JPS6349090A - ｌ−リンゴ酸カルシウムの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は！−リンゴ酸の原料である！−リンゴ酸力ルシ
クムの製造法に関する。

ｌ−リンゴ酸は、医薬用としても用いられているが将来
食品用や工業用としての利用も期待される０ 本発明の方法によれば、ｌ　−ＩＪンゴ酸カルシクムが
高い収率で純度よく製造することができる０従米の技術 １−　ＩＪンゴ酸の製造法としてフマール酸の塩をフマ
ラーゼ活性を有する微生物中の酵素フマラーゼの存在下
酵素反応させて製造することは公知である。（たとえは
特公昭３７−４５１１、特公昭４４−１１９１号公報等
） この酵素法による！−リンゴ酸の製造においては、フマ
ール酸とＪ　＋　ＩＪンゴ酸との間に反応平衡が存在し
、通常の反応温度ではフマール酸から！＋　ＩＪンゴ酸
への変換率が約８０モルチで反応が停止する。７マール
酸とｌ　−ＩＪンゴ酸は化学的諸性質の似通った二塩基
酸であるため、反応液からの両者の分離は非常に困難で
あり、ｌ　−ＩＪンゴ酸の高い工業的回収法は重要な課
題である。

一方、分離方法としてフマール酸の６Ｍ度が低いことを
利用して、大部分を除去し、カルシウムイオンを加えて
ノーリンゴ酸力ルシワムを沈殿させて分離精製する方法
も知られている。（特開昭５１−７０８８０号公報〕し
かしながら、この方法は副原料を多量（二必要とし、ま
た操作が煩雑であるなど工業的に有利な方法とは言い難
い。

これに対して、原料フマール酸からｊ−リンゴ酸への転
換率を高めるためフマール酸カルシウム塩を用いる方法
が報告されている。（Ｋ、Ｋｉ　ｔａｃｈａｖａＳ、Ｆ
ｕｋｕｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｍｉｓａｗａ　、　　ジャーナ
ルオブゼネラルアンドアプライドミクロバイオロジー　
　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆにｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、　６　
、１０８（１９６０））。

本方法によれば高い収率でＪ　−＋７ンゴ酸を製造でき
、また単離ｎ１製も簡略化されるなど工業的に有利な方
法と言える。

しかしながらフマール酸と当量のカルシウム化合物を水
溶媒中で反応させフマール酸カルシウムとしつづけてフ
マラーゼによる酵素反応でｌ　−Ｕンゴ酸を製造しよう
とした場合、ｐＨ値が至適値から大さくずれることによ
る＃素の失活のため反応がすすまなくなる。したがって
従来は、フマール酸カルシウムを車すネ、￥製したのち
原料として酵素反応に供するか、あるいは当量以上のカ
ルシウム化合物を添加してｐＨｌｌｌ１を中性とした後
反応させる必要があった。しかしながらその場合も反応
中に至適ｐＨ値からずれてしまい目的物が得られなかっ
たり（比較例）、またカルシウム化合物を当量以上使う
こと（二よる工業的に不利な面は否めなかった。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、かかる不都合を解決するため検討の結果
、水酸化力ルシクムまたは／および酸化カルシウム水溶
液にフマール酸を添加しつつｐＨ値を６〜９に保ち、フ
マラーゼの存在下酵素反応せしめることにより、フマー
ル酸に対してもまたカルシウム化合物に対しても高い収
率でｌ−リンゴ酸カルシウムを製造することが可能とな
った０発明の詳細な説明 （フマラーゼ） フマラーゼ源としてはフマラーゼを含有する菌体、その
破砕物これらの固定化物又は処理物が用いられる。本反
応においては通常フマール酸からコハク酸の副生が伴う
ため、本発明においては、％願昭６０−１８７５１８号
明細書に記載したコハク酸副生を抑制する前処理を行っ
た菌体もしくはその固定化物を用いる方法が好ましいも
のである０ このコハク酸の副生を抑制する前処理は、フマラーゼを
含有する菌体もしくはその固定化物をｌＩＪンゴ酸塩の
水溶液中で加熱処理することによりおこなうことができ
る。

