KR20190141229A - 자발적 이소펩타이드 결합 형성 속도가 향상된 단백질 및 펩타이드 태그 및 이의 용도 - Google Patents

자발적 이소펩타이드 결합 형성 속도가 향상된 단백질 및 펩타이드 태그 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자발적으로 이소펩타이드 결합을 형성할 수 있는 펩타이드 태그(펩타이드) 및 폴리펩타이드(단백질)를 포함하는 2-파트 링커에 관한 것으로, 특히 a) 상기 펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 여기서 (i) 위치 1의 X는 아르기닌이거나 또는 아미노산이 없고; (ii) 위치 2의 X는 글리신이거나 또는 아미노산이 없으며; (iii) 위치 5의 X는 히스티딘 또는 트레오닌이고, 바람직하게는 히스티딘이고; (iv) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린이고, 바람직하게는 알라닌이며; (v) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신이고, 바람직하게는 아르기닌이고; 위치 1의 X에 아미노산이 없을 때, 위치 2의 X에는 아미노산이 없으며; b) 상기 폴리펩타이드는 i) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열; ii) 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분; iii) 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이되, 이 아미노산 서열은 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산을 포함하고, 다음 중 하나 이상, 즉 1) 위치 5에 트레오닌; 2) 위치 16에 프롤린; 3) 위치 40에 아르기닌; 4) 위치 65에 히스티딘; 5) 위치 92에 프롤린; 6) 위치 100에 아스파르트산: 7) 위치 108에 글루탐산; 및 8) 위치 116에 트레오닌 중 하나 이상을 포함하고, 상기 특정 아미노산 잔기들은 서열번호 2에서의 위치들과 동등한 위치들에 있는 것인 아미노산 서열; 또는 iv) 서열번호 101에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 10에 리신, 위치 56에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉 1) 위치 16에 아르기닌; 2) 위치 41에 히스티딘; 3) 위치 68에 프롤린; 및 4) 위치 76에 아스파르트산 중 하나 이상을 포함하고, 상기 특정 아미노산 잔기들은 서열번호 101에서의 위치들과 동등한 위치들에 있는 것인 (iii)의 부분을 포함하고; 상기 펩타이드 및 폴리펩타이드는 서열번호 1의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34 또는 서열번호 101의 위치 10에 있는 리신 잔기 사이에 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다.

Description

자발적 이소펩타이드 결합 형성 속도가 향상된 단백질 및 펩타이드 태그 및 이의 용도
본 발명은 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(단백질)를 포함하는 2-파트 링커(two-part linker)에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 2-파트 링커는 펩타이드 태그와 이의 폴리펩타이드 결합 파트너 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 허용하는 조건 하에서 접촉될 때 공유 결합을 통해 접합될 수 있는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 결합 파트너 동족(cognate) 쌍으로 간주될 수 있다. 상기 2-파트 링커의 각 파트(즉, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 결합 파트너)를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 상기 2-파트 링커(즉, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 결합 파트너) 및/또는 핵산 분자/벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 또한, 상기 2-파트 링커(즉, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 결합 파트너)의 제조 방법 및 본 발명의 2-파트 링커의 용도도 제공된다.
세포 기능은 막대한 수의 가역적인 비공유 단백질-단백질 상호작용에 의존하고 복합체 내 단백질의 정확한 배열이 그 기능에 영향을 미치고 그 기능을 결정한다. 따라서, 공유 단백질-단백질 상호작용을 조작하는 능력은 기초 연구, 합성 생물학 및 생명공학에 다양한 새로운 기회를 가져오게 할 수 있다. 특히, 소위 "융합 단백질"을 형성하기 위한 2 이상의 단백질의 접합은 유용한 특성을 갖는 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 백신의 반복 항원 구조와 같은 단일 종류의 단백질 클러스터링(clustering)은 종종 생물학적 신호를 크게 향상시킨다. 상이한 활성을 갖는 단백질의 클러스터링도 역시 효소에 의한 기질 채널링(channelling)과 같은 향상된 활성을 가진 복합체를 생성할 수 있다.
전형적으로, 공유 단백질 상호작용은 이황화 결합을 통해 매개되지만, 이황화물은 가역적이고, 환원성 세포 구획에 적용할 수 없으며, 단백질 폴딩(folding)을 방해할 수 있다. 펩타이드 태그는 작은 크기가 단백질 기능에 대한 혼란을 최소화하기 때문에 단백질 분석 및 변형에 편리한 도구이다. 펩타이드 태그는 유전자 암호화가 간단하고 크기가 작기 때문에 다른 상호작용을 방해함으로 인한 붕괴, 생합성 비용 및 면역원성 도입을 감소시킨다. 그러나, 펩타이드 태그와 이들의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 결합 파트너 사이의 상호작용은 높은 친화성이 거의 없으며, 이는 안정한 복합체의 형성에 있어서 유용성을 제한한다.
자발적 이소펩타이드 결합 형성이 가능한 단백질(소위 "이소펩타이드 단백질")은 서로 공유적으로 결합하여 돌이킬 수 없는 상호작용을 제공하는 펩타이드 태그/폴리펩타이드 결합 파트너 쌍(즉, 2-파트 링커)을 개발하는데 유리하게 사용되어왔다(참조: 예를 들어 WO2011/098772 및 WO 2016/193746 모두 본원에 참조로 포함됨). 이와 관련하여, 자발적인 이소펩타이드 결합 형성이 가능한 단백질은 별도의 단편으로 발현되어 펩타이드 태그 및 이 펩타이드 태그에 대한 폴리펩타이드 결합 파트너를 제공할 수 있으며, 여기서 두 단편은 이소펩타이드 결합 형성에 의해 공유적으로 재구성될 수 있어, 펩타이드 태그 및 이의 폴리펩타이드 결합 파트너에 융합된 분자 또는 성분을 연결시킨다. 펩타이드 태그 및 이의 폴리펩타이드 결합 파트너에 의해 형성된 이소펩타이드 결합은 비공유 상호작용이 빠르게 해리되는 조건, 예를 들어 장시간(예컨대, 몇 주), 고온(최소 95℃), 강한 힘 또는 가혹한 화학 처리(예: pH 2-11, 유기 용매, 계면활성제 또는 변성제) 하에 안정적이다.
이소펩타이드 결합은 카르복실/카르복스 아미드와 아미노기 사이에 형성된 아미드 결합이며, 여기서 카르복실 또는 아미노기 중 적어도 하나는 단백질 주쇄(단백질의 골격)의 외측에 있다. 이러한 결합은 전형적인 생물학적 조건 하에서 화학적으로 비가역적이고 대부분의 프로테아제에 내성이 있다. 이소펩타이드 결합은 본질적으로 공유성이므로, 몇몇 측정된 최강의 단백질 상호작용을 초래한다.
간단히 말하면, 2-파트 링커, 즉 펩타이드 태그 및 이의 폴리펩타이드 결합 파트너(소위 펩타이드 태그/결합 파트너 쌍)는 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 단백질(이소펩타이드 단백질)로부터 유래될 수 있고, 단백질의 도메인은 별도로 발현되어 이소펩타이드 결합에 관여하는 잔기 중 하나(예 : 아스파 테이트 또는 아스파라긴)를 포함하는 펩타이드 태그 및 이소펩타이드 결합에 관여하는 다른 잔기(예를 들어, 리신) 및 이소펩타이드 결합을 형성하는데 필요한 하나 이상의 다른 잔기(예를 들어, 글루타메이트)를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 결합 파트너(또는 "캐처")를 생성한다. 펩타이드 태그와 결합 파트너를 혼합하면 태그와 결합 파트너 사이에 이소펩타이드 결합이 자발적으로 형성된다. 따라서, 펩타이드 태그 및 결합 파트너를 다른 분자 또는 성분(예를 들어, 단백질)에 별도로 융합시킴으로써, 펩타이드 태그와 결합 파트너 사이에 형성된 이소펩타이드 결합을 통해 상기 분자 또는 성분을 함께 공유적으로 연결하는 것, 즉 펩타이드 태그및 결합 파트너에 융합된 분자 또는 성분 사이에 링커를 형성하는 것이 가능하다.
SpyTag/SpyCatcher라고하는 펩타이드 태그/결합 파트너 쌍(2-파트 링커)은 Streptococcus pyogenes FbaB 단백질의 CnaB2 도메인에서 파생되었고(Zakeri et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA 109, E690-697) 및 생물재료(biomaterials)(Botyanszki et al., 2015, Biotechnology and bioengineering 112, 2016-2024; Chen et al., 2014, Proc Natl Acad Sci USA 108, 11399-11404), 차세대 시퀀싱(Stranger et al., 2016, Proc Natl Acad Sci USA 113, E6749-E6756), 효소 안정화(Schoene et al., 2016, Scientific reports 6, 21151) 및 백신 개발(Brune et al., 2016, Scientific reports 6, 19234; Thrane et al., 2016, Journal of nanobiotechnology 14, 30)을 비롯한 다양한 이용분야에 사용되고 있다. 그러나, SpyTag와 SpyCatcher 사이의 이소펩타이드 결합의 형성 속도는 정제 된 성분으로는 만족스럽지만, 이 속도는 세포 발현 수준에서는 제한적이다.
따라서, 링커, 예를 들어 펩타이드 태그("태그") 및 폴리펩타이드 결합 파트너("캐처") 쌍에, 전술한 바와 같이 안정하고 강력한 공유 결합을 형성하는 이소펩타이드 단백질, 즉 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 결합 파트너로부터 유래된 태그/캐처 시스템과 관련된 유리한 특성을 낮은 농도에서, 특히 세포 발현 수준에서 효율적인 반응을 가능하도록 하기에 충분히 높은 반응 속도로 나타내는 것으로 개발하는 것이 요구되고 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 SpyTag 및 SpyCatcher 펩타이드의 반응 속도가 SpyTag 펩타이드 및 SpyCatcher 폴리펩타이드의 아미노산 서열(각각 서열번호 6 및 7)을 변형(즉, 돌연변이)시킴으로써 현저하게 증가될 수 있음을 측정하였다. 실시예에서 상세하게 논의된 바와 같이, SpyTag 및 SpyCatcher의 반응 속도가 개선될 수 있고, 그렇다면 SpyTag 펩타이드 및 SpyCatcher 폴리펩타이드의 변형이 펩타이드 태그 및 결합 파트너 쌍의 다른 바람직한 특성에 악영향을 미치지 않으면서 반응 속도를 증가시킬 것인지를 측정하는 데에는 많은 단계가 요구되었다.
먼저, 본 발명자들은 SpyTag 및 SpyCatcher의 활성을 향상시키는 변형을 성공적으로 확인할 수 있는 선별(screen)의 파라미터, 즉 SpyTag 펩타이드(서열번호 6) 및 SpyCatcher 폴리펩타이드(서열번호 7)의 잔기가 반응 속도를 실질적으로 감소시키지 않으면서 변형될 수 있는 정도를 확인해야 했다. SpyTag 펩타이드의 활성은 소수의 "앵커" 잔기에 의해 주로 결정된다는 가설을 세웠다. 앵커 잔기의 돌연변이가 반응 속도에 약간 긍정적인 효과만을 가진 다른 위치에서의 돌연변이의 효과를 은폐할 가능성이 있기 때문에, 서열의 임의의 위치에서 돌연변이가 실제로 허용되는 펩타이드 태그의 돌연변이체 라이브러리를 생성하는 것이 실제로는 활성이 개선된 펩타이드를 식별할 가능성을 감소시킬 것으로 가정했다. 따라서, 본 발명자들은 SpyTag의 2개의 N-말단 잔기 및 SpyTag의 6개의 C-말단 잔기를 변형을 위해 선택했고 N- 및/또는 C-말단에 잔기의 첨가가 허용가능한 것인지를 측정하였다. 선별 방법에 사용하기 위해 무작위로 돌연변이된 SpyCatcher 폴리펩타이드의 라이브러리를 개발하였다. 이와 관련하여, 결정 구조에서 모든 잔기가 보이는 것은 아니기 때문에 SpyCatcher의 결정 구조에 기초하여 돌연변이를 설계하는 것은 어렵다.
둘째, 본 발명자들은 N-말단 및 C-말단 SpyTag 돌연변이체를 개별적으로 선별해야 하고, 활성이 향상된 돌연변이체 SpyTag 펩타이드 및 SpyCatcher 폴리펩타이드를 동정하기에 적합한 선별 공정을 설계해야 하는지를 확인하였다. 따라서, SpyTag의 N-말단 또는 C-말단에서 돌연변이를 갖는 라이브러리의 2개의 서브세트를 생성하고 SpyCatcher를 미끼로 사용하여 파지 디스플레이 시스템에서 개선된 활성을 선별하였다. SpyTag를 미끼로 사용하여 SpyCatcher 돌연변이체 라이브러리를 가지고 별도의 선별을 수행하였다.
파지 디스플레이 시스템에서 선택 파라미터의 설계는 간단하지 않았다. 이와 관련하여, SpyTag 펩타이드와 SpyCatcher 폴리펩타이드가 상호작용하는 속도가 반응 속도를 제한할 수 있는 것으로 가정했다. 따라서, 적절한 선별 시스템의 개발은 SpyTag 펩타이드와 SpyCatcher 폴리펩타이드 사이의 반응 속도가 최적이 아닌 반응 조건의 선택을 요구했다. SpyTag와 SpyCatcher 사이의 반응 속도가 가장 빠른 반응 조건(예 : pH, 온도 등)을 사용하면 SpyTag 및 SpyCatcher와 대비하여 각 돌연변이체 펩타이드 및 폴리펩타이드의 반응성 차이의 검출을 방해할 것이다.
돌연변이체 펩타이드 및 폴리펩타이드의 동정에 대한 추가 열쇠는 이소펩타이드 결합에 의해 연결된 복합체로부터 비공유 결합을 통해 연관된 미반응 돌연변이 태그-캐처 복합체를 분리하는데 사용되는 조건의 설계로부터 비롯되었다. 실시예에 논의된 바와 같이, 저 pH 완충액 및 프로테아제 처리의 조합을 사용하여 비공유 및 공유 복합체를 분리함으로써 각각의 파트너와 자발적으로 이소펩타이드 결합을 형성할 수 있는 돌연변이체 펩타이드 및 폴리펩타이드만이 분석 및 추가 변형을 위해 선택되도록 보장했다.
이와 관련하여, SpyTag 및 SpyCatcher에 비해 개선된 반응 속도를 갖는 돌연변이체 "태그" 및 "캐처"의 개발은 선별 공정으로부터 확인된 돌연변이체 펩타이드 및 폴리펩타이드에 대한 다양한 추가 변형(즉, 돌연변이)의 설계 및 도입을 필요로 하였다. 변형은 돌연변이되지 않은 파트너와 반응했을 때 반응 속도가 개선된 돌연변이체 "태그" 펩타이드 및 "캐처" 폴리펩타이드를 초래했을 뿐만 아니라(예를 들어, 돌연변이되지 않은 SpyCatcher와 반응한 돌연변이 태그의 경우 >6배 증가 및 돌연변이되지 않은 SpyTag와 반응한 돌연변이된 캐처의 경우 >3배 증가), 놀랍게도 돌연변이체 "태그" 및 "캐처"의 반응 속도에 대한 돌연변이의 효과는 함께 사용되었을 때 누적되는 것으로 확인되었다(즉, 돌연변이체 태그 및 캐처 쌍은 SpyTag와 SpyCatcher 쌍의 반응에 비해 반응 속도의 >10배 증가를 나타낸다). 따라서, 유리하게는, 본 발명의 돌연변이체 태그 및 캐처(즉, 2-파트 링커)는 저농도에서 특히 유용하다. 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 본 발명의 돌연변이체 태그 및 캐처의 개선된 속도 상수는 태그 및/또는 캐처가 반응을 늦출 수 있는 분자 또는 성분(예를 들어, 큰 단백질)에 융합된 반응 및 본 발명의 돌연변이체 태그 및/또는 캐처에 융합된 분자 또는 성분이 입체 장애를 유발하는 반응에도 유익한 것이다. 또한, 반응 속도를 개선하기 위해 필요한 변형은 SpyTag 및 SpyCatcher와 관련된 다른 유용한 특성, 즉 열 안정성, pH 값 및 온도 범위에 걸친 반응 및 계면활성제의 존재를 비롯한 광범위한 완충액에서의 반응 및 대장균에서의 효율적인 발현에 영향을 미치지 않는다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 즉 펩타이드 태그를 제공하며, 여기서
(i) 위치 1의 X는 아르기닌이거나 아미노산이 없고;
(ii) 위치 2의 X는 글리신이거나 아미노산이 없고;
(iii) 위치 5의 X는 트레오닌 또는 히스티딘, 바람직하게는 히스티딘이고;
(iv) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(v) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이며,
위치 1의 X에 아미노산이 없는 경우, 위치 2의 X에도 아미노산이 없고,
상기 펩타이드(펩타이드 태그)는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(즉, 폴리펩타이드 결합 파트너)와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있으며, 여기서 상기 이소펩타이드 결합은 서열번호 1의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34에 있는 리신 잔기 사이에 형성된다.
