CN1072262C - 利用微生物生产酰胺化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产酰胺化合物的方法，该方法包括：在细菌细胞培养液(内含完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶)存在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而得到的固定化制剂存在下，通过水合腈化合物，把该腈化合物转化为其相应的酰胺化合物，细菌细胞是具有把腈化合物转化为其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性微生物的生物纯培养物的细胞，例如史密斯芽胞杆菌SC-J05-1(FERM BP-4935)。

Description

利用微生物生产酰胺化合物的方法
本发明涉及利用微生物生产酰胺化合物的方法，该微生物具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。
近年来，生物催化剂(如微生物)已广泛应用于化学反应中。例如人们所熟悉的，可利用芽孢杆菌属、芽孢不动菌属、微球菌属或短杆菌属(USP4,001,081)、棒状杆菌属或奴卡氏菌属(USP4,248,968)、假单胞菌属(USP4,555,487)、红球菌属或微杆菌属(EP-188,316)或镰刀菌属(JP-A-64-86889/1989)的某个菌株，通过水合作用把腈化合物转变成酰胺化合物。
不过，所有这些微生物均属嗜常温性细菌，它们在55℃或更高温度下不能生长。
此外，在高于室温的温度范围内，嗜常温性细菌把腈化合物转为成其相应的酰胺化合物的水合作用活性也是不稳定的。由于这个原因，利用这种嗜常温性细菌生产酰胺化合物通常是在较低温度下进行的。在这种情况下，需要有冷却设备使反应器维持在较低温度，而且因冷却消耗了大量能量，这些都导致生产成本的极大上升。
在这些情况下，本发明人极力寻找某些微生物，它们具有可在高于室温的温度条件下把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。结果发明人发现，从(日本)冈山县某个温泉土壤中分离出的嗜热性微生物符合这样的要求，从而完成了本发明。
因此，本发明提供了一种生产酰胺化合物的方法，其包括：在细菌细胞培养液(内含完整的细菌细胞、破裂的细菌细胞或酶)存在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而形成的固定化制剂存在下，通过水合腈化合物把该腈化合物转变成其相应的酰胺化合物，其中的细菌细胞是具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性微生物的生物纯培养物的细胞。
本发明还提供了一种新型嗜热性微生物的生物纯培养物，该微生物具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性，将其命名为史密斯芽孢杆菌(B.smithii)SC-J05-1(FERMBP-4935)。
依照本发明的方法，可把许多腈化合物转变成其相应的酰胺化合物。腈化合物的实例有脂族腈，如正丁腈、正戊腈、异丁腈、乙腈和新戊腈；含卤素的腈，如2-氯丙腈；不饱和脂族腈，如丙烯腈、丁烯腈和甲基丙烯腈；羟基腈化合物，如乳腈和扁桃腈；氨基腈化合物，如2-苯基甘氨酸腈；芳族腈化合物；如苯并腈和氰基吡啶；二腈化合物，如丙二腈、丁二腈和己二腈。优选的是正丁腈、正戊腈、异丁腈、乙腈、新戊腈、2-氯丙腈、丙烯腈、丁烯腈、甲基丙烯腈、苯并腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、丙二腈、丁二腈和己二腈。
在细菌细胞培养液(内含完整的细菌细胞、破裂的细菌细胞或酶)存在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而形成的固定化制剂存在下，通过水合腈化合物实现了腈化合物向酰胺化合物的转变。细菌细胞是嗜热性微生物的生物纯培养物的细胞，该微生物具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。
本发明中所使用的微生物并没有特殊限制，只要其是具有将腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性细菌即可。这里所用的术语“嗜热性微生物”是指具有在55℃或更高培养温度下生长能力的微生物。
