CN101979534A - 制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞。本发明所提供的固定化大肠杆菌细胞，是通过包括如下步骤的方法得到的：1)将聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液混合，得到I液；2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合，得到II液；3)将步骤2)得到的II液滴加到氯化钙和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大肠杆菌细胞。本发明所提供的制备唾液酸的方法，是将所述固定化大肠杆菌细胞发酵培养，得到唾液酸。本发明所提供的制备唾液酸的固定化大肠杆菌细胞和发酵方法，可将固定化大肠杆菌细胞连续培养10批以上，且大肠杆菌产唾液酸的能力不下降，不需另制备菌种种子液，具有省时、省料、提高产率和降低成本等的优点。

Description

制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞

技术领域

本发明涉及制备唾液酸的方法和专用固定化大肠杆菌细胞。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)是一族神经氨酸(Neuraminic acid)衍生物，是含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，它是生物杂聚物的重要组成部分，主要以短链残基的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端。从1957年发现这种物质以来，唾液酸已经被证明对体内多种生物学功能具有重要意义。目前主要应用领域有三个方面：一是药物前体市场，二是婴儿食品市场，三是保健品市场.

无论是作为具有保健功能的食品添加剂还是用于生产具有治疗功能的临床药物，唾液酸都具有广泛的应用前景和较高的市场价值，但是，唾液酸的生产则一直处于较低水平，难以满足将来市场大规模的需求。

唾液酸单体的生产主要有化学合成法、提取法、酶法合成和微生物发酵四种。化学合成法：成本高，需要用到贵重金属铟，反应条件苛刻，纯化困难。提取法：从植物或动物组织中提取唾液酸，如：燕窝、鸡蛋、动物脏器和部分植物等，由于唾液酸的含量低，来源少，受客观因素影响大，污染也很大，不利于工业推广。酶法合成：唾液酸醛缩酶不易获得，同时需要N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸作为底物，原料成本高，导致终产品价格昂贵。而最常用的是微生物发酵，其生产原理是通过微生物发酵工艺，使特定的细菌在生长过程中合成胞外多聚唾液酸。将菌体去除后，上清液即为多聚唾液酸，多聚唾液酸经过进一步精制后，在特定的条件下进行解聚，获得唾液酸单体。运用离子柱层析纯化唾液酸单体，获得纯的唾液酸单体制品。微生物发酵属于生化过程，所以原料费用低廉，产品成本很低，但常规发酵方法菌种培养需要较多的时间、人力与物力，其生产效率还不高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种固定化大肠杆菌细胞。

本发明所提供的固定化大肠杆菌细胞，是通过包括如下步骤的方法得到的：

1)将聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液混合，得到I液；

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合，得到II液；

3)将步骤2)得到的II液滴加到氯化钙和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大肠杆菌细胞。

所述大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液；

所述将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合的体积比为10∶1；所述II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸-1×10⁹CFU大肠杆菌，具体为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌或1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁹CFU大肠杆菌；

所述步骤3)中所述II液的温度为38℃-42℃，具体为38℃、40℃或42℃；所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的温度为4℃；所述II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

所述聚乙烯醇的数均分子量为1750g/mol；

所述I液中聚乙烯醇的浓度为100g/L，海藻酸钠的浓度为10g/L；

所述大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁸CFU/ml-1×10⁹CFU/ml，具体为1×10⁸CFU/ml或1×10⁹CFU/ml；

所述氯化钙和硼酸的混合水溶液中氯化钙的浓度为20g/L，硼酸的浓度为40g/L。

所述放置的方法为先在25℃放置4小时，然后在4℃下放置16-20小时，具体为16小时、18小时或20小时；

所述滴加的方法为用注射器滴加；所述注射器的针头直径为0.4mm。

所述大肠杆菌为大肠杆菌菌种C8。

所述固定化细胞的直径为2mm-4mm。

本发明的另一个目的是提供一种制备唾液酸的方法。

本发明所提供的制备唾液酸的方法，是将所述的固定化大肠杆菌细胞发酵培养，得到唾液酸。

所述方法中，在所述发酵培养后，包括如下提取步骤：将所述发酵培养后得到的发酵液中的固定化大肠杆菌细胞取出后，将剩余的发酵液离心，取上清液经超滤浓缩后，加入硫酸铵水溶液，在0℃进行沉淀，取上清再离心，得到的上清液为唾液酸；所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