따라서, 본 발명의 펩타이드 태그는 최초의 SpyTag 펩타이드와 비교하여 적어도 4 개(예를 들어 5 개 또는 6 개)의 변형(예컨대, 첨가 및 치환)을 포함한다.
하기 실시예에서 논의된 바와 같이, N-말단 선별에서 확인된 선두 돌연변이체 펩타이드 태그(SpyTag 변이체 펩타이드)는 SpyTag에 비해 3 개의 N-말단 아미노산을 함유하고, 이들 잔기 중 2 개가 펩타이드의 반응 속도에 현저한 영향을 미침이 없이 제거될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그는 서열번호 1의 위치 1 및 2에 아미노산을 함유하지 않으며, 즉 위치 1의 X에 아미노산이 없는 경우, 위치 2의 X에도 아미노산이 없고, 위치 2에 아미노산이 없는 경우, 위치 1의 X에도 아미노산이 없다. 다르게는, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서
(i) 위치 3의 X는 트레오닌 또는 히스티딘, 바람직하게는 히스티딘이고;
(ii) 위치 9의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(iii) 위치 12의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이다.
그러나, 본 발명자들은 N-말단에 아르기닌 및 글리신 잔기의 내포가 SpyTag 변이체의 반응 속도를 추가로 개선시킨다는 것을 확인하였다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서
(i) 위치 1의 X는 아르기닌이고;
(ii) 위치 2의 X는 글리신이고;
(iii) 위치 5의 X는 트레오닌 또는 히스티딘, 바람직하게는 히스티딘이고;
(iv) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(v) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이다.
대안적으로, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서,
(i) 위치 5의 X는 트레오닌 또는 히스티딘, 바람직하게는 히스티딘이고;
(ii) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(iii) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이다.
서열번호 1 및 9의 위치 11 및 14(서열번호 8의 위치 9 및 12와 동등)에서의 보존적 치환은 펩타이드 태그의 활성에 유의적인 영향없이 허용될 수 있는 것으로 고찰된다. 그럼에도 몇몇 구체예에서, 서열번호 1 및 9의 위치 11(서열번호 8의 위치 9와 동등)은 알라닌이고(이거나) 서열번호 1 및 9의 위치 14(서열번호 8의 위치 12와 동등)는 아르기닌인 것이 바람직하다.
실시예에 기술된 N-말단 선별에서 동정된 선두 돌연변이체 펩타이드 태그(SpyTag 변이체 펩타이드)는 위치 3에 발린 잔기 및 위치 5에 트레오닌 잔기(서열번호 1의 넘버링 사용)를 함유하였으며, 이는 SpyTag(서열번호 6)에서 위치 -1 및 2에 해당한다. 선별 과정으로부터 확인된 각 아미노산 돌연변이가 SpyTag 변이체 펩타이드의 개선된 활성에 기여하는 것으로 추정되었지만, 본 발명자들은 SpyTag 변이체 펩타이드에서 비-보존적 변이를 조사했다. 이와 관련하여, 서열번호 1의 3 번 위치의 발린 잔기는 SpyTag가 유래된 스트렙토코커스 피오게네스 FbaB 단백질의 CnaB2 도메인에서의 동등 위치에 있는 아스파르트산 잔기와 비교하여 비-보존적 돌연변이를 나타낸다. 더욱이, 서열번호 1의 위치 5에 있는 트레오닌 잔기는 SpyTag에서 동등 위치에 있는 히스티딘 잔기에 대비하여 비-보존적 치환을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자들은 발린 잔기가 SpyTag 변이체의 결실이 활성을 극감시켰기 때문에 SpyTag 변이체의 개선된 활성에 필수적이라는 것을 밝혀냈다. 또한, 서열번호 1의 위치 5에서 트레오닌 잔기의 히스티딘으로의 치환(즉, SpyTag 서열로의 복귀)은 예상치 못하게 활성을 개선시켰다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서
(i) 위치 1의 X는 아르기닌이고;
(ii) 위치 2의 X는 글리신이고;
(iii) 위치 5의 X는 히스티딘이고;
(iv) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(v) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이다.
대안적으로, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하며, 여기서
(i) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
(ii) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그는 서열번호 3, 4 또는 5, 바람직하게는 서열번호 4 또는 5, 가장 바람직하게는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 파지 디스플레이 선별은 SpyCatcher에 비해 활성이 개선된 변이체(즉, 돌연변이체) 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너 또는 캐처)를 동정하였다. SpyCatcher의 아미노산 서열(서열번호 7) 대비 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)(서열번호 2, 즉 SpyCatcher 폴리펩타이드 변이체)의 각 치환은 별도로 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 활성을 향상시킬 수 있는 것으로 고찰된다.
또한, SpyCatcher 폴리펩타이드는 활성에 큰 영향을 미치지 않으면서 N-말단 및 C-말단에서 절단될 수 있다는 사실에 비추어 보면(Li et al., 2014, J Mol Biol.; 426(2): 309-317), 본원에 예시된 폴리펩타이드(즉, 서열번호 2)는 폴리펩타이드의 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 N-말단 및/또는 C-말단에서 절단될 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 서열번호 2는 N-말단에서 최대 24 개의 아미노산(예를 들어, 5, 10, 15 또는 20 개의 아미노산)까지 및/또는 C-말단에서 최대 9 개의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 아미노산)까지 절단될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은
i) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열;
ii) 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 2에 제시된 서열과 80 % 이상의 서열 동일성을 갖되, 위치 34의 리신, 위치 80의 글루탐산 및 하기 중 하나 이상, 즉
1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 40의 아르기닌;
4) 위치 65의 히스티딘;
5) 위치 92의 프롤린;
6) 위치 100의 아스파르트산 :
7) 위치 108의 글루탐산; 및
8) 위치 116의 트레오닌
중 하나 이상을 포함하고,
상기 특정 아미노산 잔기가 서열번호 2의 위치와 동등한 위치에 있는 것인 아미노산 서열; 또는
iv) 서열번호 101에 제시된 서열과 80% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 101에 제시된 서열과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 갖되, 위치 10(또는 서열번호 2의 위치 34와 동등 위치)에 리신, 위치 56(또는 서열번호 2의 위치 80과 동등 위치)에 글루탐산, 및 다음 중 하나 이상, 즉
1) 위치 16(또는 서열번호 2의 위치 40과 동등한 위치)의 아르기닌;
2) 위치 41(또는 서열번호 2의 위치 65와 동등한 위치)의 히스티딘;
3) 위치 68(또는 서열번호 2의 위치 92와 동등한 위치)에서의 프롤린; 및
4) 위치 76(또는 서열번호 2의 위치 100과 동등한 위치)에서의 아스파르트산 중 하나 이상을 포함하고,
상기 특정 아미노산 잔기는 서열번호 101(또는 서열번호 2)의 위치와 동등한 위치에 있는 것인 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분을 포함하는 것인 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)이고,
상기 폴리펩타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(펩타이드 태그)와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있으며, 여기서 상기 이소펩타이드 결합은 서열번호 5의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34 또는 서열번호 101의 위치 10에 있는 리신 잔기 사이에 형성되는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체(즉, 서열 동일성 관련된 폴리펩타이드 및 이의 부분)가 상기 특정된 모든 잔기를 함유하지는 않는 구체예에서, 변이체는 위치 5를 제외한(하기에서 논의됨) 특정 위치들에 SpyCatcher 펩타이드(서열번호 7)의 동등한 위치에 있는 아미노산 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 동등한 위치는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체의 아미노산 서열을 서열번호 7과 예를 들어 BLASTP 알고리즘을 사용하여 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구체예에서, 위치 16(또는 동등 위치)의 잔기가 프롤린이 아닌 경우, 잔기는 글루타민인 것이 바람직하다. 유사하게, 위치 40(또는 동등 위치)의 잔기가 아르기닌이 아닌 경우, 잔기는 리신인 것이 바람직하다. 위치 65(또는 동등 위치)의 잔기가 히스티딘이 아닌 경우, 잔기는 글루타민인 것이 바람직하다. 위치 92(또는 동등 위치)의 잔기가 프롤린이 아닌 경우, 잔기는 알라닌인 것이 바람직하다. 위치 100(또는 동등 위치)의 잔기가 아스파르트산이 아닌 경우, 잔기는 글루타민인 것이 바람직하다. 위치 108(또는 동등 위치)의 잔기가 글루탐산이 아닌 경우, 잔기는 리신인 것이 바람직하다. 위치 116(또는 동등 위치)의 잔기가 트레오닌이 아닌 경우, 잔기는 이소류신인 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체는 예를 들어 1 내지 50, 1 내지 45, 1 내지 40, 1 내지 35, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 또는 3 개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 1 내지 23, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1, 2 내지 3 개의 아미노산 치환 및/또는 1 내지 33, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실에 의해 서열번호 2와 다를 수 있다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 일부 구체예에서, 결실은 N- 및/또는 C-말단에서 일어나서, 즉 절두형이어서 상기 정의된 바와 같은 서열번호 2의 폴리펩타이드 부분을 생성하는 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 예시된 폴리펩타이드(서열번호 2) 대비 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 존재하는 임의의 돌연변이는 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 물리화학적 특성을 보존하는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 지칭한다(예를 들어, D는 E로 또는 그 반대로, N은 Q로, 또는 L 또는 I는 V로 또는 그 반대로). 따라서, 치환 아미노산은 일반적으로 치환되는 아미노산과 유사한 성질, 예를 들어 소수성, 친수성, 전기 음성도, 부피가 큰 측쇄 등을 갖는다. 천연 L- 아미노산의 이성질체, 예컨대 D-아미노산이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체가 상기 명시된 모든 잔기(즉, 서열번호 7 대비 서열번호 2의 모든 돌연변이체)를 포함하지 않는 일부 구체예에서, 변이체는 위치 5를 제외한 특정된 위치에서 SpyCatcher 펩타이드(서열번호 7)의 동등 위치에 있는 아미노산 잔기의 보존적 치환을 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어 위치 16의 잔기(또는 동등 위치)에 있는 잔기가 프롤린 또는 글루타민이 아닌 경우, 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 2에 제시된 서열과 80 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 34의 리신, 위치 80의 글루탐산 및 다음, 즉
1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 40의 아르기닌;
4) 위치 65의 히스티딘;
5) 위치 92의 프롤린;
6) 위치 100의 아스파르트산 :
7) 위치 108의 글루탐산; 및
8) 위치 116의 트레오닌
중 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개를 포함하고,
여기서 특정 아미노산 잔기는 서열번호 2의 위치와 동등한 위치에 있는 것이다.
하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 파지 디스플레이 선별에서 확인된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 돌연변이체(즉, 변이체)의 5번 위치(서열번호 2 및 서열번호 7의 넘버링에 기초하여)에 아스파르트산 잔기의 존재가 원치않는 부반응의 형성, 즉 폴리펩타이드들이 이소펩타이드 결합을 통해 접합된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 이량체의 형성을 초래한다는 것을 예상치않게 밝혀냈다. 위치 5에서 아스파르트산 잔기의 트레오닌 또는 알라닌으로의 돌연변이는 원치않는 부반응을 제거하는 것으로 밝혀졌고, 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 활성 속도를 더욱 개선시켰다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 2에 제시된 서열과 80 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열은 위치 5의 트레오닌, 위치 34의 리신, 위치 80의 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
1) 위치 16의 프롤린;
2) 위치 40의 아르기닌;
3) 위치 65의 히스티딘;
4) 위치 92의 프롤린;
5) 위치 100의 아스파르트산 :
6) 위치 108의 글루탐산; 및
7) 위치 116의 트레오닌을 포함하고,
여기서 특정 아미노산 잔기는 서열번호 2의 위치와 동등한 위치에 있는 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 상기 정의된 특정 아미노산 잔기의 임의의 하나 또는 임의의 조합(예를 들어, 상기 특정된 아미노산 잔기의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 임의의 조합), 예를 들어 1) 및 2), 1) 및 3), 1 및 4), 1) 및 5), 1) 및 6), 1) 및 7), 1) 및 8), 2) 및 3), 2) 및 4) 등, 1), 2) 및 3), 1), 3) 및 4), 1), 3) 및 5) 등을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 특히 바람직한 몇몇 조합은 다음을 포함하고,
a) 1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 34의 리신;
4) 위치 40의 아르기닌;
5) 위치 65의 히스티딘;
6) 위치 80의 글루탐산;
7) 위치 108의 글루탐산; 및
8) 위치 116의 트레오닌;
b) 1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 34의 리신;
4) 위치 40의 아르기닌;
5) 위치 65의 히스티딘;
6) 위치 80의 글루탐산;
7) 위치 92의 프롤린;
8) 위치 108의 글루탐산; 및
9) 위치 116의 트레오닌; 및
c) 1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 34의 리신;
4) 위치 40의 아르기닌;
5) 위치 65의 히스티딘;
6) 위치 80의 글루탐산;
7) 위치 92의 프롤린;
8) 위치 100의 아스파르트산 :
9) 위치 108의 글루탐산; 및
10) 위치 116의 트레오닌,
여기서 특정 아미노산 잔기는 서열번호 2의 위치와 동등한 위치에 있는 것이다.
일부 추가 구체예에서, 상기 정의된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체는 또한 위치 12의 글리신 및/또는 위치 22의 트레오닌을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 특히 서열번호 2에 제시된 예시된 서열과 80% 이상 동일할 수 있고, 보다 특히 서열번호 2와 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하고, 여기서 폴리펩타이드 변이체는 위치 34(또는 동등 위치)에 리신, 위치 80(또는 동등 위치)에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
1) 위치 5의 트레오닌;
2) 위치 16의 프롤린;
3) 위치 40의 아르기닌;
4) 위치 65의 히스티딘;
5) 위치 92의 프롤린;
6) 위치 100의 아스파르트산 :
7) 위치 108의 글루탐산; 및
8) 위치 116의 트레오닌
중 하나 이상을 포함하고,
여기서 특정 아미노산 잔기는 서열번호 2의 위치와 동등한 위치에 있는 것이다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 성분을, 바람직하게는 공유 결합, 예를 들어 이소펩타이드 결합에 의해 함께 연결, 즉 접합 또는 결합시키는 작용을 하는 분자를 지칭한다. 이소펩타이드 결합. 따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드는 2-파트 링커로 볼 수 있는데, 여기서 제 1 부분, 즉 펩타이드 태그와 제 2 부분, 즉 폴리펩타이드 사이에 이소펩타이드 결합의 형성은 링커를 재구성함으로써 링커의 상기 제 1 및 제 2 부분에 융합되거나 접합된 분자 또는 성분을 결합시킨다. 대안적으로, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드는 링커로서 기능하는 동족 쌍, 즉 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 동족 쌍 또는 펩타이드 태그 및 결합 파트너 동족 쌍으로 볼 수 있다. 이들 용어는 본 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용된다.
