JP3008549B2 - 発酵法によるl−リジンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−リジンの製造法Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】L−リジンは、コーン等の飼料用
穀物中に不足しているため、ブロイラーや豚用の飼料に
添加物として用いられる重要なアミノ酸である。本発明
は発酵法によるL−リジンの製造法に関するものであ
る。
穀物中に不足しているため、ブロイラーや豚用の飼料に
添加物として用いられる重要なアミノ酸である。本発明
は発酵法によるL−リジンの製造法に関するものであ
る。
【0002】
【従来の技術】従来から知られている発酵法によるL−
リジンの製造法は、自然界から分離されたブレビバクテ
リウム属やコリネバクテリウム属等に属する微生物(以
下、野生株と記す)に、ホモセリン要求性、S−(2−
アミノエチル)−L−システイン耐性、α−クロロカプ
ラクタム耐性等のL−リジン生産能獲得に必要な性質を
付与し、これを糖や窒素源を含む培地に培養し、培養液
中に生成蓄積したL−リジンを樹脂吸着法等により採取
するものである。さらには、これらのL−リジン生産菌
の改良株(例えば、L−アラニン要求性株、フルオロピ
ルビン酸感受性株、L−ロイシンアナログ耐性株等)を
用いた製造法も検討されているが、L−リジンの発酵収
率はなお満足のいくものではなく、L−リジン生産能を
さらに高め発酵収率を向上させたL−リジン生産菌また
はその改良株を用いた、従来法より安価かつ効率的なL
−リジンの製造法の開発が望まれていた。
リジンの製造法は、自然界から分離されたブレビバクテ
リウム属やコリネバクテリウム属等に属する微生物(以
下、野生株と記す)に、ホモセリン要求性、S−(2−
アミノエチル)−L−システイン耐性、α−クロロカプ
ラクタム耐性等のL−リジン生産能獲得に必要な性質を
付与し、これを糖や窒素源を含む培地に培養し、培養液
中に生成蓄積したL−リジンを樹脂吸着法等により採取
するものである。さらには、これらのL−リジン生産菌
の改良株(例えば、L−アラニン要求性株、フルオロピ
ルビン酸感受性株、L−ロイシンアナログ耐性株等)を
用いた製造法も検討されているが、L−リジンの発酵収
率はなお満足のいくものではなく、L−リジン生産能を
さらに高め発酵収率を向上させたL−リジン生産菌また
はその改良株を用いた、従来法より安価かつ効率的なL
−リジンの製造法の開発が望まれていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、L−
リジン生産菌またはその改良株のL−リジン生産能をさ
らに高め発酵収率を向上させることにより、従来法より
安価かつ効率的なL−リジンの製造法を提供することで
ある。
リジン生産菌またはその改良株のL−リジン生産能をさ
らに高め発酵収率を向上させることにより、従来法より
安価かつ効率的なL−リジンの製造法を提供することで
ある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、L−リジ
ン生産菌またはその改良株のL−リジン生産能をさらに
高め発酵収率を向上させるために鋭意研究を重ねた結
果、アシルリジン及び/またはメチル化アシルリジンに
対する耐性を付与されたL−リジン生産性の変異株が、
その目的に適合しうる事を見い出し、この知見に基づい
て本発明を完成させるに至った。
ン生産菌またはその改良株のL−リジン生産能をさらに
高め発酵収率を向上させるために鋭意研究を重ねた結
果、アシルリジン及び/またはメチル化アシルリジンに
対する耐性を付与されたL−リジン生産性の変異株が、
その目的に適合しうる事を見い出し、この知見に基づい
て本発明を完成させるに至った。
【0005】すなわち、本発明は、アシルリジン及び/
またはメチル化アシルリジンに耐性を有し、かつ、L−
リジン生産能を有するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物を培養し、培養液中に
生成蓄積したL−リジンを採取することを特徴とする発
酵法によるL−リジンの製造法を提供するものである。
またはメチル化アシルリジンに耐性を有し、かつ、L−
リジン生産能を有するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物を培養し、培養液中に
生成蓄積したL−リジンを採取することを特徴とする発
酵法によるL−リジンの製造法を提供するものである。
【0006】本発明において使用するアシルリジンと
