CN108410749B - 海洋低温(+)γ-内酰胺酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法 - Google Patents
海洋低温(+)γ-内酰胺酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种利用海洋低温(+)γ‑内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ‑内酰胺制备(‑)γ‑内酰胺的方法。本发明利用海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL‑6),保藏号为CGMCC No.8580发酵产低温(+)γ‑内酰胺酶;在水相体系中立体选择性水解(±)γ‑内酰胺,制备光学纯(‑)内酰胺,在150g/L底物浓度条件下,产物(‑)内酰胺经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(‑)内酰胺的光学纯度97%‑99.9%,化学纯度为96%‑99%。该海洋低温(+)(+)γ‑内酰胺酶法不对称水解(±)γ‑内酰胺制备(‑)γ‑内酰胺的方法,具有高立体选择性、高效率、高产率、高纯度、条件温和、环境友好等特点,且易于规模化生产,具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种利用海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法。
背景技术
(+)γ-内酰胺酶(EC 3.5.2.-)属于酰胺酶,其中的(+)γ-内酰胺酶能够高效率的动力学拆分外消旋体γ-内酰胺,获得光学纯的(-)γ-内酰胺。(-)γ-内酰胺,即(-)-文斯内酯,是(1R,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的简称,它是合成抗病毒药物碳环核苷化合物的一种重要手性中间体,是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦、抗流感药物帕拉米韦的合成原料。
抗艾滋病药物是一个巨大的市场,抗艾滋病药物的消耗,包括阿巴卡韦的需求量和销售量目前都在逐年递增;帕拉米韦是一种目前正在进行三期临床试验的治疗流感的药物。大家有目共睹的是,近几年来流感疫情发生了数次全球性的爆发,在这种形式下,迫切需要开发利用高效,低副作用的抗流感药物。而研究证明,帕拉米韦在治疗禽流感方面比“达菲”的效果更明显。综上所述,我们可以预见的是,由于阿巴卡韦和帕拉米韦的需求量的不断增加,作为重要手性原料的光学纯的(-)γ-内酰胺的产量需求今后也会不断的提高。目前阿巴卡韦在国内的研发尚处于起步阶段,未见产业化报道,一方面是专利的限制,更主要的原因是“(-)γ-内酰胺”的生产问题没有得到解决。传统化学方法合成的“γ-内酰胺”中,“(-)γ-内酰胺”和“(+)γ-内酰胺”各占50%,不能直接用来合成阿巴卡韦,而化学合成所采用不对称合成方法的缺点在于,原料昂贵,步骤烦琐,成本较高,不利于工业化生产。而通过(+)γ-内酰胺酶进行催化合成光学纯的(-)γ-内酰胺具有效率高,产物纯度高及对环境友好的特点。
海洋中微生物资源十分丰富,许多海洋微生物酶在低温条件下仍具有相对较高的活性,且代谢易于调控。在工业生产中应用低温微生物和低温酶具有以下优势:可以防止微生物污染的0~20℃范围内,低温微生物具有高生长速率、高酶活力及高催化效率,缩短处理过程,降低生产成本,节约能源;低温酶经温和的热处理即可丧失活力,而不会影响产品品质并易于规模化生产,使其研究与开发受到重视。
如果可以工业化大规模生产(-)γ-内酰胺,则可以解决目前以及今后国内医药企业在阿巴卡韦国产化过程中,关键手性中间体短缺的问题,填补国内(-)γ-内酰胺生产技术方法的空白,使阿巴卡韦的国产化变为可能。抗艾滋病药物的国产化可以极大地降低艾滋病治疗成本,减轻社会负担,具有极高的经济价值和社会价值,对于国家的疾病防治工作具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法。
为了实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案:
一株产高立体选择性海洋低温(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株,其分类命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.8580。
一种利用权利要求1所述菌株生产海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋(±)γ-内酰胺,制备(-)内酰胺的方法,采用具有立体选择性的海洋低温(+)γ-内酰胺酶,在水相体系,以(±)γ-内酰胺为底物,进行不对称水解拆分制备(-)内酰胺,步骤如下:
(1)微生物菌株:假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580;
(2)将步骤(1)的菌株接种于种子培养基中摇床培养,培养温度15~20℃;摇床转速160~220rpm;培养时间1~2天,得到种子液;其中,种子培养基为:酵母膏15.0~20.0g,蛋白胨5.0~10g,NaCl 5.0~10.0g,MgSO4 0.05~0.2g,ZnSO4·7H2O 1.0~5.0mg,自来水1.0L,pH为8.0~9.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min;
(3)将步骤(2)得到的种子液接入产酶培养基中培养,在摇床转速160~220rpm,15~20℃,培养2~5天,即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束;其中,产酶培养基为:牛肉膏10.0~15.0g,蛋白胨5.0~10.0g,乙酰胺10~20g,Tween80 0.2~0.6g,(NH4)2SO4 2.0~2.5g,KH2PO4 1.5~2.0g,MgSO4 0.1~0.3g,CaCl2 0.1~0.6g,ZnSO4·7H2O 1.4~5.0mg,自来水1.0L,pH为6.0~8.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min;
