固定化细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种固定化细胞及其制备方法,具体的,涉及一种赖氨酸脱羧酶固定化细胞及其制备方法。
背景技术
1,5-二氨基戊烷(也称为1,5-戊二胺,简称戊二胺)是化学工业中重要的五碳化合物,主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯等,另外还可以用来制造异氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化工原料。
迄今为止,二胺类物质是由石油基原材料经二羧酸中间体或者通过氨基酸的化学脱羧作用进行化学生产(Albrecht,Klaus,et al,Plastics(第5版),Winnacker-Kuechler,2005)。化石原料的局限性和人们对绿色环保的日益重视使利用可再生原材料通过生物工程学的方法合成二胺类物质成为理想途径。
利用生物法合成戊二胺的方法主要有两种。一种是使用微生物利用葡萄糖通过复杂的代谢调控,转化得到戊二胺,即从生产赖氨酸的微生物开始,通过引入编码赖氨酸脱羧酶的任选基因来产生戊二胺,其在以下文献中得到描述(Tabor,Herbert,et al;Journal of bacteriology,144(3),952-956,1980)。2007年,Takashi等报道了通过对具有较高赖氨酸合成能力的谷氨酸棒杆菌进行赖氨酸脱羧酶过量表达,使菌体直接在发酵过程中生产戊二胺,产量为2.9g/l。在提高戊二胺产量研究中,研究人员尝试使用了具有过量表达宿主同源的赖氨酸脱羧酶(cadA基因)质粒的大肠杆菌菌株(见日本专利JP2002223770A,JP2008104453A等)。中国专利CN200810005332中采用过量表达赖氨酸脱羧酶的产赖氨酸谷氨酸棒杆菌发酵生产戊二胺,戊二胺在培养液中含量约为3.4g/L。综上所述,微生物经过葡萄糖直接发酵生产戊二胺,工艺简单,但发酵周期长,且菌体对胞内戊二胺的耐受程度有限,导致戊二胺的产率较低,不利于大规模产业化生产。
在更进一步的研究中,研究人员研究了另一种方法生产戊二胺,即培养过量表达了赖氨酸脱羧酶的菌株,将收集得到的赖氨酸脱羧酶作为催化剂来催化赖氨酸得到戊二胺(见JP2002-223771A、JP2004-000114A、EP1482055B1、JP2005-060447A等)。又例如,中国专利CN101578256A中采用过量表达了cadA的大肠杆菌催化赖氨酸己二酸盐,在反
应过程中控制反应pH值来提高酶的稳定性。中国专利CN102056889A中采用赖氨酸碳酸盐为底物进行催化生产戊二胺,将反应过程中释放的二氧化碳回收利用来控制反应pH值。中国专利CN102782146A中将表达cadA的菌株进行破碎处理后催化外源赖氨酸生产戊二胺,用于提高戊二胺的产率。
上述专利中,赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸生成戊二胺的工艺中通常使用游离状态的赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞。而日本专利JP2004298033A中描述采用角叉菜胶凝胶将产赖氨酸脱羧酶菌株包埋后发酵产酶,然后将培养好的固定化细胞催化纯化的赖氨酸盐生产戊二胺,246g/l的赖氨酸盐酸盐经过固定化细胞150h的催化,生成戊二胺浓度为40g/l,赖氨酸盐酸盐的摩尔转化率约为30%。
文献“用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1,5-戊二胺”(蒋丽丽等,精细化工,2007,24(11),1080-1084)中报道采用3wt%的海藻酸钠固定含有赖氨酸脱羧酶的细胞,但是固定化细胞稳定性很差,第2批转化时酶活性就发生显著下降,到第4批时酶活性降低到约为第1批酶活性的38%。
用海藻酸钠之类天然高分子凝胶在实际操作中存在着强度不高,容易被微生物分解,在转化过程中变形、破碎或者溶解,引起酶或细胞的渗漏,固定化酶重复使用效率低等问题。