は、炭素数5から20の鎖長の脂肪酸がL体またはDL
体のリジンのα位及び/またはε位のアミノ基にアシル
結合した化合物を言う。このようなものとしては、例え
ば、Nα−ステアロイル−L−リジン、Nε−デカノイ
ル−L−リジン、Nε−ミリストイル−L−リジン、N
ε−パルミトイル−L−リジン、Nα、Nε−ジオクタ
ノイル−L−リジン、Nα、Nε−ジラウロイル−L−
リジン等がある。また、メチル化アシルリジンとはアシ
ルリジンのα位のアミノ基がメチル化された化合物を言
う。メチル化の数は1〜3のいずれでも良い。このよう
なものとしては、例えば、Nα−メチル−Nε−ステア
ロイル−L−リジン、Nα、Nα−ジメチル−Nε−デ
カノイル−DL−リジン、Nα、Nα−ジメチル−Nε
−パルミトイル−L−リジン、Nα、Nα、Nα−トリ
メチル−Nε−ミリストイル−DL−リジン、Nα、N
α、Nα−トリメチル−Nε−パルミトイル−DL−リ
ジン等がある。
は、炭素数5から20の鎖長の脂肪酸がL体またはDL
体のリジンのα位及び/またはε位のアミノ基にアシル
結合した化合物を言う。このようなものとしては、例え
ば、Nα−ステアロイル−L−リジン、Nε−デカノイ
ル−L−リジン、Nε−ミリストイル−L−リジン、N
ε−パルミトイル−L−リジン、Nα、Nε−ジオクタ
ノイル−L−リジン、Nα、Nε−ジラウロイル−L−
リジン等がある。また、メチル化アシルリジンとはアシ
ルリジンのα位のアミノ基がメチル化された化合物を言
う。メチル化の数は1〜3のいずれでも良い。このよう
なものとしては、例えば、Nα−メチル−Nε−ステア
ロイル−L−リジン、Nα、Nα−ジメチル−Nε−デ
カノイル−DL−リジン、Nα、Nα−ジメチル−Nε
−パルミトイル−L−リジン、Nα、Nα、Nα−トリ
メチル−Nε−ミリストイル−DL−リジン、Nα、N
α、Nα−トリメチル−Nε−パルミトイル−DL−リ
ジン等がある。
【0007】本発明において使用する変異株は、ブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、2
5mg/lの濃度のアシルリジンの存在下及び/または
25mg/lの濃度のメチル化アシルリジン存在下でも
生育可能な性質を持ち、さらに従来のL−リジン生産能
獲得のために必要な性質(ホモセリン要求、S−(2−
アミノエチル)−L−システイン耐性、α−クロロカプ
ラクタム耐性等)を有しているものである。具体的に例
示すれば、以下のものがある。
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、2
5mg/lの濃度のアシルリジンの存在下及び/または
25mg/lの濃度のメチル化アシルリジン存在下でも
生育可能な性質を持ち、さらに従来のL−リジン生産能
獲得のために必要な性質(ホモセリン要求、S−(2−
アミノエチル)−L−システイン耐性、α−クロロカプ
ラクタム耐性等)を有しているものである。具体的に例
示すれば、以下のものがある。
【0008】 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ12592 (FERM BP−3239) ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ12593 (FERM BP−3240) コリネバクテリウム・グルタミクム AJ12596 (FERM BP−3242)
【0009】この様な変異株を得る際に使用される親株
としては、すでにL−リジンを生産することが知られて
いるブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属
の変異株が用いられる。さらに以下に例示するような野
生株も親株として使用できる。
としては、すでにL−リジンを生産することが知られて
いるブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属
の変異株が用いられる。さらに以下に例示するような野
生株も親株として使用できる。
【0010】 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806
【0011】これらの野生株に先にL−リジン生産能を
付与した後アシルリジン及び/またはメチル化アシルリ
ジンに対する耐性を付けてもよいが、先にアシルリジン
及び/またはメチル化アシルリジンに対する耐性を付け
後でL−リジン生産能を付与してもよい。
付与した後アシルリジン及び/またはメチル化アシルリ
ジンに対する耐性を付けてもよいが、先にアシルリジン