例如，所需的微生物可通过下列程序得到。首先，采集自然界中的土壤，把适量的采集土壤或将土壤完全悬浮于水中所得到的上清液加入到熟知的微生物生长培养基(例如含有甘油、多胨、酵母膏和麦芽汁主要成分的液体培养基或琼脂培养基)中，然后在55℃或更高的温度下培养24小时到3个月不等。把用这种方法得到的培养液或所分离的部分细菌细胞铺覆在含有同上成分的琼脂平板培养基上，随后进一步培养形成一些菌落，由此可分离出嗜热性微生物。
由自然界中得到的或在各种微生物保藏机构保藏的嗜热性微生物通过在含有上述培养基成分和腈化合物或酰胺化合物(如异戊腈、丁烯腈或丁烯酰胺)的液体培养基的试管或烧瓶中，在55℃或更高的温度下培养适当的时间，例如12小时到7天不等而得以生长。把培养液加入到腈化合物(如丙腈或丙烯腈)的水溶液中，在例如30℃的温度下进行反应，时间约为10-60分钟。然后，检查反应混合物以确定酰胺化合物是否生成，这样可能容易地找到具有把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性微生物。为了检测酰胺化合物，例如可使用如下所述的气相色谱分析方法。
作为一个典型的实例，史密斯芽孢杆菌SC-J05-1可应用于本发明的方法中。这个菌株是芽孢杆菌属的嗜热性微生物，本发明人发现它具有水合腈化合物的腈基团的较高活性，该菌株于1993年12月24日被寄存在日本工业科学技术会社的国立生物科学与人类技术研究所中，登记号为FERM P-14037，后于1994年12月14日转存于布达佩斯条约国际收藏中心，登记号为FERM BP-4935。该菌株已按中国专利法实施细则第25条的规定于1995年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC M94073。
史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的细菌学特性如下：
(a)形态学
1．细胞形态与大小
形状：杆状
大小：0.5-0.8μm×0.8-2μm2．多形性：无3．游动性：灵活、周毛性鞭毛4．孢子形成：已发现有5．革兰氏染色：多变6．抗酸性：无(b)生长特性：1．营养琼脂平板培养：圆、凸、无光泽、淡褐色2．营养琼脂斜面培养：无光泽、淡褐色3．营养液体培养：均匀性混浊生长4．营养液体明胶穿刺培养：未液化5．石蕊牛乳：无变化(c)生理学特性：1．硝酸盐还原：-2．反硝化作用：-3．甲基红试验：+4．VP试验：-5．吲哚形成：-6．硫化氢形成：+7．淀粉水解作用：-8．柠檬酸利用科泽氏培养基：±9．无机氮源利用NaNO3：-(NH4)2SO4：+10．色素形成：金氏培养基A：-金氏培养基B：-11．脲酶：-12．氧化酶：+13．触酶：-至±14．生长条件pH值：4.1-7.5温度：30-60℃15．对氧气的反应：略为好氧16．氧化-发酵试验：发酵17．糖中的酸及气体形成
           酸   气体L-阿拉伯糖：    -    -D-木糖：        +    -D-葡萄糖：      +    -D-甘露糖：      +    -D-果糖：        +    -
D-半乳糖：   +    -
麦芽糖：     +    -
蔗糖：       +    -
乳糖：       -    -
海藻糖：     +    -
D-山梨糖醇： -    -
D-甘露糖醇： +    -
肌醇：       +    -
甘油：       +    -
淀粉：       -    -
(d)其它特性：
1．DNA的Mol％G+C:40.6％
人们对表现出上述特性的微生物文献进行了广泛的检索，L.Ｋ.Nakamura等人在国际系统细菌学杂志(38期，63-73页，1988年)上报导了史密斯芽孢杆菌表现出同上所述的特性。根据这些结果，由本发明人所发现的菌株SC-J05-1被鉴定为史密斯芽孢杆菌的一个菌株。
有关史密斯芽孢杆菌微生物具有把腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性这方面的信息尚不得而知。在这方面，可以认为史密斯芽孢杆菌SC-J05-1(FERM BP-4935)是一个新菌株。另外，从史密斯芽孢杆菌SC-J05-1(FERM BP-4935)得到的菌株变种(即突变体、细胞融合菌株或重组菌株)也可用于本发明的方法中。
本发明方法中所用的微生物培养物可以在多种含碳和氮源、有机和(或)无机盐等的培养基中加以制备。这些培养基都已广泛应用于制备普通细菌的培养物。
