JPH02207793A - Ｄ―β―ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグリシンとアルデヒド化合物とをＤ−スレオニ
ンアルドラーゼの存在下で反応させて対応するＤ−β−
ヒドロキシアミノ酸を製造する方法）Ｃ関する。Ｄ−β
−ヒドロキシアミノ酸は抗生物質、酵素阻害剤等の各種
医薬、農薬、その他各種の生理活性物質の合成原料とし
て有用である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来、
Ｄ−β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法としては、
ラセミ混合物を優先晶析する方法（特公昭５４−２５０
０６’Ａ報）が知られているが、操作が煩雑であり、又
収率も極めて低もい。

一方、酵素・微生物を用いる方法として、５−置換ヒダ
ントイン化合物に微生物を作用させてＤ−シアミノ酪酸
アミドに微生物を作用させて不斉加警 水分解する方法（％開昭６１−２７４６９０’公報）等
が知られているが、これらの方法は高価な出発物質を必
要とする。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明はグリシンと、置換脂肪族アルデヒド、脂環式ア
ルデヒド、芳香族アルデヒド又は複素環式アルデヒドな
り一スレオニンアルドラーゼの存在下、反応させること
を特徴とするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法であ
る。

本発明に用いる置換脂肪族アルデヒド、脂環式アルデヒ
ド、芳香族アルデヒド又は複素環式アルデヒドは、例え
ば、 置換脂肪族アルデヒドとして、クロロアセトアルデヒド
、フロロアセトアルデヒド、ニトロアセトアルデヒｖ１
　β−クロロアセトアルデヒド、エトキシアセトアルデ
ヒド等、 脂環式アルデヒドとして、シクロペンチルアルデヒｒ１
　シクロペンテニルアルデヒド、シクロヘキシルアルデ
ヒド、シクロヘキセニルアルデヒド、シクロヘキシルア
セトアルデヒド、シクロヘキセニルアセトアルデヒド等
、 芳香族アルデヒｒとして、ベンズアルデヒド、フロロベ
ンズアルデヒド、クロロベンズアルデヒド、ブロモベン
ズアルデヒド、ニトロベンズアルデヒド、クロロニトロ
ベンズアルデヒド、ヒＰロキシニトロベンズアルデヒド
、メトキシベンズアルデヒドクロロメトキシベンズアル
デヒド、トルアルデヒド、トリフロロトルアルデヒド、
フェニルアセトアルデヒド等、複素環式アルデヒｒとし
て、２−チオフエンアルテヒト、フロモー２−チオフエ
ンアルデヒｒ１４−７オルミルイミダゾール、４−メチ
ル−５−フォルミルイミダゾール等を用いることが出来
る。

本発明に用いるグリシンは通常の方法で製造したもので
よく、その製法は問わない。

本発明で用いるＤ−スレオニンアルＰラーゼはＤ−スレ
オニンに作用してグリシンとアセトアルデヒドとに分解
する酵素であり、例えば、アルカリゲネス８ハエカリス
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＩＦ
Ｏｌ　２６６９　”）　、シュードモナス（Ｐａｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　）　ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）
、アリスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　
（Ｄ　Ｋ　−１９微工研菌寄６２０１号）、及びキサン
トモナス・オリデエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚ
ａｅ　）　（ＩＡＭ　１６５７　）等がこのＤ−７，１
／オニンアルドヲーゼを生産する能力を有する。

本発明に用いる微生物は常法に従って培養することが出
来る。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な炭
素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地である。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下で−４から１０、温度２０から６０℃の任意の範
囲に制御して１〜１０日間培養を行なえばよい。

酵素反応にあたっては、微生物の培養液から分離した培
養菌体、乾燥菌体、菌体破砕液等のほか、無機塩や有機
溶媒等で分画した粗精製酵素、単離された酵素、さらに
は、菌体、菌体処理物、あるいは、酵素自体の固定化物
、その他倒れも使用できる。

酵素反応を実施する方法は、水性媒体中にてグリシンと
アルデヒド化合物を上記した微生物の培養液、菌体、菌
体処理物、酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化
したものと接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体
としては、例えば、水、緩衝液、及び、含水有機溶媒等
が使用出来る。