及び/またはメチル化アシルリジンに対する耐性を付け
後でL−リジン生産能を付与してもよい。
【0012】これらの親株を変異処理する方法は、N−
メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以
下、NGと記す)に接触せしめる等の通常の方法が適用
できる。また、これらの変異株よりアシルリジン及び/
またはメチル化アシルリジン耐性株を選別するには、親
株では生育できない濃度のアシルリジンまたはメチル化
アシルリジンを含有する培地で生育してくる株を採取す
る方法が採用できる。この耐性株の取得のより具体的な
実験例を以下に示す。
メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以
下、NGと記す)に接触せしめる等の通常の方法が適用
できる。また、これらの変異株よりアシルリジン及び/
またはメチル化アシルリジン耐性株を選別するには、親
株では生育できない濃度のアシルリジンまたはメチル化
アシルリジンを含有する培地で生育してくる株を採取す
る方法が採用できる。この耐性株の取得のより具体的な
実験例を以下に示す。
【0013】L−リジン生産菌であるブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンタム AJ12435(FERM
BP−2294)を250μg/mlのNGで30℃
にて30分間処理した後、生残率1.0%の当該菌体
を、アシルリジンの1種であるNα、Nε−ジオクタノ
イル−L−リジンを50mg/l含む表1に示す最少培
地の寒天平板培地に播種し、30℃で1週間培養し、生
育したコロニーを採取した。尚、培地に添加するアシル
リジンまたはメチル化アシルリジンの濃度は使用する親
株の最少生育阻止濃度により適宜検討し、目的の耐性株
が効率よく採取出来るよう設定する。ここで得られた耐
性株の内の1株がブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムAJ12592(FERM BP−3239)で
あり、さらに以下の実験に供した。同様に、Nα、
Nα、Nα−トリメチル−Nε−パルミトイル−DL−
リジン耐性株としてブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ12593(FERM BP−3240)
を取得した。
ム・ラクトフェルメンタム AJ12435(FERM
BP−2294)を250μg/mlのNGで30℃
にて30分間処理した後、生残率1.0%の当該菌体
を、アシルリジンの1種であるNα、Nε−ジオクタノ
イル−L−リジンを50mg/l含む表1に示す最少培
地の寒天平板培地に播種し、30℃で1週間培養し、生
育したコロニーを採取した。尚、培地に添加するアシル
リジンまたはメチル化アシルリジンの濃度は使用する親
株の最少生育阻止濃度により適宜検討し、目的の耐性株
が効率よく採取出来るよう設定する。ここで得られた耐
性株の内の1株がブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムAJ12592(FERM BP−3239)で
あり、さらに以下の実験に供した。同様に、Nα、
Nα、Nα−トリメチル−Nε−パルミトイル−DL−
リジン耐性株としてブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ12593(FERM BP−3240)
を取得した。
【0014】
【表1】
【0015】また、コリネバクテリウム・グルタミクム
AJ3463(FERM−P1987)を親株とし
て、同様な操作によりN α 、N ε −ジオクタノイル−L
−リジン耐性株としてコリネバクテリウム・グルタミク
ム AJ12596(FERMBP−3242)を取得
することが出来た。
AJ3463(FERM−P1987)を親株とし
て、同様な操作によりN α 、N ε −ジオクタノイル−L
−リジン耐性株としてコリネバクテリウム・グルタミク
ム AJ12596(FERMBP−3242)を取得
することが出来た。
【0016】この様にして得られた各耐性株のアシルリ
ジンまたはメチル化アシルリジンに対する耐性度につい
ては次のようにして測定し、親株と比較した。表2に示
す培地にアシルリジンまたはメチル化アシルリジンを各
濃度添加し、その4mlを小型試験管に分注し、殺菌後
試験菌株を接種した。30℃にて24時間培養した後、
波長562nmにおける濁度を測定し、アシルリジンま
たはメチル化アシルリジン無添加の培地での値に対する
相対生育度を算出した。その結果を表3に示す。25m