(4)将步骤(3)的培养物离心,取上清液,得到含有海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液,低温透析浓缩得到浓缩酶液,冷冻干燥,保存备用;
(5)反应体系的配制:以(±)γ-内酰胺为底物,用pH4~10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为5g/L~500g/L;
(6)酶催化反应:在步骤(5)的单一水相反应体系中,加入步骤(4)的粗酶液100~500U/mL进行反应,反应温度为15~30℃,反应时间为5~24小时,摇床转速为100~220rmp;
(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液,加入氯仿:正丁醇=5:1(v/v)混合,震荡后离心除去蛋白,上清液采用乙酸乙酯萃取,无水硫酸镁干燥,在30~100℃下蒸发浓缩,-20~-4℃下冷却结晶,得到高纯度的(-)内酰胺,光学纯度97%-99.9%,化学纯度为96%~99%。
具体地,步骤(1)中假交替单胞菌的菌液涂布于平板筛选培养基,20℃下培养3~5天,挑取单菌落,进行活性测定;其中,平板筛选培养基为:酵母膏10.0g,N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g,NH4Cl 10.0g,Na2HPO4 1.2g,NaH2PO4 1.0g,MgSO4 0.5g,琼脂粉20g,自来水1.0L,pH为8.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min。
与现有技术相比,本发明的有益效果:本发明利用筛选获得的海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580,生产具有高立体选择性的低温(+)γ-内酰胺酶,在水相体系中,水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺。在300g/L底物浓度下,产物(-)γ-内酰胺的光学纯度(ee值)达到100%,产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶的达到光学纯的(-)γ-内酰胺,产物的光学纯度97%~99.9%,化学纯度为96%~99%。该生物酶法不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高效率、高产率、高纯度、条件温和、环境友好等特点,本发明在自然温度下应用、无需加热和冷却系统,易于规模化生产,产品性能稳定,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果;
图2为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶最适作用温度结果;
图3为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶最适作用pH及其稳定性结果;
图4为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶制备高纯度的(-)γ-内酰胺的HPLC结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对说明书做进一步说明。
实施例1
所述的一种海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCCNo.8580生产海洋低温(+)γ-内酰胺酶的方法,包括以下步骤:
(1)利用保藏的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580的菌液涂布于平板筛选培养基,20℃下培养3~5天,挑取单菌落,进行活性测定。
(2)将筛选的菌株接种于种子培养基,培养温度20℃,摇床转速2020rpm下培养2天,得到种子液;
(3)将种子液接入产酶培养基中培养,在摇床转速220rpm,20℃,培养3天,即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束,将培养物高速离心后获得上清液,即得到海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液(见图1)。
(4)将粗酶液低温透析浓缩得到浓缩酶液,冷冻干燥,保存备用;
(5)反应体系的配制:以(±)γ-内酰胺为底物,用pH4~10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为5g/L~500g/L;
(6)酶催化反应:在步骤(5)的单一水相反应体系中,加入步骤(4)的粗酶液100~500U/mL进行反应,反应温度为15~30℃,反应时间为5~24小时,摇床转速为100~220rmp;
(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液,加入氯仿:正丁醇=5:1(v/v)混合,震荡后离心除去蛋白,上清液采用乙酸乙酯萃取,无水硫酸镁干燥后进行手性HPLC检测(结果见图4);
检测方法:采用日本岛津LC-20A,色谱柱型号为日本大赛璐手性色谱柱型号:CHIRALPAK AS-H 250×4.6mm;流动相:异丙醇/乙腈=20/80(v/v);流速:0.6ml/min;内标:0.1g/L苯甲酰胺;波长230nm;进样量:10μL。
(8)产物的分离提取:采用乙酸乙酯萃取步骤(7)中上清液,无水硫酸镁干燥,在30~100℃下蒸发浓缩,-20~-4℃下冷却结晶,得到高纯度的(-)γ-内酰胺,光学纯度97%~99.9%,化学纯度为96%-99%。
平板筛选培养基:酵母膏10.0g,N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g,NH4Cl 10.0g,Na2HPO41.2g,NaH2PO4 1.0g,MgSO4 0.5g,琼脂粉20g,自来水1.0L,pH为8.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min。
种子培养基为:酵母膏20.0g,蛋白胨5.0g,NaCl 5.0g,MgSO4 0.2g,ZnSO4.7H2O5.0mg,自来水1.0L,pH为8.00,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min。
