HU215184B

HU215184B - Eljárás L-lizin és L-lizint termelő Brevibacterium és Corynebacterium nemzetségbeli muntáns törzsek előállítására

Info

Publication number: HU215184B
Application number: HU9200728A
Authority: HU
Inventors: Yoshio Kawahara; Harufumi Miwa; Tsuyoshi Oosumi; Kazuhiko Totsuka; Manabu Yokomori
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1998-10-28
Also published as: CS65992A3; KR0181297B1; ITMI920460A1; MX9200977A; SK280783B6; FR2673645B1; HU9200728D0; ITMI920460A0; FR2673645A1; US5304476A; NO920849L; KR920018228A; DE4207154A1; JP3008549B2; JPH067182A; BR9200742A; HUT64599A; NO920849D0; DE4207154C2; RU2099424C1

Abstract

A találmány tárgya eljárás L-lizin fermentációs útőn történőelőállítására, amely abban áll, hőgy egy Brevibacteriűm vagyCőrynebacteriűm nemzetséghez tartőzó, L-lizin termelésére képes ésacil-lizinnel és/vagy metilezett acil-lizinnel szemben rezisztenciávalrendelkező mikrőőrganizműst tenyésztenek, és a fermentlébentermelődött L-lizint kinyerik. A találmány tárgyát képezi tővábbá aenti eljárásban alkalmazőtt műtáns törzsek előállítására szőlgálóeljárás is. ŕ

Description

Az L-lizin fontos aminosav, amelyet például broilercsirkék és sertések takarmánykiegészítőjeként használnak, mert az L-lizin mennyisége nem elegendő az olyan takarmányokban, mint a kukorica. A találmány tárgya javított eljárás L-lizin fermentációs úton történő előállítására.

A korábbi ismert hagyományos eljárások L-lizin fermentációs úton történő előállítására abból állnak, hogy a természetből izolált (a továbbiakban vad törzseknek nevezett), például a Brevibacterium vagy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokba L-lizin-termelőképesség megszerzéséhez szükséges tulajdonságokat, így homoszerin-auxotrófiát, S-(2-amino-etil)-L-cisztein-rezisztenciát, a-klór-kaprolaktám-rezisztenciát visznek be, ezeket a mikroorganizmusokat szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajban tenyésztik, és a termelt és a fermentlében felszaporodott L-lizint például műgyantán történő adszorpcióval izolálják.

Vizsgálták továbbá egy, ezeknek az L-lizint termelő mikroorganizmusoknak javított törzseit, így L-alaninauxotrófokat, fluor-piruvát szenzitív és L-leucin-analógokra rezisztens törzseket alkalmazó eljárást is, de az így fermentációval termelt L-lizin hozama még nem kielégítő.

Ezért szükséges volt egy L-lizint termelő hatékonyabb, a hagyományosaknál olcsóbb eljárás kidolgozása.

A találmány tárgya olyan eljárás, amely hatékonyan, a korábban ismert eljárásoknál olcsóbban termel L-lizint azáltal, hogy növeli az L-lizint termelő mikroorganizmusok vagy azok mutánsainak L-lizin-termelőképességét, és így javítja a fermentáció hozamát.

A találmány tárgya eljárás L-lizinnek fermentációval, az eddig leírtaknál nagyobb kitermeléssel történő előállítására, amely eljárás acil-lizinre, metilezett acillizinre, vagy acil-lizinre és metilezett acil-lizinre rezisztens és L-lizin termelésére képes mikroorganizmus tenyésztéséből és az L-lizinnek a fermentléből való kinyeréséből áll.

Jelen találmány tárgyát közelebbről a fent leírt olyan eljárás képezi, amelynél az alkalmazott mikroorganizmus a Brevibacterium nemzetségből, a Corynebacterium nemzetségből vagy azok mutánsai közül való.

A találmány egy további tárgyát egy, a Brevibacterium és Corynebacterium nemzetségből származó, egy acil-lizinre, metilezett acil-lizinre, vagy mind acillizinre, mind metilezett acil-lizinre rezisztens mutáns törzs előállítása képezi. Az alkalmazott mikroorganizmus tipikusan képes L-lizin termelésére.

A találmány szerint előállított előnyös mutáns törzs a Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (FERM BP-3240), amely metilezett acil-lizinre rezisztens.

A találmány szerint előállított másik előnyös mutáns törzs a Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242), amely acil-lizinnel szembeni rezisztenciával rendelkezik.