反応液のアルデヒド化合物の濃度は酵素を著しく阻害、
失活させない程度であれば良＜、０．０５から２．０　
Ｍ／Ｌが好ましへ一方の基質であるグリシンは、アルデ
ヒド化合物と等モル程度でよい。

かかるグリシン、およびアルデヒド化合物の添加は反応
の任意の段階で可能であり、−括、連続、分割のいずれ
の手段でも実施できる。

反応温度は、１０から７０℃が良く、１０から４０℃が
より好適である。反応時の−は５から１０、好ましくは
５．５から７．０である。補酵素として、ピリドキサー
ル５′リン酸を反応系に添加すると酵素活性を高めて反
応を促進させることが出来る。

また、反応系に２−メルカプトエタノールや亜硫酸水素
ナトリウムなどを添加することにより反応収率な高める
ことが出来る場合がある。

反応形式はバッチ方式、連続方式のいずれでも良い。か
くして、反応は０．５から５０時間程度で終了する。

このようにして得られたＤ−β−ヒドロキシアミノ酸を
酵素液から採取するには、通常の方法、例えば遠心分離
や限外ろ過等で除菌・除タンパクし、活性炭やイオン交
換樹脂等で分離・精製するなどの方法により行なうこと
が出来る。

〔実施例〕

例中チは重量％を示す。

酵素製造例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５チ、Ｋｎ２Ｐ
０．０．１％から成るｐＨ７，５ノ培地ヲ調製シ、５１
の培養槽にその３ノを添加し、１２０℃で１５分間加熱
殺菌した。その培地にアリスロバクター（Ａｒｔｈｒｃ
ｂａｃｔｅｒ　）　（Ｄ　Ｋ　−１９微工研菌寄６２０
１号）を接種し、ｐｌ（７，５Ｋ保ちながら３０℃テ２
０時間通気及び、攪はんをしつつ培養した。

培養終了後、培養液から菌体な遠心分離で集菌、水洗後
、０．０１　ｍＭピリドキサール−５′−リン酸、及び
１．ＱｍＭ塩化マンガンを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液１００１に懸濁し、この懸濁液を２
０ＫＨｚ、３分間の超音波破砕処理を４回行（へ、破砕
液の懸濁物質を遠心分離で除去して粗製酵素液を調製し
た。

次に、この粗製酵素液に冷アセトンを攪はんしながら徐
々に添加し、アセトン濃度４５から６５チ画分の析出物
を分取し、上記緩衝液１０＋１１７に溶解してアセトン
分画酵素液を調製した。

酵素製造例２ シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａ　）　Ｄ　Ｋ
　−２（微工研菌寄６２００号）、アルカリゲネス・ハ
エカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ
　）　（ＩＦＯ１２６６９ン、及びキサントモナス・オ
リデエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ　）　（
ＩＡＭ　１６５７　）を酵素製造例１と同様の方法で菌
体、及びアセトン分画酵素液を調製した。

実施例１ 酵素製造例１で得たアリスロパクター （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　Ｄ　ｘ　−１９（微
工研菌寄６２０１号）の酵素液１０１１ｉｌＶＣグリシ
ンを２．０ｍモル、アルデヒド化合物２．０Ａル、２−
メルカプトエタノール２−Ｑｍモル、ぎリドキサール−
５′−リン酸２．０μモル、塩化マンガン（２価）２０
μモル、及び−６，８の０．５　Ｍ　−ａＥｐＥｓ緩衝
液（Ｑｃｔｉｔｅ　ｑｏｏａ’ｓ緩衝液）１０１７より
成る基質溶液を加え３０℃で２０時間反応させた。

反応終了後、薄層クロマトグラフィーで生成β−ヒドロ
キシアミノ酸を分離・定量した。薄層クロマトグラフィ
ーは、１−プロパツールと２５％アンモニア水の比が２
：１の混合液を展開溶媒としてシリカゾル薄層上でクロ
ントゲラフイーを行い、ニンヒドリンで発色させ、デン
シトメーター（Ｃ８−９１０、高滓製作所）で定量した
。これらの分析結果を第１表に示す。

