L 422882 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（3 ) [發明領域] 本發明係有關一種製造醯胺類化合物的方法，其乃利 用一種具有使腈類化合物轉換成其對應之醯胺化合物之水 合活性之微生物。 [發明背景] 近年來生物性催化劑如，徹生物已被廣泛的使用於化 學反應中。例如，已知腈類化合物可藉由使用下列各屬之 某些菌株進行水合反瞧而轉換成醯胺化合物：桿菌屬、芽 孢不動菌屬（Bacteri-dium)、徹球菌屬（Micrococcus)或短 擇 S 屬（B r e v i b_a.c ter i u m ) (USP 4,001,081);棒桿 _屬（ Comebacterium)或諾卡氏菌（Η o c a r d i a ) ( U S P 4,2 48, 9 6 8 );假單胞 ® (Pseudomonus) (USP 4,555,487);紅球菌 屬（RhQdQC.oeeus)或撤桿 _ 屬（Microbacterium) ( E P - 1 8 8 , 3 1 6 );或梭徽 ® 屬（F u a s r i u nt) ( J P - A 6 4 - 8 6 8 8 9 / 1 9 8 9 )。 然而，這些徹生物全都歸類於不能生長於或更高 之溫度之噻中溫菌。 此外，嗜中溫_將腈類化合物轉化成其對應之Μ胺化 合物之水合活性在高於室溫之溫度中不穩度。基於此種原 因，使用此等_中溫菌製造醯胺化合物的反應通常偽在較 低的溫度下進行。在此情形下，需要冷却設備以保持反應 器於較低之溫度中，而且冷却時消耗大量的能量，而導致 生産費用明顯增加。 [發明之概述] 在這些情況下，本發明人業已針對即使是高於室溫之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -u— I L— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 422882 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明（ 4 ) 1 I 溫 度 下 亦 具 有 將 腈 類 化 合 物 轉 化 成 其 對 應 之 醯 胺 化 合 物 之 1 I 水 合 能 力 的 徹 生 物 進 行 廣 泛 的 研 究 9 結 果 7 由 闹 山 縣 ( 1 1 Ok ay am a - k e η ) 的 某 溫 泉 的 土 m 中 分 離 出 -- 種 付 合 該 等 需 ) 請 1 I 求 之 耐 熱 徹 生 物 > 而 兀 成 本 發 明 〇 先 閱 1 .1' 讀 1 | 因 此 * 本 發 明 係 提 供 一 種 製 造 m 胺 化 合 物 之 方 法 t 具 背 Λ 1 I 之 1 包 括 藉 水 合 腈 化 合 物 使 該 腈 化 合 物 轉 化 成 其 對 應 之 醯 化 合 注 意 1 1 物 * 此 反 應 偽 在 細 菌 細 胞 之 培 養 肉 汁 兀 整 之 細 m 細 胞 破 事 項 再 ▲ 碎 之 細 菌 細 胞 或 含 於 其 中 之 酵 素 » 或 可 由 使 J=ir* 兀 整 之 細 菌 細 寫 本 裝 I 胞 破 碎 的 細 細 胞 或 含 於 其 中 之 酵 素 固 定 化 獲 得 的 固 定 頁 V_^ 1 1 製 劑 存 在 下 進 行 0 該 細 m 細 胞 % 具 有 可 使 腈 化 合 物 轉 化 成 1 1 其 對 應 之 醯 胺 化 合 物 之 水 Λ Ώ 活 性 的 耐 熱 撤 生 物 之 生 物 純 培 1 1 養 細 胞 0 訂 | 本 發 明 亦 提 供 - 種 具 有 使 腈 類 化 合 物 轉 換 成 其 對 應 之 1 I 醯 胺 化 合 物 之 水 合 活 性 的 新 穎 耐 熱 徹 生 物 的 生 物 性 純 培 爱 1 1 I 物 t 其 名 為 史 密 氏 捍 菌 SC -J05 -1 (FER Η ΒΡ -4935) 0 Λ [發明之詳逑] 1 根 據 本 發 \lx. 明 之 方 法 > 可 將 各 種 腈 類 化 合 物 Μ 符 化 成 為 其 1 1 對 之 醯 胺 化 合 物 0 腈 類 化 合 物 之 實 例 為 脂 族 腈 » 如 正 严 1 | 丁 睛 正 -戊腈、 異丁腈、 乙腈及三甲基乙睛； 含鹵素之 J I 腈 類 化 合 物 如 2 - 氯 丙 腈 J 不 飽 和 之 脂 族 腈 頚 化 合 物 > 如 丙 1 I 烯 腈 巴 豆 腈 以 及 甲 基 丙 烯 m » 羥 基 睛 類 化 合 物 * 如 乳 腈 1 及 苯 乙 醇 腈 t 胺 基 臆 類 化 合 物 9 如 2 - 苯 基 甘 胺 醯 腈 芳 族 1 1 睛 類 化 合 物 % 如 苯 甲 睛 及 氟 基 吡 啶 以 及 二 腈 化 合 物 1 如 t 1 丙 二 腈 Λ 丁 二 腈 及 己 二 腈 0 較 佳 為 正 -丁腈、 正層 戊 腈 異 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X29?