含有赖氨酸脱羧酶活性的细胞可催化多种形式的赖氨酸溶液,例如纯化的赖氨酸,赖氨酸的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、己二酸盐及其他盐类,还可催化未被纯化的赖氨酸发酵液,但是由于赖氨酸发酵液成分复杂,对含有赖氨酸脱羧酶的细胞的稳定性影响较大,容易导致细胞裂解,酶流失,降低赖氨酸脱羧酶的使用效率。将含有赖氨酸脱羧酶的细胞固定于一定的载体中,会显著的提高含有赖氨酸脱羧酶的细胞在赖氨酸发酵液中的稳定性,提高酶的催化效率,降低了赖氨酸纯化成本。
综上所述,利用微生物生产的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸生成戊二胺的研究较多,其特点为多采用纯化的赖氨酸或赖氨酸盐,需要对赖氨酸进行纯化,工艺复杂,生产成本高,限制了戊二胺的产业化生产。另外,酶催化生产赖氨酸生成戊二胺反应体系中多采用游离酶细胞进行,酶的稳定性较低,而且导致酶反应液中戊二胺提取工艺复杂,影响戊二胺成品的纯度,不利于工业化生产。
因此,本技术领域需要一种工艺更简单、经济,可提高赖氨酸脱羧酶重复使用效率的方法。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种固定化含有赖氨酸脱羧酶的细胞的方法,其包括如下步骤:
a)将第一合成高分子物质于水性溶液中充分溶解;
b)向得到的溶液中加入待固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞并使之固定化,
其中,第一合成高分子物质是具有形成凝胶能力的任何合成高分子物质,固定化的条件以不破坏含有赖氨酸脱羧酶的细胞的活力为限。
在一些实施方案中,所述得到的溶液中还进一步包含天然高分子物质、第二合成高分子物质中的一种、多种或其混合物,其中天然高分子物质和第二合成高分子物质是具有形成凝胶能力的天然或合成高分子物质,且第二合成高分子物质不同于第一合成高分子物质。
在一些实施方案中,第一合成高分子物质、第二合成高分子物质选自聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯腈、醋酸纤维、二醋酸纤维中的一种或多种,在进一步的实施方案中,选自聚乙烯醇和聚乙二醇。
在一些实施方案中,天然高分子物质选自海藻酸钠、卡拉胶、黄原胶、活性炭、硅藻土、热凝胶、壳聚糖中的一种或多种,在进一步的实施方案中,天然高分子物质为海藻酸钠。
在进一步的实施方案中,所述得到的溶液为聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液或聚乙烯醇和聚乙二醇的混合溶液,在一些实施方案中,聚乙烯醇的添加量为1~13wt%,在进一步的实施方案中,聚乙烯醇的加入量为6~11wt%,在更进一步的实施方案中,聚乙烯醇的加入量为7~9wt%,在一个实施方案中,聚乙烯醇的加入量为8wt%,海藻酸钠的添加量为0.1~3wt%,如0.5~2.5wt%,1~2.0wt%,在一个实施方案中,海藻酸钠的添加量为1.5wt%,聚乙二醇的添加量为0.1-5wt%,如0.2~3wt%,0.3~1.5wt%,0.4~1wt%,在一个实施方案中,聚乙二醇的添加量为0.5wt%。
在一些实施方案中,步骤b)中的固定化采用物理固定化或化学固定化,优选化学固定化,更优选氯化钙和硼酸交联固定化,优选地,氯化钙溶液浓度为0.2~5wt%,如0.3~3wt%,0.4%~2wt%,0.6~1.5wt%,在一个实施方案中,氯化钙溶液浓度为1wt%,硼酸溶液浓度为1~10wt%,如2~8wt%,3~6wt%,在一个实施方案中,硼酸溶液浓度为4wt%。
在一些实施方案中,所述方法还包括在溶液凝胶化后用环氧氯丙烷溶液和/或液态环
氧树脂进行处理的步骤,优选地,按照PVA中羟基理论摩尔数的1~1.5倍投入环氧氯丙烷溶液和/或液态环氧树脂振荡反应20~60min,分离出颗粒并洗涤后得到成品。
在一些实施方案中,含有赖氨酸脱羧酶的细胞来源于植物、微生物、昆虫或动物。