碳源的实例有葡萄糖、甘油、糊精、蔗糖、有机酸、动、植物油和糖浆。
氮源的实例为有机和无机氮源，如肉汤、胨、酵母膏、麦芽汁、大豆粉、玉米浆、棉籽粉、干酵母、酪蛋白氨基酸、硝酸钠和尿素。
有机和无机盐的实例有诸如钾、钠、镁、铁、锰、钴及锌等元素的氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。其具体实例有氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、碳酸钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
在本发明的方法中，最好在培养基中加入腈化合物(如异戊腈和丁烯腈)和酰胺化合物(如丁烯酰胺)，旨在提高所用微生物的腈水合作用活性。例如，这些化合物用量可在每100ml培养基中约为10mg-1g。
本发明方法中所用微生物的培养物可依据用于制备普通细菌培养物的常规方法进行制备，如使用试管、往复或旋转振荡器的固体或液体振荡培养，以及使用发酵罐的其它培养。
微生物的培养物通常是在有氧条件下进行培育的。特别是使用发酵罐时，有必要导入无菌气体，导入速度通常为每分钟大约0.1-2倍的培养体积。
培养温度可在所用微生物能在培养中存活的温度范围内变化。例如，培养温度约为30℃-100℃。要对pH值加以控制，例如控制在大约2-11。
特别是在培养史密斯芽孢杆菌时，培养温度应在约30℃-100℃范围内，最好为约40℃-55℃，培养基的pH值范围约为5-7。
培养时间可依据不同培养条件而定，通常约为1-7天。
例如，本发明的方法可按下述进行。
把细菌细胞、完整细菌细胞或经处理按上述方法制备的细菌细胞而得到的材料在水或水溶液(如磷酸盐缓冲液)中悬浮，然后把该悬浮液加入到腈化合物中进行反应。
这里所用的术语“经处理细菌细胞而得到的材料”是指所含的破裂的细菌细胞或酶，是由诸如超声波分解、用法国压榨机进行的均化作用或破裂作用等常规技术而得到的；或者是指依据固定化方法(如载体载带方法，其中这些材料通过共价键、离子键、吸附等载于适当的载体上)或者包含方法(其中这些材料被包含在聚合体的网状结构中)，通过固定其中所合的完整或破裂细菌细胞或酶使其在不能溶解之后处于易除去状态而得到的固定化制剂。
细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料的通常使用浓度约为0.01-20％(重量)，最好约为0.01-10％(重量)。就酶或固定化制剂而言，其浓度可依其纯度或所用的固定化方法而变化；例如，优选的是使制得的酶和固定化制剂具有与细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料水合腈基团之活性相似的活性。在加入腈化合物之前，细菌细胞的培养液可在不进行任何进一步处理的条件下加以使用。优选的是稀释或浓缩细菌细胞培养液使其具有与细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料水合腈基团之活性相似的活性。
反应条件通常为温度约为0-70℃，最好约为0-50℃，pH值约为5-10，最好约为6-9，时间约为10分钟到72小时。当把pH值控制在上述范围内时，细菌细胞能储集所生成的酰胺化合物，得到高浓度的反应混合物。
这样生成的酰胺化合物可利用任何本领域内已知的常规方法从反应混合物中加以回收。例如，可通过离心从反应混合物中分离出细菌细胞或经处理细菌细胞而得到的材料，继而利用活性炭或离子交换树脂进行处理以除去杂质。纯化的混合物经在减压条件下蒸馏或蒸发加以浓缩，把析出的晶体在有机溶剂(如甲醇)中进行重结晶，得到所需要的酰胺化合物。
以下实施例将进一步说明本发明，但不应被看作是限制本发明的范围。
实施例1：细菌细胞的分离
在(日本)冈山县某处温泉采集土壤，把所采土样加入到含有1.0％的甘油、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏和0.3％的麦芽汁(以上均为重量比)的培养基(pH值7.2)中，随后在约55℃条件下往复振荡培养21天。将部分培养液铺覆在其组分同上所述的琼脂培养基上，再次进行培养以形成一些菌落。