公釐） 4 A228B2 A7 B7五、發明説明（5 ) 丁腈、乙腈、三甲基乙腈、2-氛丙腈、丙烯睛、巴豆腈、 甲基丙烯腈、苯甲睛、2 -氣基吡啶、3 -氣基吡啶、4 -氡基 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胞其或 合其培 具的 集於 基物或 養的落 熱 細於胞 化成純 於物在 收 浮養出 P 培分菌ffi 菌含細 睛化性 屬合使 。-懸培抽55之成些 之 細或菌 該轉物 是化即 物 先全長 芽於得 同某 得 在胞細 使物生 要胺指生首完生麥著 獲相成 獲 傺細的下合之 只醯傺微 。壤 物及接法述形 關 應菌碎 在化物 ，之?''的得 土生物 ，此上使 機 物 反細破 存腈生 制應 Μ 力獲此 微出基 由有育 存 的之 、劑 使微 限對 i 活序使的抽養使含培 寄 。 物碎胞製可熱 殊其 _ 長程或知母培月於的 物 猜合破細定有耐 特成彳生列壤 已酵脂個佈步 生 二化 、菌固具的 無化”有 下土至 、瓊 3 塗一 微 己胺 胞細 的係性 並 轉之具 由之加 陳或至 胞進 種 及 醯細之 得胞活 物 物用仍 可得 添白基 時細藉 。各 以 成菌整 獲細合 生合使下物收量蛋養小菌著物於 腈化 細完化菌水 撤化此度生此適多培24細接生存 二 轉之使定細之 之 類在溫 微捋以 、體約之 ，微寄 丁 物整由 固該物 明腈 。養 需並 液油液 育出 上熱或 、 合完坷 素 。合 發使 可培所 ，清甘 之培離 基耐界 腈化 、或酵成化 本而即的該壤上有 份中分養離然 二 類汁 -之完 胺 於 力物高 _ 土之含 成度分 培分自 丙 腈肉素中而醯 用能生更如的得 ，要溫部板可由 、 使養 酵 其合之 。使合 撤或例 界獲如 主的或 平此使 啶 培之 於水應者 水熱°c然後例為高汁脂由 吡 之中含 物對養 有耐55自水 ，作更 肉瓊， ---------f -裝------訂-----> 〆 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 2 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I 89. 2 8 8p> ).0 6 月日 修正 補充 1 A7 B7 五、 發明説明 Γ 激 生 物 培 育 於 具有 含 上 述 培 着 基 成 分 Μ 及 猜 類 化 合 物 或 釀 胺 化 合 物 9 如 異戊 猜 巴 豆 腈 或 Η 釀 胺 之 液 體 培 着 基 之 試 管 或 培 養 瓶 内， 於 55 t: 或 更 高 的 溫 度 中 生 長 例 如 約 1 2小 時 至 7 天 之 時 間C 將 該 培 養 肉 汁 加 入 猜 化 合 物 如 丙 腈 或 丙 烯 睛 之 水 溶 液 中， 並 使 反 應 於 例 如 30 之 溫 度 下 進 行 約 10 至 約 60分 鐘 之時 間 〇 然 後 1 試 驗 該 反 應 混 合 物 是 否 產 生 醯 胺 化 合 物 使之 可 能 確 實 發 現 具 有 使 m 化 合 物 轉 化 成 其 對 應 之 醮 胺 化 合物 之 水 合 活 性 之 射 热 微 生 物 0 魅 胺 化 合 物 之 檢 澜 * 例 如 可使 用 如 下 述 之 氣 體 m 層 析 術 作 為 分 析 方 法 0 Μ 可 用 於 本發 明 方 法 中 之 典 型 實 例 為 史 密 氏 桿 菌 SC - J05-1 = 該菌株係 - •種捍菌騙的射热微生物， 其係由本發 明 人 發 現 之 具 有較 古 向 活 性 Μ 使 腈 類 化 物 之 睡 .Wf 基 水 合 者 並 於 1993 年 12 月24 Β 寄 存 於 Β 本 工 業 科 學 技 術 協 會 之 國 家 生 物 科 學 暨 人 類技 術 研 究 所 (the Η at i 〇 n a 1 In s t it u t e 0 f B 1 0 S C ί e rt c e a η d Hu a a η Te c h no 1 〇 g y in th e A g e η c y 0 f I η ά U S t P i a 1 s C i e n c e a η d Te c h no 1 ο 1 g y) * 登 錄 號 碼 為 FERH Ρ ~ 1 40 37 ,於 1 9 9 4 年 12月 14 曰 轉 移 至 布 達 佩 斯 條 約 之 國 際 寄 存 中 心， 其 登 錄 號 碼 為 FERM BP - 49 3 5 9 Μ 及 於 1995 年 1月19日寄 存至新竹市食品工業發展研究所（ F IDR I) ， 其 登 錄 號 碼 為 CCRC- 910022 〇 史 密 氏 桿 菌SC -J05 -1 之 特 徼 如 下 (a )形態： 1 .