"동족(cognate)"이라는 용어는 함께 기능하는 구성 우레아를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 동족 쌍은 자발적으로 함께 반응하여 이소펩타이드 결합을 형성하는 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 이소펩타이드 결합의 자발적 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 효율적으로 함께 반응하여 이소펩타이드 결합을 형성하는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드를 포함하는 2-파트 링커는 또한 "상보성 쌍", 즉 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 상보성 쌍이라고 지칭될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 펩타이드(펩타이드 태그) 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 포함하는 2-파트 링커를 제공하고, 여기서
a) 상기 펩타이드(펩타이드 태그)는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고;
b) 상기 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고,
상기 펩타이드(펩타이드 태그) 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 1의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34에 있는 리신 잔기 사이에 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 1의 10 번 위치의 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 34 번 위치의 리신 잔기 사이에, 상기 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합의 형성에 적합한 하기 설명된 것들을 포함하는 다양한 조건 하에서 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성한다. 하기 실시예로부터 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 다양한 조건 하에서 활성이라는 것이 명백하다.
예를 들어, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 인산염 완충 식염수(PBS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), HEPES 완충 식염수(HBS) 및 Tris 완충 식염수(TBS)를 EDTA가 있거나 없이 포함하는 다양한 완충액에서 활성이다. 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 약 3.0 내지 8.0, 예를 들어 4.0-7.0, 5.0-7.0(예컨대, 약 5.5-6.5)의 pH에서 넓은 온도 범위에 걸쳐, 예를 들어 0 내지 40℃, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35 또는 37℃, 바람직하게는 약 25-35℃, 예컨대 약 25℃에서 활성이다. 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 또한 일반적으로 사용되는 계면활성제, 예를 들어 Tween 20 및 Triton X-100의 존재하에(최대 약 1 %(v/v)의 농도까지), 그리고 우레아의 존재하에(예를 들어 최대 약 3M의 농도까지) 활성이다. 당업자는 다른 적절한 조건을 쉽게 밝혀낼 수 있을 것이다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 상기 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합 형성에 적합한 조건은 본 발명의 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 접촉시키면 상기 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이, 특히 서열번호 1의 위치 10(또는 동등 위치)의 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34(또는 동등 위치)의 리신 잔기 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 초래하는 임의의 조건을 포함한다. 예를 들어, 상기 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 완충된 조건, 예를 들어 완충 용액 또는 PBS와 같은 완충액으로 평형화된 고체상(예를 들어 칼럼)에서 접촉시키는 것이다. 접촉 단계는 임의의 적합한 pH, 예컨대 pH 3.0-8.0, 예를 들어 4.0-7.0, 예컨대 pH 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8 또는 7.0일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 접촉 단계는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 약 0-40 ℃, 예컨대 약 1-39, 2-38, 3-37, 4-36, 5-35, 6-34, 7-33, 8-32, 9-31 또는 10-30℃, 예를 들어 약 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 33, 35 또는 37℃, 바람직하게는 약 25-35℃, 예를 들어 약 25℃에서 이루어질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 "이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 가능하게 하는 조건 하에서" 접촉시키는 것은 화학적 샤페론, 예를 들어 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 반응성을 향상시키거나 개선시키는 분자의 존재하에 상기 펩타이드 태그와 폴리펩타이드를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 화학적 샤페론은 TMAO(트리메틸 아민 N-옥사이드)이다. 일부 구체예에서, 화학 샤페론, 예를 들어 TMAO는 약 0.2M 이상, 예를 들어 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 또는 2.5M 이상, 예를 들어 약 0.2-3.0 M, 0.5-2.0 M, 1.0-1.5 M의 농도로 반응에 존재한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이의 이소펩타이드 결합의 형성은 자발적이다. 이와 관련하여, 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 위치 80(또는 동등 위치, 서열번호 2의 넘버링을 기준으로 함)에 글루탐산을 포함하고, 이는 예를 들어, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 내에 있는 각 아스파테이트 및 리신 잔기 사이에 이소펩타이드 결합의 형성을 용이하게 하고, 예컨대 유도, 촉진 또는 촉매한다.
본원에 사용된 용어 "자발적"은 단백질에서 또는 펩타이드 또는 단백질 간에(예를 들어, 2 개의 펩타이드 간에 또는 펩타이드와 단백질 사이, 즉 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 간에) 임의의 다른 작용제(agent)(예를 들어, 효소 촉매)의 존재 없이 및/또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 변형 없이, 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 사용한 천연 화학적 결찰 또는 화학적 커플링 없이 형성될 수 있는 이소펩타이드 결합을 지칭한다. 따라서, C-말단 티오에스테르를 갖는 펩타이드 또는 단백질을 변형시키기 위한 천연 화학적 결찰은 수행되지 않는다.
따라서, 자발적인 이소펩타이드 결합은 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드의 화학적 변형없이 분리될 때 본 발명의 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 형성될 수 있다. 따라서, 자발적 이소펩타이드 결합은 효소 또는 다른 외인성 물질의 부재 및 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드의 화학적 변형없이 저절로 형성될 수 있다.
자발적 이소펩타이드 결합은 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 거의 접촉 직후에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분 내에 또는 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 시간 내에 형성될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 3-5에 제시된 예시적인 펩타이드 및 서열번호 2에 제시된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 각각 구조적으로 유사한 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 돌연변이체 형태(즉, 본원에서는 상동체, 변이체 또는 유도체로 지칭됨)를 포함한다. 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체는 펩타이드 태그 및 결합 파트너(캐처)로서 기능할 수 있으며, 즉 펩타이드 태그 변이체의 위치 10(또는 동등 위치)에 있는 아스파르트산과 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체의 위치 34(또는 동등 위치)에 있는 리신 사이에 상기 정의된 바와 같은 적합한 조건 하에서 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다.
펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체가 각각 서열번호 1 및 2와 관련하여 돌연변이, 예컨대 결실 또는 삽입을 포함하는 경우, 상기 특정된 잔기들은 변이체 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 서열에서 동등한 아미노산 위치에 존재한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체의 결실은 N-말단 및/또는 C-말단 절두형이 아니다.
그러나, 상기 언급된 바와 같이, 본원에 예시된 폴리펩타이드(즉, 서열번호 2)는 폴리펩타이드의 활성을 현저하게 감소시키지 않으면서 N-말단 및/또는 C-말단에서 절단될 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 서열번호 2는 N-말단에서 최대 24 개의 아미노산(예를 들어, 5, 10, 15 또는 20 개의 아미노산) 및/또는 C-말단에서 최대 9 개의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 아미노산)까지 절단될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 변이체는 예시된 폴리펩타이드의 절단 변이체를 포함한다. 대안적으로, 본 발명은 예시된 폴리펩타이드의 부분을 제공하는 것으로 보여질 수 있으며, 여기서 상기 부분은 상기 논의된 바와 같이 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
본원에서 언급된 "부분"은 적어도 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열, 즉 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 서열번호 2(이로부터 유래되는 서열)의 적어도 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 105 또는 110 개 이상의 아미노산을 포함한다. 따라서 상기 부분은 서열의 중심 또는 N-말단 또는 C-말단 부분으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는 상기 부분은 중심 부분으로부터 얻어지며, 즉 상기 정의된 바와 같이 N-말단 및/또는 C-말단 절두형을 포함한다. 특히, 본원에 기술된 "부분"은 본 발명의 폴리펩타이드이므로 본원에 언급된 동일성(비교 영역에 대비하여) 조건 및 기능적 동등 조건을 만족시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 변이체는 서열번호 1과 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 내지 3 개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 치환에 의해 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 2와 상이할 수 있다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단, 예를 들어 가변 pamfactor를 갖는 FASTA pep-cmp 및 12.0으로 설정된 갭 생성 페널티 및 4.0으로 설정된 갭 확장 페널티 및 2 개의 아미노산 윈도우를 사용하는 SWISS-PROT 단백질 서열 데이터뱅크를 사용하여 확인할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 확인하기 위한 다른 프로그램은 University of Wisconsin의 Genetics Computer Group(GCG) 버전 10 소프트웨어 패키지의 BestFit 프로그램을 포함한다. 이 프로그램은 기본 값, 즉 갭 생성 페널티 -8, 갭 확장 페널티 = 2, 평균 일치 = 2.912, 평균 불일치 = -2.003을 가지고 Smith와 Waterman의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다.
바람직하게는 상기 비교는 전체 길이의 서열에 걸쳐 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우, 예를 들어 100, 80 또는 50개 미만의 연속 아미노산에 걸쳐 이루어질 수 있다.
바람직하게는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 변이체(예를 들어, 서열 동일성 관련 변이체)는 서열번호 3-5 또는 서열번호 2 또는 101에 각각 제시된 서열을 갖는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 기능적으로 동등하다. 본원에서 언급된 "기능적 동등성"은 상기 논의된 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 변이체를 지칭하며, 이는 각각의 파트너와 모 분자(즉, 서열 상동성을 나타내는 분자)에 대비하여 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성이 일부 감소된 효능(예를 들어, 더 낮은 발현 수율, 더 낮은 반응 속도, 또는 제한된 범위의 반응 조건(예를 들어, 10-30℃ 등의 더 좁은 온도 범위)에서의 활성을 나타낼 수 있지만, 효율적이거나 더 효율적인 것이 바람직하다.
서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 펩타이드 태그는 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성과 유사한(즉, 비슷한) 활성, 즉 펩타이드 태그의 실제 적용이 크게 영향을 미치지 않는, 예를 들어 실험 오류의 한계 이내일 정도의 유사한 활성을 가질 수 있다. 따라서, 동등한 펩타이드 태그 활성은 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 펩타이드 태그가 폴리펩타이드(예를 들어 서열번호 2, 7 또는 101에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩타이드 태그 결합 파트너)와 동일한 조건하에서 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 펩타이드 태그와 유사한 반응 속도(즉, 하기 논의된 속도 상수 및/또는 수율로 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있음)를 의미한다.
유사하게, 서열번호 2 또는 101(바람직하게는 서열번호 : 2)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서열번호 2 또는 101(바람직하게는 서열번호 2)에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 활성과 유사한(즉, 비슷한) 활성을 가질 수 있고, 즉 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 실제 적용이 예를 들어 실험 오류의 한계 내에서 크게 영향을 미치지 않도록 한다. 따라서, 동등한 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 활성은 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 펩타이드 태그(예를 들어, 서열번호 3-6 중 하나에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성됨)와 동일한 조건 하에서 서열번호 2 또는 101(바람직하게는 서열번호 2)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 유사한 반응 속도(즉, 이하에 논의되는 바와 같은 속도 상수) 및/또는 수율로 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다는 것을 의미한다.
동일한 반응 조건, 예를 들어 상기 예시된 온도, 기질(즉, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 서열) 및 이들의 농도, 완충액, 염 등 하에서 측정된 상이한 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(예를 들어, 각각 서열번호 5 대 돌연변이체 또는 서열번호 2 대 돌연변이체)의 활성은 쉽게 비교되어 각각의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드에 대한 활성이 더 높거나 낮거나 동등한 지 여부를 확인할 수 있다.
특히, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 변이체는 각각 서열번호 3-5 또는 서열번호 2 또는 101에 제시된 서열을 갖는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드와 동등한 속도 상수를 갖는다. 속도 상수는 반응물 농도의 곱(즉, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드의 농도의 곱)에 주어진 온도에서의 반응 속도(이소펩타이드 결합의 형성)를 관련짓는 비례 계수를 지칭한다.
따라서, 변이체(예를 들어, 돌연변이체) 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수는 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수의 60% 이상, 예를 들어 70, 75, 80, 85 또는 90% 이상, 예를 들어 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%일 수 있다. 대안적으로 보면, 돌연변이체 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수는 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수보다 40% 이하로 낮을 수 있고, 예컨대 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수보다 35, 30, 25 또는 20% 이하로 낮을 수 있으며, 예컨대 서열번호 3-5 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그의 활성, 예컨대 속도 상수보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하로 낮을 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 변이체(예컨대, 돌연변이체) 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 활성, 예컨대 속도 상수는 서열번호 2 또는 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩타이드의 적어도 60%, 예컨대 적어도 70, 75, 80, 85 또는 90%일 수 있고, 예컨대 서열번호 2 또는 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드의 활성, 예컨대 속도 상수의 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%일 수 있다. 대안적으로 보면, 돌연변이체 폴리펩타이드의 활성은 서열번호 2 또는 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩타이드의 활성, 예컨대 속도 상수보다 40% 이하로 낮을 수 있고, 예컨대 서열번호 2 또는 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩타이드의 활성, 예컨대 속도 상수보다 35, 30, 25 또는 20% 이하로 낮을 수 있으며, 예컨대 서열번호 2 또는 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩타이드의 활성, 예컨대 속도 상수보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하로 낮을 수 있다.
특히, 본 발명의 펩타이드 태그와 폴리펩타이드의 반응 속도 상수는 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드가 단리된 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드보다 느리게 확산하는 큰 분자 또는 성분(예를 들어, 단백질)로 융합되는 경우에는 실시예에 기재된 값보다 낮을 수 있다. 또한, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드가 융합되는 분자 또는 성분이 반응에 입체 장애를 유발하는 경우 상기 속도 상수는 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 변이체의 반응 속도 상수를 측정할 때, 이 측정은 단리된 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드, 즉 다른 분자 또는 성분에 융합되거나 접합되지 않은 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
큰 분자 또는 성분에 대한 융합 및/또는 입체 장애가 또한 다른 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드, 예컨대 SpyTag 및 SpyCatcher의 속도 상수에 영향을 미칠 것임은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드의 속도 상수의 향상은 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드가 저농도로 사용될 때는 물론 고농도(예를 들어, 큰 분자 또는 성분에 융합될 때)로 사용될 때에도 여전히 유리할 수 있다.
반응 속도 및 속도 상수는 당업계에 공지되고 실시예에 기재된 임의의 적당한 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 반응 속도는 SDS에서의 비등처리 또는 모든 비공유 상호작용을 방해할 수 있는 다른 강한 변성 처리 후 SDS-PAGE 상에서 반응 생성물의 이동성을 평가하거나 또는 질량 분광분석법으로 모니터할 수 있다.
따라서, 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 서열번호 2의 위치 34와 동등한 위치에 리신 잔기 및 서열번호 2의 위치 80과 동등한 위치에 글루탐산 잔기 및 상기 정의된 바와 같은 서열번호 2의 위치 5, 16, 40, 65, 92, 100, 108, 116 및 선택적으로 12 및 22와 동등한 위치에 적어도 하나(바람직하게는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 다른 아미노산 잔기(들)를 포함하고 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하는 한, 즉 서열번호 3 내지 6 중 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예컨대 속도 상수, 온도 및/또는 완충액 범위를 갖는 한, 서열번호 2에 임의의 변형 또는 변형의 조합이 이루어져 본 발명의 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 생성할 수 있다.
대안적으로 보면, 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 서열번호 101의 위치 10과 동등한 위치에 리신 잔기 및 서열번호 101의 위치 56과 동등한 위치에 글루탐산 잔기 및 상기 정의된 바와 같은 서열번호 101의 위치 16, 41, 68 및 76과 동등한 위치에 적어도 하나(바람직하게는, 2, 3 또는 4)의 다른 아미노산 잔기(들)를 포함하고 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하는 한, 즉 서열번호 3 내지 6 중 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 펩타이드 태그와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예컨대 속도 상수, 온도 및/또는 완충액 범위를 갖는 한, 서열번호 101에 임의의 변형 또는 변형의 조합(바람직하게는, 치환)이 이루어져 본 발명의 변이체 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 생성할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그에서 동등한 위치는 바람직하게는 서열번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 참조하여 결정한다. 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에서 동등 위치는 서열번호 2 또는 101의 아미노산 서열을 참조하여 결정한다. 상동성 또는 상응하는 위치는 상동체(돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 펩타이드 태그의 서열과 서열번호 1 또는 5의 서열을, 또는 상동체(돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 서열과 서열번호 2 또는 101의 서열을 서열 간에 상동성 또는 동일성에 기초하여, 예컨대 BLAST 알고리즘을 사용하여 정렬시킴으로써 쉽게 추론할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "태그" 및 "펩타이드 태그"는 일반적으로 펩타이드 또는 올리고펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩타이드 태그 결합 파트너", "결합 파트너" 또는 "캐처"는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다.