在一些实施方案中,微生物选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum),优选大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌。
本发明的第二方面涉及上述第一方面所述的固定化含有赖氨酸脱羧酶的细胞的方法获得的固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞。
本发明的第三方面涉及一种1,5-戊二胺的制备方法,其包括将第二方面所述的固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞与含有赖氨酸的液体接触以及获得1,5-戊二胺的步骤。
在一些实施方案中,含有赖氨酸的液体为赖氨酸发酵液,赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液,赖氨酸发酵液去除菌体后的除菌赖氨酸发酵液和除菌赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液,以及配制的赖氨酸溶液;优选为赖氨酸发酵液。
在一些实施方案中,赖氨酸发酵液通过微生物发酵制备获得。
在一些实施方案中,制备赖氨酸发酵液的微生物选自棒状杆菌属、埃希氏杆菌属,优选大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。
在一些实施方案中,制备赖氨酸发酵液的碳源是可发酵性糖,优选地,可发酵性糖来自于淀粉类物质,优选玉米,木薯,或者木质纤维素类物质,优选秸杆、树木,更优选地,可发酵性糖选自葡萄糖、果糖、蔗糖。
在一些实施方案中,含有赖氨酸的液体还包含硫酸根离子且其浓度不低于0.005mol/kg。
在一些实施方案中,含有赖氨酸的液体还包含糖和游离的NH4
+,总糖含量不低于300ppm,游离的NH4
+含量不低于0.028mol/kg。
在一些实施方案中,含有赖氨酸的液体还添加有辅酶,所述辅酶选自吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种,优选为5'-磷酸吡哆醛,优选地,辅酶的添加量按反应体系重量计为0.01~0.3mmol/kg。
在一些实施方案中,与固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞接触的含有赖氨酸的液体
的pH值为4.0~9.0,优选为4.5~8.5。
在一些实施方案中,固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞与含有赖氨酸的液体接触的温度为25~55℃,更优选28℃~45℃。
在一些实施方案中,含有赖氨酸的液体中的赖氨酸含量为1%~50%(w/w),更优选5~20%(w/w)。
换言之,本发明所要解决的技术问题是提供一种可在工业生产上以低生产成本、工艺简单地制备戊二胺的固定化细胞及其制备方法,并进一步提供了采用该固定化细胞得到戊二胺的方法。
本发明的方法利用合成高分子物质对含有赖氨酸脱羧酶的细胞进行了固定化处理,得到了赖氨酸脱羧酶固定化细胞,显著提高了酶的稳定性,简化了反应体系和戊二胺的分离工艺。与以往所报道的固定化细胞制备戊二胺相比,该方法可以直接使用赖氨酸发酵液来制备戊二胺,提高了赖氨酸脱羧酶在成分复杂的赖氨酸发酵液中的催化稳定性,克服了现有技术中使用赖氨酸纯品、赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐和赖氨酸二羧酸盐等作为底物导致的成本高、工艺复杂等缺点,减少了赖氨酸发酵液的纯化步骤。因此,本发明提高了酶的使用效率,简化了戊二胺提取生产工艺,节约了赖氨酸纯化成本,降低戊二胺生产成本。
具体实施方式