细胞形狀 及大小 形狀： 桿 狀 大小： 0 . 5 0 . 8 μ Β X 0 .8 2 μ m 2 .多形性： 無 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 6 (修正頁） 37 2 7 1 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（7 ) 3.運動性：活躍、周生鞭毛 4，芽孢形成：有 5 .格蘭氏染色：不定 6 .抗酸性：無 (b )生長特色： 1. 營養瓊脂平板培養：圓凸形、無光澤、淡棕色 2. 營養瓊脂斜面培養：無光澤、_淡棕色 3. 營養肉湯液體培養：均一的温濁生長 4 .營養肉汁明膠穿剌培養：不液化 5 .石蕊牛奶：不改變 (c )生理特性： 1 .硝酸塩還原反應：~ 2 .脫硝化作用：- 3 . MR試驗：+ 4 . V P試驗：- 5 .吲睬形成：- 6 .硫化氫形成：+ 7 .澱粉水解：_ 8 .檸檬酸利用 柯塞爾氏培養基：土 9 .無機性氮源之利用 N a N 0 3 ：- (NH4)2S〇4： + 1 Ο .色素形成 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· '^ 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^22832 -_ 五、發明説明（8 ) 金氏A培養基：-金氏B培養基：-11 .尿素酶：-1 2 .氧化酶：+ 13,過氣化氳醮：-至士 1 4 .生長條件 pH ： 4 · 1 〜7 . 5 溫度：3 0〜6 0 t 15.氣氣需求狀況：撒量需氣 16 . 0-F試驗：P 17.於糖中酸及氣體之形成 酸 氣體 L -阿拉伯糖 - D -木糖 十 D -葡萄糖 + D-甘露耱 + D-果糖 + D -半乳糖 + 麥穿糖 + 蔗糖 + 乳糖 - 菌藻糖 + D -山梨糖醇 - D -甘露糖醇 + 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
、1T Λ 22Β Α7 Β7 五、發明説明（9 ) 肌醇 + - 甘油 + - 澱粉 _ - (d)其他待性： ΐ . D N A 之 G + C 莫耳 ％· : 4 0 . 6 % 由文獻中廣泛捜尋具有上述特性之徹生物，並發現經 L.K.Nakamura等人報導於細菌分類學國際期刊（ International Journal of Systematic Bacteriology), 38,63-73(1988)之史密氏捍菌具有如上述之相同特徽。由 這些結果鑑定本發明人發現之菌株S C - J 0 5 - 1屬於史密氏桿 菌。 沒有資料顯示史密氏捍菌之徹生物具有可使腈化合物 轉換成其對應之醯胺化合物之水合活性。基於此點認為史 密氏捍菌SC-J05-1(FERM BP-4935)為一種新穎的菌株。此 外，該β株之變異種，即由史密氏桿菌SC-J05-UFERM ΒΡ-4935)衍生之突變種、融合細胞株或重組菌株，亦可使 用於本發明之方法中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 源 氮 及 碳 含 由 可 物 養 培 的 物 生 撤 之 法 方 明 j 備 機 發 g 製 無 本或於 於广用 用及使 使機的 有泛 、 廣 已 皆 其 備 製 基 養 培 的 同 不 種 各 之 等 塩 機 無 或 換 養 培 的 0 細 般 酸 i 機 有 糖 蔗、 精 糊、 由 甘 \ ο 糖蜜 萄糖 葡 及 為以 例 -實油 之物 源植 碩及 物 母乾 酵 、 , 粉 腺籽 白 棉 蛋 、 、 液 汁漬 肉 浸 如米 源玉 0 、 機粉 無豆 及大 機 、 有物 為出 例抽 實芽 之麥 源 、 氣物 出 抽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2!0X297公釐） Λ228Β2 