从这些菌落中分离出细菌细胞，把一菌环分离出的细菌细胞接种到一液体培养基中，该培养基除合同上组分外，还含0.1％(重量)的异戊腈，然后在55℃条件下培养24小时，得到的培养物作为样品。然后，把1ml培养液加入到9ml2.78％(重量)的丙烯腈溶液(0.05M磷酸盐缓冲液，pH值为7.7)中。在10℃下开始反应。10分钟后，加入1ml 2N HCl停止反应。取反应混合物的等分试样，用气相色谱法进行分析检查所产生的丙烯酰胺，以便筛选某些具有水合腈基团活性的细菌菌株。这样，就得到了史密斯芽孢杆菌SC-J05-1，它作为一种嗜热性微生物，具有把腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性。
气相色谱条件：
柱：填充柱
载体：Porapak型Q(网眼80-100)
长度：1.1m
柱温度：210℃
载体气体的流速：50ml/分钟
样品注入体积：2μl
实施例2：用于检查嗜热特性的细菌细胞的培养
把从实施例1中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的细菌细胞和在JP-B62-21519/1987)中描述的嗜温性细菌(芽孢杆菌种细菌，贮藏于法国Ecole Nationale Superieure desAgriculture的遗传学实验室收藏中心，贮藏号为R332；也贮藏于日本工业科学技术会社的国立生物科学及人类技术研究所，登记号为FERM P-2717；下文中被称做芽孢杆菌种细菌R332)的细菌细胞分别铺覆在一营养琼脂平板培养基上，在不同温度条件下加以培养以检查其生长能力。结果见表1。
                      表1
每种菌株的培养温度(℃) 史密斯芽孢杆菌SC-J05-1(本发明) 芽孢杆菌种细菌R332(对照)
    203040556070     -+++++++-     +++++---
标准：(-)不生长
      (+)生长
      (++)大量生长
从表1中可以看出，本发明的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1是不同于作为对照的芽孢杆菌种细菌R332的一种嗜热性微生物。
实施例3：细菌细胞的培养
在容积500ml的坂口烧瓶中加入100ml灭菌培养基，培养基pH值为7.2，含有1.0％的蔗糖、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏、0.3％的麦芽汁、0.001％的硫酸亚铁、0.001％的硫酸锰、0.001％的氯化钴和0.001％的硫酸锌(以上均为重量比)。把0.1ml已在同上培养基中培养过的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1培养液接种到该烧瓶中。然后把这个烧瓶在55℃条件下往复振荡培养1天，振荡速度为135次/分钟，这样就得到了史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞的培养液。
参考实施例1：细菌细胞的培养
在容积500ml的坂口烧瓶中加入100ml灭菌培养基，培养基pH值为7.2，含有1.0％的甘油、0.5％的多胨、0.3％的酵母膏、0.3％的麦芽汁、0.001％的硫酸亚铁、0.001％的硫酸锰、0.001％的氯化钴和0.001％的硫酸锌(以上均为重量比)。把0.1ml已在同上培养基中培养过的芽孢杆菌种细菌R332培养液接种到这个烧瓶中。然后把该烧瓶在30℃条件下往复振荡培养2天，振荡速度为135次/分钟，这样就得到了芽孢杆菌种细菌R332细菌细胞的培养液。
对比实施例1：耐热性
从400ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮在100ml的上述缓中液中。检查这样制备出的细菌细胞悬浮液把腈化合物转变为其相应的酰胺化合物的水合作用活性。另外，为了检查其耐热性，把同样的细菌细胞悬浮液在恒温条件下保持一段恒定时间。
用下述程序来测试其把腈化合物转变为相应的酰胺化合物的水合作用活性。在9ml2.78％丙烯腈溶液(0.05M磷酸盐缓冲液，pH值为7.7)中加入1ml测试溶液，在10℃下开始反应。10分钟后，加入1ml2N HCl停止反应。
取反应混合物的等分试样，在与实施例1所述的相同条件下进行气相色谱分析以确定所生成的丙烯酰胺量。
关于下文中所用的酶活性单位，把每分钟将1μmol丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性定义为一个单位(U)。