A fent leírt mikroorganizmusokat 1991. január 24én, a Budapesti Egyezmény feltételei szerint Japánban, a Fermentációs Kutatási Intézetben helyeztük letétbe.

Az ezekből származó mutánsok is használhatók a találmány kivitelezésénél.

A találmány alábbi leírásából nyilvánvalóvá lesznek annak egyéb különböző előnyei is.

A találmány tárgyát egy L-lizin termelésére szolgáló javított eljárás és megnövelt L-lizin fermentációs hozam képezi a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok vagy azok mutánsainak alkalmazásával. L-lizint termelő mikroorganizmusokat vagy azok mutánsait állítottuk elő, amelyek acil-lizin vagy metilezett acil-lizin iránti rezisztenciával vagy a két rezisztencia kombinációjával rendelkeznek, és amelyek alkalmasak a jelen találmány szerinti eljárásban való felhasználására.

A találmány egyik megvalósításának tárgyát képezi egy eljárás L-lizin fermentációs úton való előállítására, amely eljárás egy acil-lizin vagy metilezett acil-lizin iránti rezisztenciával vagy e két rezisztencia kombinációjával rendelkező és L-lizin termelésére is képes mikroorganizmus tenyésztéséből és a termelt és a fermentlében felhalmozódott L-lizin azt követő kinyeréséből áll. Az említett mikroorganizmusok a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartoznak. A felhasznált mikroorganizmus a Brevibacterium lactofermentum vagy a Corynebacterium glutamicum egyik törzse lehet.

A találmány megvalósítása során alkalmazott acillizin alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek az Lvagy DL-lizin a- vagy ε-helyzetű amincsoporthoz acilkötéssel kapcsolódó 5-20 szénatomos zsírsavmaradékot tartalmaznak. Az ilyen vegyületekre példaként szolgál az N-a-sztearoil-L-lizin, Ν-ε-dekanoil-L-lizin, Ν-εmirisztoil-L-lizin, Ν-ε-palmitoil-L-lizin, Ν-α,Ν-εdioktanoil-L-lizin, és Ν-α,Ν-ε-dilauroil-L-lizin.

A találmány megvalósítása során alkalmazott metilezett acil-lizin alatt olyan acil-lizint értünk, amely az α-helyzetű aminocsoportján van metilezve. Az ilyen vegyületekre példaként szolgál az N-a-metil-N-εsztearoil-L-lizin, N-a,N-a-dimetil-N-8-dekanoil-DLlizin, N-a,N-a-dimetil-N-8-palmitoil-DL-lizin, N-a, N-a,N-a-trimetil-N^-mirisztoil-DL-lizin, és az N-a, N-a,N-a-trimetil-N-e-palmitoil-DL-lizin.

A találmány megvalósítása során használt mutánsok a Brevibacterium és a Corynebacterium nemzetségbe tartoznak, és rezisztenciával rendelkeznek valamely acil-lizinnel, valamely metilezett acil-lizinnel szemben mind acil-lizinnel, mind metilezett acil-lizinnel szemben, azaz a mutánsok jól növekednek acil-lizin jelenlétében, még ha az 25 mg/1 koncentrációban van is jelen, vagy metilezett acil-lizin jelenlétében, annak még 25 mg/1 koncentrációja esetén is, vagy mind acil-lizin, mind metilezett acil-lizin jelenlétében, ha azok különkülön 25 mg/1 koncentrációban vannak jelen. Ezek a mikroorganizmusok rendelkeznek azokkal a további tulajdonságokkal, amelyekről tudott, hogy szükségesek az L-lizin termelőképesség megszerzéséhez, így például homoszerin-auxotrófiával, S-(2-amino-etil)-L-ciszteinnel szembeni rezisztenciával, a-klór-kaprolaktám-rezisztenciával vagy ezek kombinációjával. Az az állítás, hogy a mikroorganizmus rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy jól növekszik acil-lizin vagy metilezett

HU215 184 Β acil-lizin jelenlétében, itt azt jelenti, hogy viszonylagos növekedési foka legalább 50, ha az acil-lizin és metilezett acil-lizin távollétében tapasztalt növekedést 100nak vesszük (a méréseket az 562 nm-nél mért zavarossági értékekben fejezzük ki).

A mutánsok közül specifikus példákként megemlítjük a következőket:

Brevibacterium lactofermentum

Corynebacterium glutamicum

AJ 12592 (FERM BP-3239), AJ 12593 (FERM BP-3240), AJ 12596 (FERM BP-3242).