本発明において用いられるフマラーゼを含有する歯体と
しては、たとえば微工研に寄託されているブレビバクテ
リウム−フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ３０６８ン　（
特公昭５７−２６７５５号公報参照）の菌体およびこの
菌よりα−アミノ酪酸耐性株として取得したＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ３８１２）（特公昭５９−２
８３９８号公報参照）の菌体等公知の張体がある。

これらの菌体は遊離菌体のまま用いることもできるが、
更には該菌体、あるいはその含有する酵素（フマラーゼ
源を固定化したものを反応に供してもよい。この固定化
物の副反応抑制処理である加熱処理は固定化の前後いず
れでもよい。固定化としては、この種の菌体又は酵素の
固定化に通常用いられる方法が使用可能で、たとえばポ
リアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル、膜状高分子
等に固定化して用いられる。

コハク酸副生の抑制条件としては、加熱温度は４０〜６
０℃が用いられるが好ましくは４０℃〜５５℃、ｐＨ値
は４〜１０、好ましくは５〜９、ｌ−リンゴ酸塩濃度は
０．０１〜５Ｍ好ましくは０．０１〜０．３　Ｍ、反応
時間は菌体濃度によっても意　るが１０分〜５時間が用
いられる。

（反応方法ン 水酸化力ルシクムまたは／および酸化カルシウム水溶液
にフマール酸を逐次添加しｐＨ値を６〜９の範囲で一定
となるようにする。すなわちフマール酸の添加を開始し
た初期の場合は、添加した瞬間ｐＨ値は６〜９の範囲と
なるが時間と共にｐＨ値が変化して約１２となりフマラ
ーゼの至適ｐＨ値から大きくずれる。添刀口をつづけて
いくに従い、ｐＨ値の変化する間隔は次第に長くなり、
当量の約０．７〜０．９添加した所でｐＨ値は６〜９の
範囲で一定となり、フマラーゼの至ｉＭＴ）ｉｆ値とな
る。

次に所定量の７マラーゼを添加して反応を開始する。！
−リンゴ酸カルシウムの生成とともにｐＨ値が高くなる
のでフマール酸１逐次添加してｐＨ値が６〜９となるよ
うに調節する。反応の進行とともにフマール酸を添加す
る間隔は長くなり、カルシウム化合物と当量加えた所で
反応は完結する。

本反応における反応温度は１５〜６５℃好ましくは２０
〜５５℃である。反応時間はフマラーゼの量によって変
るが通常的０．５〜４８時間である。

水酸化カルシウムまたは／および酸化カルシ２ムの使用
量は特に制限はないが、一般に０．２〜２Ｍ好ましくは
０．５〜１．５Ｍである。またフマール酸は水酸化カル
シウムまたは／および酸化カルシウムの当モル以下で使
用される。またフマラーゼある。得られたｌ−リンゴ酸
カルシウム反応液からは通常の方法で収率よ＜　ｌ　−
ＩＪンゴ酸を単離精製することができる。

次に実施例により本発明を説明する。

参考例 第１表に示した組成の培地１００−を５００ｍの三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で１５分間加圧滅菌したもの
にエタノールを２　ｖｏｌチ無菌的に添加し、これにブ
レビバクテリウム−フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１
を一白金耳量植菌し、３０℃にて２４時間培養した。

この培養液２０−を２／ジャーファーメンタ−中の第２
表に示した組成の培地１ｊに接種し、３３℃、ｐＨ７，
６、通気１ｔ１ｖｖｍノ条件ニテ渣拌しエタノール濃度
が１〜１．５　ｖｏｌ　％に保たれるようにエタノール
を断続的に添加した。３０時間の培養後、培養液を遠心
分離（６０００ｒｐｍ、　　・１５分）して得た菌体を
供試菌体とした。