然后，从400ml参考实施例1中得到的芽孢杆菌种细菌R332细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，将这些细菌细胞悬浮在10ml的同上缓冲液中。用上述方法检查这样制备的细菌细胞悬浮液把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。另外，为了确定其耐热性，把同样的细菌细胞悬浮液在恒温下保持一段恒定时间，然后检验其活性。活性的检测方法同上所述。根据检测结果，计算每一菌株处理前后的相对活性(下文中被称做剩余活性)，将芽孢杆菌种细菌R332的剩余活性定为100，据此换算出史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的剩余活性。
                            表2
 处理温度(℃)  处理时间(℃) 史密斯芽孢杆菌SC-J05-1 芽孢杆菌种细菌R332
    504030     0.51.547     6542280212(本发明)     100100100(对照)
对比实施例2：反应稳定性
从实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)中洗后，把这些细菌细胞悬浮在同上的缓中液中，得到20U/ml的细菌细胞悬浮液。
另外，从芽孢杆菌种细菌R332细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮在100ml的上述缓中液中，得到20U/ml的细菌细胞悬浮液。
然后，将每种细菌细胞悬浮液1ml和2.78％(重量)丙烯腈溶液(0.05M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.7)9ml相混合，分别在30℃、40℃、50℃或60℃条件下进行反应。10分钟后加入1ml2NHCl停止反应。取反应混合物的等分试样，在如实施例1所述的相同条件下进行气相色谱分析以确定所生成的丙烯酰胺量。根据从芽孢杆菌种细菌R332得出的数值(定为100)分别换算出在不同温度下所生成的丙烯酰胺的量。换算的数值如表3所示。
                   表3
反应温度(℃) 史密斯芽孢杆菌SC-J05-1 芽孢杆菌种细菌R332
    30405060     27565752006200(本发明)     100100100100(对照)
实施例4：利用细菌细胞培养液的反应
在100ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞培养液中加入2.5g(47.2mmol)的丙烯腈，反应在20℃下进行并用磁力搅拌器加以搅拌。3小时后，取1.0ml的反应混合物，在其中加入0.1ml的2N HCl停止反应。在如实施例1所述的同样条件下对反应混合物的等分试样进行气相色谱分析。结果所有部分的丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没有发现诸如丙烯酸等副产物的形成。
实施例5：利用细菌细胞的反应
从150ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。在用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)冲洗后，把这些细菌细胞悬浮在50ml的相同缓冲液中。在该悬浮液中分三部分加入3.0g(56.6mmol)的丙烯腈反应在20℃下进行并用磁力搅拌器加以搅拌。4小时后，取1.0ml的反应混合液，在其中加入0.1ml的2N HCl停止反应。对该反应混合物的等分试样在如实施例1中所述的相同条件下进行气相色谱分析。结果所有三部分丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没有发现诸如丙烯酸等副产物的形成。
另外，以10,000×g离心10分钟把细菌细胞从剩余的反应混合物中除去，并在低于50℃的条件下蒸馏浓缩上清液使晶体析出，然后在甲醇中进行重结晶，得到3.7g(52.1mmol,92％产率)的无色片状晶体。由熔点测定、元素分析、红外光谱和核磁共振光谱证实了这些晶体是丙烯酰胺。
实施例6：使用酶溶液的反应
