로서는, L-라이신 생합성 경로 상에 위치하는 유전자를 들 수 있으며, 구체적으로 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(dapA), 아스파르토 키나제 유전자(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디아미노피멜산 데카르복실라제 유전자(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh), 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 아스파르타제 유전자(aspA), 파이루베이트 카르복실라제(Pyc)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 펜토스 포스페이트 경로 상에 존재하는 트랜스케토라제(tkt) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 L-라이신 생산능을 가질 수 있는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신 생산과 관련된 당업계에 공지된 변이를 포함하도록 함으로써 L-라이신 생산능을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 하나의 양태는 (a) 상기 L-라이신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법이다.

상기 L-라이신, 및 이를 생산하는 미생물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 구체적인 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 당업자의 일반적인 지식 또는 종래에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 이에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 구체적으로는 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 30℃ 내지 35℃이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100시간일 수 있다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법에는 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-라이신 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 글루코네이트 리프레서 변이체를 포함하는 L-라이신을 생산하는 미생물은 상기 변이체를 포함하지 않는 미생물에 비하여 향상된 당 소모 속도를 나타내어, L-라이신의 효과적인 생산을 가져올 수 있다. 특히, L-라이신은 동물사료의 필수 아미노산으로 산업적으로 대량 생산이 요구되는 바, 본 발명에 따라 높은 효율로 L-라이신을 생산하면 사료 제조의 비용의 절감 효과도 얻을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 변이형 코리네박테리움 글루타미쿰 게노믹(genomic) DNA 라이브러리 제작

본 실시예에서는 L-라이신 생산능 및 생산성에 유효한 효과를 주는 유전자 및 변이를 발굴하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 N-메틸-N-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)에 의한 인공돌연변이를 유도한 후, 통상적으로 알려진 추출법에 의하여 게노믹 DNA를 추출하였다. 준비된 DNA에 제한효소 Sau3AI를 처리하여 1 내지 3 kb의 부분 절편을 획득하였다. 상기 절편을 제한효소 BamHI 말단을 갖는 대장균 및 코리네박테리움의 형질전환용 셔틀벡터 pECCG122에 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR(서열번호 5 및 6의 프라이머 이용)을 통해 상기 절편이 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 이들을 모두 혼합 배양하여 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법에 의해 플라스미드를 추출하였다.

서열번호 5 : TCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTAT

서열번호 6 : CCGCGCGTAATACGACTCACTATA

실시예 2: 인공 변이 라이브러리 도입 및 L-라이신 생산능 향상 균주 선별

KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여 받음, 대한민국 특허 등록번호 제10-0159812호) 균주를 모균주로 하여 상기 제작된 벡터를 형질전환하고 하기의 복합평판 배지에 도말하였다.

<복합평판 배지>

포도당 20 g, (NH₄)₂SO₄ 50 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 5 g, K₂HPO₄ 10 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, 한천 20 g, 카나마이신 25 mg (증류수 1리터 기준)

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확보된 약 10,000개의 콜로니를 각각 300 μL의 선별배지에 접종하여 96 딥 웰 플레이트(deep well plate)에서 32˚C, 1000 rpm 으로 약 16시간 동안 배양하였다. 배양 중 생산된 L-라이신의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388). 배양이 완료된 후 배양 상층액 10 μL와 닌하드린 반응용액 190 μL (63% 글리세롤, 27% 닌하이드린 용액)를 65˚C 에서 30분간 반응시킨 후 파장 570 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하고 대조구 (KCCM11016P/pECCG122)의 흡광도와 비교해 유사하거나 증가된 흡광도를 보이는 변이 균주 248종을 선별하였다. 상기 조건의 배양 시 대조구 균주는 1~2 g/l의 잔류당이 남아있기 때문에, 대조구 대비 당 소모속도가 빠르거나 라이신 생산능이 증가된 균주를 선별할 수 있었다.