所述发酵培养的培养基由以下成分组成：

山梨醇、硫酸铵、胰蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁和水；

以上成分在所述培养基中浓度分别为：

山梨醇25g/L、硫酸铵5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾20g/L和硫酸镁0.4g/L；

所述发酵培养的温度为37℃；

所述发酵培养的pH值为7.8；

所述发酵培养的时间为65小时；

所述发酵培养中固定化细胞的用量为5粒-15粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基，具体为5粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基、10粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基或15粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基。

所述的固定化大肠杆菌细胞在制备唾液酸中的应用也属于本发明保护的范围。

本发明所提供的制备唾液酸的固定化大肠杆菌细胞和发酵方法，可将固定化大肠杆菌细胞连续培养10批以上，且大肠杆菌产唾液酸的能力不下降，不需另制备菌种种子液，具有省时、省料、提高产率和降低成本等的优点。本发明所提供的固定化大肠杆菌细胞的制备方法简单，整个工艺易于操作，效果显著。因此，本方法在开发唾液酸及其衍生物产品方面，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

聚乙烯醇(数均分子量1750g/mol；购自北京博恩创奇科贸中心，产品目录号为00636)；

海藻酸钠(购自北京中生百欣科技服务有限公司，产品目录号为5-84)。

实施例1、制备固定化大肠杆菌细胞

方法I

固定化大肠杆菌细胞的制备方法如下：

1)将聚乙烯醇的水溶液和海藻酸钠的水溶液混合，得到I液；I液中聚乙烯醇的浓度为100g/L，数均分子量为1750g/mol，海藻酸钠的浓度为10g/L。

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液按照体积比为10∶1的比例混合，得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌。大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液，在大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁸CFU/ml。

3)将步骤2)得到的II液放在温度为38℃的水浴锅中温浴，然后取10ml II液用5ml注射器滴(注射器的针头直径为0.4mm)加到4℃的500mL氯化钙和硼酸的混合水溶液(含有20g/L氯化钙和40g/L硼酸)中，边滴加边搅拌，25℃放置4小时，然后在4℃(冰箱冷藏室)下放置16小时进行硬化，制备得到固定化细胞。得到的固定化细胞为直径为2mm-4mm的颗粒。所述滴加的II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

上述大肠杆菌菌悬液是通过如下步骤的方法得到：

(1)将大肠杆菌菌种C8(保藏在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4214)(公众可从中围科学样微生物研究所获得该大肠杆菌菌种C8，记载过该材料的非专利文献是：郭良栋，钱世钧，叶军，张树政.产多聚唾液酸的菌种筛选及产酸条件.微生物学报，1998，38(2)，103-107)按5％的接种量(体积百分比)接入培养基A，在pH值为7.8、37℃和250rpm的条件下培养65小时得到发酵液；

(2)取50ml步骤1得到发酵液，4000rpm离心10min，去掉上清，收集大肠杆菌细胞；

(3)将步骤(2)收集的大肠杆菌细胞用0.85％的生理盐水洗涤2次后，溶于5ml生理盐水，制备得到大肠杆菌菌悬液；

所述培养基A由以下成分组成：

山梨醇、硫酸铵、胰蛋白胨(购自北京鼎国生物技术有限责任公司，产品目录号为DH378)、磷酸氢二钾、硫酸镁和水；

以上成分在所述培养基A中浓度分别为：

山梨醇25g/L、硫酸铵5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾20g/L和硫酸镁0.4g/L。

方法II

固定化细胞的制备方法如下：

1)与方法I中步骤1)相同。

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液按照体积比为10∶1的比例混合，得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌。大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液，在大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁸CFU/ml。

3)将步骤2)得到的II液放在温度为40℃的水浴锅中温浴，然后取10ml II液用5ml注射器(注射器的针头直径为0.4mm)滴加到4℃的500mL氯化钙和硼酸的混合水溶液(含有20g/L氯化钙和40g/L硼酸)中，边滴加边搅拌，25℃交联4小时，然后在4℃(冰箱冷藏室)下放置18小时进行硬化，制备得到固定化细胞。得到的固定化细胞为直径为2mm-4mm的颗粒。所述滴加的II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