本发明基于发明人的以下发现:将含赖氨酸脱羧酶的细胞用合成高分子物质固定化处理后加入赖氨酸发酵液中,得到了含有戊二胺的混合液。现有技术已经报道了采用海藻酸钠等天然高分子物质制备固定化的含赖氨酸脱羧酶的细胞,虽然所制的固定化细胞酶活力回收较高,但是固定化细胞在使用过程中结构不稳定,容易瓦解,导致使用稳定性下降。同时,天然高分子物质价格昂贵,严重限制了其工业应用。相对于采用天然高分子物质作为载体,采用合成高分子物质的固定化细胞的结构稳定性可以得到提高,固定化细胞的制备成本也显著降低,但是,截至目前,合成高分子材料并未在含赖氨酸脱羧酶细胞的固定化中得到实际应用。这是由于,赖氨酸脱羧酶的催化产物戊二胺为强极性产物,会和含有大量羟基的合成高分子材料吸附,影响了合成高分子材料在含赖氨酸脱羧酶活性细胞的固定化中的应用。因此,本发明的一些实施方案将合成高分子材料和天然高分子材料组合作为含赖氨酸脱羧酶细胞的固定化载体,从而结合了合成高分子材料和天然高分子材料的优点。利用这两类材料制备的固定化细胞通透性较好且结构较稳定。在本发明的一些实施方
案中,还同时通过环氧氯丙烷和/或液态环氧树脂处理消除了常用高分子物质结构上的极性基团与戊二胺的相互吸附作用,显著提高了固定化细胞的催化效率。
本发明提供了一种将含有赖氨酸脱羧酶的细胞进行固定化的方法。
上述含有赖氨酸脱羧酶(简称LDC,EC4.1.1.18)的细胞是可将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的细胞,其来源没有特别限制,可以来自已知的生物。赖氨酸脱羧细胞可以来自微生物、动物、植物或昆虫的细胞,例如野生菌株,包括但不限于,嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等;赖氨酸脱羧酶也可以来自于基于上述菌株的诱导突变后的菌株、基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体、活性片段,所述突变体可以是天然突变体,也可以是人工重组突变体,所述活性片段是保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段。含有赖氨酸脱羧酶的突变体、活性片段的菌株、基因工程菌同样适用于本发明的方法。
基因工程重组细胞没有特别限制,可例如是来自微生物、动物、植物或昆虫的重组细胞。更具体而言,例如,当使用动物时,可举出小鼠、大鼠或其培养细胞等;另外,当使用植物时,可举出例如拟南芥、烟草或其培养细胞等;另外,当使用昆虫时,可举出例如蚕或其培养细胞等;当使用微生物时,可举出例如大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌等。
上述重组细胞可单独使用或组合使用两种以上。
作为提高细胞赖氨酸脱羧酶活性的方法,例如可以采用使赖氨酸脱羧酶的酶量增加的方法等。作为使细胞酶量增加的方法,可举出例如基因转录调节领域的改良、基因拷贝数的增加、蛋白翻译效率的提高、酶催化活性的改进等。
另外,对于培养上述重组细胞的方法,没有特别限制,可采用任何公知的方法。更具体而言,例如,当培养微生物时,培养基可使用含有碳源、氮源及无机离子的培养基。
碳源可以是本领域使用的任何碳源,可举出例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖或淀粉的水解物等糖类;例如甘油、甘露醇或山梨糖醇等醇类;例如葡糖酸、富马酸、柠檬酸或琥珀酸等有机酸类等,优选葡萄糖、蔗糖和淀粉水解物等作为碳源。上述碳源可单独使用或组合使用两种以上。
氮源可以是本领域使用的任何氮源,可举出例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵
盐;例如大豆水解物等有机氮源。上述氮源可单独使用或组合使用两种以上。
无机离子可以是本领域使用的任何无机离子,可举出例如钠离子、镁离子、钾离子、钙离子、氯离子、锰离子、铁离子、磷酸根离子、硫酸根离子等。培养基中可添加一种或多种上述无机离子。
另外,根据需要,也可向培养基中添加其它微量营养素,可举出例如各种氨基酸、微量元素和维生素等。
上述培养基可以是本领域使用的任何培养基,更具体而言,可举出如LB培养基,例如包含蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%、pH值为7.0的LB培养基。