从8ml实施例3中得到的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1细菌细胞培养液中，以10,000×g离心10分钟收集细菌细胞。中洗后，把细菌细胞悬浮于300ml0.05M的HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)，用法国压榨机以20,000磅/平方英寸破碎两次。将破裂细胞以10,000×g离心30分钟以除去残留的细菌细胞。使用透析管(Wako纯化学品有限公司生产)，在4℃、4次更换10mM HEPES-KOH缓中液(pH值7.2)条件下，透析上清液24小时。使透析液滤过作为阴离子交换树脂的DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)柱(50mmφ×200mm)(事先用0.05M的HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)加以平衡)，从而使酶吸附到柱上。
然后，把0.05M的HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)过柱进行中洗，用0.05M的HEPES-KOH缓中液(pH值7.2，含0-1.0M的氯化钾)进行梯度洗脱。对表现出把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物之水合作用活性的级分加以回收，在4℃、4次更换10mM HEPES-KOH缓冲液(pH值7.2)条件下，用透析管(Wako纯化学品有限公司生产)透析24小时。用阴离子交换色谱法对透析液进行纯化，操作条件同上，只是用0.05mM的HEPES-KOH缓冲液(H值7.2，含0.2-0.8M的氯化钾)进行梯度洗脱。用如上所述的方法对洗脱液进行透析，得到一种粗酶溶液。
可据下述方法确定其把腈化合物转变成其相应的酰胺化合物的活性：
首先，把1ml粗酶溶液加入到9ml100mM的丙腈水溶液(pH值7.7)中，在10℃下开始反应。10分钟后，加入1ml2N HCl停止反应。取反应混合液的等分试样，用气相色谱法加以分析以确定所生成的丙酰胺量。
关于下文中所用的酶活性单位，把每分钟将1mmol丙腈转变为丙酰胺的活性定义为一个单位(U)。
把这样得到的粗酶溶液用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)加以稀释。在100ml的这种稀释液中加入2.5g(47.2mmol)的丙烯腈，反应在20℃下进行并用磁力搅拌器加以搅拌。3小时后，取1.0ml反应混合物，加入0.1ml2N HCl停止反应。对该反应混合物的等分试样进行气相色谱分析，操作条件同实施例1所述。结果，所加入的所有部分的丙烯腈都完全转变成了丙烯酰胺，并且没有发现诸如丙烯酸等副产物的形成。
实施例7：多种腈化合物的转化
在这个实施例中，检查了史密斯芽孢杆菌SC-J05-1中所含的腈水合酶把多种腈化合物转化成其相应的酰胺化合物的能力。在60个单位的实施例5中得到的粗酶溶液中，加入20ml0.05M的磷酸盐缓冲液(pH值7.7)和1mmol表4中所示的每一种被测试的腈化合物(作为底物)，在30℃下反应3小时。结果发现由史密斯芽孢杆菌SC-J05-1制备的粗酶溶液具有把所有被测试的腈化合物转化成其相应的酰胺化合物的水合作用活性。用气相色谱法或液相色谱法对反应混合物进行分析以确定所生成的酰胺化合物的量或所消耗的腈化合物的量。
          表4
    被测试的腈化合物
正丁腈正戊腈异丁腈2-氯丙腈丙烯腈丁烯腈3-氰基吡啶4-氰基吡啶     丙二腈丁二腈己二腈乙腈新戊腈甲基丙烯腈苯并腈2-氰基吡啶
根据本发明，即使在高于室温的条件下也能把多种腈化合物稳定地转化为其相应的酰胺化合物，与通常在低温下进行的常规方法相比，本发明的方法使得在一个较宽温度范围内高效生产高纯度酰胺化合物成为可能。

Claims (2)

1．一种生产酰胺化合物的方法，该方法包括在内含完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶的细菌细胞培养液存在下或在经固定内含的完整细菌细胞、破裂细菌细胞或酶而得到的固定化制剂存在下，通过水合腈化合物，把所说的腈化合物转化为其相应的酰胺化合物，所说的细菌细胞是具有把腈化合物转化为其相应的酰胺化合物的水合作用活性的嗜热性微生物保藏编号为CCTCCM94073的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1的生物纯培养物的细胞。
2．具有把腈化合物转化成其相应的酰胺化合物的水合作用活性的保藏号为CCTCC M94073的史密斯芽孢杆菌SC-J05-1或其变种的生物纯培养物。
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