生成β−ヒドロキシアミノ酸の同定は、反応液を限外ろ
過し、イオン交換樹脂カラムで精製稜、上記した条件の
薄層クロマトグラフィーで展開し、生成物を抽出、真空
乾燥してに’　１３−ＮＭＲ、及びＨｌ−ＮＭＲ分析に
より行なった。

また、生成β−ヒドロキシアミノ酸の光学純度はＮ−カ
ルボキシアラニン無水物（ＮＣＡ　）と反応させジアス
テレオマーに変換した後、ＯＤ８カラムを用いる液体ク
ロマトグラフィーによる分析、光学分割カラム（キラル
パツク、ダイセル社製）を用いる液体クロマトグラフィ
ーによる分析、及びシフト試薬を用い九ＮＭＲ分析にて
より測定した。上記の方法で生成β−ヒドロキシアミノ
酸を分析したところ全てＤ一体であった。

実施例２ 酵素製造例２で得たシュードモナス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　Ｄ　Ｋ　−２（微工研
菌寄６２００号）、アルカリ２ネス・ハエ力’）　ス（
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａａｃａｌｉｓ　）　（ＩＦ
Ｏ１２６６９）、及びキサントモナス・オリデｘ　（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　）　（ＩＡＭｌ
　６５７　）の酵素液を用い、グリシンとベンズアルデ
ヒドを基質とし、実施例１と同様の方法で酵素反応を行
い、生成物を分離・定量した。これらの分析結果を第２
表に示す。尚、生成フェニルセリンは全てＤ一体であっ
た。

第２表　Ｄ−フェニルセリンの生成量（ｍモル）実施例
６ 酵素製造例１で得たアリスロバクター （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　Ｄ　Ｋ　−１９（微
工研菌寄６２０１号）の酵素液１００−にグリシン３．
０．９，２−メルカプトエタノール３．Ｑ１ｎ！、塩化
マンガン０．１ｍモル及び０−フロロベンズアルデヒド
０．５　ｍｌを３０分毎に１０回添加（合計５．０　ｄ
　）　ｔ、て、攪はん下で３０℃で、２０時間反応を行
なった。反応中は密閉状態を保ち、０．２　Ｎ　−Ｎａ
ＯＨ，で反応−を６．５に保った。

反応終了後、濃塩酸で反応液の−を２．０に低下させ、
遠心分離で不溶物を除去した後、分画分子量５万の限外
ろ過膜で懸濁物質と高分子量物質を除去した。次に、こ
の反応液を５０Ｍの活性炭カラム（ツルミコールＧＬ−
３０）に通液して生成物を吸着させ、脱イオン水で十分
に洗浄した後、酢酸２０重量％、フェノール５．０％の
混合水溶液で吸着物質を溶出させ、０−７０ロフエニル
セリンの溶出部分を採取した。

次に、この０−フロロフェニルセリンの溶出部分を脱イ
オン水１．０ノに希釈し、Ｈ＋型にしたＤＯＷ１３）Ｃ
５０ＷＸ　８　（５０から１００メツシヘダウケミカル
社ＩＩりを充填した１００ｄのカラムに通液し、脱イオ
ン水で洗浄後、０．５Ｍのアンモニア水で吸着物質を溶
出させ、０−７０ロフエニルセリンの溶出部分を採取し
た。

次に、１−プロパツールと２５％アンモニア水の比が２
＝１の混合液を展開溶媒としてシリカゾル薄層上でクロ
マトグラフィーな行い、生成物を抽出後、エタノールで
結晶化して０．１ｇの結晶を得た。この結晶はＩＲ，Ｎ
ＭＲ，及び元素分析から０−７０ロフエニルセリンであ
ることを確認した。

また、実施例１と同様の方法で光学純度を測定したとこ
ろ全てＤ一体であった。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれ（六人量に生産されているグリシン
とアルデヒド化合物から一挙＆Ｃ対応するＤ−β−ヒド
ロキシアミノ酸を製造しうるので、工業的なり一β−ヒ
ドロキシアミノ酸の製造法として極めて優れている。

特許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. グリシンと、置換脂肪族アルデヒド、脂環式アルデヒド
   、芳香族アルデヒド又は複素環式アルデヒドをＤ−スレ
   オニンアルドラーゼの存在下、反応させることを特徴と
   するＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法。