CN100392090C - 酶法拆分制备l－蛋氨酸－15n和d－蛋氨酸－15n的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，该方法采用游离米曲霉菌体细胞或直接用氨基酰化酶拆分DL-蛋氨酸-15N，以外消旋乙酰-蛋氨酸-15N(N-AC-DL-Met-15N)为原料，以游离米曲霉菌体细胞中的氨基酰化酶(EC.3，5，14)或氨基酰化酶粉为水解催化剂；使用该方法获得的L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N产品收率高、光学纯度高、化学纯度高、丰度不下降。
Description
技术领域
本发明涉及一种外消旋化合物的拆分方法，是一种生化制品的制备方法，尤其涉及一种酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法。
背景技术
蛋氨酸是构成蛋白质的基本单位之一，是必需氨基酸中唯一含有硫的氨基酸，它除了参与动物体内甲基的转移及磷的代谢和肾上腺素、胆碱和肌酸的合成外，还是合成蛋白质和胱氨酸的原料。蛋氨酸无法在动物体内合成，需从食物中摄人，将它加入饲料中，可以促进禽畜生长、增加瘦肉量和达到缩短饲养周期的效果。在动物饲料中添加1kg蛋氨酸，相当于50kg鱼粉的营养价值，一般添加量为0.05％～0.2％。畜禽缺少蛋氨酸时，表现为发育不良、体重减轻、肝和肾机能受到破坏，并伴有肌肉萎缩和毛质变坏等现象。蛋氨酸不仅在饲料工业、医药工业、保健业及食品业中有广泛的用途、还可用于生化研究、照相技术、化妆品、香料等领域。L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N作为一种示踪剂在生理和生命科学研究中得到了有效的应用，国内和国际市场前景广阔，而且价格不菲。
L-蛋氨酸的生产方法主要有四种，即蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法。D-蛋氨酸的生产方法主要有拆分法和生物法。拆分法主要包括结晶拆分法、手性试剂拆分法、色谱拆分法、膜拆分法、酶拆分法等。生物法主要是指对用化学合成法获得的外消旋乙酰-蛋氨酸经D-型氨基酰化酶处理后生成D-蛋氨酸的方法。
目前，世界上蛋氨酸的主要生产国是法国、美国、日本和德国、年总生产能力约为38万吨，年总产量约为30万吨。我国自50年代开始研究化学法合成蛋氨酸，并获得成功，与国外相比存在的主要差距是：生产规模小、以间歇操作为主。控制水平低、成本高、收率低。
中国专利CN1504577A所述发明涉及了一种利用大肠杆菌基因工程菌中的氨基酰化酶合成L-蛋氨酸的方法；中国专利CN1196392 A所述发明涉及了一种氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法；中国专利CN1263153A所述发明涉及了一种米曲霉菌体固定化制备氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的装置；中国专利CN1306092A所述发明涉及了一种固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生产左旋氨基酸的方法，该法对混旋乙酰氨基酸进行脱乙酰生成L-氨基酸后，对D-乙酰氨基酸进行外消旋再混入下一步拆分；世界专利WO00/23598所述发明涉及了一种用D型氨基酰化酶拆分制得D型氨基酸的方法。化学试剂，1992，14(1)，36～39涉及了一种固定化酰化氨基酸水解酶的制备及其在L-氨基酸和D-氨基酸生产中的应用。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，使用该方法获得的L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N产品收率高、光学纯度高、化学纯度高、丰度不下降。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，该方法采用游离米曲霉菌体细胞或直接用氨基酰化酶拆分DL-蛋氨酸-15N，以外消旋乙酰-蛋氨酸-15N(N-AC-DL-Met-15N)为原料，以游离米曲霉菌体细胞中的氨基酰化酶(EC.3，5，14)或氨基酰化酶粉为水解催化剂，将外消旋乙酰-蛋氨酸-15N按照0.05-0.3mol/L的浓度，每克底物加入1～8g游离米曲霉菌体细胞或0.05～0.3g氨基酰化酶酶粉，于37℃，一定的摇床转速下，反应35～60小时；反应结束后将反应液浓缩至一定浓度后经1500H型强酸性阳离子交换树脂处理后，有效的分离了酶反应液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并去除杂酸，同时得到产品L-蛋氨酸-15N和初级产品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；接下来对N-乙酰-D-蛋氨酸-15N经盐酸水解后，采用1500H型强酸性离子交换树脂处理去除杂质和杂酸，可得到D-蛋氨酸-15N产品。
该方法的具体工艺路线如下：