g/l濃度のアシルリジンまたはメチル化アシルリジン
存在下で、本発明の変異株は良好な生育を示すのに対
し、親株はアシルリジンまたはメチル化アシルリジン無
添加培地の10%以下という非常に弱い生育しか示さな
い。このように本発明の変異株はアシルリジンまたはメ
チル化アシルリジン耐性を有する点で親株と明確に区別
することができる。
ジンまたはメチル化アシルリジンに対する耐性度につい
ては次のようにして測定し、親株と比較した。表2に示
す培地にアシルリジンまたはメチル化アシルリジンを各
濃度添加し、その4mlを小型試験管に分注し、殺菌後
試験菌株を接種した。30℃にて24時間培養した後、
波長562nmにおける濁度を測定し、アシルリジンま
たはメチル化アシルリジン無添加の培地での値に対する
相対生育度を算出した。その結果を表3に示す。25m
g/l濃度のアシルリジンまたはメチル化アシルリジン
存在下で、本発明の変異株は良好な生育を示すのに対
し、親株はアシルリジンまたはメチル化アシルリジン無
添加培地の10%以下という非常に弱い生育しか示さな
い。このように本発明の変異株はアシルリジンまたはメ
チル化アシルリジン耐性を有する点で親株と明確に区別
することができる。
【0017】
【表2】
【0018】
【表3】
【0019】これらの耐性株を用いてL−リジンを生産
せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及
び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する通常の
栄養培地を用いて常法により行うことが出来る。炭素源
としては、グルコース、シュクロース、糖蜜、デンプン
加水分解液などの糖類、酢酸、プロピオン酸などの有機
酸類、エタノール、プロパノールなどのアルコール類な
どが使用できる。窒素源としては、硫安、硝安、塩安、
尿素、アンモニアなどを使用できる。
せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及
び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する通常の
栄養培地を用いて常法により行うことが出来る。炭素源
としては、グルコース、シュクロース、糖蜜、デンプン
加水分解液などの糖類、酢酸、プロピオン酸などの有機
酸類、エタノール、プロパノールなどのアルコール類な
どが使用できる。窒素源としては、硫安、硝安、塩安、
尿素、アンモニアなどを使用できる。
【0020】培養方法は、発酵温度24〜37℃、好ま
しくは30〜34℃で通気培養を行い、発酵日数は通常
2〜7日である。培養開始時及び培養中のpHは5.0
〜8.5、好ましくは6.0〜7.5が良く、pHの調
整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物
質、更には尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなど
を使用することができる。
しくは30〜34℃で通気培養を行い、発酵日数は通常
2〜7日である。培養開始時及び培養中のpHは5.0
〜8.5、好ましくは6.0〜7.5が良く、pHの調
整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物
質、更には尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなど
を使用することができる。
【0021】培養終了後の発酵液からのL−リジンの採
取は、イオン交換樹脂法、晶析法等の従来からの公知の
方法及びその組合せにより行うことが出来る。
取は、イオン交換樹脂法、晶析法等の従来からの公知の
方法及びその組合せにより行うことが出来る。
【0022】
【実施例】次に、実施例によってこの発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【0023】実施例1 グルコース36g/l、塩化アンモニウム20g/l、
KH2PO41g/l、MgSO4・7H2O400m
g/l、FeSO4・7H2O10mg/l、MnSO
4・4H2O8mg/l、大豆蛋白質加水分解物(窒素
として)3mg/l、サイアミン塩酸塩0.1mg/
l、及びビオチン0.3mg/lを含有する培地(pH
7.0)を500ml容振とうフラスコに20mlずつ
分注した。115℃で10分間加熱殺菌後、予め180
℃で2時間乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを加えた。