該固体２．５ｆを５０−のｐＨ６，０，０，２Ｍ、ｌ−
リンゴ酸ナトリウム水溶液にＭ濁し、４５℃、２時間処
理した。この後、遠心分離にて集菌し、蒸留水ＩＱｄで
２度洗浄した後、遠心集菌した。

第１表 尿素　　　　　　　　　　　　　４．０２硫酸アンモニ
ウム　　　　　　１４．０　ＰＫ）ｉ、ＰＯ４０，５Ｐ Ｋ２ＨＰ０，０．５９ ＭｇＳＯ４φ７Ｈ２００，５ｊ’ ＦｅＳＯ４’　７ｆ（２０６，ＯｒａｙＭｎ　ＳＯ４・
４〜６　Ｈ２Ｏ６，Ｏｑ酵母エキス　　　　　　　　　
　　１．０ｖカザミノ酸　　　　　　　　　　　１．０
タビオチン　　　　　　　　　　２００μ２チアミン塩
酸塩　　　　　　　１００μ２蒸留水　　　　　　　　
　　１０００ｍ第２表 硫酸アンモニウム　　　　　　２３．０　ＰＫ　）ｉ□
ＰＯ４０，５Ｐ Ｋ２ＨＰＯ４０，５Ｓ’ ＭｇＳ　山　拳　７Ｈ２００，５５芦 ｆ＋’ｅｓ０４＃　７Ｈ，０２０”７ Ｍｎ５０４−４〜６　Ｈ２Ｏ２０２９ 酵母エキス　　　　　　　　　　　３Ｐカザミノ酸　　
　　　　　　　　　　３２ビオチン　　　　　　　　　
　　２００μｍチアミン塩酸塩　　　　　　　１００μ
Ｖ蒸留水　　　　　　　　　　１０００ゴ実施例 ｐＨ計、かくはん器を備えた７１！の反応器に水酸化カ
ルシウム２９６Ｆ（４モル）および水４！！を仕込んだ
。４Ｓ’Ｃで加熱がくはんさせながらフマール酸を、ｐ
Ｈ値を測定しながら添加したところ４００２添加したと
ころでｐＨ値が約６．５で一定となった。つづけて参考
例の方法で処理した菌体を１２０９添加した。反応の進
行とともに９Ｈ値が高くなるためフマール酸を除々に添
加しｐＨｃｉ、５〜７．３の範囲で反応をおこなった。

添カロしたフマール酸は６４りで合計４６４１（４ｍＯ
６）となり、添加に要した時間は３時間でさらに１時間
加熱かくはんした。反応終了後、高速液体クロマトグラ
フで分析したところ！−リンゴ酸カル／ワムの収率は水
酸化カルシウムおよびフマール酸のそれぞれに対して９
８．７％であった。

比較例１ ｐＨ計、かくはん器を備えた５００ＣＨの反応器に水酸
化カルシウム１４．８　Ｆ　（０，２モル）および水２
００ＣＣを仕込んだ。４５℃で加熱かくはんしながら当
量のフマール酸２３．２　Ｆ　（０，２モル）仕込んだ
ところｐＨ値は３．６であったため、水酸化カルシウム
３．Ｏｆ　（、ｏ、ｏ　４モル〕を追加してｐＨを７と
した。ついで実施例で用いたものと同じ菌体１０２を添
加して反応をおこなったがｌ　＋　リンゴ酸カルシウム
の生成は認められなかった。又、反応液のｐＨは約１２
と強塩基性であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水酸化カルシウムまたは／および酸化カルシウム水溶液
   にフマール酸を添加しつつｐＨ値を６〜９に保ち、フマ
   ラーゼの存在下酵素反応せしめることを特徴とするｌ−
   リンゴ酸カルシウムの製造法。