该方法拆分DL-蛋氨酸-15N制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的步骤如下：
(1)游离米曲霉菌体细胞的制备：由于菌种长时间使用、传代次数频繁、杂菌污染等原因，经常会引起菌种退化，因此，在使用前要进行纯化，筛选出一株酶活较高、遗传性能稳定的菌株备用；取一支储存斜面，用接种环挑取5环斜面孢子，放入装有100ml无菌水的三角瓶中，充分摇荡，并进一步稀释至10-4～10-8倍，各吸取0.1～0.3ml于直径为9cm已装有察氏培养基的平皿中，放入30℃培养箱中培养2～4天；长出绿色孢子后，挑选单菌落转入察氏培养基斜面，于30℃培养箱中培养3～5天；长出绿色孢子后，向各管加入无菌水1～5ml，用玻璃棒轻轻搅拌，吸取0.2～1.0ml孢子悬液接入到装有20～60ml黄豆汁培养基的500ml三角瓶中，于30℃，150～220rpm振荡培养35～60h；下摇床，抽滤，蒸馏水洗净，收集直径在2.0～3.0mm的米曲霉菌体小球备用；
(2)酶反应底物的配制：取一定量的N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N，用稀NaOH溶解后定容至0.05-0.30mol/L的浓度，再用稀盐酸调至pH6～8，按照每克底物加入1～8g游离米曲霉菌体细胞或0.05～0.3g氨基酰化酶酶粉的比例加入游离的米曲霉菌体细胞或氨基酰化酶酶粉；
(3)37℃，一定的摇床转速下，保温反应35～60小时；
(4)反应结束后反应液浓缩至原体积的1/6～1/3，用2mol/L盐酸调pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，开始收集流出的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；
(5)反应液流净后用水洗3遍以减少损失，然后用蒸馏水洗至流出液无色，pH中性，无N-乙酰-D-蛋氨酸-15N流出时，结束收集N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；改用0.05～0.5mol/L的氯化铵洗脱，此时用自动收集器收集流出液，纸层析点样，确定含有L-蛋氨酸-15N的管数；
(6)合并上述氯化铵洗脱液体，在40～60℃下对其进行浓缩后，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化铵，待流出液无Cl-后，改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脱，收集单斑，在40～60℃下浓缩，赶氨，经活性炭脱色，最后在60～90℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到获得L-蛋氨酸-15N产品；
(7)合并(5)中水洗脱液体，在40～60℃下浓缩，获得初级产品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；将其在80～100℃下，以氮气保护，用2～6mol/L的盐酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N与盐酸的质量体积比在1∶5～1∶20之间，回流反应时间为1.5～10小时之间，直至水解完全；
(8)水解反应结束后在氮气保护下降至室温，用10mol/L的NaOH调pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化钠等杂质，待流出液无色无Cl-后改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脱，收集单斑后在40～60℃下浓缩，赶氨，经活性炭脱色，最后在60～90℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到D-蛋氨酸-15N产品。
本发明方法简练，设备易得，采用两步水解法，从N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N中获得了L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N两种产品。通过1500H型强酸性离子交换树脂处理，有效的分离了酶反应液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并实现了L-蛋氨酸-15N和杂酸的完全分离，使用该方法获得的L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N产品收率高、光学纯度高、化学纯度高、丰度不下降。采用氮气保护回流有效地解决了高温时蛋氨酸遇氧分解的问题。
本发明，以N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N为原料，同时获得化学纯和光学纯的L和D两种类型蛋氨酸-15N产品。外消旋N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N经L-型氨基酰化酶处理，脱乙酰基可生成L-蛋氨酸-15N，未反应的N-乙酰-蛋氨酸-15N经水解可得蛋氨酸-15N。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