本发明的含赖氨酸脱羧酶的细胞的培养条件没有特别限制,例如,当培养蜂房哈夫尼菌时,在需氧条件下,培养温度例如为20~45℃,优选为25~38℃;培养pH值例如为5.0~8.5,优选为5.5~7.5;培养时间例如为10~50小时。
本发明还提供了一种固定化细胞的制备方法,包括以下步骤:a)将1~13wt%(重量百分比)第一合成高分子物质加入水中并使之溶解,如加热搅拌至溶解;b)在20~40℃下向得到的溶液中加入含有赖氨酸脱羧酶的细胞,搅拌溶解后使溶液凝胶化,得到固定化细胞。所述第一合成高分子物质是具有形成凝胶能力的任何合成高分子物质。
上述制备方法中,所述得到的溶液中还可以含有天然高分子物质、第二合成高分子物质中的一种或混合物。天然高分子物质或第二合成高分子物质的加入没有特定的限制,只要得到混合均匀的溶液即可,可以在加入第一合成高分子物质之前加入,也可以与第一合成高分子物质同时加入,还可以在加入第一合成高分子物质后加入。在一些实施方案中,向含有第一合成高分子物质的溶液中加入所述第一合成高分子物质的1:20~1:4的第二合成高分子物质,并搅拌溶解得到均一的溶液。所述天然高分子物质和第二合成高分子物质是具有形成凝胶能力的任何天然或合成高分子物质。
第一合成高分子物质或第二合成高分子物质可以为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯腈、醋酸纤维、聚丙烯酰胺、二醋酸纤维等中的一种或多种,优选为聚乙烯醇和聚乙二醇,聚乙二醇的使用分子量范围为1000-8000道尔顿,如1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000道尔顿及其间的任意分子量。第二合成高分子的具体选择可以与第一合成高分子物质不同。当选择聚乙烯醇和聚乙二醇作为合成高分子物质使用时,第一合成高分子物质优选为聚乙烯醇,第二合成高分子物质优选为聚乙二醇。在一些实施方案中,当选择为聚丙烯酰胺和角叉菜胶作为固定化载体时,聚丙烯酰胺为第一合成高分子,角叉菜胶为天然高分子物质。
本发明中对第一合成高分子物质如聚乙烯醇的投入量没有特别的限制,只要能溶解于水中即可,但是浓度太低形成的固定化材料结构松散,赖氨酸脱羧酶容易渗漏,当第一合成高分子物质如聚乙烯醇的浓度低于0.5wt%时,形成的固定化材料将结构过于松散,不适于固定化细胞制备。在一些实施方案中,第一合成高分子物质如聚乙烯醇的投入量为水分的1~13wt%,优选为6~11wt%。
本发明中对第一合成高分子物质如聚乙烯醇的溶解方法没有特别的限制。在一些实施方案中,将水加热到50~100℃,加入第一合成高分子物质如聚乙烯醇不断搅拌使之溶解。
在一些实施方案中,天然高分子物质和/或第二合成高分子物质的加入量为第一合成高分子物质如聚乙烯醇量的1/20~1/4,更优选为第一合成高分子物质如聚乙烯醇量的1/10~1/5。在一些实施方案中,聚乙二醇的加入量为第一合成高分子物质如聚乙烯醇量的1/20~1/4,更优选为第一合成高分子物质如聚乙烯醇量的1/10~1/5。
本发明中所述的天然高分子物质,包括但不限于,海藻酸钠、角叉菜胶、壳聚糖、琼脂糖、卡拉胶、明胶等。在一些实施方案中,所述的天然高分子物质为海藻酸钠,在一些实施方案中,所述的天然高分子物质为角叉菜胶。
本发明中以含有赖氨酸脱羧酶的细胞的形式计,含酶细胞的加入量为上述的溶液的重量的0.5%~7%,以上述的溶液的重量计,也可以加入含有10-50%水分的酶发酵液浓缩液。
本发明中对合成高分子物质的凝胶化的方法没有特别的限制,可以采用硼酸法,可以采用冷冻法。在一个实施方案中,向溶液中投入1~10wt%的硼酸,优选3~6wt%的硼酸溶液,将固定化细胞的溶液滴入获得的硼酸溶液中形成球状颗粒。在一个实施方案中,将固定化细胞的溶液在-5~-20℃条件下冷冻10~40小时,室温下解冻后放入饱和硫酸钠溶液中脱水,然后切成颗粒状。在一个实施方案中,将固定化细胞的溶液在-5~-20℃条件下冷冻10~40小时,室温下解冻后放入饱和硫酸铵溶液中脱水,然后制成颗粒状。
