CN101285059A - 微杆菌的固定化方法及其用于生产(-)γ-内酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
微杆菌的固定化方法及其用于生产(－)γ－内酰胺的方法属于手性领域。本发明的固定化方法：将聚乙烯醇和海藻酸钠混合后加热溶解，冷却至40℃以下后与微杆菌细胞混合均匀得到混合溶液；所述的微杆菌保藏号为CGMCC No.2350；将均匀混合有微杆菌细胞的聚乙烯醇－海藻酸钠溶液滴入含有氯化钙的硼酸饱和溶液中，形成珠体。用固定化细胞生产(－)γ－内酰胺的方法：将固定化细胞用生理盐水洗涤，得到生物催化剂；生物催化剂与2～20g/L(+/－)γ－内酰胺溶液混合，在25～50℃pH6.0～8.0条件下，200～220转/分钟振荡1～12小时后以10000转/分钟离心5分钟。通过手性HPLC测定得到固定化细胞转化消旋的γ－内酰胺得到(－)γ－内酰胺的ee值可达到93.66％。
Description
技术领域
本发明涉及一种氧化烃微杆菌的固定化方法及应用固定化细胞生产手性药物中间体(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮的方法。
背景技术
(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮是一种十分有用的药物中间体，它有两种异构体即(1R，4S)构型和(1S，4R)构型。阿巴卡韦及卡波韦等许多碳环嘌呤和嘧啶核苷酸类似物具有抗HIV效果，(1R，4S)构型的化合物是合成以上药物的原料。
对经诱变筛选得到的可以立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物的产酶菌株进行细胞固定化，得到的固定化细胞应用于立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物。在制药行业有实际应用价值，特别对抗艾滋病药物的合成具有重要意义。
从工业化角度看，固定化细胞有稳定性高，可重复使用的优点，适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以立体选择性水解消旋2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮而得到其(1R，4S)构型化合物的产酶菌株的固定化方法与利用固定化细胞生产手性药物中间体(1R，4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮的方法。
本发明中，用于固定化的菌株为实验室筛选并经诱变筛选后保藏的氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)(L29-9-B-4)，保藏号为CGMCC No.2350。
本发明用于固定化的微生物是一种氧化烃微杆菌
(Microbacterium hydrocarbonoxydans)(L29-9-B-4)。
该菌株具有如下的性质：
1.形态生理生化特征：
形态特征：杆菌，菌落呈浅黄色，湿润，粘稠，圆形，边缘整齐，不透明。
生理生化特征：革兰氏阳性细菌，产γ-内酰胺水解酶。
2.采用的培养基及培养条件：
参见专利“微杆菌及诱变方法与其在手性药物中间体生产上的应用”，申请号：200810056829.8，申请日：2008-1-25。
本发明所述微杆菌的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠混合后加热溶解，冷却至40℃以下后与微杆菌细胞混合均匀得到混合溶液；所述的微杆菌Microbacteriumhydrocarbonoxydans保藏号为CGMCC No.2350；在该混合溶液中海藻酸钠浓度为10～30g/L，聚乙烯醇浓度为30～100g/L，微杆菌细胞浓度为5～20g/L。
(2)将均匀混合有微杆菌细胞的聚乙烯醇-海藻酸钠溶液滴入含有氯化钙的硼酸饱和溶液中，形成珠体，即为固定化细胞；氯化钙在最终溶液中浓度为10～30g/L。
应用固定化细胞生产(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备生物催化剂：将固定化细胞用生理盐水洗涤，得到生物催化剂；
(2)生物转化实验：将步骤(1)中的生物催化剂与2～20g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，在25～50℃pH6.0～8.0条件下，200～220转/分钟振荡1～12小时；生物催化剂浓度为固定化的细胞质量/(+/-)γ-内酰胺体积为0.3％质量/体积百分比。
(3)分离样品：取步骤(2)中的转化液，以10000转/分钟离心5分钟以上，得到上清液即为样品。用手性HPLC法测定ee值。
在上述方法中，手性HPLC采用CHIRALPAK AS-H 250x4.6mm，流动相：乙腈∶异丙醇(80∶20)。通过手性HPLC测定得到固定化细胞转化消旋的γ-内酰胺得到(-)γ-内酰胺的ee值达到93.66％。
附图说明
图1是外消旋γ-内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为(+)γ-内酰胺，2号峰为(-)γ-内酰胺。
图2是按照本发明实施例1的方法，转化后的γ-内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为(+)γ-内酰胺，2号峰为(-)γ-内酰胺。
图3是按照本发明实施例2的方法，转化后的γ-内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为(+)γ-内酰胺，2号峰为(-)γ-内酰胺。
图4是按照本发明实施例3的方法，转化后的γ-内酰胺的手性HPLC图谱。1号峰为(+)γ-内酰胺，2号峰为(-)γ-内酰胺。
具体实施方式
实施例一：微杆菌的固定化方法及其在手性药物中间体生产上的应用
(1)菌种选择：选用经过逐级诱变的氧化烃微杆菌
(Microbacterium hydrocarbonoxydans)的突变株L29-9-B-4；
(2)细胞固定化；将聚乙烯醇和海藻酸钠混合后加热溶解，冷却至40℃以下后与微杆菌细胞混合均匀；将均匀混合有微杆菌细胞的聚乙烯醇-海藻酸钠溶液滴入含有氯化钙的硼酸饱和溶液中，形成珠体；在该混合溶液中海藻酸钠浓度为10g/L，聚乙烯醇浓度为30g/L，微杆菌细胞浓度为5g/L。氯化钙在最终溶液中浓度为10g/L。
(3)制备生物催化剂：将步骤(2)中制得的固定化细胞用生理盐水洗涤，得到生物催化剂；
(4)生物转化实验：将步骤(3)中的生物催化剂与2g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，在25℃，pH6.0条件下，200转/分钟振荡1小时；生物催化剂浓度为固定化的细胞质量/(+/-)γ-内酰胺体积为0.3％质量/体积百分比。
(5)分离样品：取步骤(4)中的转化液5ml，以10000转/分钟离心5分钟，得到上清液即为样品。
取步骤(5)中5μl样品进样，利用手性HPLC测定(+)γ-内酰胺及(-)γ-内酰胺的含量，得到ee值为21.28％。
其余实施例见下表
Claims (2)
1.一种微杆菌的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠混合后加热溶解，冷却至40℃以下后与微杆菌细胞混合均匀得到混合溶液；所述的微杆菌Microbacteriumhydrocarbonoxydans保藏号为CGMCC No.2350；在该混合溶液中海藻酸钠浓度为10～30g/L，聚乙烯醇浓度为30～100g/L，微杆菌细胞浓度为5～20g/L；
(2)将均匀混合有微杆菌细胞的聚乙烯醇-海藻酸钠溶液滴入含有氯化钙的硼酸饱和溶液中，形成珠体，即为固定化细胞；氯化钙在最终溶液中浓度为10～30g/L。
2.应用权利要求1所述固定化方法得到的固定化细胞生产(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备生物催化剂：将固定化细胞用生理盐水洗涤，得到生物催化剂；
(2)生物转化实验：将步骤(1)中的生物催化剂与2～20g/L(+/-)γ-内酰胺溶液混合，在25～50℃pH6.0～8.0条件下，200～220转/分钟振荡1～12小时；
(3)分离样品：取步骤(2)中的转化液，以10000转/分钟离心5分钟以上，得到上清液即为样品。
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