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、 發明説明（ 10) 1 I 酵 母 > 酪 蛋 白 胺 基 酸 硝 酸 銷 及 尿 素 0 1 1 1 有 機 及 無 機 ·*τπτ 之 實 例 為 元 素 如 鉀 鈉 、 m Af» 鐵 Λ 錳 -V 1 1 鈷 及 鋅 之 氨 化 物 硫 酸 塩 醋 酸 塩 % 碩 酸 塩 及 m 酸 塩 0 其 1 1 請 1 I 特 例 為 氯 化 鉀 、 氯 化 鈉 、 硫 酸 m Λ 硫 酸 亞 m > 硫 酸 錳 氯 先 聞 1 .1* 讀 1 | 化 鈷 硫 酸 鋅 、 硫 酸 銅 、 醋 酸 m 碩 酸 鈣 % m 酸 鈉 m 酸 背 面 1 I 之 1 一 氫 鉀 磷 酸 二 氫 鉀 ·、 磷 酸 一 氫 鈉 及 磷 酸 二 氫 鈉 0 注 意 1 事 1 在 本 發 明 之 方 法 中 > 較 佳 偽 添 加 睛 化 合 物 如 異 戊 腈 及 項 再 暖 Λ.丨 巴 豆 腈 或 11 胺 化 合 物 如 [XI, 豆 醯 胺 至 培 養 基 中 以 達 增 強 其 中 填 寫 本 裝 使 用 之 撤 生 物 的 腈 水 合 活 性 巨 的 〇 例 如 這 it 化 合 物 可 頁 1 1 以 每 1 0 0 ίο L培養基使用約1 0 m g至約1 g之量。 [ f 使 用 於 本 發 明 方 法 之 微 生 物 的 培 養 係 依 據 習 知 之 施 用 1 1 於 — 般 細 Μ 的 程 序 » 以 固 體 培 養 或 液 m 培 養 的 形 式 進 行 * 訂 i 如 使 用 試 管 交 互 振 m 器 或 旋 轉 式 振 盪 培 養 f 以 及 使 用 陶 1 I 製 發 酵 器 或 酵 槽 之 他 種 培 養 0 1 1 I 微 生 物 的 培 養 通 常 像 在 有 氧 的 條 件 下 培 3¾ 〇 特 別 曰 疋 在 1 使 用 陶 製 發 酵 器 時 需 要 引 入 無 菌 的 空 氣 至 其 中 通 常 % 以 外 1 每 分 鐘 約 0 . 1至約2 倍的培養體積之速率引入。 1 1 培 育 溫 度 可 在 所 使 用 之 微 生 物 在 培 養 基 内 可 存 活 之 範 ί [ 圍 内 作 異 動 0 例 如 i 培 養 係 於 約 30 至 約 1 0 0 °c之溫度範 ] I 圍 内 進 行 培 育 0 培 養 基 之 pH 可 控 制 在 例 如 約 2 至 約 11 0 ί I 特 別 是 當 培 養 史 密 氏 桿 菌 之 微 生 物 時 » 培 育 溫 度 範 圍 1 是 約 30 至 約 1 C o°c, 較佳傜約4 0 °C 至約 5 5 t , 及培養基 1 ί 之 pH 範 圍 約 5 至 約 7 0 1 1 培 育 期 間 可 依 各 種 狀 況 而 異 9 而 且 培 養 之 一 般 培 育 期 1 i 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 10
A A7 B7 五、發明説明（11 )間約1至約7天（ 本發明之進行方法，例如，如下所述 細液中 理溶物 處水合 藉或化 或水腈 、 於至 胞浮液 細懸浮 菌法懸 細方此 整同加 完相添 、 之 並 汁述 ， 肉上備 養以製 培質而 之物中 胞之液 細得衝 _ 獲缓 細所塩 使胞酸 細磷 1如 解 分 波 音 之超 用如 。 使 術 應此技 反在之 行 知 進 習 由 指 偽 質 物 之 得 獲 所 胞 細 菌 細 該 理 處 藉 力 壓 氏 蘭 法 以 或 化 質 均 η e Γ 素 酵 的 中 其 於 含 或 胞 細 細 的 碎 破 之 裂 分 酵 之 中 其 於 含 或 胞 細 菌 細 的 碎 破 或 的 整 完 使 由 0 可 指 或 或 結 鍵 子 離 結 .i· 遵 價 共 經 質 物 等 使 如 /f\ 法 方 定 固 依 素 法 撑 支法 體含 載包 之之 體中 載 溝 -IIWI F*f 當結 適狀 於網 撑之 支 锪 等 合 用聚 作於 附 含 吸包 質 物 等 IKL 使 或 後 解 溶 不 其 在 定 固 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 劑 製 定 固 之 得 獲 態 狀 之 出 取 於 易 之 係 常 通 質 物 之 得 獲 胞 菌 細 該 tm t 理 處 由 或 胞 細 0 細 等 該 約 以 約 {% 佳 較 用 使 度 濃 之 ¾ 量 重 ο 2 約 至 ο 1 約 至 度 純 其 視 可 度 濃 其 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 製 定 固 及 素 酵 該 使 , 是 中好 形較 情 ， 的如 劑例 製 ； 定異 固 而 或法 素 方 酵定 在固 〇 之 .