产酶培养基为:牛肉膏10.0g,蛋白胨5.0g,乙酰胺10g,Tween80 0.6g,(NH4)2SO42.5g,KH2PO4 1.5g,MgSO4 0.1g,CaCl2 0.1g,ZnSO4·7H2O 1.4mg,自来水1.0L,pH7.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min。
实施例2温度对酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的影响
温度是影响酶作用的一个至关重要的因素,以(±)γ-内酰胺为底物,用pH8、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液,反应时间为24小时,摇床转速为220rmp。将反应体系分别置于10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、70.0℃等环境考察酶的温度稳定性。从图2可见,(+)γ-内酰胺酶在不同温度下孵育30min后,在4℃下酶活力为100%,60℃时保持在80%以上,在70℃仍有50%活性,显示出该酶对温度的广泛适应性。(+)γ-内酰胺酶在低于20℃情况下仍能保持稳定的酶催化活力,这符合低温酶的生理特性,且在中低温环境下酶活保持较高水平,这对于药物的合成具有重要意义。
实施例3
以(±)γ-内酰胺为底物,底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液,反应时间为24小时,摇床转速为220rmp,温度20℃。用pH4.0~10.0、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,考察pH对该(+)γ-内酰胺酶活力的影响。如图3所示,该酶的最适作用pH为8.0。在pH为8.0时,酶活为最适pH时的90%左右,表明该酶在弱碱性环境下具有较好作用效果。该(+)γ-内酰胺酶的pH稳定性曲线表明pH范围在4.0~10.0、20.0℃保温2h,酶活力波动较大,pH稳定性一般。
实施例4
以(±)γ-内酰胺为底物,用pH8、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液,反应时间为24小时,反应温度20℃,摇床转速为220rmp。反应体系中加入1mM不同的金属离子,考察其对酶活性的影响。主要表现在,金属离子不作为酶结构的一部分,但酶需要通过加入金属离子才能发挥其催化作用。早期研究表明K+、Na+、Mg2 +和Ca2+是海洋环境中含量最丰富四种金属离子,可显著促进海洋低温酶活性。本研究中K+、Na+、Mg2+和Ca2+表现出一定提高(+)γ-内酰胺酶酶活效果(见表1),证明其海洋来源酶的特性。
表1金属离子对海洋低温(+)γ-内酰胺酶活性的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种制备(-)γ-内酰胺的方法,其特征在于,采用具有立体选择性的海洋低温(+)γ-内酰胺酶,在水相体系,以(±)γ-内酰胺为底物,进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺,步骤如下:(1)微生物菌株:假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)CGMCCNo.8580;(2)将步骤(1)的菌株接种于种子培养基中摇床培养,培养温度15~20℃;摇床转速160~220rpm;培养时间1~2天,得到种子液;其中,种子培养基为:酵母膏15.0~20.0g,蛋白胨5.0~10g,NaCl5.0~10.0g,MgSO40.05~0.2g,ZnSO4·7H2O1.0~5.0mg,自来水1.0L,pH为8.0~9.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min;(3)将步骤(2)得到的种子液接入产酶培养基中培养,在摇床转速160~220rpm,15~20℃,培养2~5天,即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束;其中,产酶培养基为:牛肉膏10.0~15.0g,蛋白胨5.0~10.0g,乙酰胺10~20g,Tween80 0.2~0.6g,(NH4)2SO42.0~2.5g,KH2PO41.5~2.0g,MgSO40.1~0.3g,CaCl20.1~0.6g,ZnSO4·7H2O1.4~5.0mg,自来水1.0L,pH为6.0~8.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min;(4)将步骤(3)的培养物离心,取上清液,得到含有海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液,低温透析浓缩得到浓缩酶液,冷冻干燥,保存备用;(5)反应体系的配制:以(±)γ-内酰胺为底物,用pH4~10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系,底物浓度为5g/L~500g/L;(6)酶催化反应:在步骤(5)的单一水相反应体系中,加入步骤(4)的粗酶液100~500U/mL进行反应,反应温度为15~30℃,反应时间为5~24小时,摇床转速为100~220rmp;(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液,加入氯仿:正丁醇=5:1(v/v)混合,震荡后离心除去蛋白,上清液采用乙酸乙酯萃取,无水硫酸镁干燥,在30~100℃下蒸发浓缩,-20~-4℃下冷却结晶,得到高纯度的(-)内酰胺,光学纯度97%-99.9%,化学纯度为96%~99%。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中假交替单胞菌的菌液涂布于平板筛选培养基,20℃下培养3~5天,挑取单菌落,进行活性测定;其中,平板筛选培养基为:酵母膏10.0g,N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g,NH4Cl 10.0g,Na2HPO4 1.2g,NaH2PO4 1.0g,MgSO4 0.5g,琼脂粉20g,自来水1.0L,pH为8.0,于103kpa,121℃高压蒸汽灭菌30min。
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