取储存斜面一支，用接种环挑取5环斜面孢子，放入装有100ml无菌水的三角瓶中，充分摇荡，并进一步稀释至10-4～10-8倍。各吸取0.2ml于直径为9cm的装有察氏培养基的平皿中，放入30℃培养箱中培养3天。长出绿色孢子后，挑选单菌落转入察氏培养基斜面，于30℃培养箱中培养4天，长出绿色孢子后，向各管加入无菌水3ml，用玻璃棒轻轻搅拌，吸取0.5ml孢子悬液接入到装有50ml黄豆汁培养基的500ml三角瓶中，于30℃，200rpm振荡培养50h。下摇床后抽滤，用蒸馏水洗净，收集直径在2.0～3.0mm的米曲霉菌体小球备用。
实施例2
称取5g乙酰-DL-蛋氨酸固体，先用稀的NaoH溶解，然后定容至500ml，再用稀盐酸调至pH7.0左右，称取25g湿的游离米曲霉菌体细胞或0.5g氨基酰化酶酶粉混入配制的底物中，将装有底物和酶的三角烧瓶放入水域摇床中37℃下，120转/min保温反应48小时后停止反应，此时水解率接近100％。反应液于45℃下用旋转蒸发器蒸至原体积的1/5，用2mol/L盐酸调pH至2左右，以0.04ml/min.g载体的流速匀速流过装有300ml的1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱。开始收集流出的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N，上柱液流净后用蒸馏水洗涤3遍，然后用蒸馏水洗柱子，至流出液无色，pH中性，无N-乙酰-D-蛋氨酸-15N流出时，结束收集N-乙酰-D-蛋氨酸-15N。改用0.1～0.2mol/L的氯化铵梯度洗脱，用自动收集器收集流出液，纸层析点样以确定含有L-蛋氨酸-15N的管数。合并上述氯化铵洗脱液体，在45℃下对其进行浓缩后，再次以0.04ml/min.g载体的流速匀速流过装有300ml的1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化铵，待流出液无Cl-后改用0.1mol/L的氨水洗脱，收集单斑，在45℃下浓缩、赶氨，经活性炭脱色，最后在80℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到L-蛋氨酸-15N产品1.69g，丰度为98.36at.％，纯度为99.5％，收率为86.7％，旋光度[α]D 21＝+21.7±1°(c＝1，HCl)。
实施例3
合并实施例2中第一次上柱的水洗脱液体，在45℃下对其进行浓缩，获得N-乙酰-D-蛋氨酸-15N浓缩液，将其在90℃下，以氮气保护，用4mol/L的盐酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N与盐酸的质量体积比在1∶10，回流反应时间为5小时。水解反应结束后在氮气保护下待温度降至室温后，用10mol/L的NaoH调pH至2左右，以0.04ml/min.g载体的流速匀速流过装有300ml的1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化钠等杂质，待流出液无色无Cl-后改用0.2mol/L的氨水洗脱，收集单斑后在45℃下浓缩、赶氨，经活性炭脱色，最后在80℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到D-蛋氨酸-15N产品1.54g，丰度为98.35at.％，纯度为99.5％，收率为78.97％，旋光度[α]D 21＝-21.7±1°(c＝1，HCl)。
Claims (2)
1.酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，该方法采用游离米曲霉菌体细胞或直接用氨基酰化酶拆分DL-蛋氨酸-15N，以外消旋乙酰-蛋氨酸-15N为原料，以游离米曲霉菌体细胞中的氨基酰化酶或氨基酰化酶粉为水解催化剂，将外消旋乙酰-蛋氨酸-15N按照0.05-0.3mol/L的浓度，每克底物加入1～8g游离米曲霉菌体细胞或0.05～0.3g氨基酰化酶酶粉，于37℃，一定的摇床转速下，反应35～60小时；反应结束后将反应液浓缩至一定浓度后经1500H型强酸性阳离子交换树脂处理后，有效的分离了酶反应液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并去除杂酸，同时得到产品L-蛋氨酸-15N和初级产品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；接下来对N-乙酰-D-蛋氨酸-15N经盐酸水解后，采用1500H型强酸性离子交换树脂处理去除杂质和杂酸，可得到D-蛋氨酸-15N产品；
其中，制备L-蛋氨酸-15N的步骤为：
拆分反应结束后，反应液浓缩至原体积的1/6～1/3，用2mol/L盐酸调pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，开始收集流出的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；