この培地に各菌株を接種し、31.5℃で48時間振と
う培養した。培養液中に蓄積したL−リジンを、酸性−
銅ニンヒドリン発色法により定量した結果を表4に示
す。いずれの耐性株においても、親株に比較して顕著な
L−リジン蓄積の増大が認められた。
KH2PO41g/l、MgSO4・7H2O400m
g/l、FeSO4・7H2O10mg/l、MnSO
4・4H2O8mg/l、大豆蛋白質加水分解物(窒素
として)3mg/l、サイアミン塩酸塩0.1mg/
l、及びビオチン0.3mg/lを含有する培地(pH
7.0)を500ml容振とうフラスコに20mlずつ
分注した。115℃で10分間加熱殺菌後、予め180
℃で2時間乾熱滅菌した炭酸カルシウム1gを加えた。
この培地に各菌株を接種し、31.5℃で48時間振と
う培養した。培養液中に蓄積したL−リジンを、酸性−
銅ニンヒドリン発色法により定量した結果を表4に示
す。いずれの耐性株においても、親株に比較して顕著な
L−リジン蓄積の増大が認められた。
【0024】
【表4】
【0025】実施例2 廃糖蜜を糖として80g/l、硫酸アンモニウム50g
/l、KH2PO41g/l、MgSO4・7H2O1
g/l、大豆蛋白質加水分解物(窒素として)10mg
/l、サイアミン塩酸塩0.1mg/l、及びビオチン
0.3mg/lを含有する培地(pH7.0)を、50
0ml容振とうフラスコに20mlづつ分注した。12
0℃で10分間加熱殺菌後、予め180℃で2時間乾熱
滅菌した炭酸カルシウム1gを加えた。この培地に各菌
株を接種し、31.5℃で72時間振とう培養した。培
養液中に蓄積したL−リジンを測定した結果を表5に示
す。いずれの耐性株においても、親株に比較して顕著な
L−リジン蓄積の増大が認められた。
/l、KH2PO41g/l、MgSO4・7H2O1
g/l、大豆蛋白質加水分解物(窒素として)10mg
/l、サイアミン塩酸塩0.1mg/l、及びビオチン
0.3mg/lを含有する培地(pH7.0)を、50
0ml容振とうフラスコに20mlづつ分注した。12
0℃で10分間加熱殺菌後、予め180℃で2時間乾熱
滅菌した炭酸カルシウム1gを加えた。この培地に各菌
株を接種し、31.5℃で72時間振とう培養した。培
養液中に蓄積したL−リジンを測定した結果を表5に示
す。いずれの耐性株においても、親株に比較して顕著な
L−リジン蓄積の増大が認められた。
【0026】
【表5】
【0027】
【発明の効果】本発明の、アシルリジン及び/またはメ
チル化アシルリジンに耐性を有し、かつ、L−リジン生
産能を有する微生物を用いた製造法により、高蓄積かつ
高収率でL−リジンを生産することができ、L−リジン
の工業生産において大幅なコストダウンが期待できる。
チル化アシルリジンに耐性を有し、かつ、L−リジン生
産能を有する微生物を用いた製造法により、高蓄積かつ
高収率でL−リジンを生産することができ、L−リジン
の工業生産において大幅なコストダウンが期待できる。
フロントページの続き (72)発明者 大住 剛 神奈川県川崎市川崎区鈴木町1−1 味 の素株式会社中央研究所内 審査官 斎藤 真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12P 13/00 - 13/24 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (3)
- 【請求項1】 アシルリジン及び/またはメチル化アシ
ルリジンに耐性を有し、かつ、L−リジン生産能を有す
るブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に
属する微生物を培養し、培養液中に生成蓄積したL−リ
ジンを採取することを特徴とする発酵法によるL−リジ
ンの製造法。 - 【請求項2】 アシルリジンがNα、Nε−ジオクタノ
イル−L−リジンである請求項1記載の発酵法によるL
−リジンの製造法。 - 【請求項3】 メチル化アシルリジンがNα、Nα、N
α−トリメチル−Nε−パルミトイル−DL−リジンで
ある請求項1記載の発酵法によるL−リジンの製造法。
Priority Applications (14)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3123285A JP3008549B2 (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
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