¾. 用 量 使 重或 物 之 得 獲 胞 細 菌 細 該 m 二 理 處 經 或 胞 細 菌 細 該 與 有 具 成 備 製 劑 添 在 汁 肉 養 培 胞 細 菌 細 之 用 使 〇 者 力 能 合 水 基 腈 之 同 相 質 田 田 0 該 JJ. rTTc 細 理 該處 使 由 是或 好胞 較細〇a 理細 處 該 的與 步有 一 具 進成 何縮 任濃 須或 不釋 前稀 物汁 合 肉 化養 腈 培 加胞 合 水 基 腈 之 同 rm Hy 質在 物是 之常 得通 獲應 胞反 細 0 約 至 者 力 匕匕
至 OC ο 約 為 佳 較 度 溫 的 P 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Λ22882 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 (1 2) 約 50 於 約 5 至 約 10 之 pH > 較 佳 偽 約 6 至 約 9 下 t 進 行 約 1 0分 鐘 至 約 72小 時 之 時 間 〇 當 p Η 控 制 於 上 述 範 圍 内 1 細 菌 細 胞 可 使 産 生 之 醯 胺 化 合 物 以 高 濃 度 累 積 於 反 應 混 合 物 中 〇 如 是 産 生 之 醯 胺 可 藉 此 領 域 已 知 之 任 何 習 用 方 法 由 反 應 混 合 物 中 回 收 0 例 如 以 離 心 作 用 使 該 細 菌 細 胞 或 由 處 理 該 細 菌 細 胞 獲 得 之 物 質 由 反 應 混 合 物 中 分 離 \ 接 著 以 活 性 m 或 離 子 交 換 樹 脂 處 理 以 除 去 不 純 物 0 此 純 化 之 混 合 物 以 蒸 餾 法 或 在 減 壓 下 蒸 發 濃 縮 > 並 於 有 機 溶 劑 如 甲 醇 中 使 該 沈 澱 晶 體 再 結 晶 而 得 需 求 之 醯 胺 化 合 物 〇 玆 以 下 列 實 例 進 步 閫 逑 本 發 明 I 但 本 發 明 並 不 偶 限 於 此 範 圍 0 例 1 ： 細菌細胞之分離 於 岡 山 縣 的 某 溫 泉 中 收 集 土 壤 > 將 此 牧 得 之 土 壤 添 加 至 含 有 1 . 0重量。 ί甘油， 0 .5 重 量 % 多 蛋 白 陳 0 . 3重量 % 酵 母 抽 出 物 及 0 . 3重量？ 。麥芽抽出物之培養基（PH7. 2) 中 t 接 著 於 55 交 互 振 盪 培 育 2 1 天 0 部 分 培 養 肉 汁 塗 佈 於 含 有 上 述 相 同 成 份 之 瓊 脂 培 養 基 上 ί 並 培 ^3ί 此 培 養 物 至 形 成 某 菌 落 0 由 該 等 菌 落 分 離 細 菌 細 胞 » 並 接 種 一 値 接 種 環 之 分 離 細 菌 細 胞 至 除 與 上 述 相 同 成 份 外 尚 含 0 . 1重量？ $異戊腈的 液 髖 培 養 基 中 t 接 著 於 5 5 t： 培 育 2 4小 時 } 以 提 供 培 養 肉 汁 作 為 樣 本 0 妷 後 9 添 加 1 m L培養肉汁至含2 .78重量 έ之 0 . 05M m 酸 塩 緩 衝 液 (Ρ H 7 .7 )中， 反應於1 0 t開始。 1 〇分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Δ22^δ2 at Β7 五、發明説明（13) 鐘後，加入lmL之2Η HC1以停止反應。取出部分反應混合 物並以氣體層析術分析檢視産生之丙烯醯胺之存在以篩選 具有腈基水合活性之部分菌株。由此法獲得具有使腈化合 物轉換成其對應之醯胺化合物之水合活性之耐熱徹生物為 史密氏桿_ SC-J05-1。 氣體層析術之條件 管柱：填充管柱 載體：Porapak Q型（網目80〜100)
