JP2020530029A - ノルボルネン部分を担う新規アミノ酸 - Google Patents
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Abstract
Description
[0007] 本発明は、ノルボルネン基を担う新規アミノ酸に、前記新規アミノ酸を生成するための方法に、そしてそれらの使用に関する。
[0009] 本発明のさらなる態様は、D若しくはL−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルアルコール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチル−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−イソプロピルアルコール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルチオール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−ブタンアミン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−イソペンタン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−酪酸−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルピロリジン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチル(プロピル)スルファン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−1−ブチルグアニジン−3−ノルボルネンセリン、L−2−プロピオンアミド−3−ノルボルネンセリン、及びL−2−ブチルアミド−3−ノルボルネンセリンからなる群より選択される化合物に関する。
[0011] 表1
[0017] 本発明のさらなる態様は、一般式Iの少なくとも1つのアミノ酸を含んでなるポリペプチドに関する。
[0020] 本発明の1つの態様は、本明細書に記載されるようなポリペプチドを提供する工程、前記ポリペプチドをテトラジン又はアジド化合物と接触させる工程、及びテトラジン又はアジドのノルボルネン基への環化付加反応による連結を可能にするためにインキュベートする工程を含んでなる、ノルボルネン基を含んでなるポリペプチドを生成する方法に関する。
[0023]
[0034] 例えば、トレオニンアルドラーゼは、粗製酵素として、市販酵素として、市販調製品よりさらに精製された酵素として、例えば、分散液、乳液、溶液の形態でも固定化された形態でも存在してよい。トレオニンアルドラーゼは、トレオニンアルドラーゼを自然に又は遺伝子修飾により保有する細胞全体(場合によっては、透過処理及び/又は固定化される)において、又はそのような活性のある細胞の溶解液において、その供給源より既知の精製法の組合せによって入手し得る。トレオニンアルドラーゼの全細胞における発現は、当業者に知られた方法を使用して高めることができる。当業者には、トレオニンアルドラーゼを含む天然に存在する(野生型)酵素の変異体も本発明による方法において利用し得ることが明らかであろう。例えば、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、指向性進化法、遺伝子シャッフリング、融合タンパク質(例えば、トレオニンアルドラーゼとデカルボキシラーゼの融合タンパク質)、等のような突然変異誘発技術を使用して、野生型酵素をコードするDNAを修飾することによって、例えば野生型酵素の変異体を作製することができて、そうすると、そのDNAは、野生型酵素とは少なくとも1つのアミノ酸が異なる酵素をコードして、このように修飾されたDNAの好適な(宿主)細胞における発現が有効になる。トレオニンアルドラーゼの変異体は、例えば、基質への選択性、及び/又は活性、及び/又は安定性、及び/又は耐溶剤性、及び/又はpHプロフィール、及び/又は温度プロフィールに関して改善された特性を有する場合がある。あるいはまた代わりに、野生型酵素をコードするDNAは、その発現を高めるために修飾してよい。
[0046] 本発明のさらなる態様は、ノルボルネン基を有する単一アミノ酸を含んでなるポリペプチドに関する。ノルボルネン基を担う単一アミノ酸だけを有することで、正確に規定されるポリペプチド生成物が提供される。ノルボルネン基を担う単一アミノ酸だけを有することで、多重標識化又は不完全標識化の問題が回避される(反応が完了しなければ、不均一な生成物が生じる可能性があって、ノルボルネン基を担う単一アミノ酸だけを有することによって有益に対処される問題になり得る)。いくつかの態様では、前記ノルボルネン基が、ノルボルネングリシン、ノルボルネンアラニン、ノルボルネンセリン、ノルボルネンイソロイシン、ノルボルネンロイシン、ノルボルネントレオニン、ノルボルネングルタミン酸、ノルボルネンプロリン、ノルボルネンメチオニン、ノルボルネンアルギニン、ノルボルネンアスパラギン、ノルボルネングルタミン、ノルボルネンリジン、及びノルボルネンシステインのアミノ酸残基として存在する。本発明のいくつかの態様は、ノルボルネングリシン、ノルボルネンアラニン、ノルボルネンセリン、又はノルボルネンリジンのアミノ酸残基として存在するノルボルネン基に関する。好ましい態様において、前記単一アミノ酸は、N末端アミノ酸ではない。好ましくは、N末端アミノ基は、ノルボルネンを含まない。本発明のさらなる態様は、ノルボルネンを担うアミノ酸残基がその内部アミノ酸であるポリペプチドに関する。