이와 관련하여, 펩타이드 또는 올리고펩타이드가 의미하는 것 간에 크기 경계에 관한 기준 정의는 없다. 전형적으로, 펩타이드는 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있고, 올리고펩타이드는 21 내지 39개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드는 적어도 40개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본원에 정의된 펩타이드 태그는 12개 이상의 아미노산, 예를 들어 12-39 아미노산, 예를 들어 13-35, 14-34, 15-33, 16-31, 17-30개의 아미노산 길이를 포함하는 것으로 볼 수 있고, 예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다.
본원에 정의된 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너, 결합 파트너 또는 "캐처")는 80개 이상의 아미노산, 예를 들어 80-150 아미노산, 예를 들어 80-140, 80-130, 80-120개 아미노산 길이를 포함하는 것으로 볼 수 있고, 예를 들어 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 2-파트 링커(예를 들어, 태그 및 캐처 시스템 또는 쌍, 즉 동족 쌍)는 많은 유용성이 있으며, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 이소펩타이드 결합을 통해 두 분자 또는 성분을 접합(즉, 결합 또는 연결) 시에 특히 유용성이 있다. 예를 들어, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 관심 있는 분자 또는 성분에 개별적으로 접합 또는 융합된 후 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건 하에서 함께 접촉되어, 이소펩타이드 결합을 통해 분자 또는 성분을 결합(즉, 연결 또는 접합)시킬 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 이소펩타이드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키는, 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드(펩타이드 태그) 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 쌍의 사용을 제공하는 것으로 볼 수 있으며,
여기서, 이소펩타이드 결합을 통해 접합된 상기 분자 또는 성분은 다음을 포함한다:
a) 본 발명의 펩타이드(펩타이드 태그)를 포함하는(예를 들어, 접합 또는 융합되는) 제1 분자 또는 성분; 및
b) 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 포함하는(예를 들어, 접합 또는 융합되는) 제2 분자 또는 성분.
전술한 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 쌍(즉, 2-파트 링커)의 사용이 상기 기재된 바와 같이 상기 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 가능하게 하는(촉진하거나 용이하게 하는) 적합한 조건 하에서 상기 제1 분자 및 제2 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 것은 명백할 것이다.
대안적으로 보면, 본 발명은 다음을 포함하여 이소펩타이드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키는 방법을 제공한다:
a) 본 발명의 펩타이드(펩타이드 태그)를 포함하는(예를 들어, 접합 또는 융합되는) 제1 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
b) 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 포함하는(예를 들어, 접합 또는 융합되는) 제2 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
c) 상기 기재된 바와 같이 펩타이드와 폴리펩타이드 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 가능하게 하는(예를 들어, 촉진시키거나 용이하게 하는) 조건 하에서 상기 제1 및 제2 분자 또는 성분을 접촉시킴으로써, 상기 제1 분자 또는 성분을 상기 제2 분자 또는 성분에 이소펩타이드 결합을 통해 접합시켜 복합체를 형성하는 단계.
복합체를 형성하기 위해 2개 이상의 분자 또는 성분을 연결하는 것에 관한 본 발명의 문맥에서 용어 "접합" 또는 "연결"은 상기 분자 또는 성분, 예컨대 단백질을 공유 결합을 통해, 특히 상기 분자 또는 성분, 예컨대 단백질에 포함되거나, 또는 융합되는 폴리펩타이드와 펩타이드 태그 사이에 형성되는 이소펩타이드 결합을 통해 결합 또는 접합시키는 것을 의미한다(예컨대, 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 함께 접합되거나 연결되는 단백질의 도메인을 형성할 수 있다).
위에서 언급한 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 다른 분자 또는 다른 성분 또는 실체(entities)에 융합되거나 접합된다. 이러한 분자 또는 성분(즉, 실체)은 핵산 분자, 단백질, 펩타이드, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 착물, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 융합되거나 접합된 성분 또는 실체는 하기에 정의된 바와 같은 고체 지지체, 즉 고체 기질 또는 고체상이다.
따라서, 대안적으로 보면, 본 발명은 핵산 분자, 단백질, 펩타이드, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 착물, 다당류, 나노 입자, 나노 튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자 또는 이의 임의의 조합 또는 고체 지지체가 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 융합 또는 접합된 것을 제공한다.
세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포이다.
일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 분자, 예를 들어 항생제, 항 바이러스제, 백신, 항종양제, 예를 들어 방사성 화합물 또는 동위원소, 사이토카인, 독소, 유전자를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 및 핵산, 또는 핵산 백신에 접합 또는 융합될 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 표지(label), 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 발광 표지, 발색단 표지 및 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 검출 가능한 기질을 생성하는 물질 및 효소에 접합 또는 융합될 수 있다. 이 검출은 웨스턴 블롯팅/면역블롯팅, 조직 화학, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 유세포 분석(FACS) 형식을 포함하여 항체가 통상적으로 사용되는 수많은 분석에 적용될 수 있다. 또한, 자기 공명 영상술을 위한 표지, 양전자 방출 단층촬영 프로브 및 중성자 포획 요법을 위한 붕소 10도 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 접합될 수 있다. 특히, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 다른 펩타이드, 예를 들어 His6 태그와 융합되거나, 함께 생산될 수 있고/있거나 예를 들어 말토오스 결합 단백질(Maltose Binding Protein)에 융합하여 재조합 단백질의 발현을 향상시키기 목적으로 다른 단백질에 융합되거나 또는 함께 생산될 수 있다.
특히 유용한 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 다른 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합되거나 접합된다. 예를 들어, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 하기 논의된 바와 같은 재조합 기술에 의해 다른 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드의 파트로서, 즉 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리펩타이드로서 생산될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드에 융합될 수 있음은 명백할 것이다. 단백질은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 생물학적 샘플 및 임상 샘플, 예를 들어, 유기체(진핵 생물, 원핵 생물)의 임의의 세포 또는 조직 샘플, 또는 이로부터 유래된 임의의 체액 또는 제조물, 및 세포 배양물, 세포 제조물, 세포 용해물 등과 같은 샘플로부터 시험관내 해독되거나 정제될 수 있다. 단백질은 환경 샘플로부터 유래되거나 수득, 예컨대 정제될 수 있고, 예컨대 토양 및 물 샘플 또는 식품 샘플도 포함된다. 샘플은 새로 제조될 수 있거나 또는 예컨대 저장을 위해, 임의의 편리한 방식으로 전처리될 수 있다.
상기한 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드에 융합된 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 단백질은 재조합으로 생산될 수 있으며, 따라서 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 모든 원핵 또는 진핵 세포, 바이러스, 박테리오파지, 마이코 플라스마, 원형질체 및 소기관을 포함한 임의의 바이러스 또는 세포 물질로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 따라서, 이러한 생물학적 물질은 모든 종류의 포유동물 및 비포유동물 세포, 식물 세포, 남조류를 포함한 조류, 진균, 박테리아, 원생 동물, 바이러스 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질은 합성 단백질일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 펩타이드 및 폴리펩타이드(단백질)는 고체상 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
재조합 또는 합성 단백질 내에서 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 위치는 특별히 중요하지 않다. 따라서, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드 내에 내부적으로 위치할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 내부 도메인으로 간주될 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 구체예에서, 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 도메인으로 간주될 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 결합 또는 접합되는 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 사이에는 하나 이상의 스페이서, 예를 들어 펩타이드 스페이서를 포함하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 서로 직접 연결될 수 있거나 하나 이상의 스페이서 서열에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 스페이서 서열은 재조합 또는 합성 폴리펩타이드의 2 이상의 개별 부분을 이격 또는 분리시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 스페이서는 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 일부 구체예에서, 스페이서는 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 양쪽에 있을 수 있다.
스페이서 서열의 정확한 성질은 중요하지 않고 가변 길이 및/또는 서열일 수 있으며, 예를 들어 1-40, 보다 특히 2-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 잔기, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 잔기를 가질 수 있다. 대표적인 예로서, 스페이서 서열은 존재하는 경우 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 잔기 등을 가질 수 있다. 잔기의 성질은 중요하지 않으며, 예를 들어 임의의 아미노산, 예를 들어 중성 아미노산, 또는 지방족 아미노산, 또는 대안적으로 이들은 소수성이거나, 극성이거나 하전형 또는 구조 형성성, 예컨대 프롤린일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 링커는 세린 및/또는 글리신이 풍부한 서열이다.
따라서, 예시적인 스페이서 서열은 임의의 단일 아미노산 잔기, 예를 들어 S, G, L, V, P, R, H, M, A 또는 E 또는 이러한 하나 이상의 잔기로 구성된 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사-펩타이드를 포함한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드, 즉 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 융합된 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드(예컨대, 이종 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드, 즉 본 발명의 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드와 정상적으로 관련이 없는, 즉 다른 유기체 기원의 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 제공한다. 재조합 또는 합성 폴리펩타이드는 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 스페이서를 포함한다.
본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩타이드는 또한 이의 정제를 용이하게 하기 위한 정제 모이어티 또는 태그를 포함할 수 있다(예를 들어, 이하에 논하는 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 전에). 임의의 적합한 정제 모이어티 또는 태그가 폴리펩타이드에 혼입될 수 있고 이러한 모이어티는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 재조합 또는 합성 폴리펩타이드는 펩타이드 정제 태그 또는 모이어티, 예를 들어 His-태그 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정제 모이어티 또는 태그는 폴리펩타이드 내 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 정제 모이어티는 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 N- 또는 C-말단쪽(즉, N- 또는 C-말단의 5, 10, 15, 20개 아미노산 이내에)에 위치한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 이점은 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드에 포함된 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)(예를 들어 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩타이드)가 완전히 유전자 암호화될 수 있다는 사실에서 기인한다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩타이드 태그, 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 또는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 정의된 펩타이드 태그를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 11-13 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 11-13 중 어느 하나에 기재된 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 정의된 결합 파트너를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 14에 제시된 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 비교되는 서열과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상 동일하다.
핵산 서열 동일성은 예를 들어 GCG 패키지를 사용하는 FASTA Search에 의해 기본 값 및 가변 pamfactor, 12.0으로 설정된 갭 생성 페널티, 4.0으로 설정된 갭 확장 페널티, 6개 뉴클레오티드의 윈도우 하에 측정할 수 있다. 바람직하게는 상기 비교는 전체 길이의 서열에 걸쳐 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우, 예를 들어 600, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50개 미만의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 이루어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드뿐만 아니라 Watson-Crick형 또는 유사한 염기쌍 상호작용에 참여할 수 있는 합성 잔기, 예를 들어 합성 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다.
상기 기재된 핵산 분자는 발현 제어 서열, 또는 이러한 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 DNA 클로닝 매개체 또는 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이로써 유전자 산물로서 본 발명의 펩타이드 및 폴리펩타이드의 세포 발현을 가능해지며, 이의 발현은 관심 세포 내로 도입된 유전자(들)에 의해 지시된다. 유전자 발현은 관심 세포에서 활성인 프로모터(promoter)로부터 유도되고 게놈에 포함시키거나 독립적인 복제 또는 일시적 형질감염/발현을 위해 선형 또는 원형 핵산(예를 들어, DNA) 벡터 중 임의의 형태에 삽입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어 있다. 대안적으로, 노출된 핵산(예를 들어, 하나 이상의 합성 잔기, 예를 들어 염기 유사체를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA) 분자가 본 발명의 펩타이드 및 폴리펩타이드의 생성을 위해 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 시험관내 전사에 의해 mRNA로 변환될 수 있고 관련 단백질은 시험관내 해독에 의해 생성될 수 있다.
적절한 발현 벡터는 적절한 제어 서열, 예를 들어 해독(예컨대, 시작 및 정지 코돈, 리보솜 결합 부위) 및 전사 제어 우레아(예컨대, 프로모터-오퍼레이터(operator) 영역, 종결 정지 서열)를 본 발명의 핵산 분자와 정합성 리딩 프레임으로 연결하여 포함한다. 적절한 벡터는 플라스미드 및 바이러스(박테리오파지 및 진핵 바이러스 모두 포함)를 포함할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 및 또한 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 및 백시니아/폭스 바이러스를 포함한다. 많은 다른 바이러스 벡터가 당업계에 기술되어 있다. 적합한 벡터의 예는 박테리아 및 포유동물 발현 벡터 pGEX-KG, pEF-neo 및 pEF-HA를 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩타이드는 추가 서열(예를 들어, 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 펩타이드/폴리펩타이드 태그)을 포함할 수 있고, 따라서 핵산 분자는 편리하게는 추가 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 예를 들어, His-태그, 말토오스-결합 단백질을 암호화하는 DNA와 융합되어 발현 시에 융합 단백질을 생성한다.
따라서, 추가 측면에서 볼 때, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 벡터 핵산에 삽입하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 포함한다.
바람직하게는 벡터에 함유된, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어 있다. 다수의 기술이 공지되어 있고, 상기 벡터를 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 숙주 세포는 곤충 세포주, 효모, 포유동물 세포주 또는 대장균, 예컨대 균주 BL21/DE3을 포함한다. 본 발명은 또한 핵산 분자, 특히 상기 정의된 벡터를 함유하는 형질전환된 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포에까지 확대된다.
따라서, 다른 측면으로, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 및/또는 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.
"재조합"은 핵산 분자 및/또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되었음을 의미한다. 숙주 세포는 당연히 핵산 분자의 내인성 카피를 함유하거나 함유하지 않을 수 있지만, 핵산 분자 및/또는 벡터의 외인성 또는 추가 내인성 카피가 도입되었다는 점에서 재조합체이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를, 상기 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 암호화하는 상기 핵산 분자가 발현되는 조건하에 배양하고, 이와 같이 생산된 상기 분자(펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너))를 회수하는 것을 포함하여, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 제조하는 방법을 제공한다. 발현된 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너), 또는 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 위한 상기 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 예를 들어, 아미노산 또는 작은 합성적으로 생성된 펩타이드의 결찰에 의해, 또는 더 편리하게는 상기 기재된 바와 같은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 본원에서 용어 "단백질"과 상호교환적으로 사용된다. 상기 언급된 바와 같이, 용어 폴리펩타이드 또는 단백질은 전형적으로 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 아미노산, 예컨대 40-1000, 50-900, 60-800, 70-700, 80-600, 90-500, 100-400 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 핵산 분자일 수 있다.
따라서, 대안적으로 보면, 본 발명의 펩타이드 태그, 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 바람직하게는 비 천연, 즉 비 천연 발생의 분자이다.
표준 아미노산 명명법이 본원에 사용된다. 따라서, 아미노산 잔기의 전체 명칭은 1 문자 코드 또는 3 문자 약어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 리신은 K 또는 Lys로 치환될 수 있고, 이소류신은 I 또는 Ile로 치환될 수 있으며, 기타 등등이다. 더욱이, 용어 아스파테이트와 아스파르트산, 및 글루타메이트와 글루탐산은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 각각 Asp 또는 D, 또는 Glu 또는 E로 교체될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 및 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 재조합적으로 생산될 수 있고 이것이 본 발명의 바람직한 구체예인 것으로 예상되지만, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)가 다른 수단에 의해 상기 정의된 바와 같은 단백질 또는 다른 실체, 예컨대 분자 또는 성분에 접합될 수 있음은 분명할 것이다. 환언하면, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 및 다른 분자, 성분 또는 실체, 예컨대 단백질은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 재조합적으로 별도로 생산되고, 이어서 접합되어(결합되어) 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있는 펩타이드 태그-다른 성분 접합체 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)-다른 성분 접합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 상기 기재된 바와 같이 합성적으로 생산되거나 재조합적으로 생산될 수 있고, 다른 성분, 예컨대 단백질에 비-펩타이드 링커 또는 스페이서, 예컨대 화학적 링커 또는 스페이서를 통해 접합될 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 및 다른 성분, 예컨대 단백질은 결합을 통해 직접 또는 연결 기를 통해 간접으로 함께 결합될 수 있다. 연결 기가 이용되는 경우, 이러한 기는 이 연결 기를 통해 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 다른 실체, 예컨대 단백질이 공유 부착하게 하는 것으로 선택할 수 있다. 당해의 연결 기는 다른 실체, 예컨대 단백질의 본질에 따라 매우 달라질 수 있다. 연결 기는 존재하는 경우, 많은 구체예들에서 생물학적으로 불활성이다.