長度：1 . 1 in 管柱溫度：2 1 0 1C 載體氣體流速：50raL7mU 樣本注射體積：2 μ L 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 奮例2 :細菌細胞培養物之耐熱待性测試使由實例1獲得 之史密氏桿菌SC-J05-1細菌細胞及述於JP-B 62-21519/ 1987之一種嘻中溫桿_屬細_細胞（已寄存於法國之 Ecole Nationale Superieut-e.des Agriculture,寄存编. 號R 3 2 2，及亦寄存於日本工業科學技術協會之國家生物科 學竪人類技術研究所，登錄號碼為FERM P-2717;下文亦 稱為桿g靥細菌R332)各自塗佈於營養瓊脂平板培養基·上.， 並培育於不同溫度下以測試其生長能力。結果示於表1 。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） r Λ22ΒΒ2 A7 B7 五、發明説明（14) 耒1 每一菌株之 培育溫度 (τη 史密氏桿菌 SC-J05- 1 (本發明） 捍菌屬細 菌 R332 (對照組） 20 - + + 30 + + + 40 + + + 55 + + - 60 + + - 70 - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
，1T 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 判斷標準：（-)不生長；（+ )生長；及（ + + )大量生長 如表1所示，本發明之史密氏桿SSC-J05-1係一種不 同於對照組之捍菌屬細菌R 3 3 2之耐熱微生物。 奮例3 :細菌細胞之培養 在500ml SakAsueh丨培養瓶中置入lOOnl含有1.0重量 %蔗糖，0 . 5重量％多蛋白陳，0 . 3重量％酵母抽出物、0 . 3重量％麥芽抽出物、0 . 0 01重量％硫酸亞鐵、0 . 0 01重量 %硫酸錳、0 . 0 0 1重量：¾氯化鈷及0 . 0 0 1重量％硫酸鋅之無 菌培養基（PH7.2)。將0.1ml之培養於上述相同培養基中的 史密氏捍菌S C - J 0 5 - 1之培養肉汁接種至該培養瓶。然後， 該培養瓶培育於55t,以135次/min的速率交互振盪1天， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 14 五、發明説明（15) 以提供史密氏桿菌SC-J05-1之細菌細胞培養肉汁。 參考例1 :細菌細胞培養 於500ml Sakaguchi培養瓶中置人lOOmi之含有1.0重 量％甘油、0.5重量％•多蛋白陳、0.3重量％酵母抽出物、 0.3重量％麥芽抽出物、0.001重量％硫酸亞鐵、0.001重 量％'硫酸錳、0 . 0 0 1重量％'氨化鈷及0 . 0 0 1重量％硫酸鏡之 無菌培養基（PH7.2)。以0.1ml之培養於上述相同培養基之 桿菌屬細菌R332之培養肉汁接種至該培養瓶。然後，該培 養瓶培育於3 (TC ,以1 3 5次/ m丨(1的速率交互振盪2天，以 提供細菌屬細菌R332之細i細胞培養肉汁。 出較例1 :耐熱性 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 0 0 m 1之實例3所得之史密氏捍菌S C - J 0 5 - 1捍菌細胞 培養肉汁，藉10,OOOXg離心10分鐘收集該細菌細胞。以 0.05M磷酸塩緩衝液（PH7.7)清洗後，懸浮該等細_細胞於 1 0 0 ® 1之相同緩衝液中。測試如此製得之細菌細胞懸浮液 之使腈化合物轉化成其對應醯胺化合物的水合活性。此外 ,該細菌細胞懸浮液保持於定溫下一段固定時間，以測試 其耐熱活性。 以下列步驟測量睛化合物轉換成其對應之醯胺化合物 的水合活性。 添加1 m 1測試溶液至9 m 1含有2 . 7 8 %丙烯腈溶液之 0 . 0 5 Μ磷酸塩緩衝溶掖（p Η 7 . 7 )中，且反應於1 (TC起始。1 0 分鐘後，加入ΙηιΙ 2Ν HC1終止反。取出部分皮應混合物 ，並藉氣體層析術在實例1所述之相同條件下進行分析， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 15 422882 A7 B7 五、發明説明（16) 以測定産生之丙烯醯胺之量。