在本发明制备固定化细胞的方法中,还包括在溶液凝胶化后,按照聚乙烯醇(PVA)中羟基理论摩尔数的1~1.5倍投入环氧氯丙烷溶液和/或液态环氧树脂振荡反应20~60min,分离出颗粒并洗涤后得到成品的步骤。本发明中,仅仅简单采用PVA替代或部分替代海藻酸钠作为固定化材料仅能基本实现本发明的目的,究其原因为PVA带有大量的羟基,而戊二胺属于极性物质,会大量的吸附在PVA上,过高浓度的戊二胺对酶转化有较强的产物抑制作用。这样导致酶转化效率变低。用环氧氯丙烷和/或液态环氧树脂处理,
可以改变载体表面性质,消除载体对产物的吸附作用。不仅是PVA,本发明中使用的其它合成高分子物质如聚乙二醇、聚丙烯腈、醋酸纤维、二醋酸纤维也都可以通过环氧氯丙烷和/或液态环氧树脂处理改变载体表面性质,消除载体对产物的吸附作用。如下述实施例中所证实的,环氧氯丙烷和/或液态环氧树脂处理显著改善了固定化的含有赖氨酸脱羧酶的细胞的稳定性和使用效果。
本发明中的环氧氯丙烷可以水溶液或者酒精溶液的形式存在,浓度为1~5.5wt%。在一些实施方案中,在1~5.5wt%的环氧氯丙烷中投入颗粒状固定化细胞,在20~50℃,速度100~300转/min振荡20~120min。
本发明中的液态环氧树脂选择为带有环氧基团的室温下为液态的环氧树脂,对环氧树脂分子量没有特别的限制,只要是液态的环氧树脂,都可以使用,其使用量具体根据环氧树脂的环氧基含量换算得来,在一些实施例中,可按照PVA中羟基理论摩尔数的1~1.5倍投入环氧氯丙烷。
本发明还公开了一种制备戊二胺的方法,包括:
a)将赖氨酸或其盐与上述固定化细胞接触;
b)固液分离得到含有戊二胺的溶液。
本发明对赖氨酸或其盐的形式没有特别的要求,可以为含有赖氨酸的任何液体,如赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液,赖氨酸发酵液去除菌体后的除菌赖氨酸发酵液和除菌赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液,纯化或部分纯化的赖氨酸发酵液,由赖氨酸或其盐配制的溶液;优选为赖氨酸发酵液。所述的赖氨酸盐,包括但不限于,赖氨酸盐酸盐,赖氨酸硫酸盐,赖氨酸碳酸盐,赖氨酸磷酸盐,赖氨酸己二酸盐,赖氨酸癸二酸盐。
在本发明的一些实施方案中,固定化细胞与赖氨酸或其盐接触时,温度为30~50℃,赖氨酸或其盐溶液的pH值为5~7。
在本发明的一些实施方案中,固定化细胞与赖氨酸或其盐接触时,溶液中赖氨酸或其盐的浓度为6~30wt%,优选8~20wt%。
在本发明的一些实施方案中,固定化细胞与赖氨酸或其盐接触时,加入辅酶。所述的辅酶可选自吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种,更优选为5'-磷酸吡哆醛。在一些实施方案中,按反应体系重量计(除辅酶,所有反应原物料重量计),辅酶的添加量0.01~0.5mmol/kg。
反应结束后,得到含有戊二胺的混合液(即反应终止液),对固液分离的方式没有特别的要求,例如离心,过滤等方式。可以采用现有的公知技术。对从固液分离后的清液中
提取戊二胺的方式没有特别要求,例如日本专利JP200400114A提到的先将溶液的pH值调节到12~14,然后用有机溶剂萃取,将萃取液减压蒸馏得到戊二胺。
本申请中所述的赖氨酸发酵原液包括所有现有技术制得的赖氨酸发酵液。
本发明中,所使用的赖氨酸发酵液可包含Cl-、SO4
2-等无机离子。
本发明中,赖氨酸发酵液还包含培养基配方中发酵后的残糖和残氮等各种残留组分。
本发明的用合成高分子物质固定化的表达赖氨酸脱羧酶的细胞催化赖氨酸发酵液生产戊二胺的方法具有以下优点:1)将含有赖氨酸脱羧酶的细胞进行固定化处理,提高了酶的利用率,有利于戊二胺生产工艺简化,并提高戊二胺的产品质量。
2)提高了固定化细胞的稳定性,从而使该方法可直接采用赖氨酸发酵原液来制备戊二胺,克服了现有技术中使用赖氨酸纯品、赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐和赖氨酸二羧酸盐等作为底物导致的成本高、工艺复杂等缺点,减少了赖氨酸发酵液的纯化步骤,简化工艺,降低戊二胺生产成本。