많은 연결 기는 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명에 사용된다. 대표적인 구체예에서, 연결 기는 일반적으로 약 50 달톤(dalton) 이상, 보통 약 100 달톤 이상이고, 연결 기가 스페이서를 포함하는 경우 1000 달톤 이상, 예를 들어 최대 1000000 달톤일 수 있지만, 일반적으로 약 500 달톤을 초과하지 않을 것이고 보통 약 300 달톤을 초과하지 않을 것이다. 일반적으로, 이러한 링커는 어느 한쪽 말단이 펩타이드 태그 또는 결합 파트너 및 다른 분자 또는 성분, 예컨대 단백질과 공유 결합할 수 있는 반응성 작용기로 종결된 스페이서 기를 포함할 것이다.
당해의 스페이서 기는 지방족 및 불포화 탄화수소 쇄, 산소(폴리에틸렌글리콜과 같은 에테르) 또는 질소(폴리아민)과 같은 헤테로 원자를 함유하는 스페이서, 펩타이드, 탄수화물, 가능하게는 이종원자를 함유할 수 있는 환형 또는 비환형 시스템을 포함할 수 있다. 스페이서 기는 또한 금속 이온의 존재가 둘 이상의 리간드를 배위하여 착물을 형성하도록 금속에 결합하는 리간드로 구성될 수도 있다. 특정 스페이서 우레아는 1,4-디아미노 헥산, 자일릴렌디아민, 테레프탈산, 3,6-디옥사옥탄디산, 에틸렌디아민-N,N-디아세트산, 1,1'-에틸렌비스(5-옥소-3-피롤리딘카르복실산), 4,4'-에틸렌디피페리딘, 올리고에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다. 잠재적 반응성 작용기는 친핵성 작용기(아민, 알코올, 티올, 하이드라지드), 친전자성 작용기(알데하이드, 에스테르, 비닐 케톤, 에폭사이드, 이소시아네이트, 말레이미드), 고리첨가 반응을 할 수 있거나, 이황화 결합을 형성할 수 있거나 또는 금속에 결합할 수 있는 작용기를 포함한다. 구체적인 예는 1차 및 2차 아민, 하이드록삼산, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, N-하이드록시숙신이미딜 카보네이트, 옥시카르보닐이미다졸, 니트로페닐에스테르, 트리플루오로에틸 에스테르, 글리시딜 에테르, 비닐술폰 및 말레이미드를 포함한다. 본 발명의 차단 시약에 사용될 수 있는 특정 링커 기는 이종작용기성 화합물, 예컨대 아지도벤조일하이드라지드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜디티오]프로피온아미드, 비스-설 포석신이미딜수버레이트, 디메틸아디피미데이트, 디숙신이미딜타르트레이트, N-말레이미도부티릴옥시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-숙신이미딜[4-아지도페닐]-1,3'-디티오프로피오네이트, N-숙신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트, 글루타르알데히드 및 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카르복실레이트, 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(SPDP), 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(SMCC) 등을 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 알킨과 반응하는 아지드로 형성되거나 트랜스-사이클로옥텐 또는 노르보르넨과 반응하는 테트라진으로 형성될 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 그 중의 하나 이상의 잔기를 변형시켜 이 분자들의 접합을 용이하게 하고(하거나) 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 안정성을 향상시키는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너), 또는 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 비천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너), 또는 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 하나 이상, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 비-통상적 아미노산, 예컨대 10, 15, 20개 이상의 비-통상적 아미노산, 즉 본원에서 "비-암호화된 아미노산"이라 지칭되는, 표준 유전자 코드에 의해 암호화되지 않는 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 표 1 참조)을 포함할 수 있다. 이들은 오르니틴 또는 타우린과 같은 대사 과정을 통해 형성되는 아미노산 및/또는 9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐(Fmoc), (tert)-부틸옥시카르보닐(Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 보호된 아미노산, 또는 벤질옥시-카르보닐(Z) 기를 가진 아미노산과 같은 인공적으로 변형된 아미노산에서 선택될 수 있다.
본 발명의 및 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에 사용될 수 있는 비표준 또는 구조 유사체 아미노산의 예는 D 아미노산, 아미드 이소스테레(예를 들어, N-메틸 아미드, 레트로-인버스 아미드, 티오아미드, 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌, 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-α메틸아미노산, D-N-메틸 아미노산이다. 비-통상적, 즉 비-암호화된 아미노산의 예는 표 1에 나열된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 고체 기질(즉, 고체상 또는 고체 지지체)에 융합 또는 접합시키는 것이 유용할 수 있으며, 이것이 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있음은 명백할 것이다. 따라서, 고정화 방식 또는 수단 및 고체 지지체는 선택에 따라 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌에 기재된 임의의 수의 고정화 수단 및 고체 지지체로부터 선택될 수 있다. 따라서, 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는, 예를 들어 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 도메인 또는 모이어티를 통해 지지체에 직접 결합될 수 있다(예를 들어 화학적 가교). 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 링커 기 또는 중간 결합기(들)에 의해(예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해) 간접적으로 결합될 수 있다. 따라서, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 고체 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. 연결은 가역적(예를 들어, 절단 가능) 또는 비가역적 연결일 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 연결은 효소적으로, 화학적으로, 또는 예를 들어 빛에 의해 절단될 수 있고, 예컨대 연결은 감광성 연결일 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)에는 지지체 상에 제공된 고정화 수단(예를 들어, 결합 파트너, 즉 동족 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 항체에 결합할 수 있는 친화성 결합 파트너, 예를 들어 바이오틴 또는 합텐)이 구비될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 고체 지지체 사이의 상호작용은 세척 단계를 허용하기에 충분하게 견고해야 하며, 즉 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)와 고체 지지체 사이의 상호작용은 세척 단계에 의해 붕괴(유의적으로 붕괴)되지 않는다. 예를 들어, 각각의 세척 단계에서, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)의 5% 미만, 바람직하게는 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1% 미만이 고체상으로부터 제거되거나 용리되는 것이 바람직하다.
고체 지지체(상 또는 기질)는 고정화, 분리 등을 위해 현재 널리 사용되거나 제안된 잘 알려진 임의의 지지체 또는 매트릭스일 수 있다. 이들은 입자(예를 들어, 자성, 상자성, 또는 비자성일 수 있는 비드), 시트, 겔, 필터, 막, 섬유, 모세관, 슬라이드, 어레이 또는 마이크로타이터 스트립, 튜브, 플레이트 또는 웰 등의 형태를 취할 수 있다.
지지체는 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합체 물질로 제조될 수 있다. 융합 단백질의 결합을 위해 높은 표면적을 나타내는 물질이 적합하다. 이러한 지지체는 불규칙한 표면을 가질 수 있고 예를 들어 다공성 또는 미립자, 예컨대 입자, 섬유, 웹, 소결물 또는 체(sieve)일 수 있다. 미립자 물질, 예컨대 비드는 이들의 큰 결합 능력으로 인해 유용하고, 특히 중합체 비드가 유용하다.
편리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 미립자 고체 지지체는 구형 비드를 포함할 것이다. 비드의 크기는 중요하지 않지만, 예를 들어 직경이 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2 ㎛ 정도일 수 있고, 최대 직경은 바람직하게는 10 ㎛ 이하, 예를 들어 6 ㎛ 이하인 것이다.
단분산 입자, 즉 크기가 실질적으로 균일한 입자(예를 들어, 직경 표준 편차가 5% 미만인 크기)는 반응의 매우 균일한 재현성을 제공한다는 이점을 갖는다. 대표적인 단분산 중합체 입자는 US-A-4336173에 기재된 기술에 의해 제조될 수 있다.
그러나, 조작 및 분리를 돕기 위해, 자성 비드가 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "자성"은 지지체가 자기장에 배치될 때 지지체에 부여된 자기 모멘트를 가질 수 있고, 따라서 자기장의 작용에 의해 변위될 수 있음을 의미한다. 다시 말해, 자성 입자를 포함하는 지지체는 자성 응집에 의해 쉽게 제거될 수 있으며, 이는 이소펩타이드 결합 형성 단계 후에 입자를 빠르고 간단하고 효율적으로 분리하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 고체 지지체는 아밀로오스 수지이다.
추가 구체예에서, 본 발명은 키트, 특히 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기위한, 즉 이소펩타이드 결합을 통해 2 개의 분자 또는 성분을 접합시키기위한 키트를 제공하며, 여기서 복합체 내의 2 개의 분자 또는 성분은 이소펩타이드 결합을 통해 접합되고, 상기 키트는
(a) 단백질과 같은 분자 또는 성분에 선택적으로 접합 또는 융합된 상기 정의된 바와 같은 펩타이드(펩타이드 태그); 및
(b) 단백질과 같은 분자 또는 성분에 선택적으로 접합되거나 융합된 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너), 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩타이드와 같은 단백질; 및/또는
(c) (a)에 정의된 바와 같은 펩타이드(펩타이드 태그)를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및
(d) (b)에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터를 포함한다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 광범위한 유용성이 있음은 명백할 것이다. 대안적으로 보면, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 다양한 산업에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 형광 또는 다른 생체물리학적 프로브 또는 표지를 특정 단백질에 대해 표적화하는데 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 당해의 단백질은 상기 논의된 바와 같이 본 발명의 펩타이드 태그(예를 들어, 서열번호 3-5 중 하나)를 포함하도록 변형될 수 있고, 형광 또는 다른 생체물리학적 프로브 또는 표지는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너, 예를 들어 서열 2)에 융합되거나 접합될 수 있다. 변형된 단백질 및 프로브 또는 표지는 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 단백질은 이소펩타이드 결합을 통해 표지 또는 프로브로 표지될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 프로테오믹스(proteomics)에서 단백질 고정화에 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 당해의 단백질은 본 발명의 펩타이드 태그(예를 들어, 서열번호 3-5 중 하나)를 포함하도록 변형될 수 있고, 고체 기질은 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너, 예를 들어 서열번호 2)에 융합되거나 접합될 수 있다. 변형된 단백질 및 고체 기질은 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 이소펩타이드 결합을 통해 고체 기질 상에 단백질을 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 다수의 단백질을 고상/기질 상에 동시에 고정시키는데 사용될 수 있음은 명백할 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 백신 접종을 위해 바이러스-유사 입자, 바이러스, 박테리아 또는 다량체화 스캐폴드에 항원을 접합시키는 데 유용성이 있을 수 있다. 예를 들어, 표면에 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)(서열번호 2)를 표시하는(display) 바이러스-유사 입자, 바이러스 또는 박테리아의 생성은 이소펩타이드 결합을 통해 그 표면에 본 발명의 펩타이드 태그(서열번호 3-5)를 포함하는 항원의 접합을 용이하게 할 것이다. 이와 관련하여, 항원 다량체화는 면역 반응을 크게 향상시킨다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드에 융합된 분자 또는 성분은 바이러스 캡시드 단백질이고/이거나 본 발명의 펩타이드 태그에 융합된 분자 또는 성분은 항원, 예를 들어 감염과 같은 특정 질병과 관련된 항원이다.
다른 구체예에서, 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 예를 들어 펩타이드 태그 및 결합 파트너를 효소의 각 말단에 융합시키고, 이어서 펩타이드 태그와 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성시킴으로써 효소를 고리화하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 효소의 고리화는 효소 유연성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
특히, 효소 또는 효소 중합체(융합 단백질)의 고리화는 효소 중합체에서 단백질 또는 단백질 단위의 열안정성을 향상시킬 수 있다. 이와 관련하여, 효소는 많은 공정에서 유용한 도구이지만 불안정하고 회수하기가 어렵다. 효소 중합체는 온도, pH 및 유기 용매에 대해 더 큰 안정성을 지녀, 산업 공정에서 효소 중합체를 사용하려는 요구가 증가하고 있다. 그러나, 효소 중합체 생성은 일반적으로 글루 타르알데히드 비특이적 반응을 사용하며, 이는 잠재적으로 유용한 많은 효소를 손상시키거나 변성(즉, 활성 감소)시킬 것이다. 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)를 이용하여 이소펩타이드 결합을 통한 단백질의 사슬(중합체)로의 부위-특이적 결합은 동물 사료에 첨가된 효소 또는 진단학에서와 같이 효소 유연성을 향상시킬 것으로 예상된다. 특히 바람직한 구체예에서, 효소는 상기 논의된 바와 같이 고리화에 의해 안정화될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 WO 2016/193746에 기술된 바와 같이, 대사 효율을 증진시키기 위한 경로에 다수의 효소를 연결하는 데에도 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 효소는 종종 세포 내의 경로에서 함께 기능하고, 전통적으로 다수의 효소를 세포 외부(시험관 내)에서 함께 연결하는 것은 어려웠다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 융합 단백질을 생성하도록 효소를 커플링 또는 접합시켜 다단계 효소 경로의 활성을 향상시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 다양한 산업적 변환 및 진단학에 유용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 또한 항체 중합체의 생산에도 유용성이 있을 것이다. 이와 관련하여, 항체는 가장 중요한 의약품 부류 중 하나이며 종종 표면에 부착되어 사용된다. 그러나, 샘플에서의 항원 혼합 및 이에 따라 상기 샘플에서 상기 항원의 포획은 표면 부근이어서 비효율적이다. 항체 사슬을 연장시킴으로써 포획 효율이 향상될 것으로 예상된다. 이것은 혈행 종양 세포 분리에 특히 중요할 것이며, 이는 현재 조기 암 진단을 가능하게 하는 가장 유망한 방법 중 하나이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 세포 신호전달(signalling)을 활성화시키기 위한 약물의 생산에 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 세포 기능을 활성화시키는 가장 효과적인 많은 방법은 단백질 리간드를 통한 것이다. 그러나, 본질적으로 단백질 리간드는 일반적으로 단독으로 작동하지 않고 다른 신호전달 분자의 특정 조합에 의해 작동 할 것이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 세포 신호전달의 최적 활성화를 제공할 수 있는 맞춤형 융합 단백질(즉, 단백질 팀)의 생성을 가능하게 한다. 이들 융합 단백질(단백질 팀)은 세포 생존, 분열 또는 분화를 제어하는데 적용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너)는 진핵 세포, 예를 들어 뉴런, 줄기 세포의 성장을 위한 하이드로겔의 생성, 생체재료의 제조, 염료 또는 효소에 의한 항체 작용기화 및 고리화에 의한 효소 안정화에 유용성이 있을 수 있다.
본 발명은 이제 하기 도면을 참조하여 이하의 비제한적 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 M13 파지의 pIII에 표시된 SpyTag 변이체를 선택하기 위한 패닝(panning) 절차의 카툰을 도시한 것이다.
도 2는 (A) 야생형(WT) SpyCatcher 미끼로 선택한 후 회수된 SpyTag-파지의 양을 비반응성 SpyCatcher EQ와 비교하여 콜로니 형성 단위(cfu)로 정량하여 입증하는 막대 차트(평균 ± 1 sd, n = 3)이고; (B) N-말단 라이브러리(NLib1-3, 서열번호 15-17) 및 후속 C-말단 라이브러리(CLib1-10, 서열 18-27)의 최종 선택 라운드로부터 선택된 SpyTag 변이체 서열의 표이다. WT는 SpyTag의 서열(서열번호 6)을 나타내고, SpyTag002는 개선된 반응 속도를 가진 변이체, 서열번호 3을 나타낸다.
도 3은 SpyTag N-말단 라이브러리의 가장 반응성이 높은 변이체(NLib1-MBP)의 결실 변이체와 반응하는 SpyCatcher의 시간 경과 그래프를 도시한 것이다. PPVPT는 서열번호 15를 나타내고, PVPT는 서열번호 30을 나타내고, VPT는 서열번호 31을 나타내고, PT는 서열번호 32를 나타낸다. 데이터는 3반복으로 수행된 반응의 평균±1 s.d.을 나타낸다; 일부 오차 막대는 너무 작아 보이지 않는다.
도 4는 (A) 가속된 SpyCatcher 변이체에 대한 파지 디스플레이 선택 체계의 카툰을 도시한 것이다. 스트렙타비딘-비드로부터 TEV 프로테아제 용리 전에 M13 파지상의 SpyCatcher 돌연변이체를 비오티닐화된 AviTag-SpyTag-MBP 미끼에 대해 패닝한다; (B)는 cfu(평균 ± 1 s.d., n = 3)로 정량화된 WT SpyTag-MBP 또는 비반응성 SpyTag DA-MBP 대조군으로 선별한 후 회수된 SpyCatcher-파지의 양을 보여주는 막대 차트를 나타낸다.