<선별배지 (pH 8.0)>

포도당 10 g, 암모늄 설페이트 (ammonium sulfate) 5.5 g, MgSO₄·7H₂O 1.2 g, KH₂PO₄ 0.8 g, K₂HPO₄ 16.4 g,바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

또한, 선별된 248종의 균주를 대상으로 상기의 방법을 반복수행하여 KCCM11016P/pECCG122 균주 대비 L-라이신 생산능이 10% 이상 향상된 상위 29종의 변이 균주를 선별하였다.

실시예 3: 인공변이 선별주의 L-라이신 생산능 및 당 소모속도 분석

상기 실시예 2에서 선별한 29종의 균주들의 L-라이신 생산능과 당 소모속도를 아래와 같은 방법으로 배양하여 분석하였다.

종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였고, 균주들의 당 소모속도 및 생산성을 측정하기 위하여 시간대별 배양액 중의 잔여 당 농도를 측정하였다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

29종의 변이 균주들 중 대조구 대비 L-라이신 농도는 동등수준 이상이고 당 소모속도 및 생산성이 증가된 3 종의 균주를 선별하여 상기 배양 및 분석을 반복수행 하였으며, 분석된 결과는 [표 1]과 같다.

균주 번호		잔류당 (g/L)		L-라이신 (g/L)	평균
균주 번호		18 시간	28 시간	L-라이신 (g/L)	평균
KCCM11016P /pECCG122	1	50.9	38.2	43.1	43.4
	2	51.9	39.8	42.5
	3	51.2	37.6	44.5
KCCM11016P/3	1	47.9	34.2	43.3	43.4
	2	48.6	33.8	43.8
	3	46.9	31.9	43.0
KCCM11016P/94	1	47	33.7	44.5	44.3
	2	46.7	33.6	44.3
	3	44.8	32.8	44.1
KCCM11016P/1160	1	42.2	26.8	44.2	43.9
	2	43.5	25.4	44.1
	3	42.9	24.3	43.5

상기 세 균주는 대조구와 동등수준 이상의 L-라이신을 생산하였으나, 단위시간당 당 소모속도가 대조구보다 향상되어 발효 생산성이 개선됨을 확인할 수 있었다. 선발된 변이주들 중 생산성이 가장 의미있게 향상된 균주 KCCM11016P/1160을 최종 선별하고 당 소모속도 및 생산성 증가를 유발한 근본적인 유전자 수준에서의 염기서열 돌연변이를 탐색하기 위하여 플라스미드를 추출하였다. 그 후, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였다. KCCM11016P/1160에서 유래된 플라스미드는 NCgl2440 유전자 ORF 개시코돈 상류 약 450 bp 지점부터 종결코돈 하류 약 350 bp 부근까지를 포함하고 있었다. 또한 미국 국립 보건원 유전자 은행(NIH GenBank)을 근거로 한 유전자의 염기서열 분석을 통하여 유전자가 글루코네이트 리프레서 중 하나인 gntR1임을 확인하였고, KCCM11016P/1160 균주에 도입된 gntR1 변이는 304번째 염기서열이 C에서 T로 치환되어 102번째 아미노산이 알지닌에서 시스테인으로 돌연변이되었음을 확인하였다.

즉, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 gntR1의 102번째 아미노산인 알지닌이 시스테인으로 치환되었음을 확인하였다.

실시예 4: gntR1 변이를 L-라이신 생산주의 염색체에 도입하기 위한 벡터 제작

상기 실시예 3에서 확인된 gntR1 변이 적용 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다.

보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 7)와 3' 말단에 SalⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 8)를 합성하였다. 이 프라이머 쌍을 이용하여, KCCM11016P/1160의 플라스미드를 주형으로 PCR을 수행하여 gntR1 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 40초 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.

서열번호 7: AAGAATTCAGCAGATCGAAGAAGAAGC

서열번호 8: AAGTCGACGGGACTAAAAGCTGGCG

PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 EcoRⅠ 및 SalⅠ말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제 10-0924065호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 gntR1에 삽입된 변이에 따라 pDZ-gntR1(R102C)로 명명하였다.