反应液流净后用水洗3遍以减少损失，然后用蒸馏水洗至流出液无色，pH中性，无N-乙酰-D-蛋氨酸-15N流出时，结束收集N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；改用0.05～0.5mol/L的氯化铵洗脱，此时用自动收集器收集流出液，纸层析点样，确定含有L-蛋氨酸-15N的管数；
合并上述氯化铵洗脱液体，在40～60℃下对其进行浓缩后，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化铵，待流出液无Cl-后，改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脱，收集单斑，在40～60℃下浓缩，赶氨，经活性炭脱色，最后在60～90℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到获得L-蛋氨酸-15N产品。
2.根据权利要求1所述的酶法拆分制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，该方法拆分DL-蛋氨酸-15N制备L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的步骤如下：
(1)游离米曲霉菌体细胞的制备：由于菌种长时间使用、传代次数频繁、杂菌污染等原因，经常会引起菌种退化，因此，在使用前要进行纯化，筛选出一株酶活较高、遗传性能稳定的菌株备用；取一支储存斜面，用接种环挑取5环斜面孢子，放入装有100ml无菌水的三角瓶中，充分摇荡，并进一步稀释至10-4～10-8倍，各吸取0.1～0.3ml于直径为9cm已装有察氏培养基的平皿中，放入30℃培养箱中培养2～4天；长出绿色孢子后，挑选单菌落转入察氏培养基斜面，于30℃培养箱中培养3～5天；长出绿色孢子后，向各管加入无菌水1～5ml，用玻璃棒轻轻搅拌，吸取0.2～1.0ml孢子悬液接入到装有20～60ml黄豆汁培养基的500ml三角瓶中，于30℃，150～220rpm振荡培养35～60h；下摇床，抽滤，蒸馏水洗净，收集直径在2.0～3.0mm的米曲霉菌体小球备用；
(2)酶反应底物的配制：取一定量的N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N，用稀NaOH溶解后定容至0.05-0.30mol/L的浓度，再用稀盐酸调至pH6～8，按照每克底物加入1～8g游离米曲霉菌体细胞或0.05～0.3g氨基酰化酶酶粉的比例加入游离的米曲霉菌体细胞或氨基酰化酶酶粉；
(3)37℃，一定的摇床转速下，保温反应35～60小时；
(4)反应结束后反应液浓缩至原体积的1/6～1/3，用2mol/L盐酸调pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，开始收集流出的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；
(5)反应液流净后用水洗3遍以减少损失，然后用蒸馏水洗至流出液无色，pH中性，无N-乙酰-D-蛋氨酸-15N流出时，结束收集N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；改用0.05～0.5mol/L的氯化铵洗脱，此时用自动收集器收集流出液，纸层析点样，确定含有L-蛋氨酸-15N的管数；
(6)合并上述氯化铵洗脱液体，在40～60℃下对其进行浓缩后，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化铵，待流出液无Cl-后，改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脱，收集单斑，在40～60℃下浓缩，赶氨，经活性炭脱色，最后在60～90℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到获得L-蛋氨酸-15N产品；
(7)合并(5)中水洗脱液体，在40～60℃下浓缩，获得初级产品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；将其在80～100℃下，以氮气保护，用2～6mol/L的盐酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N与盐酸的质量体积比在1∶5～1∶20之间，回流反应时间为1.5～10小时之间，直至水解完全；
(8)水解反应结束后在氮气保护下降至室温，用10mol/L的NaOH调pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g载体的流速匀速流过装有1500H型强酸性阳离子交换树脂的离子交换柱，水洗以除去氯化钠等杂质，待流出液无色无Cl-后改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脱，收集单斑后在40～60℃下浓缩，赶氨，经活性炭脱色，最后在60～90℃下用乙醇结晶，-18℃结晶过夜，抽滤晶体，并用-18℃的无水乙醇反复洗涤，经真空干燥得到D-蛋氨酸-15N产品。
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