도 5는 SpyCatcher 라이브러리 선택의 최종 라운드에서 선택된 변이체의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. * 변화 없음, : 매우 보전적 변화, . 보전적 변화, 및 갭은 먼 변화를 나타낸다. WT는 서열번호 7, L1C1은 서열번호 33, L1C4는 서열번호 34, L1C2는 서열번호 35, L2C1은 서열번호 36, L1C3은 서열번호 37, L1C6은 서열번호 38을 나타내고, L2C8은 서열번호 39를 나타내고, SC002는 서열번호 40을 나타낸다.
도 6은 파지-선택된 SpyCatcher 변이체의 반응 시간 경과 그래프를 보여준다. SpyTag-MBP는 PBS pH 7.5, 25℃에서 각 단백질을 1μM로 하여 SpyCatcher 및 선택된 변이체와 함께 배양하였다. 반응은 비등가열 후 쿠마시 염색과 SDS-PAGE에 의해 분석했다. 데이터는 반복 반응의 평균을 나타낸다. SpyCatcher는 서열번호 7, L1C1은 서열번호 33, L1C4는 서열번호 34, L1C2는 서열번호 35, L2C1은 서열번호 36, L1C3은 서열번호 37, L1C6은 서열번호 38을 나타내고, L2C8은 서열번호 39를 나타낸다.
도 7은 (A) L1C6 SpyCatcher 변이체의 자기 반응이 SpyCatcher002로 차단되었음을 나타내는 SDS-PAGE 겔을 보여준다. L1C6 및 SpyCatcher002는 단독으로 또는 SpyTag002-MBP와 반응 후에 SDS-PAGE하여 쿠마시 염색으로 분석했다. SpyTag002-MBP와 반응한 L1C6 이량체의 생성물뿐만 아니라, 공유 L1C6 이량체의 작은 분획이 표시된다. 반응 조건 : 10 μM(+) SpyCatcher 변이체, 13 μM(++) SpyTag002-MBP, PBS pH 7.5, 25 ℃에서 1 시간 동안; 및 (B) SpyTag의 아미노산 서열의 파트(서열번호 41)와 SpyCatcher L1C6의 N-말단(서열번호 42)의 정렬. L1C6 D5T의 N-말단(서열번호 43)은 자기 반응을 방지했다.
도 8은 SpyCatcher002와 중첩된 SpyCatcher의 시차 주사 열량측정을 나타내는 그래프를 도시한다. Tm 값이 삽입도로 표시된다.
도 9는 (A) SpyCatcher002와 SpyTag002 사이에 자발적 이소펩타이드 결합 형성의 특징을 나타내는 SDS-PAGE 겔을 보여준다. SpyCatcher002 및 SpyTag002-MBP는 pH 7.0의 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에서 10 μM로 1 시간 동안 혼합하고 비등가열 후 쿠마시 염색과 SDS-PAGE로 분석했다. 미반응성 대조 단백질, SpyCatcher002 EQ 및 SpyTag002 DA-MBP도 나타냈다; 및 (B) pH 7.0의 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에서 0.1 μM의 SpyCatcher002-sfGFP와 SpyTag002-MBP의 반응 또는 SpyCatcher-sfGFP와 SpyTag-MBP의 반응에 대한 시간 경과 그래프(3반복의 평균 ± 1 s.d.; 일부 오차 막대는 너무 작아 보이지 않음).
도 10은 pH 7.0의 숙신산-포스페이트-글리신 완충액에서 (A) 1 μM 및 (B) 10 μM인 SpyCatcher002-sfGFP와 SpyTag002-MBP의 반응 또는 SpyCatcher-sfGFP와 SpyTag-MBP의 반응에 대한 시간 경과 그래프를 보여준다(3반복의 평균 ± 1 s.d.; 일부 오차 막대는 너무 작아서 볼 수 없음)(B).
도 11은 3반복 측정(각 데이터 점이 표시됨)으로부터 SpyTag002-MBP와 반응하는 SpyCatcher002의 속도 상수를 정량화한 그래프이다. 각 단백질 0.5 μM을 pH 7.0, 25 ℃에서 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에 제조했다. 추세선에 대한 방정식과 상관 계수가 표시된다.
도 12는 종결하는 SpyCatcher002/SpyTag002의 반응 시험을 나타내는 SDS-PAGE 겔을 보여준다. Spy-Catcher002는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의한 분석 전에 25℃에서 1 시간 동안 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액 pH 7.0에서 SpyTag002-MBP와 함께 배양하였다. 단백질은 10 μM(+) 또는 20 μM(+++)이었다.
도 13은 (A) SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 분석된, 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에서 25℃에서 1분 또는 5분 동안 SpyCatcher002와 SpyTag002-MBP 반응의 pH 의존성을 도시한 그래프이다; (B) PBS pH 7.5에서(A)에서와 같은 반응의 온도-의존성을 나타내는 막대 차트이다; (C) PBS, PBS + 1 mM EDTA, 50 mM HEPES, 50 mM HEPES-완충 식염수(HBS) 또는 Tris 완충 식염수(TBS)를 사용한 25 ℃ 및 pH 7.5에서 (A)에서와 같은 반응의 완충액 의존성을 보여주는 막대 차트이다; (D) 계면활성제(PBS) 없이, 1% Triton X-100과 PBS, 또는 1% Tween-20과 PBS 하에 25℃, PBS pH 7.5에서 (A)에서와 같은 반응의 계면활성제 의존성을 보여주는 막대 차트이다; 및 (E) 25℃, pH 7.5 PBS에서 30분 또는 120분 동안의 SpyCatcher002와 SpyTag002-MBP 반응의 우레아 의존성을 보여주는 그래프이다. 모든 그래프는 3반복의 평균 ± 1 s.d.를 나타낸다; 일부 오차 막대는 너무 작아 볼 수 없다.
도 14는 (A) PBS pH 7.5, 25℃에서 각 단백질을 0.5 μM로 사용한 SpyTag002-MBP와 반응하는 MBPx-SpyCatcher 및 MBPx-SpyCatcher002의 시간 경과를 비등가열 후 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석하여 나타낸 그래프를 보여주며, 이는 단백질이 N-말단에 융합되었을 때 SpyCatcher보다 SpyCatcher002의 개선된 반응성이 유지되었음을 입증한다; (B) 각 단백질 2 μM에서 25℃, PBS pH 7.5 하에 1분 또는 5분 동안 SpyCatcher 또는 SpyCatcher002와 항온처리되고 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석된 AffiEGFR-SpyTag002의 반응성에 대한 막대 차트이다. 데이터는 3반복으로 수행된 반응의 평균 ± 1 s.d.를 나타낸다; 일부 오차 막대는 너무 작아 볼 수 없다. 이는 SpyTag002가 C-말단에 있을 때 SpyCatcher에 비해 SpyCatcher002의 향상된 반응성이 유지되었음을 보여준다.
도 15는 (A) 0.5 μM SpyTag002-MBP(서열번호 3-MBP) 또는 SpyTag002 T3H-MBP(서열번호 4-MBP); 및 (B) 0.5 μM SpyTag002-T3H-MBP(서열번호 4-MBP) 또는 SpyTag002 RG T3H-MBP(서열번호 5-MBP)와 반응하는 0.5 μM D5T SpyCatcher002(서열번호 40)에 대한 시간 경과를 나타내는 그래프를 보여준다. 반응은 25℃에서 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.5에서 수행하고 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석했고, 데이터는 3반복으로 수행된 반응의 평균 ± 1 s.d.로 나타냈다. 추세선에 대한 방정식 및 상관 계수가 제시된다. 추세선의 기울기로부터 반응의 2 차 속도 상수가 수득되며 단위는 μM-1 min-1이다.
도 16은 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.5, 25℃에서 0.5 μM AP-SpyTag002-MBP(서열번호 3-MBP)와 반응하는 0.5 μM D5A SpyCatcher002 변이체(서열번호 44-47)의 속도 분석을 나타내는 그래프를 보여준다. 모든 반응은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석했으며, 데이터는 3반복으로 수행된 반응의 평균 ± 1 s.d.를 나타낸다. 추세선에 대한 방정식 및 상관 계수가 표시된다. 추세선의 기울기로부터 반응의 2 차 속도 상수가 수득되며 단위는 μM-1 min-1이다.
실시예
실시예 1 - SpyTag(서열번호 6)의 파지 디스플레이 최적화
SpyTag/SpyCatcher는 펩타이드 상호작용에 대한 통상적이지 않은 시도이며, 합리적 설계로 예측할 수 없는 상호작용의 특징이 있다. 파지 라이브러리로부터의 선택은 수십 년 동안 확립되어 왔고 어려운 것은 항상 비가역적 상호작용에 대한 선별 과제보다는 약한 상호작용을 감지하는 것이다. 우리는 처음으로 이소펩타이드 결합 형성의 효율적인 선택을 해결할 모델 선택을 확립했다.
SpyTag-파지의 성공적인 패닝을 가능하게 하는 우리가 발견한 첫 번째 주요 특징은 SpyCatcher를 비드에 부착하는 대신 용액에서 SpyCatcher(서열번호 7) 미끼를 포획하는 것이었다. 용액-포획은 미끼 농도의 용이한 적정을 허용했고 비드에 파지의 비특이적 결합으로 인한 배경을 감소시켰다(도 1).
두번째 주요 특징은 비오틴과 SpyCatcher 사이에 TEV 프로테아제 부위를 통해 스트렙타비딘-비드로부터 파지를 특이적으로 용리하기 위해 프로테아제 절단을 사용하는 것이었다(도 1).
세번 째 주요 특징은 파지-펩타이드 변이체에 의해 거의 모든 비공유 상호작용을 해리하기에 충분히 가혹하지만 파지 감염성이 파괴될 정도로 가혹하지는 않은 조건을 확립하는 것이었다. 우리는 글리신-HCl pH 2.2로의 1 회 세척, 그 다음 0.5% (v/v) Tween-20으로의 4 회 세척을 사용하기로 결정했다.
모델 선택을 위해 우리는 pIII에서 SpyTag를 표시하는 M13 파지를 사용했다. 미끼는 AviTag를 통해 부위 특이적으로 비오틴화시켰고, SpyCatcher 또는 공유 결합 형성에 필수적인 글루탐산에 돌연변이를 갖는 음성 대조군 SpyCatcher EQ에 연결시켰다. 과량의 미끼를 제거하는 침전, 스트렙타비딘-비드 포획, 세척 및 TEV 용리 후, 회수된 파지를 파지에 포장된 DNA의 정량적 PCR(qPCR) 검출로 측정했다. 우리의 패닝 조건 최적화 후, 이 시험은 SpyCatcher EQ보다 wt SpyCatcher에 대해 4 자릿수의 농축을 나타냈다(도 2a).
종래 부위 지정 돌연변이유발은 SpyTag에서 중심 β 가닥 잔기의 주요 역할을 밝혀냈는 바, 우리는 SpyTag의 N-말단 및 C-말단 단부의 잔기를 무작위화한 2 개의 다른 라이브러리를 제조했다(도 2b). N-말단 무작위화 및 파지 패닝의 라운드를 통해, NLib1(PPVPTIVMVDAYKPTK, 서열번호 15)이 가장 빠른 반응을 제공했다. NLib1은 모 SpyTag보다 3개의 잔기가 더 길었기 때문에, 여분의 N-말단 잔기가 얼마나 중요한지를 시험했다. NLib1은 속도에 거의 영향을 미치지 않으면서 2 잔기가 N 말단에서 절단될 수 있었지만, 3번째 잔기의 절단은 반응을 크게 감소시켰다(도 3). 따라서 이후 N-말단에는 VPT-를 사용했고, C-말단은 이 선두부에 기초하여 무작위화했다. 파지 라이브러리 선별 라운드 후, 농축된 적중 CLib1-10이 확인된다(도 2b). 이들 변이체 중에서, CLib1은 SpyCatcher와의 반응에 가장 빨랐고 흥미롭게도 SpyTag에서 C-말단 YK 서열을 보존했다. 그러나, CLib1의 시스테인은 이량체화 가능성으로 인해 바람직하지 않았는 바, 이 잔기는 A로 복원시켰다(도 2b). 또한, 우리는 SpyTag의 말단 K(파지 라이브러리에 존재하지 않음)가 반응 속도를 증가시키는 것을 발견했다. 따라서, 이러한 파지 선택과 합리적인 디자인의 조합을 통해 우리는 최적화된 태그 SpyTag002(VPTIVMVDAYKRYK, 서열번호 3)에 도달했다(도 2B).
실시예 2 - SpyCatcher(서열번호 7)의 파지 디스플레이 최적화
SpyCatcher의 파지 디스플레이 선택은 파지의 표면에 분할 단백질의 표시가 추가 과제를 제공하지만, SpyTag 변이체의 선택과 유사하게 수행했다. 우리가 효율적인 선택을 위해 중요하다고 발견한 주요 특징은 파지에서 SpyCatcher와 pIII 사이의 TEV 프로테아제 절단 부위(자성 비드로부터 파지의 특정 용리를 허용함)와 공해독성 전위를 위한 DsbA 신호 서열의 사용이였고, 이는 pIII에서 SpyCatcher의표시를 향상시켰다. 미끼는 비오티닐화된 AviTag-SpyTag-MBP였고, SpyCatcher 변이체는 오류 발생이 쉬운(error-prone) PCR로 제조했다(도 4A). 우리는 먼저 바람직한 미끼(SpyTag) 또는 SpyCatcher에 비공유적으로 결합하지만 반응하지 않는 음성 대조군인 SpyTag DA를 사용하여 모델 선택을 최적화했다. 이 선택은 회수된 파지의 qPCR로 평가된 바와 같이, SpyTag DA 미끼에 비해 wt SpyTag 미끼의 포획을 약 1,000 배 향상시켰다(도 4B).
증가하는 엄중성 하에 패닝의 라운드 후 선택된 클론의 서열은 도 5에 나타냈다. 돌연변이는 그 구조 상에서 널리 분포되어 있어, 많은 돌연변이 잔기들이 SpyTag 결합 부위로부터 멀리 떨어져 있었다. 적중체(hit)는 대장균에서 가용성 단백질로 발현되었고 SpyTag-MBP와의 반응 속도에 대해 평가했다. 최대 반응성 서열은 L1C6이었다(도 6).
이 과정 동안, L1C6 SpyCatcher 변이체의 재조합 발현 후 SDS-PAGE에서 새로운 밴드가 확인되었다(도 7A). 이 밴드는 SpyTag002-MBP와 혼합할 때 완전히 이동했고 SpyCatcher보다 약 2배의 이동성을 갖기 때문에 우리는 이 밴드가 공유 SpyCatcher 이량체를 나타낸다고 확신했다. SpyCatcher 반응성을 향상시키면 이러한 의도하지 않은 자기 반응성의 형성을 촉진한다는 가설을 세웠다. SpyTag와 유사한 서열을 SpyCatcher에서 살펴본 결과, 우리는 SpyCatcher의 N-말단 GAMVDT(서열번호 42)가 SpyTag의 IVMVDA(서열번호 41)와 유사하다는 것을 발견했다(도 7B). 우리는 우리의 가속 변이체(SpyCatcher002, 도 5)에서 GAMVDT(서열번호 42)를 GAMVTT(서열번호 43)로 돌연변이시키는 것이 이러한 부반응을 없앤다는 것을 알게되어 기뻤다(도 7A).
SpyCatcher 폴딩에서 돌연변이의 영향을 조사하기 위해, 우리는 상기 작제물을 시차 주사 열량 측정법(DSC)으로 시험했다. DSC는 SpyCatcher(49.3℃)와 SpyCatcher002(49.9℃) 사이에 언폴딩 전이 점의 변화가 최소여서, 돌연변이유발이 열안정성을 손상시키지 않았음을 보여주었다(도 8).