A fent leírt törzseket 1991. január 24-én, a Budapesti Egyezmény feltételei szerint helyeztük letétbe a Fermentációs Kutató Intézetben (FRI=Fermentation Research Institute), Nemzetközi Kereskedelmi és Iparügyi Minisztérium, 1-3, Hitgashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japán.

E mutánsok nyeréséhez szülőtörzsként olyan, a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat használunk, amelyekről már tudott, hogy termelnek L-lizint. Ezenfelül az alábbi, a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó vad törzseket is használhatjuk szülőtörzsként: Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium flavum ATCC 14067,

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020,

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806.

E vad törzseknél az L-lizin-termelőképességre való szelektálás után elvégezhetjük az acil-lizinnel és/vagy metilezett acil-lizinnel szembeni rezisztenciaszelektálást is. Más módszer szerint e vad törzseknél szelektálhatunk először az acil-lizinnel és/vagy metilezett acillizinnel szembeni rezisztenciára és azután szelektálhatunk az L-lizin-termelőképességre.

E szülőtörzsek mutációs kezelésénél szokásos módszereket alkalmazhatunk, így például kezelhetjük azokat N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel (a továbbiakban NG-vel rövidítve). E mutánsok közül az acillizinnel és/vagy metilezett acil-lizinnel szemben rezisztens törzsek kiválasztására alkalmazhatjuk azt a módszert, amelynél azokat a mutánsokat gyűjtjük össze, amelyek acil-lizint vagy metilezett acil-lizint olyan koncentrációban tartalmazó táptalajon is jól növekednek, amely a szülőtörzsek növekedését jelentősen gátolja. A rezisztens törzsek gyűjtésének közelebbről meghatározott példáját alább mutatjuk be.

L-lizint termelő és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinnel szemben rezisztens Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (FERM BP-2294) mikroorganizmus csíraképes sejtjeit 250 mg/ml NG-vel 30 percig kezeljük 30 °C hőmérsékleten. Az 1,0% túlélési arányt mutató sejteket az 50 mg/l Ν-α,Ν-ε-dioktanoil-L-lizinnel (ami egy acillizin) kiegészített, az 1. táblázatban részletezett minimális táptalajt tartalmazó agar lemezre oltjuk, a lemezt 30 °C-on egy hétig inkubáljuk, és a kinőtt telepeket lemossuk a lemezről. A táptalajhoz kiegészítésként adott acil-lizin vagy metilezett acil-lizin koncentrációját az alkalmazott szülőtörzs esetében érvényes minimális növekedésgátló koncentrációtól függően megfelelő módon választjuk, azt úgy állítva be, hogy a kívánt rezisz5 tens törzseket hatásosan kapjuk. Az egyik ilyen izolált rezisztens törzs a Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (FERM BP-3239), amelyet tovább alkalmaztunk a következő példában. Hasonlóképpen nyerjük a Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (FERM

BP-3240)-et, mint N-a,N-a,N-a-trimetil-N-e-palmitoil-DL-lizin-rezisztens törzset.

1. táblázat

Komponens	Koncentráció
Glükóz	20 g/1
Ammónium-szulfát	10 g/1
Kálium-dihidrogén-foszfát	1 g/1
Magnézium-szulfát - víz (1/7)	0,4 g/1
Vas(II)-szulfát - víz (1/7)	10 mg/l
Mangán(II)-szulfát - víz (1/4)	10 mg/l
Biotin	50 pg/l
Tiamin-hidroklorid	100 pg/l
Karbamid	2 g/1
Agar-agar	20 g/1

Továbbá a Corynebacterium glutamicum AJ 30 3463 (FERM BP-1987)-et szülő törzsként használva kapjuk a Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242) törzset, mint Ν-α,Ν-α,Ν-α-trimetilN-palmitoil-DL-lizin-rezisztens törzset.

Minden egyes izolált, acil-lizinre vagy metilezett 35 acil-lizinre rezisztens törzset az alábbiakban jelzettek szerint vizsgálunk meg és hasonlítunk össze a szülőtörzzsel. Az acil-lizint vagy metilezett acil-lizint a 2. táblázatban megadott táptalajhoz adjuk minden egyes koncentrációban és a táptalajból 4 ml mennyiséget kü40 lön kis kémcsőbe mérünk.