上述大肠杆菌菌悬液的制备方法与方法I中相同。

方法III

固定化细胞的制备方法如下：

1)与方法I中步骤1)相同。

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液按照体积比为10∶1的比例混合，得到II液；II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁹CFU大肠杆菌∶大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液，在大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁹CFU/ml大肠杆菌。

3)将步骤2)得到的II液放在温度为42℃的水浴锅中温浴，然后取10ml II液用5ml注射器(注射器的针头直径为0.4mm)滴加到4℃的500mL冷却的氯化钙和硼酸的混合水溶液(含有20g/L氯化钙和40g/L硼酸)中，边滴加边搅拌，25℃交联4小时，然后在4℃(冰箱冷藏室)下放置20小时进行硬化，制备得到固定化细胞。得到的固定化细胞为直径为2mm-4mm的颗粒。所述滴加的II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

上述大肠杆菌菌悬液的制备方法与方法I中相同。

实施例2、制备唾液酸

方法I

1、固定化细胞的培养

取实施例1制备得到的直径为2mm-4mm的固定化细胞颗粒5粒，用无菌水洗涤后，放入装有50ml已灭菌好的发酵培养基的250ml的三角瓶中，在pH值为7.8、37℃和250rpm的条件下培养65h得到发酵液。所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

上述发酵培养的培养基由以下成分组成：

山梨醇、硫酸铵、胰蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁和水；

以上成分在所述培养基中浓度分别为：

山梨醇25g/L、硫酸铵5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾20g/L和硫酸镁0.4g/L。

2、固定化细胞的连续培养

将步骤1得到的发酵液倒出，取出5粒固定化细胞颗粒，用无菌水冲洗后，再接入装有50ml已灭菌好的上述发酵培养基的250ml三角瓶中，在与步骤1同样的条件下摇瓶培养，发酵完毕，用同样方法取出5粒固定化细胞颗粒，继续下一批培养。

按此方法连续培养13批。

3、分离提取唾液酸

将步骤2每批培养得到的发酵液中的固定化细胞颗粒取出后，将剩余发酵液离心，取上清液经超滤浓缩后，加入浓度为291g/L的硫酸铵水溶液使超滤浓缩后的上清液达到50％饱和度，在0℃进行沉淀，取上清再离心，得到的上清液即为唾液酸。

4、唾液酸含量的测定

将所得的唾液酸进行含量测定，方法如下：

R-试剂：将间苯二酚0.2ml溶解在10ml水中，并加入80ml浓HCL和0.25ml0.1mol/L的硫酸铜，用水定容到100ml。

取0.1ml步骤3得到的唾液酸，加1.9ml蒸馏水，加2ml R-试剂，在沸水中煮15min，冷却后加入4ml丁酸丁酯∶正丁醇(体积比为85∶15)，剧烈振荡，并在冰水中冷却10min，离心(1000g，5min)，将有机相转到1cm比色杯中，以未加入样品的为对照，在580nm处测光密度。

测定结果表明，每批培养所得的发酵液中的唾液酸的含量没有明显的变化(表1)，没有出现唾液酸的含量下降趋势。具体的数据如下：

表1发酵液中的唾液酸的含量

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
														唾液酸ug/ml	558.9	543.9	661.5	558.9	764.4	808.5	779.1	558.9	588	573.3	632.1	617.4	617.4

方法II

1、固定化细胞的培养

除取实施例1制备得到的直径为2mm-4mm的固定化细胞颗粒10粒以外，其余方法均与方法I相同。

2、固定化细胞的连续培养

将步骤1得到的发酵液倒出，取出10粒固定化细胞颗粒，用无菌水冲洗后，再接入装有50ml已灭菌好的上述发酵培养基的250ml三角瓶中，在与步骤1同样的条件下摇瓶培养，发酵完毕，用同样方法取出10粒固定化细胞颗粒，继续下一批培养。