실시예 3 - SpyTag002 및 SpyCatcher002 변이체 속도 검증
고려중인 SpyTag002와 SpyCatcher002를 사용하여 우리는 서로의 반응 거동을 신중하게 검증했다. 우리는 SpyTag002(DA) 또는 SpyCatcher002(EQ)에서 단일 돌연변이가 반응을 없애는 것을 보여줌으로써 추정 반응성 잔기의 주요 역할을 확인했다(도 9A).
SpyTag/SpyCatcher 반응은 고농도에서 효율적이다. 이 반응을 저농도에서 분석하기 위해, 우리는 폴리아크릴아미드 전기영동 후 공유 결합 형성을 형광 검출하기 위해 수퍼폴더 GFP(sfGFP)와 반응시켰다. 샘플을 비등가열하지 않는 경우 sfGFP는 심지어 SDS가 있더라도 폴딩되고 형광성을 유지할 수 있다. 이 분석은 모 형태에 비해 SpyTag002 및 SpyCatcher002에 의한 반응 속도가 크게 향상되었음을 보여주었다(도 9B). 예상한 바와 같이, 두 파트너의 농도가 1 μM 및 10 μM로 증가했을 때 차이는 현저하지 않았지만, 002 형태는 여전히 10 μM에서 더 빨랐다(도 10A 및 10B). 반응 속도는 2차 반응에 잘 맞았다(도 11). pH 7.0, 25℃에서 SpyTag002-MBP는 SpyCatcher002와 속도 상수 2.0 ± 0.2 x 104 M-1.s-1(SpyCatcher와 반응하는 SpyTag-MBP보다 12배 빠름)로 반응했다. SpyTag002 및 SpyCatcher002는 둘 다 모 형태와 효율적으로 반응하는 역행적 호환성(backwards-compatibility)을 나타냈다(표 2).
Figure pct00005
SpyTag 시스템은 반응성 기(아민 및 카르복실산)의 고유 반응성이 낮기 때문에 에스테르 또는 티오에스테르의 가수분해와 같은 부반응의 기회가 줄었다. 거의 정량적인 수율은 고상 폴리프로팀 합성 또는 균일성이 중요한 임상 개발과 같은 복수의 순차적 반응에 특히 중요하다. 2배 과량의 파트너 이용으로 1시간 후 >99% SpyCatcher002 및 >97% SpyTag002-MBP가 반응했다(도 12).
또한, SpyTag002와 SpyCatcher002 사이의 이소펩타이드 결합 형성은 반응시 H2O의 예상 손실을 나타내는 전기분무 이온화 질량 분광분석법에 의해 확인되었다.
실시예 4 - SpyTag002 및 SpyCatcher002 변이체 반응 조건의 검증
우리는 광범위한 조건에서 SpyTag002와 SpyCatcher002 반응의 복원력을 시험했다. 상기 속도 상수는 pH 7에서 계산되었지만, 반응성은 pH 4에서 유사했고 pH 5 및 6에서 약간 더 높았다(도 13A). 반응은 4, 25 및 37 ℃에서 빨랐다(도 13B). 반응은 완충액과 비교적 무관했고, 인산염, Tris 또는 HEPES 완충 시 효율적으로 반응했고, 특정 1가 또는 2가 음이온 또는 양이온에 대한 의존성이 비교적 거의 없었다(도 13C). SpyTag002와 SpyCatcher002의 반응은 계면활성제 Triton X-100 또는 Tween-20의 존재를 꽤 허용했고, 반응성을 약간 향상시켰다(도 13D). SpyTag002와 SpyCatcher002의 반응은 3M 우레아에서도 허용되었다(도 13E).
SpyCatcher002는 pIII에 N-말단 융합으로서 파지에 선택되었다. 우리는 SpyCatcher002가 또한 C-말단 융합으로도 잘 작동했음을 확인했고, 이는 S-Tag002-MBP와 MBPx-SpyCatcher002의 효율적인 반응을 보여준다(도 14A). 우리는 SpyTag002가 N-말단에 SpyTag002-MBP(도 12)로서 또는 C-말단에 AffiEGFR-SpyTag002(도 14B)로서 융합되었을 때 효율적으로 반응한다는 것을 확인했다.
실시예 5 - SpyTag002의 추가 최적화
SpyTag002-MBP 융합은 SpyCatcher002와 0.40 μM-1min-1의 반응 속도를 갖는다. 우리는 놀랍게도 반응 속도가 SpyTag002 펩타이드에 추가 변형을 도입함으로써 추가로 개선될 수 있다는 것을 확인했다.
SpyTag002(서열번호 3)의 위치 3에 있는 트레오닌 잔기의 히스티딘으로의 치환, 즉 SpyTag의 동등한 위치에 있는 잔기로의 복귀는 0.53-0.55 μM-1min-1의 반응 속도를 갖는 펩타이드(서열번호 4)를 초래했고, 즉 활성을 약 35% 증가시켰다(도 15A).
N-말단에 아르기닌 및 글리신 잔기를 포함하도록 개선된 펩타이드의 변형(서열번호 5)은 반응 속도를 1.21 μM-1min-1로 2배 넘게 증가시켰다(도 15B).
실시예 6 - SpyCatcher002의 추가 최적화
위치 5에 알라닌 잔기를 함유하는 SpyCatcher002의 변이체(SpyCatcher002D5A 서열번호 44)는 SpyTag002-MBP와 0.45 μM-1min-1의 반응 속도를 갖는다. 우리는 놀랍게도 반응 속도가 SpyCatcher002 폴리펩타이드에 추가 변형을 도입함으로써 추가로 개선될 수 있음을 확인했다.
SpyCatcher002 변이체(서열번호 44)의 위치 92에 있는 알라닌 잔기의 프롤린으로의 치환은 0.84 μM-1min-1의 반응 속도, 즉 활성의 약 85% 증가를 갖는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너, 서열번호 45)를 생산했다(도 16).
이론에 의해 국한시키려는 것은 아니지만, 폴리펩타이드 내 이 위치에 프롤린 잔기의 삽입은 폴리펩타이드 루프의 유연성을 감소시키는 것으로 추정된다. 이와 관련하여, 프롤린의 파이 각도는 고정되어 있는 반면, 다른 모든 잔기의 파이 각도는 실질적으로 변할 수 있다. 여기서 우리는 Ala가 프롤린에 의한 치환에 적합한 파이 각도를 가졌다는 것을 발견했고 프롤린의 증가된 측쇄 크기가 입체적으로 허용될 것으로 판단했다. SpyTag/SpyCatcher 상호작용의 결정학에 대한 우리의 연구를 바탕으로, 우리는 또한 SpyCatcher의 이 루프가 SpyTag의 근접성 때문에 상호작용에 특히 중요할 것으로 생각했다. 따라서, 우리는 이 돌연변이가 SpyCatcher 변이체 형태를 SpyTag 도킹에 사전지향적으로 만들 것이라고 가정했다.
유사하게, SpyCatcher002 변이체(SpyCatcher002D5A 서열번호 44)의 위치 100에 있는 글루타민 잔기의 아스파르트산으로의 치환은 0.93 μM-1min-1의 반응 속도, 즉 약 105%의 활성 증가를 갖는 폴리펩타이드(펩타이드 태그 결합 파트너, 서열번호 46)를 생성했다(도 16). 이것은 이 위치에서의 아스파르트산이 리신 111과 정전 기적 상호작용을 형성할 수 있어, SpyCatcher 변이체의 두 루프 사이에 상호작용의 안정성을 증가시키는 것으로 생각된다. 우리는 이 돌연변이가 SpyCatcher 형태를 SpyTag 도킹에 사전지향적으로 만들어 반응 속도를 증가시킬 것이라고 가정했다.
상기 설명된 치환들의 조합(서열번호 47)은 반응 속도를 1.22 μM-1min-1로 더 개선시켜서, 각 돌연변이가 반응 속도에 별도의 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 특히, 서열번호 47의 위치 5에서 알라닌을 트레오닌으로 치환하면(즉, 서열번호 2를 초래함), 반응 속도가 추가로 개선된다(도 16).
방법
클로닝
Q5 High-Fidelity Polymerase(NEB)를 사용하여 모든 PCR 및 부위-지정 돌연변이유발을 수행했다. Gibson Assembly Master Mix(NEB)는 제조업체의 지침에 따라 사용했다. 모든 작제물은 먼저 화학적 적격(competent) E. Coli NEB5α 세포(NEB)로 클로닝했다.
플라스미드 pET28a SpyTag-MBP(Addgene 플라스미드 ID 35050), pET28A SpyTag-DA-MBP, pDEST14 SpyCatcher(GenBank JQ478411, Addgene 플라스미드 ID 35044), 및 pDEST14 SpyCatcher EQ(Addgene 플라스미드 ID 35045)는 종래 개시되어 있다(Zakeri et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109, E690-697). pDEST14 AP-SpyCatcher(GenBank 수탁번호 KU500645, Addgene 플라스미드 ID 72326)는 N-말단에 부위 특이적 비오티닐화를 위한 펩타이드 태그(AP)를 함유하는 WT 및 EQ 형태로서, 프라이머 5'-GATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTG(서열번호 48), 5'-GCCTGAACGATATTTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAGGCGATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTG(서열번호 49), 5'-GTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATG(서열번호 50) 및 5'-TGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAAATATCGTTCAGGCCGCTGCCGTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATG(서열번호 51)를 사용하는 SLIM PCR을 이용해 pDEST14 SpyCatcher(WT/EQ)로부터 작제되었다. pET28a AP-SpyTag-MBP 및 AP-SpyTag DA-MBP는 5'-ATTACATATGGGTCTGAATGATATTTTCGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAGGTAGCGGAGCCCACATCGTGATGGTG (서열번호 52) 및 5'-GGGGAAGCTTTTACGAGCTCGAATTAGTCTG(서열번호 53)를 사용하여 상기 동일한 비오티닐화 태그 N-말단(그러나, TEV 프로테아제 절단 부위 없이)을 pET28a SpyTag(WT/DA)-MBP로 삽입하여 작제했다. 삽입체는 HindIII(NEB) 및 NdeI(NEB)로 분해하고 pET28a에 결찰시켰다.
주형으로 pET28a SpyTag-MBP를 가진 QuikChange PCR을 사용하여 개별 SpyTag 변이체(SpyTag002 DA-MBP 포함)를 생성하고 NEB5α 세포로 형질전환시켰다. 개별 SpyCatcher 변이체는 정방향(5'-CCGAAAACCTGTATTTT CAGGGCGCCATG(서열번호 54)) 및 역방향(5'-GCATCAACCATTTAGCTACCACTGGATCC (서열번호 55)) 프라이머를 사용하여 SpyCatcher 유전자를 PCR 증폭시킴으로써 용해성 단백질을 발현시키기 위해 pFab5cHis 파지미드 벡터로부터 pDEST14로 클로닝했다. 역방향 프라이머는 SpyCatcher 단백질에 C-말단이 되는 pFab5cHis의 GSGGS 펩타이드 링커를 보유하여 pDEST14 벡터와의 후속 중첩을 허용한다. 선택된 SpyCatcher 변이체(SpyCatcher002 EQ 비활성 형태 포함)의 추가 점 돌연변이는 QuikChange PCR 돌연변이유발에 의해 도입되었다. 모든 돌연변이 및 작제물은 서열분석으로 검증했다.
슈퍼 폴더 GFP(sfGFP)에 융합된 SpyCatcher를 암호화하는 플라스미드 pJ404-SpyCatcher-sfGFP는 Karl Brune(옥스포드 대학)으로부터 받은 호의적인 선물이었고, 3 파트 Gibson Assembly에서 생산했다. SpyCatcher 유전자 (His-태그 및 TEV 프로테아제 절단 부위 포함)는 정방향(5'-GTTTAACTTTAATAAGGAGATA TACCATGTCGTACTACCATCACCATCACC(서열번호 56)) 및 역방향(5'-CTTTACGGCCTGAACCACCAATATGAGCGTCACCTTTAGTTGC(서열번호57)) 프라이머를 사용하여 pDEST14 SpyCatcher 플라스미드로부터 증폭시켰다. GGSG 링커가 앞에 오는 sfGFP는 정방향(5'-GGTGGTTCAGGCCGTAAAGG(서열번호 58)) 및 역방향(5'-CCTTGGGGCTCGAGTTATCATTTGTACAGTTCATCCATACCATGC(서열번호 59)) 프라이머를 이용하여 pJ404-sfGFP 플라스미드(DNA2.0)로부터 증폭시켰다. 플라스미드 골격은 정방향 (5'-CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAGGG (서열번호 60)) 및 역 (5'-TGATAACTCGAGCCCCAAGG (서열번호 61)) 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 3 개의 PCR 산물은 그 다음 Gibson Assembly에 의해 연결시켰다. 플라스미드 pJ404-SpyCatcher002-sfGFP는 정방향 (5'-CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAGGG(서열번호 62)) 및 역방향 (5'-TGATAACTCGAGCCCCAAGG(서열번호 63)) 프라이머를 사용하여 pDEST14-SpyCatcher002로부터 SpyCatcher002 유전자를 증폭시켜 생성했다. 벡터 골격은 4개의 프라이머 (5'-GGTGGTTCAGGCCGTAAAGGCGAAGAGCTG(서열번호 64); 5'-CGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCCTC (서열번호 65); 5'-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGG(서열번호 66); 및 5'-GAGGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCAC CAGCAAATCGCG (서열번호 67))를 사용하여 2 부분으로 증폭시키고 Gibson Assembly화되어 최종 작제물을 생성했다.
pET21 MBPx-SpyCatcher(N-말단 His6 태그-MBPmt-스페이서-MBPmt-스페이서-SpyCatcher) (GenBank 수탁 번호 KU361183, Addgene 플라스미드 ID 72327)는 종래 개시되었다(Veggiani et al., 2016 Proc Natl Acad Sci USA 113, 1202-1207). pET21 MBPx-SpyCatcher002는 3-파트 Gibson 어셈블리를 통해 생성되었다. SpyCatcher002는 정방향 (5'-CGAGCTCGGGTTCGGGCGGTAGTGGTGCC ATGGTAACCACCTTATCAGGTTTATCAGGTG(서열번호 68)) 및 역방향(5'-GTGGTGGTGCTCGAGTG CGGCCGCAAGCTTCTATTAAGTATGAGCGTCACCTTTAGTTGC (서열번호 69)) 프라이머를 사용하여 pDEST14-SpyCatcher002로부터 증폭시켰다. 주형 골격은 플라스미드 pET21 MBPx -SpyCatcher로부터 4개의 프라이머 (5'-GGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG (서열번호 70); 5'-CATGGCACCACTACCGCCCGAACCCGAGCTCG(서열번호 71); 5'-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGC(서열번호 72); 5'-CGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACC(서열번호 73)를 사용하여 플라스미드 pET21 MBPx-SpyCatcher로부터 2 부분으로 생성되었고 Gibson Assemble화되어 최종 생성물을 산출했다.
pET28a Aff0iEGFR-SpyTag002는 4개의 프라이머(5'- GGCAGCATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAGGCAGTGGTGAGTCG GGATCCGGAGCTAGC(서열번호74); 5'-GTTTATTATTTATAGCGTTTGTAGGCGTCCACCATAACAATAGTAGGAACACCGGAACCTTCCCCGGATCCC TCGAGGCC(서열번호75); 5'-GGACGCCTACAAACGCTATAAATAATAAACTCTAGCACCACTGAGA TCCGGCTGCTAAC(서열번호76); 5'-ACTGCCTTTGTTCACTTTAATAAATTCAATGCTGCCCAGTT TCCCCATATGGCTGCCGCG(서열번호77))을 사용하고, 주형으로서 플라스미드 pET28a SnoopTag-AffiEGFR-SpyTag(GenBank 수탁번호 KU296973)를 사용하여 2-파트 Gibson 어셈블리를 통해 생성되었다.
pET28a His-MBP는 pMAL 벡터(NEB) 유래의 말토스 결합 단백질 유전자를 Zakeri et al(2012, 상기 문헌 참조)에 종래 기술된 바와 같은 pET28a 벡터로 클로닝하여 제조했다.