下面通过制备实施例对本发明进行示例性说明,使本发明的特征和优点更清楚,但本发明并不局限于本文中列出的实施例。如没有特别说明,所有培养基组分比例均为重量比,浓度为质量百分比浓度,赖氨酸含量以赖氨酸盐酸盐计。如没有特别说明实施例中所采用的原料均为市售。
实施例
制备实施例1、赖氨酸脱羧酶发酵液的制备
按照如下所述制备赖氨酸脱羧酶发酵液:
(1)种子培养
将表达赖氨酸脱羧酶的蜂房哈夫尼基因工程菌甘油保存菌液(山东凯赛)接种于装有100毫升液体的液体培养基(LB培养基,包含蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化钠1%,pH7.0)的500毫升种子瓶内,在30℃,250rmp摇床培养15小时。
(2)赖氨酸脱羧酶发酵
在5L发酵罐内,加入3升LB培养基,121℃灭菌20分钟后以接入上述种子液开始发酵(发酵培养基配方为LB培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化钠1%,pH7.0),于30℃、500转/分钟下开始发酵,控制通气流量为1vvm,罐压为0.1MPa;发酵过程中用碱溶液控制pH值为7.0,发酵30小时(h)后停止发酵。发酵结束后离心收集酶细胞用于固定
化细胞制备。
对比实施例1、角叉菜胶制备固定化赖氨酸脱羧酶细胞
(1)固定化细胞制备
将100ml水煮沸后,加入4g角叉菜胶,搅拌加热到角叉菜胶充分溶解,然后冷却到室温后加入制备实施例1制得的含有赖氨酸脱羧酶的细胞1克,充分搅拌均匀,用针管滴入2-5%的CaCl2水溶液中,生成直径约3-8mm的颗粒,过滤收集固定化细胞备用。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,将市售的赖氨酸含量为20%的赖氨酸发酵液稀释至浓度为8%,加入辅酶至终浓度0.1mM,将此含有辅酶的赖氨酸发酵液从酶反应柱的底部通入柱中,调整流速以保证流出的反应液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。戊二胺产率、固定化细胞使用时间及固定化细胞形态变化见表1
对比实施例2、海藻酸钠制备固定化赖氨酸脱羧酶的细胞
(1)固定化细胞制备
将100ml水煮沸后,加入3-5g海藻酸钠,搅拌加热到海藻酸钠充分溶解,然后冷却到室温后加入制备实施例1得到的含有赖氨酸脱羧酶的细胞1克,充分搅拌均匀,用针管滴入2-5%的CaCl2水溶液中,生成直径约3-8mm的颗粒,过滤收集固定化细胞备用。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,将浓度为8%赖氨酸发酵液通入固定化细胞反应柱,调整流速以保证流出的反应液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。将反应液不断收集浓缩后蒸馏得到戊二胺产品。戊二胺产率、固定化细胞使用时间及固定化细胞形态变化见表1。
对比实施例3、游离态的赖氨酸脱羧酶细胞对赖氨酸发酵液的催化效率
将1g赖氨酸脱羧酶细胞加入10g浓度为8%的赖氨酸发酵液的三角瓶中,加入辅酶至终浓度0.1mM,在40℃在200rpm催化反应1h,赖氨酸转化率99.25%,离心收集细胞重复催化赖氨酸发酵液,共反应3h后含酶细胞有部分破碎,离心回收细胞量仅为0.5g,对赖氨酸发酵液的催化效率下降至40%以下,相对酶活力显著下降,结果详见表1。
实施例1、聚乙烯醇制备赖氨酸脱羧酶固定化细胞
(1)固定化细胞制备
将100ml水煮开后,加入8g聚乙烯醇,搅拌,继续加热到聚乙烯醇充分溶解,冷却到室温后加入制备实施例1得到含有赖氨酸脱羧酶细胞的菌体悬液3克,充分搅拌均匀,放入-20℃冰箱中冷冻至凝固,取出加入饱和硫酸钠脱去80%的水分后,剪切成直径约4-8mm的颗粒。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,将含8%赖氨酸的发酵液通入固定化细胞反应柱,调整流速以保证流出的转化液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。收集酶脱羧液,浓缩后蒸馏得到戊二胺成品。