按此方法连续培养13批。

3、分离提取唾液酸

与方法I相同。

4、唾液酸含量的测定

测定方法与方法I相同。

测定结果与方法I无显著差异。

方法III

1、固定化细胞的培养

除取实施例1制备得到的直径为2mm-4mm的固定化细胞颗粒15粒以外，其余方法均与方法I相同。

2、固定化细胞的连续培养

将步骤1得到的发酵液倒出，取出15粒固定化细胞颗粒，用无菌水冲洗后，再接入装有50ml已灭菌好的上述发酵培养基的250ml三角瓶中，在与步骤1同样的条件下摇瓶培养，发酵完毕，用同样方法取出15粒固定化细胞颗粒，继续下一批培养。

按此方法连续培养13批。

3、分离提取唾液酸

与方法I相同。

4、唾液酸含量的测定

测定方法与方法I相同。

测定结果与方法I无显著差异。

Claims (10)

1.一种固定化大肠杆菌细胞，是通过包括如下步骤的方法得到的：

1)将聚乙烯醇水溶液和海藻酸钠水溶液混合，得到I液；

2)将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合，得到II液；

3)将步骤2)得到的II液滴加到氯化钙和硼酸的混合水溶液中，放置，得到固定化大肠杆菌细胞。

2.根据权利要求1中所述的固定化大肠杆菌细胞，其特征在于：

所述大肠杆菌菌悬液是大肠杆菌的生理盐水溶液；

所述将步骤1)得到的I液与大肠杆菌菌悬液混合的体积比为10∶1；

所述II液中，聚乙烯醇、海藻酸钠和大肠杆菌的配比为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌-1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁹CFU大肠杆菌，具体为1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁸CFU大肠杆菌或1g聚乙烯醇∶0.1g海藻酸钠∶1×10⁹CFU大肠杆菌；

所述步骤3)中所述II液的温度为38℃-42℃，具体为38℃、40℃或42℃；所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的温度为4℃；所述II液与所述氯化钙和硼酸的混合水溶液的体积比为1∶50。

3.根据权利要求1或2所述的固定化大肠杆菌细胞，其特征在于：

所述聚乙烯醇的数均分子量为1750g/mol；

所述I液中聚乙烯醇的浓度为100g/L，海藻酸钠的浓度为10g/L；

所述大肠杆菌菌悬液中菌浓度为1×10⁸CFU/ml-1×10⁹CFU/ml，具体为1×10⁸CFU/ml或1×10⁹CFU/ml；

所述氯化钙和硼酸的混合水溶液中氯化钙的浓度为20g/L，硼酸的浓度为40g/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述的固定化大肠杆菌细胞，其特征在于：

所述放置的方法为先在25℃放置4小时，然后在4℃下放置16小时-20小时，具体为16小时、18小时或20小时；

所述滴加的方法为用注射器滴加；所述注射器的针头直径为0.4mm。

5.根据权利要求1-4中任一所述的固定化大肠杆菌细胞，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌菌种C8。

6.根据权利要求1-5中任一所述的固定化大肠杆菌细胞，其特征在于：所述固定化大肠杆菌细胞的直径为2mm-4mm。

7.制备唾液酸的方法，是将权利要求1-6中任一所述的固定化大肠杆菌细胞发酵培养，得到唾液酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵培养后，包括如下提取步骤：将所述发酵培养后得到的发酵液中的固定化大肠杆菌细胞取出后，将剩余的发酵液离心，取上清液经超滤浓缩后，加入硫酸铵水溶液，在0℃进行沉淀，取上清再离心，得到的上清液为唾液酸；所述发酵液为发酵容器内的所有物质。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养的培养基由以下成分组成：

山梨醇、硫酸铵、胰蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁和水；

以上成分在所述培养基中浓度分别为：

山梨醇25g/L、硫酸铵5g/L、胰蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾20g/L和硫酸镁0.4g/L；

所述发酵培养的温度为37℃；

所述发酵培养的pH值为7.8；

所述发酵培养的时间为65小时；

所述发酵培养中固定化大肠杆菌细胞的用量为5粒-15粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基，具体为5粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基、10粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基或15粒所述固定化大肠杆菌细胞/50ml发酵培养基。

10.权利要求1-6中任一所述的固定化大肠杆菌细胞在制备唾液酸中的应用。