2. táblázat

Komponens	Koncentráció
Szacharóz	20 g/1
Ammónium-szulfát	5 g/1
Kálium-dihidrogén-foszfát	lg/1
Magnézium-szulfát - víz (1/7)	0,4 g/1
Vas(II)-szulfát - víz (1/7)	10 mg/l
Mangán(II)-szulfát - víz (1/4)	10 mg/l
Biotin	100 j-tg/l
Tiamin-hidroklorid	200 pg/l
Nikotinamid	5 mg/l
F ehérj ehidrolizátum	lg/1
	(nitrogénként számolva)
Karbamid	3 g/1

HU215 184 Β

Sterilizálás után a vizsgálandó törzset a táptalajba oltjuk. A tenyészetet 30 °C hőmérsékleten 24 órán át rázzuk, majd annak zavarosságát 562 nm hullámhosszon méljük, és a sem acil-lizint, sem metilezett acil-lizint nem tartalmazó táptalajban mért növekedési sebességhez viszonyított relatív növekedési sebességet számoljuk. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.

3. táblázat

Vizsgált törzs	Alkalmazott vegyszer	A vegyszer koncent- rációja	Relatív növeke- dési sebesség
Brevibacterium	Ν-α,Ν-Σ-	0 mg/1	100
lactofermentum	-dioktanoil-	10	29
AJ 12453	-L-lizin	25 50 100	8 6 5
Brevibacterium	Ν-α,Ν-ε-	0 mg/1	100
lactofermentum	-dioktanoil-	10	92
AJ 12592	-L-lizin	25 50 100	81 14 10
Brevibacterium	Ν-α,Ν-α,Ν-α-	0 mg/1	100
lactofermentum	-trimetil-N-	10	48
AJ 12435	-palmitoil-	25	9
	-DL-lizin	50 100	8 5
Brevibacterium	Ν-α,Ν-α,Ν-α-	0 mg/1	100
lactofermentum	-trimetil-Ν-ε-	10	100
AJ 12593	-palmitoil-	25	53
	-DL-lizin	50 100	13 11
Corynebacterium	Ν-α,Ν-ε-	0 mg/1	100
glutamicum	-dioktanoil-	10	38
AJ 3463	-L-lizin	25 50 100	7 6 5
Corynebacterium	Ν-α,Ν-ε-	0 mg/1	100
glutamicum	-dioktanoil-	10	100
AJ 12596	-L-lizin	25 50 100	93 45 24

A találmány szerinti mutánsok jó vagy 50-nél jobb relatív növekedési sebességet mutatnak acil-lizin vagy metilezett acil-lizin 25 mg/1 koncentrációjának jelenlétében, míg a szülőtörzsek 10-nél kisebb, nagyon gyenge növekedési sebességet mutatnak. Miként fent említettük, a találmány szerinti mutánsok élesen megkülönböztethetők a szülőtörzsektől, minthogy a mutánsok rezisztensek acil-lizinre vagy metilezett acil-lizinre.

Ezeket a rezisztens törzseket használva, L-lizint állíthatunk elő fermentációs úton, nitrogénforrást, szervetlen ionokat, növekedési faktorokat és a mikroorganizmus számára szükséges és a szokásos módon használt tápanyagokat tartalmazó közönséges táptalajban. A felhasználható szénforrások lehetnek például cukrok, így glükóz, szacharóz, melasz vagy keményítőhidrolizátumok; szerves savak, így ecetsav vagy propionsav, valamint alkoholok, így etanol vagy propanol.

Az alkalmazható nitrogénforrások lehetnek például ammónium-szulfát, ammónium-nitrát, ammónium-klorid, karbamid vagy ammónia.

A törzsek inkubálásának körülményeit illetően, a levegőztetett tenyésztés az előnyös, 24 °C és 37 °C közötti, előnyösen 30 °C és 34 °C közötti fermentációs hőmérsékleten. A fermentációhoz szükséges napok száma általában 2-7 nap. A fermentáció elején vagy folyamán a pH értéke 5,0 és 8,5 között, előnyösen 6,0 és 7,5 között van. A pH beállítására szervetlen vagy szerves, savas vagy lúgos anyagokat, továbbá karbamidot, kalcium-karbonátot, ammónia-gázt vagy hasonlókat használhatunk.

A fermentáció befejezése után a termelt L-lizint a fermentléből ismert módszerekkel, például ioncserélő gyantát vagy kristályosítást, vagy ezek kombinációját használva nyerjük ki.

A következő példák a találmány további szemléltetésére szolgálnak, oltalmi kör bármiféle korlátozása nélkül.