실시예 5: L-라이신 생산주인 KCCM11016P에 gntR1 변이를 도입한 균주의 제작 및 생산성 비교

상기 실시예 4에서 제조한 신규 변이 도입 벡터를 2단계 상동염색체 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 gntR1 변이가 도입된 균주를 염기서열 분석에 의하여 선별하였으며, 상기 gntR1 변이가 도입된 균주를 KCCM11016P::gntR1(R102C)로 명명하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신 농도 및 잔류 당 농도를 측정하였다. 또한 원당에서의 배양 효과도 확인하기 위하여 포도당 생산배지 대신 원당생산배지를 이용하여 동일한 방법으로 분석하였다[표 2].

<원당생산배지 (pH 7.0)>

원당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

	균주 번호		잔류당 (g/L)		L-라이신 (g/L)	평균
	균주 번호		18 시간	28 시간	L-라이신 (g/L)	평균
포도당	KCCM11016P	1	47.1	32.5	43.8	43.5
		2	46.2	33.8	42.6
		3	45	32.0	44.1
	KCCM11016P::GntR1(R102C)	1	34.5	21.4	43.5	43.9
		2	39.5	21.2	44.2
		3	37	20.6	43.9
원당	KCCM11016P	1	42.9	28.6	47.3	47.0
		2	42.0	29.1	46.
		3	41.0	28.4	47.6
	KCCM11016P::GntR1(R102C)	1	34.1	17.2	47	47.4
		2	35.2	16.3	47.7
		3	33.7	15.6	47.4

그 결과, 단위시간당 당 소모속도는 포도당 및 원당 배지에서 대조구인 KCCM11016P에 비해 KCCM11016P::gntR1(R102C)는 L-라이신 생산능에는 영향을 주지 않으면서 당 소모속도가 증가하였음을 확인하였다. 또한, 포도당 및 원당을 모두 소모한 시점을 확인한 결과, 대조구는 72시간, 68시간에 완전히 소모하고 L-라이신을 각각 43.5, 47.0 g/L 생산하였고, gntR1 변이 도입 균주는 60시간, 58시간에 L-라이신을 각각 43.9, 47.4 g/L 생산하였다. 즉, gntR1 변이를 도입한 균주의 경우, 시간당 L-라이신의 생산성이 포도당, 원당에서 각각 21 %, 18 % 증가되는 것을 확인하였다 [표 3].

	균주 번호	생산성 (g/h)	%
포도당	KCCM11016P	0.60	100
포도당	KCCM11016P::gntR1(R102C)	0.73	121
원당	KCCM11016P	0.69	100
원당	KCCM11016P::gntR1(R102C)	0.82	118

상기의 결과는 gntR1 변이의 도입이 동등수준의 L-라이신 생산능을 가지면서도 포도당 및 원당 소모속도에 효과적임을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 gntR1 변이를 도입한 경우, L-라이신 발효 생산성이 개선되는 효과의 우수성을 시사하는 것이다. 이에, 본 발명자들은 상기 당 소모속도 및 생산성이 향상된 균주인 KCCM11016P::gntR1(R102C)을 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2293"이라 명명하였고, 2014년 12월 5일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11628P를 부여받았다.

실시예 6: L-라이신 생산주인 KCCM11347P에 gntR1 변이를 도입한 균주의 제작 및 생산성 비교

코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서의 효과도 확인하기 위해 상기 실시예 5와 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 대한민국 특허 등록번호 제10-0073610호)에 gntR1 변이가 도입된 균주를 제작하고, KCCM11347P::gntR1(R102C)라고 명명하였다. 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 제작된 균주를 배양하고 라이신 생산능과 잔류당을 비교하였다[표 4].