關於下文使用之酵素活性的單位，傜以每分鐘1 μ m 〇 1 丙烯腈轉化成丙烯醱胺的活性定義為1單位U)D 然後，400isl之參考例1獲得之捍Η屬細_R332細i 細胞培養肉汁，藉1 Ο , Ο Ο Ο X S離心1 〇分鐘收集該細菌細胞。 以0 . 0 5 Μ磷酸塩緩衝液（p Η 7 . 7 )清洗後，使該等細菌細胞懸 浮於1 Ο π! 1之相同緩衝掖。以上述之相同方法测試如此製得 之細菌細胞懸浮液使腈類化合物轉化成其對應醯胺化合物 的水合活性。此外，為了測定耐熱活性，使該細Μ細胞懸 浮液保持於定溫下一段固定時間，然後測試其活性。以上 述之相同方法測量活性。基於測量結果，計算每一 _株在 處理後之活性相對於處理前的活性（下文稱為剩餘活性）， 以桿菌屬細g細胞R332的剩餘活性定為100作為基準，並 換算史密氏桿菌SC-J05-1之剩餘活性。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 處理溫度 (V ) 處理時間 (hr) 史密氏桿a SC-J05-1 桿菌屬細菌 R332 50 0.5 6 5 4 2 100 40 1.5 280 100 30 47 212 10 0 (本發明） (對照組） 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4规格（210X297公嫠） 16 A22BB2 A7 B7 五、發明説明（n) 比較例2 =反應穩定性 由實例3獲得之史密氏桿菌S C - J 0 5 - 1細菌細咆培養液 ，藉10,000xg離心10分鐘收集細菌細胞。以0.05M磷酸塩 緩衝液（p Η 7 . 7 )清洗後，使該等細菌細胞懸浮於相同的緩 衝液中，得到2 0 U / m 1細菌細胞懸浮液。 另一方面，自桿菌屬細菌細胞R332之細菌細胞培養肉 汁中，藉10,000xg離心10分鐘收集細菌細胞。以0.05M磷 酸塩緩衝液（PH7 . 7)清洗後，懸浮該細菌細胞於lOOmL之相 同缓衝液而得到2 0 II / m 1細菌細胞懸浮液。 然後，使lml之每種細菌細胞懸浮液與9m丨含有2.78重 量％丙烯腈水溶液之0 . 酸塩缓衝液（pH7 . 7)互相混合 ，並於3 0 , 4 0 °C , 5 0 °C或6 0 υ進行反應。1 0分鐘後，加 入lnil 2Ν HC丨使反應停止。取出部分反應混合物，並藉氣 體層析術以實例1所述之相同條件測定丙烯醯胺生成量D 以桿®屬細菌R332在各情況下獲得之丙烯醯胺生成量的值 定為100,換算各溫度之丙烯醯胺生成量。換算值示於表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反應溫度 (°c ) 史密氏桿菌 SC-J05-1 捍菌屬細_ R332 3 0 27 5 1 0 0 40 67 5 100 50 5 2 0 0 100 60 6 2 0 0 100 (本發明） (對照組） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 17 Λ22ΒΒ2 a? B7 五、發明説明（18) 審例4 :使用細菌細胞培養肉汁之反應 添加2 . 5 g ( 4 7 . 2 m in 〇 U丙烯腈至1 〇 〇 m 1由實例3獲得之 史密氏桿鐘SC-J05-1細菌細胞培養液中，並於20¾進行反 應同時以磁性攪拌器攪拌。3小時後，取出1 . 0 m 1反應混 合物，於其中加入O.lmL 2N HC1以終止反應。此反應混合 物一部分藉氣體層析術以實例1所述之相同條件分析。結 果，所有的丙烯請部分全部轉化成丙烯胺，而且未發現任 何副産物如丙烯酸形成。 審例5 :使用細菌細胞之反應 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 150b1由實例3獲得之史密氏桿菌SC-J05-1細菌細胞 培養肉汁，藉1 0 , 0 0 0 X s離心1 〇分鐘收集該細菌細胞。以〇 . 0 5 Μ磷酸塩缓衝液（p Η 7 . 7 )清洗後，使該等細菌細胞懸浮於 5 0 m 1之相同緩衝液。3 . 0 g ( 5 6 . 6 m m ο 1 )丙烯腈分3次加至此 懸浮中，並於2 0它進行反應，同時以磁性攪拌器攆拌。4 小時後，取出1 . 0 tn L反應混合液，並添加0 . 1 m L 2 N H C L至 其中以終止反應。反應混合物之部分藉氣體層析術以實例 1所述之相同條件分析。結果.所有的丙烯腈部分全然轉 化為丙烯醯胺，並未發現任何副産物如丙烯酸之形成。 另一方面，以1 0 , 0 0 0 X g離心1 〇分鐘，由剩餘的反應混 合物中移除細菌細胞，並在低於的溫度下蒸餾濃縮上 清液得到晶體沈澱物，然後，以甲醇進行再結晶得3 . 7 g ( 5 2 . 1 m πι ο 1 ,産率9 2 % )無色平板狀晶體。測量融點、元素 分析、IR光譜以及NMR光譜，確定該等晶體為丙烯醯胺。 普例6 :使用酵素溶液之反應 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1 g 0 Ο Α7 _ 五、發明説明（ig) 3 L由實例3獲得之史密氏桿@ S C - J Ο 5 - 1細菌細胞培養 肉汁，以1 Ο , 〇 〇 〇 x s離心1 〇分鐘收集細®細胞。清洗後，細 菌細胞懸浮於3 Ο Ο π( 1 0 . 0 5 Μ Η E P E S - Κ Ο Η緩衝液（ρ Η 7 · 2 )，並