[0051] いくつかの態様において、当該ポリペプチドは、単一のノルボルネン基を含む。このことには、そのノルボルネン基で指向される可能性があるさらなる化学的修飾への特異性を維持するという利点がある。例えば、目的のポリペプチド中に単一のノルボルネン基だけがある場合、部分修飾というあり得る課題(例えば、ポリペプチド中のノルボルネン基の亜集合だけを後に修飾すること)、又は同じポリペプチド中の交互のノルボルネン基の間で反応微小環境が変動する課題(このことは、ポリペプチド中の異なる位置にある異なるノルボルネン基(複数)の間で不均等な反応性をもたらす可能性がある)が有利にも回避される。故に、いくつかの態様において、当該ポリペプチドは、単一のノルボルネンアミノ酸残基を含む。
[0055] 別の側面において、本発明は、ノルボルネン基を含んでなるポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、上記に記載のようなノルボルネン基を含んでなるポリペプチドを提供する工程、前記ポリペプチドをテトラジン又はアジド化合物と接触させる工程、及びテトラジン又はアジドのノルボルネン基への環化付加反応による連結を可能にするために該混合物をインキュベートする工程を含んでなる。前記環化付加反応は、例えば、逆電子要請型ディールス・アルダー(Diels-Alder)環化付加反応であってよい。
i)該タンパク質をコードするヌクレオチド配列中の所望部位にアンバーコドンのような直交性コドンを導入する工程、又はそこで特定のコドンをそれに置き換える工程、
ii)ピロリルシル−tRNAシンテターゼ/tRNA対のような直交性tRNAシンテターゼ/tRNA対の発現系を細胞中に導入する工程、
iii)本発明によるノルボルネン含有アミノ酸のある培地において該細胞を増殖させる工程。
[0085] フェニルセリン/トレオニンアルドラーゼの遺伝子を収容している大腸菌(E. coli)細胞を培養して、フェニルセリン/トレオニンアルドラーゼを発現させる。収穫後、標準的な細胞破壊手順を使用して、この細胞を破壊する。細胞残滓を遠心分離によって除去して、澄明な細胞溶解液を得る。50mMリン酸緩衝液を使用して、この溶解液を6〜9の範囲のpHへ緩衝化する。次いで、この溶解液へアミノ酸とアルデヒド(有機共溶媒(DMSO)の全量20%で溶かす)を加えて、30℃で24時間反応させる。生成物は、この反応の経過の間に沈殿して、pH補正と遠心分離によって回収する。
[0086] メタノサルキナ属(Methanosarcina)由来ピロリシル−tRNAシンテターゼである野生型ピロリシル−tRNAシンテターゼより入手される、変異体ピロリシル−tRNAシンテターゼ、及び/又は変異体ピロリシル−tRNAシンテターゼは、ピロリジンtRNAをアミノアシル化し、本明細書に記載されるようなアミノ酸を組み込む。
[0087] シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)kt2440(DSM−6125)ゲノムDNAを鋳型として使用して、フェニルセリン/トレオニンアルドラーゼの遺伝子を増幅した。この鋳型は、単純な細胞溶解と同時にエタノールを使用するDNA沈殿によって調製した。使用したプライマーを以下に示す:
LTAフォワード:GCTAATTCATATGACAGACAAGAGCCAACAATTCGCCAGC
LTAリバース:TACGATTAAGCTTTTATTAGCCACCAATGATCGTGCGGATATC
[0088] この酵素は、L−アラビノース誘導性発現系の制御下に制限酵素(NdeI,HindIII)を使用して、低コピーベクター中へクローン化した。
[0089] プラスミド含有L−TA1を大腸菌(E. coli)BL21(DE3)中へ形質転換して、含有50μg/mLカナマイシンを含有するLBプレート上でのプレート培養によって選択した。単一のコピーを摘出して、カナマイシンを含有する15mLの無菌LB培地中へ接種した。この培養物を振り混ぜながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、50mMのグルコースと50μg/mLのカナマイシンを含有する1Lのテリフィック培地(Terrific Broth medium)にこの15mLの一晩培養液を接種した。この培養液を37℃で4時間振り混ぜながら増殖させて、0.2% L−アラビノースを加えることによってこの酵素の発現を誘導した。誘導後、この培養液を30℃での振り混ぜに移して、一晩インキュベートした。翌日、この培養液を、4℃で30分間、5,000gで遠沈させることによって収穫した。この細胞ペレットを0.9%無菌NaClで洗浄して、同じ条件下で再びペレット化した。この細胞ペレットは、さらなる使用まで、−20℃で凍結させた。
[0090] 500mL培養液からの細胞ペレットを室温で融解して、30mLの50mM Na2HPO4緩衝液(pH8)に再懸濁させた。この細胞懸濁液を、音波破砕を使用して溶解した。4℃で30分間、15,000gで細胞残滓をペレット化した。アミノ酸合成のために、この溶解液を、1Mの各アミノ酸、20% DMSO、及び300mMのノルボルネン−カルボキシアルデヒドを含有する100mM Na2HPO4緩衝液(pH7)と1:7で混合する。この反応混合物を30℃で16時間インキュベートする。生じる白色の沈殿を8,000gで30分間の遠心分離によって収穫して、凍結乾燥によって乾燥させて、当該アミノ酸を得る。
共溶媒スクリーニング:
[0092] 上記に記載のように細胞溶解液を調製した。共溶媒スクリーニングは、1.5mLエッペンドルフ(Eppendorf)チューブにおいて実施した。この成分は、以下の順序で加えた:50mM Na2HPO4緩衝液(pH8.0)、共溶媒、アルデヒド、及び溶解液。反応混合物の組成は、表1に要約される。10%及び20%(v/v)の以下の共溶媒について試験した:アセトン、アセトニトリル、ブタン−1−オール、tert−ブタノール、1,4−ジオキサン、DMSO、エタノール、酢酸エチル、エチレングリコール、グリセロール、THF、及びトルエン。