1. példa:

g/1 glükózt, 20 g/1 ammónium-kloridot, 1 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 400 mg/1 magnézium-szulfát - víz (l/7)-t, 100 mg/1 vas(II)-szulfát - víz (l/7)-t, 8 mg/1 mangán(II)-szulfát - víz (l/4)-t, 3 mg/1 szójabab fehérje-hidrolizátumot (nitrogénben számolva), 0,1 mg/1 tiamin-hidrokloridot és 0,3 mg/1 biotint tartalmazó 7,0 pH-jú táptalaj 20-20 ml térfogatú részleteit 500 ml-es rázólombikokba mérjük. 115 °C-on 10 percig végzett hősterilizálás után 1-1 g, előzetesen szárazon hősterilizált kalcium-karbonátot adunk a lombikhoz. Az egyes törzseket beoltjuk a táptalajba, majd a lombikokat 31,5 °C hőmérsékleten 48 órán át rázva inkubáljuk. Az egyes lombikokban lévő fermentlében termelt L-lizin mennyiségét a savas-réz-ninhidrin kolorimetriás módszerrel meghatározzuk. Az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg. A találmány szerinti rezisztens törzsek mindegyikénél jelentősen növekszik a szülő törzshöz viszonyított L-lizin termelés.

4. táblázat

Törzs	Termelt-Llizin (g/1)	A cukor mennyiségére számolt kitermelés (%)
B. lactofermentum AJ 12435 (szülőtörzs)	9,5	26,4
B. lactofermentum AJ 12592 (találmány szerinti rezisztens törzs)	11,8	32,8
C. glutamicum AJ 3463 (szülötörzs)	7,0	19,5
C. glutamicum AJ 12596 (találmány szerinti rezisztens törzs)	10,7	29,7

HU 215 184 Β

2. példa:

g/1 melaszt (cukorban számolva), 50 g/1 ammónium-szulfátot, 1 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 1 g/1 magnézium-szulfát - víz (l/7)-t, 10 mg/1 szójahidrolizátumot (nitrogénben számolva), 0,1 mg/1 tiaminhidrokloridot és 0,3 mg/1 biotint tartalmazó 7,0 pH-jú táptalaj 20-20 ml térfogatú részleteit 500 ml-es mérőlombikba mérjük. 120 °C-on 10 percig végzett hősterilizálás után 1-1 g előzetesen 180 °C-on 2 órán át szárazon hősterilizált kalcium-karbonátot adunk a lombikokhoz. Az egyes törzseket beoltjuk a lombikokban lévő táptalajba, majd azokat 31,5 °C hőmérsékleten 72 órán keresztül rázva inkubáljuk. A fermentlevekben termelődött L-lizin mennyiségét mérjük. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatja be. A rezisztens találmány szerinti törzseknél jelentősen növekszik a szülőtörzshöz viszonyított L-lizin termelés.

5. táblázat

Törzs	Termelt L-lizin (g/D	A cukor mennyiségére számolt kitermelés
B. lactofermentum AJ 12435 (szülőtörzs)	20,4	25,5
B. lactofermentum AJ 12593 (találmány szerinti rezisztens törzs)	24,8	31,0

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás L-lizin fermentációval történő előállítására egy, a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozó és L-lizin termelésére képes mikroorganizmus tenyésztésével és a fermentlében termelt Llizin kinyerésével, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus acil-lizinnel és/vagy metilezett acil-lizinnel szembeni rezisztenciával rendelkezik.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus egy Brevibacterium lactofermentum törzs.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus egy Corynebacterium glutamicum törzs.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus a Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (FERM BP-3239) törzs vagy annak egy mutánsa.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus a Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (FERM BP-3240) törzs vagy annak egy mutánsa.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus a Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242) törzs vagy annak egy mutánsa.
7. Eljárás egy, a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozó és L-lizin termelésére képes mutáns törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozó és L-lizin termelésére képes mikroorganizmust mutációnak vetünk alá, az így kapott mutánsokat acillizinnel és/vagy metilezett acil-lizinnel szembeni rezisztenciára vizsgáljuk, és az említett rezisztenciával rendelkező mutánst szelektáljuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Brevibacterium lactofermentum fajba tartozó törzset mutálunk.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy Corynebacterium glutamicum fajba tartozó törzset mutálunk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium lactofermentum AJ 12435 (FERM BP-2294) törzset mutáljuk.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum AJ 3463 (FERM BP-1987) törzset mutáljuk.
12. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium lactofermentum AJ 12592 (FERM BP-3239) mutáns törzset állítjuk elő.
13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium lactofermentum AJ 12593 (FERM BP-3240) mutáns törzset állítjuk elő.
14. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum AJ 12596 (FERM BP-3242) mutáns törzset állítjuk elő.