	균주 번호		잔류당 (g/L)		L-라이신 (g/L)	평균
	균주 번호		18 시간	28 시간	L-라이신 (g/L)	평균
포도당	KCCM11347P	1	43.8	27.6	38.5	38.6
		2	42.6	28.8	38.7
		3	43.2	27.2	38.6
	KCCM11347P::gntR1(R102C)	1	39.2	18.2	38.6	38.7
		2	37.6	18.0	38.6
		3	37.0	17.5	38.9
원당	KCCM11347P	1	39.9	24.9	41.2	41.3
		2	39.3	25.3	41.4
		3	38.8	24.7	41.3
	KCCM11347P::gntR1(R102C)	1	35.7	14.4	41.3	41.4
		2	34.2	13.7	41.3
		3	33.3	13.1	41.6

그 결과, 상기 실시예 5에서와 마찬가지로 gntR1 변이 도입주는 대조구 대비 포도당, 원당에서 모두 당 소모속도가 증가하였음을 확인하였다. 또한, 포도당 및 원당을 모두 소모한 시점을 확인한 결과, 대조구는 72시간, 69시간에 당을 완전히 소모하고 L-라이신을 각각 38.6, 41.3 g/L 생산하였고, gntR1 변이 도입 균주는 61시간, 58시간에 L-라이신을 38.7, 41.4 g/L 생산하였다. 즉, gntR1 변이를 도입한 균주의 경우, 시간당 L-라이신의 생산성이 포도당, 원당에서 각각 18 %, 19 % 증가되는 것을 확인하였다[표 5].

	균주 번호	생산성 (g/h)	%
포도당	KCCM11347P	0.54	100
포도당	KCCM11347P::gntR1(R102C)	0.63	118
원당	KCCM11347P	0.60	100
원당	KCCM11347P::gntR1(R102C)	0.71	119

실시예 7: L-라이신 생산주인 CJ3P 에 gntR1 변이를 도입한 균주의 제작 및 생산성 비교

코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 또다른 균주에서의 효과도 확인하기 위해 상기 실시예 5과 같은 방법으로 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 gntR1 변이가 도입된 균주를 제작하고, CJ3P::GntR1(R102C)라고 명명하였다. CJ3P 균주는 공지된 기술을 바탕으로　야생주에 3종의 변이(pyc(Pro458Ser), hom(Val59Ala), lysC(Thr311Ile))를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다. 상기 실시예 5과 동일한 방법으로 제작된 균주를 배양하고 라이신 생산능과 시간대별 배양액 중의 잔여 당 농도를 측정하였다[표 6].

	균주 번호		잔류당 (g/L)		L-라이신 (g/L)	평균
	균주 번호		12 시간	18 시간	L-라이신 (g/L)	평균
포도당	CJ3P	1	37.2	23.6	8.1	8.2
		2	37.9	23.0	8.2
		3	37.4	21.1	8.2
	CJ3P::gntR1(R102C)	1	35.0	17.7	8.4	8.4
		2	35.5	17.5	8.3
		3	34.2	16.7	8.4
원당	CJ3P	1	34.3	21.5	8.7	8.8
		2	34.1	20.9	8.8
		3	32.7	19.2	8.8
	CJ3P::gntR1(R102C)	1	30.8	16.1	9.0	9.0
		2	31.8	15.9	8.9
		3	31.3	15.2	9.0

그 결과, 상기 실시예 5, 6에서와 마찬가지로 gntR1 변이 도입주는 대조구 대비 포도당 및 원당에서 모두 당 소모속도가 증가하였음을 확인하였다. 또한, 포도당 및 원당을 모두 소모한 시점을 확인한 결과, 대조구는 포도당과 원당을 각각 48시간, 42시간에 완전히 소모하고 L-라이신을 각각 8.2, 8.8 g/L 생산하였고, gntR1(R102C) 도입 균주는 42시간, 38시간에 L-라이신을 각각 8.4, 9.0 g/L 생산하였다, 즉, gntR1 변이를 도입한 균주의 경우, 시간당 L-라이신의 생산성이 17 %, 13 % 증가되는 것을 확인하였다[표 7].