[0096] 古細菌(メタノサルキナ属(Methanosarcina)又はメタノカルドコッカス属(Methanocaldococcus)、他のような)由来ピロリシル−tRNAシンテターゼである、野生型ピロリシル−tRNAシンテターゼより入手される変異体ピロリシル−tRNAシンテターゼ、及び/又は変異体ピロリシル−tRNAシンテターゼは、ピロリジンtRNAをアミノアシル化し、本明細書に記載されるようなアミノ酸を組み込む。この変異体ピロリシル−tRNAシンテターゼは、構造情報に基づく(structure guided)部位飽和突然変異誘発又は指向性進化法又はそれらの組合せのような、最先端のタンパク質工学技術によって産生した。また、遺伝子シャッフリングのような他の技術も可能であろう。
Claims (15)
- 一般式I:
- D若しくはL−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルアルコール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチル−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−イソプロピルアルコール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルチオール−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−ブタンアミン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−イソペンタン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−酪酸−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチルピロリジン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−メチル(プロピル)スルファン−3−ノルボルネンセリン、D若しくはL−2−1−ブチルグアニジン−3−ノルボルネンセリン、L−2−プロピオンアミド−3−ノルボルネンセリン、L−2−ブチルアミド−3−ノルボルネンセリンからなる群より選択される、請求項1に記載の化合物。
-
- ノルボルネン−2−カルボキシアルデヒドをトレオニンアルドラーゼの存在下にアミノ酸と反応させる工程を含んでなる、一般式Iの化合物を製造する方法。
- アミノ酸が、グリシン、アラニン、セリン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、グルタミン酸、プロリン、メチオニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジン、及びシステインからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- トレオニンアルドラーゼが真核生物又は原核生物起源であり、好ましくは細菌、酵母、又は真菌起源である、請求項4又は請求項5に記載の方法。
- トレオニンアルドラーゼが、シュードモナス属(Pseudomonas)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、アゾリゾビウム属(Azorhizobium)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、エスケリキア属(Escherichia)、テルモトガ門(Thermotoga)、シリシバクター属(Silicibacter)、パラコッカス属(Paracoccus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コルウェリア属(Colwellia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)に由来する、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- トレオニンアルドラーゼがシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)に由来する、請求項7に記載の方法。
- トレオニンアルドラーゼが細胞溶解液として含まれる、請求項4〜8のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つの一般式Iのアミノ酸を含んでなるポリペプチド。
- ノルボルネン基を有する前記アミノ酸が野生型ポリペプチド中の当該アミノ酸残基に対応する位置で組み込まれる、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記ノルボルネン基がテトラジン基へ連結している、請求項10又は11に記載のポリペプチド。
- 請求項10又は11に記載のポリペプチドを提供する工程、前記ポリペプチドをテトラジン又はアジド化合物と接触させる工程、及びそのテトラジン又はアジドのノルボルネン基への環化付加反応による連結を可能にするためにインキュベートする工程を含んでなる、ノルボルネン基を含んでなるポリペプチドを製造する方法。
- 一般式Iの化合物をポリペプチド中へ遺伝的に組み込むか又はペプチド合成を介して組み込む、請求項10のポリペプチドを製造する方法。
- 一般式Iの化合物の、化学合成用の構築ブロック(building block)化合物として、又は医薬品成分用のシントン(synthon)としての使用。
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