戊二胺产率、固定化细胞使用时间及固定化细胞形态变化见表1。
实施例2、聚乙烯醇和海藻酸钠混合制备赖氨酸脱羧酶固定化细胞
(1)固定化细胞制备
在100ml水中加入7g聚乙烯醇,加热搅拌至聚乙烯醇充分溶解,然后加入1.5g海藻酸钠加热溶解均匀,冷却到室温后加入一定量含有赖氨酸脱羧酶湿菌体的细胞,充分搅拌均匀,将溶液滴入6%的硼酸溶液中,形成颗粒,用水洗涤3遍后收集固定化细胞颗粒。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,将8%的赖氨酸发酵液从反应柱的底部通入,调整流速以保证流出的转化液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。收集酶反应液,浓缩后蒸馏得到戊二胺成品。
戊二胺产率、固定化细胞使用时间、固定化细胞形态变化及固定化细胞相对剩余酶活见表1。
实施例3、聚乙烯醇和聚乙二醇混合制备赖氨酸脱羧酶固定化细胞
(1)固定化细胞制备
在100ml水中加入7g聚乙烯醇,加热搅拌至聚乙烯醇充分溶解,然后加入0.5g聚乙二醇(PEG5000)加热溶解均匀,冷却到室温后加入1.5g赖氨酸脱羧酶细胞,充分搅拌均匀,将溶液烘干成型,剪切洗涤收集颗粒,得到固定化细胞。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,将8%的赖氨酸发酵液从反应柱的底部通入,调整流速以保证流出的转化液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。将反应液浓缩蒸馏得到戊二胺成品。
戊二胺产率、固定化细胞使用时间、固定化细胞形态变化及固定化细胞相对剩余酶活见表1。
实施例4、环氧氯丙烷处理固定化细胞
(1)固定化细胞制备
在100ml水中加入7g聚乙烯醇,加热搅拌至聚乙烯醇充分溶解,然后加入1.5g海藻酸钠加热溶解均匀,冷却到室温后加入含有赖氨酸脱羧酶的细胞2g,充分搅拌均匀,将溶液滴入含1%氯化钙的4%硼酸溶液,形成球状颗粒,取出颗粒用水洗涤3遍后加入到5%环氧氯丙烷酒精溶液中,在200rpm,室温振荡2小时后用水洗涤除去环氧氯丙烷,收集固定化细胞。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,从反应柱的底部通入浓度为8%(W/V)的赖氨酸发酵液液,调整流速以保证流出的转化液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),反应温度控制在40℃。反应液浓缩后蒸馏得到戊二胺成品。
戊二胺产率、固定化细胞使用时间、固定化细胞形态变化及固定化细胞相对剩余酶活见表1。
实施例5、环氧氯丙烷处理固定化细胞
(1)固定化细胞制备
在100ml水中加入8g聚乙烯醇,加热搅拌至聚乙烯醇充分溶解,冷却到室温后加入含有赖氨酸脱羧酶的细胞,充分搅拌均匀,将溶液滴入含1wt%氯化钙的4wt%硼酸溶液,形成球状颗粒,取出颗粒用水洗涤3遍后加入到5%环氧氯丙烷酒精溶液中,在200rpm,室温振荡2小时后洗涤除去环氧氯丙烷,收集固定化细胞。
(2)固定化细胞催化赖氨酸发酵液
将固定化细胞装入高径比为3:1的反应柱中,从反应柱的底部通入浓度为8%(W/V)的赖氨酸发酵液液,调整流速以保证流出的转化液中赖氨酸的残留量小于0.1%(W/W),
反应温度控制在40℃。反应液浓缩后蒸馏得到戊二胺成品。
戊二胺产率、固定化细胞使用时间、固定化细胞形态变化及固定化细胞相对剩余酶活见表1。
表1
注:戊二胺产率为一定反应时间内生成戊二胺摩尔数与反应液初始赖氨酸摩尔数比值。
虽然本发明实施例中仅对包埋法制备的固定化赖氨酸脱羧酶细胞催化不同处理的赖氨酸发酵液的方法进行说明,但本领域技术人员能够理解,本发明方法不局限于此,同样可用于其他产酶细胞的固定化和其他包含赖氨酸的溶液。