以20,OOOpsi法蘭氏壓力破碎兩次。該破碎細胞以1〇, 〇〇〇 xs離心30分鐘而除去殘留細®細胞。使用透析管（和光純 藥化學工業有限公司），使上清液於1 0 m Μ Η E P E S - Κ 0 Η緩衝 液（ρ Η 7 . 2 )， 4 t：中透析2 4小時（其間更換該緩衝液四次）Q 使透析餘物通過事先以〇·〇5Μ HEPES-K0H緩衝液（pH7.2)平 衡之DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換樹脂管柱 (SOroiiiOXSOOinffl),藉此作用吸附酵素於其上。 然後，使0.05M HEPES-K0H缓衝液（pH7.2)通過管柱以 清洗之，並以含〇 Μ〜1.0M氨化鉀之0.05M HEPES-K0H( 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) P Η 7 . 2 )梯度緩衝液進行溶離。回收使猜化合物轉化成其對 匾醛胺化合物之具水合活性的部分並使用透析管（和光純 藥化學工業有限公司）於1 〇 m Μ Η E P E S - Κ 0 Η緩衝液（ρ Η 7 · 2 ), 4C中透析24小時（其間更換該緩衝液四次）。透析餘物藉 陰離子交換樹脂層析術在上述相同條件下純化，但其溶離 偽以含 0.2M〜0.8M氛化鉀之 0.05mM HEPES-K0H(pH7.2)梯 度缓衝液進行。以上述之相同方法透析該溶離液而得粗製 的酵素溶液。 如下測定腈化合物轉化成其對應醯胺化合物之活性： 首先，lml粗製酵素溶液添加至9ml 100»M丙睛水溶液 (PH7.7)中，反於10°C起始。.10分鐘後，加人lml 2NHC1終止反應。取出部分反應混合物，並以氣體層析術 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > A4规格（210X2.97公釐> Jlj 經濟部中央梯隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 0) 分析測定丙醯瞭生成量。 關於下文使用之酵素活性單位，傺以每分鐘使1 m Μ ο 1 丙睛轉化成丙醯胺的活性定義為1單位（ϋ)。 以0. 05 Μ磷酸塩緩衝液（ΡΗ7.7)稀釋如此獲得之粗製酵 素溶液。添加2.5g(47.2mmol)丙烯腈至100ml該稀釋液中， 並於2 0°C進行反應，同時以磁性攪拌器攪拌。3小時後， 取出1.0ml反應混合物，並加入0.1ml 2NHC1使反應停止。 部份反應混合物以氣體層析術在實例1所述之相同條件下 分析。結果，所有添加之丙烯睛部分全部轉化成丙烯醯胺 ,且未發現任何副産物如丙烯酸形成。 當例7 :各種腈化合物之轉化作用。 在此實例中，測試含於史密氏桿菌S C - J 0 5 - 1之腈水合 酵素使各種睛化合物轉化成其對應醯胺化合物的能力。於 6 0 U得自實例5之粗製酵素溶液中，加入2 0 m 1 0 . 0 5 Μ磷酸 塩緩衝液（Ρ Η 7 . 7 ),並以1 n m ο 1示於表4之各種待測腈類化 合物作為受質，於30f進行反應3小時。結果發現，由史 密氏捍菌S C - J 0 5 - 1製得之粗製酵素具有使全部之待測膳化 合物轉化成其對應醇胺化合物之水合能力。反應混合物藉 氣髏層析術或液體層析術分析以測定産生之醯胺化合物的 量或腈化合物消耗量。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS > Α4規格（210Χ297公釐） 2 0 A7 B7 五、發明説明（2 1) 衷4 待測腈 化合物 正-丁腈 丙二腈 正-戊腈 丁二腈 異丁腈 己二腈 2 _氣丙睛 乙睛 丙烯腈 三甲基乙腈 巴豆睛 甲基丙烯睛 3 -氣基吡啶 苯甲腈 4 -氰基吡啶 2 -氡基吡啶 合一 生 化比地 猜在率 種得效 各使 高 圍這 中 範-圍 度物範 溫合度 的化溫 溫胺廣 〇 室 醯寬能 於 的更可 高應 法得 在 對方變 使 其用物 即 成習合 , 化之化 明轉行胺 發 的進醯 本 定溫之 據 穩低度 根 可較純 皆 於 高 物般産 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_ 訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公釐） 1—Η 2