	균주 번호	생산성(g/h)	%
포도당	CJ3P	0.17	100
포도당	CJ3P::gntR1(R102C)	0.20	117
원당	CJ3P	0.21	100
원당	CJ3P::gntR1(R102C)	0.24	113

따라서, 상기의 결과들로부터 코리네박테리움 속 유래 라이신 생산 균주에 gntR1 변이의 도입시 당 소모속도 증가로 인한 라이신 생산성 향상에 효과가 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11628P

20141205

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A gluconate repressor variant, a microorganism comprising the same and a method for producing L-lysine using the microorganism <130> KPA141340-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GntR1 (R102C) <400> 1 Met Thr Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Cys Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 2 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gntR1(R102C) <400> 2 atgaccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggcat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcgatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggtgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctcgc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcact ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atgaccccag caaacgaaag tcctatgact aatccattag gttctgcccc caccccagcc 60 aagccacttc ttgacagtgt tcttgatgag ctcggtcaag atatcatcag tggcaaggtt 120 gctgtcggag ataccttcaa gctgatggac atcggcgagc gttttggcat ttcccgcaca 180 gtggcacgcg aagcgatgcg cgctttggag cagctcggtc ttgtcgcttc ttcacgtcgc 240 attggcatta ctgttttgcc acaggaagag tgggctgttt ttgataagtc catcattcgc 300 tggcgtctca atgacgaagg tcagcgtgaa ggccagcttc agtctcttac cgagcttcgt 360 attgctattg aaccgattgc cgcgcgcagc gttgctcttc acgcgtcaac cgccgagctc 420 gagaaaatcc gcgcgctcgc aacagagatg cgtcagttgg gtgaatctgg tcagggtgcg 480 tcccagcgct tcctcgaagc ggacgtcact ttccacgagc tcatcttgcg ttattgccac 540 aatgagatgt tcgctgcact gattccgtcg attagcgcgg ttcttgtcgg ccgcaccgag 600 ctcggcctgc agcctgatct gccggcgcac gaggcgctag acaaccacga taagcttgcc 660 gacgccctcc ttaaccgcga cgccgacgcc gcagaaactg cgtcccgaaa catcctcaat 720 gaggtgcgca gcgcgctggg cacgctgaac taa 753 <210> 4 <211> 250 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Pro Ala Asn Glu Ser Pro Met Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Ala Lys Pro Leu Leu Asp Ser Val Leu Asp Glu Leu Gly 20 25 30 Gln Asp Ile Ile Ser Gly Lys Val Ala Val Gly Asp Thr Phe Lys Leu 35 40 45 Met Asp Ile Gly Glu Arg Phe Gly Ile Ser Arg Thr Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ala Met Arg Ala Leu Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Ser Ser Arg Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Pro Gln Glu Glu Trp Ala Val Phe Asp Lys 85 90 95 Ser Ile Ile Arg Trp Arg Leu Asn Asp Glu Gly Gln Arg Glu Gly Gln 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Thr Glu Leu Arg Ile Ala Ile Glu Pro Ile Ala Ala 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu His Ala Ser Thr Ala Glu Leu Glu Lys Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Thr Glu Met Arg Gln Leu Gly Glu Ser Gly Gln Gly Ala 145 150 155 160 Ser Gln Arg Phe Leu Glu Ala Asp Val Thr Phe His Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Arg Tyr Cys His Asn Glu Met Phe Ala Ala Leu Ile Pro Ser Ile Ser 180 185 190 Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Glu Leu Gly Leu Gln Pro Asp Leu Pro 195 200 205 Ala His Glu Ala Leu Asp Asn His Asp Lys Leu Ala Asp Ala Leu Leu 210 215 220 Asn Arg Asp Ala Asp Ala Ala Glu Thr Ala Ser Arg Asn Ile Leu Asn 225 230 235 240 Glu Val Arg Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn 245 250 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tcagggtgta gcggttcggt ttat 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ccgcgcgtaa tacgactcac tata 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aagaattcag cagatcgaag aagaagc 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aagtcgacgg gactaaaagc tggcg 25

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는, 글루코네이트 리프레서 활성을 갖는 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
제1항의 폴리펩타이드를 발현하는, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
(a) 제5항 또는 제6항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.