자가 분해 속도를 감소시키는 S219V 돌연변이를 함유하는 MBP-His6-TEV 프로테아제를 암호화하는 pRK793은 절단을 억제하기 위해 TEV 인식 부위를 돌연변이시켜 MBP로부터 TEV 프로테아제의 자가 절단을 방지하도록 추가로 변형시켰다.
파지미드 플라스미드는 PelB 리더 서열, 클로닝 부위 및 M13 파지 pIII의 최종 C- 말단 도메인을 암호화하는 유전자 III의 파트만을 암호화하는 pFab5c.His의 변이체였다. SpyTag 파지미드 플라스미드(pFab5cHis-PelB-SpyTag-gIII)는 PelB 리더와 gIII 사이에 SpyTag를 암호하하는 DNA를 삽입함으로써 제조했다. pFab5cHis 플라스미드는 XhoI(NEB) 및 NotI(NEB)로 분해했다. 프라이머 5'-TCGAGGGCGGCGCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCGACGAAGGGCGC (서열번호 78) 및 5'-GGCCGCCTTCGTCGGCTTGTAGGCGTCCACCATCACGATGTGGGCGCCGCCC (서열번호 79)를 어닐링하고 pFab5cHis에 결찰시켰다. pFab5cHis SpyTag DA를 생성하기 위해, pFab5cHis를 XhoI 및 NotI로 분해시켰다. 프라이머 5'-TCGAGGGCGGCGCCCACATCG TGATGGTGGCCGCCTACAAGCCGACGAAGGGCGC (서열번호 80) 및 5'-GGCCGCCTTCGTCGGCTTGTAGCGGCCACCATCACGATGTGGGCGCCGCCC (서열번호 81)를 어닐링하고 pFab5에 결찰시켰다. pFab5cHis-DsbA-SpyCatcher-GSSGS-TEV 프로테아제 절단 부위-gIII는 2 단계 공정으로 작제했다. 제1 단계로 SpyCatcher와 그 다음에 서열 GSSGSENLYFQGSG를 증폭을 통해 PelB 리더 및 gIII과 프레임내 클로닝했다. SpyCatcher는 5'-TAATCTCGAGATCAGGGCGCCATGGTTGATACCTTATC (서열번호 82) 및 5'-ATATGCGGCCGCTCCACTCCCCTGGAAGTAGAGGTTTTC(서열번호 83)를 사용하여 pDEST14 SpyCatcher로부터 증폭시켰다. 삽입체 및 벡터는 XhoI 및 NotI를 사용하여 분해한 다음, 결찰시켰다. 제2 단계에서, PelB 신호 서열은 5'-GCGTTTAGCGCATCGGCGGGCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGTGCAGCTGCAGGTCG (서열번호 84), 5'-CGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACTAAACCAGCCAGCGCCAGCCAAATC TTTTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG (서열번호 85), 5'-GGTGCAGCTGCAGGTCG (서열번호 86) 및 5'-TTTCATA GCTGTTTCCTGTGTGAAATTG (서열번호 87)를 사용하여 SLIM PCR에 의해 DsbA 신호 서열로 대체시켰다.
SpyTag의 무작위 N-말단 라이브러리의 생성
라이브러리는 파지미드 pFab5cHis-PelB-SpyTag-gIII의 하나의 PCR-증폭 단편 및 하나의 제한효소-분해된 벡터로부터 결찰에 의해 어셈블리시켰다. 삽입체는 XhoI 및 NdeI 제한효소 부위를 추가하는 내측을 향한 SpyTag 유전자에 근접한 정방향 (5'-ACCTCGAGATNNKNNKNNKNNKNNKATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCC (서열번호 88)) 및 역방향 (5'-ATTCATATGGTTTACCAGCGCCAAAGACAAAAGGG (서열번호 89)) 프라이머를 사용하여 PCR하여 증폭시켰다. 열 사이클링 후 DpnI를 삽입체 PCR 혼합물에 첨가했고 1 시간 동안 37 ℃에서 항온처리하고 20 분 동안 80 ℃에서 열 불활성화시켰다. 벡터 DNA를 37 ℃에서 1.5 시간 동안 CutSmart 완충제 (NEB)에서 XhoI 및 NdeI로 분해시키고, 20 분 동안 65 ℃에서 열 불활성화시켰다. 총 삽입체 및 벡터 반응 혼합물은 6x DNA 로딩 염료와 혼합하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리시켰다. 벡터 및 삽입체에 상응하는 DNA 밴드를 겔 추출에 의해 정제하였다. 삽입체 DNA는 37 ℃에서 1 시간 동안 CutSmart 완충액에서 XhoI 및 NdeI로 분해시키고 20 분 동안 65 ℃에서 열 불활성화시켰다. 분해된 삽입체를 Thermo Scientific 스핀 컬럼을 사용하여 세척 및 농축하고 MilliQ 수로 용출시켰다. 결찰은 총 부피 150 μL에서 각 단편 627 ng DNA로 1:7 (1:1 중량)의 최적화된 벡터:삽입체 몰비에서 수행 했다. DNA 및 물은 65℃에서 5 분 동안 가열하고, 냉각시키고, T4 DNA 리가제 (NEB) 및 완충액을 첨가하고 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. DNA를 스핀-필터상에서 농축시키고 전기천공(electroporation)에 의해 전기-적격 ER2738 앰버 종결 코돈 억제인자 세포(Lucigen)로 형질전환시켰다. 형질전환체는 37 ℃에서 1 시간 동안 950μL SOC 배지를 첨가하고 100μg/mL의 앰피실린 및 25μg/mL의 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천에 플레이팅하여 회수했다. 플레이트는 37℃에서 16 시간 동안 항온배양하였다. 라이브러리를 수확하기 위해, 5mL LB를 플레이트 표면에 첨가하고, 세포를 플라스틱 스프레더로 긁어 내고 50mL Falcon 튜브로 피펫팅하고 추가 5mL로 반복하였다. 모든 플레이트로부터 수집한 후, 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 2,500 x g에서 펠릿화하고, 앰피실린(100 μg/mL), 테트라사이클린(25 μg/mL) 및 22%(v/v) 글리세롤을 함유하는 10 mL LB에 재현탁시켰다. 분취 량을 급속냉동시키고 -80 ℃에서 보관하였다.
무작위 C-말단 SpyTag 라이브러리의 생성
라이브러리는 파지미드 pFab5cHis-PelB-SpyTag-gIII의 2 개의 PCR 증폭 단편으로부터 조립했다. 첫번째 PCR에서, 정방향 프라이머(5'-CGACCTCGAGATGTGCCTACTA TCGTGATGGTGGACNNKNNKNNKNNKNNKGCGGCCGCAGGCTCTAAAGATATCAGACC (서열번호 90))는 C-말단 돌연변이를 도입하는 것 외에 AH 대신 VPT를 개시하도록 SpyTag의 N-말단을 변환시키고, 역방향 프라이머는 앰피실린 내성 유전자로부터 프라이밍시킨다(5'-GATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCC (서열번호 91)). 두번째 PCR 반응에서, 앰피실린 유전자(5'-GGCCAACTTACTTCTGACAACGATC(서열번호 92)) 및 역방향 프라이머(5'-GTCC ACCATCACGATAGTAGGCACATCTCGAGGTCGACCTGC(서열번호 93))는 이 영역이 돌연변이되기 직전에 VPT-SpyTag의 개시로부터 프라이밍되었다. 2 개의 PCR 생성물을 상기와 같이 DpnI로 분해시키고, DNA 로딩 염료와 혼합하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. DNA 밴드를 겔 추출에 의해 정제하고 Gibson Assembly에 의해 결합시켰다. DNA를 세척, 농축하고 전기-적격 ER2738 세포로 형질전환시켰다.
오류 발생이 쉬운 PCR을 통해 SpyCatcher 변이체 라이브러리의 생성
라이브러리는 Gibson 어셈블리에 의해 파지미드 pFab5cHis-DsbA-SpyCatcher 변이체-GSSGS-TEV 프로테아제 절단 부위-gIII 유래의 2개의 PCR-증폭 단편으로부터 조립되었다. 벡터는 SpyCatcher 유전자가 바깥 쪽을 향하게 근접되어 있는 올리고 뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머: 5'-GGATCCAGTGGTAGCGAAAACC (서열번호 94); 역방향 프라이머: 5'-AACCATGGCGCCCTGATCTCG (서열번호 95))를 가지고 KOD 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. 삽입체는 오류 발생이 쉬운 조건(0.4mM MnCl2; 불균형 dNTP, 0.24mM dGTP, 0.2mM dATP/dCTP/dTTP 최종 농도)에서 SpyCatcher 옆에 내측을 향하는 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머 : 5'- CCTCGAGATCTCTCAGGGCG (서열번호 96); 역방향 프라이머 : 5'-GAAGTAGAGGTTTTCGCTACCACTGGATC (서열번호 97))를 사용하여 18-23 사이클 동안 Taq 중합효소로 증폭시켰고, 사이클 수는 SpyCatcher에 돌연변이 부하를 변경하기 위해 변동시켰다. DpnI은 열 사이클링 후 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 항온배양하고 80 ℃에서 20 분 동안 열-불활성화시켰다. 총 반응 혼합물을 6x DNA 부하 염료와 혼합하고 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 벡터 및 삽입체에 대한 DNA 밴드는 겔 추출(Thermo Scientific)에 의해 정제하고 Gibson Assembly(NEB)에 의해 연결시켰다. DNA를 세척하고 농축한 후 전기적격 XL1 블루 앰버 종결 코돈 억제인자 세포(Agilent Technologies)로 형질전환시켰다.
파지 생산
XL1 Blue의 SpyCatcher 라이브러리 및 ER2738 세포의 SpyTag 라이브러리는 감염에 의해 파지 디스플레이 단백질 라이브러리로 변환시켰다. 첫번째 패닝 라운드에서 더 큰 파지 성장에는 앰피실린(100 μg/mL), 테트라사이클린(25 μg/mL) 함유 250mL 2xTY를 SpyCatcher 파지 생산을 위해 추가로 포함된 0.2%(v/v) 글리세롤의 사용이 필요했다. 이 배지에는 상기 기재된 바와 같이 생성된 초기 라이브러리로부터 생성된 세포를 위해 100 μL의 -80℃ 라이브러리 배양 스톡을 접종하였다. 후속 패닝 라운드를 위해, 600 μL의 -80℃ 라이브러리 배양 스톡(하기 기술 된 바와 같이 제조)을 사용하여 100 mL의 성장 배지에 접종하였다. 모노클로널 파지 변이체의 정제를 위해, 밤새 배양한 스타터 배양물(성장 배지에서 성장)을 사용하여 15 mL의 성장 배지(1 : 100 희석으로)에 접종하였다. 모든 경우에, 배양물은 0.5의 OD600에 도달(약 3-4 시간)할 때까지 200 rpm으로 37℃에서 성장시키고, 1012 R408 헬퍼 파지에 감염시키고 37℃에서 30 분 동안 느린 혼합(80 rpm)으로 배양하였다. SpyCatcher/SpyTag-pIII 단백질의 발현은 IPTG(SpyTag 파지 생산의 경우 0.42 mM 및 SpyCatcher 파지 생산의 경우 0.1 mM)로 유도하고 25℃(SpyTag 파지) 또는 18℃(SpyCatcher 파지)에서 200 rpm으로 18-20 시간 동안 배양하였다.
침전에 의한 파지 정제
감염된 박테리아 배양물은 박테리아 세포를 제거하기 위해 4 ℃에서 10 분 동안 15,000 x g로 원심분리하였다. 1 부피의 침전 완충액[멸균, 20%(w/v) PEG8000, 2.5 M NaCl]은 4 부피의 상청액에 첨가하였다. 상청액을 혼합하고 4℃에서 3-4 시간 동안 항온배양하였다. 파지를 4℃에서 30분 동안 15,000 x g에서 원심 분리하여 펠릿화하고 상청액을 제거하였다. 파지 펠릿은 PBS pH 7.5 (100mL 배양물 당 2mL)에 재현탁시키고, 임의의 잔류 세포를 제거하기 위해 4 ℃에서 10 분 동안 15,000 x g로 원심분리한 뒤, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 혼합물은 이전과 같이 다시 침전시켰지만, 이번에는 100mL 배양물 당 0.25mL PBS에 재현탁시켰다. 샘플은 4℃에서 10 분 동안 15,000 x g로 원심분리하여 임의의 잔류 세포를 제거했고, 파지를 3번째 침전시키고 100mL 배양물 당 0.25mL PBS의 최종 부피에 재현탁시켰다. 샘플은 4℃에서 단기(1-2 주), 또는 -80℃에서 장기 보관하였다. 전형적으로, 100 mL 배양물은 250 μL의 ~1012 파지/mL를 제공하였다.
파지 정량
정제된 파지는 gIII 유전자(5'-GTCTGACCTGCCTCAACCTC (서열번호 98) 및 5'-TCACCGGAACCAGAGCCAC (서열번호 99))에 특이적인 프라이머를 사용하여 용해된 파지의 qPCR(PBS에서 95℃로 7 분 동안 비등가열)로 정량화하였다. 5 μL 파지 용해물을 qPCR 튜브(Qiagen) 중의 10 μL qPCR 마스터 믹스(Bioline)에 첨가하여 1x SensiMix 완충액(Bioline) 및 각 프라이머 0.25 μM의 최종 농도를 제공하였다. 104 내지 109 파지/mL의 공지된 파지 농도의 표준물질을 시험하여 표준 곡선을 생성하고 물 + 완충액 마스터 믹스 샘플을 음성 대조군으로 포함시켰다. 샘플은 다음과 같이하여 2반복으로 수행했다: 초기 변성 95℃, 10 분(첫번째 사이클만); 변성 95℃, 10 초; 어닐링 60℃, 10 초; 연장 72℃, 15 분으로 45 사이클, Gain; Rotor-Gene Q qPCR 기계(Qiagen)에서 녹색 10 황색 5, HRM 7. 데이터는 제조업체의 소프트웨어와 0.2의 상한 임계값 및 곡선의 배경 노이즈 위만 보정하는 기울기를 사용하여 분석하여 카운트(Ct) 값을 제공하였다. 표준물질은 파지 수 대 Ct의 플롯을 생성하는데 사용했다.
라이브러리 변이체의 패닝
비오티닐화된 AP-SpyCatcher(WT/EQ) 및 AP-SpyTag(WT/DA)-MBP는 각각 SpyTag 및 SpyCatcher 파지 라이브러리와 반응시키기 위한 미끼로서 사용하였다. 미반응성 미끼 변이체(SpyCatcher EQ 및 SpyTag-DA-MBP)는 후속 세척의 효율을 평가하기 위해 병행 선택에 포함시켰다. 반응은 25μM His6-MBP(SpyTag가 아닌 MBP에 결합하는 SpyCatcher-파지 변이체를 역선택하도록 하는 SpyCatcher 파지 선택을 위해)가 보충된 3%(w/v) BSA 함유 PBS pH 7.5, 25℃에서 수행했다. 첫번째 패닝 라운드에서, 반응물에 1 x 1012 파지를 미끼 농도(SpyTag-파지 패닝의 경우 0.5 μM bio-AP-SpyCatcher; 및 SpyCatcher-파지 패닝의 경우 0.5 μM bio-AP-SpyTag-MBP)로 포함시키고 5 시간(SpyTag-파지) 또는 18 시간(SpyCatcher-파지) 동안 반응시켰다. 패닝의 2회의 후속 라운드(2 라운드에서 0.2 μM bio-AP-SpyCatcher 및 30 분 반응, 및 3 라운드에서 0.2 μM bio-AP-SpyCatcher 및 10 분 반응)는 SpyTag-파지의 경우 라운드 3 반응에 10 mM DTT를 첨가한 변형으로 수행했다. SpyCatcher-파지의 경우에는 3회의 후속 선택 라운드를 수행했다(라운드 2에서 0.2 μM bio-AP-SpyTag 및 30 min 반응 및 라운드 3에서 0.2 μM bio-AP-SpyTag 및 10 분 반응; 라운드 4에서 0.05 μM bio-AP-SpyTag 및 10 분 반응). 각각의 경우에, 반응 시간은 AP-태그없이 과량(50-100 μM)의 미끼 단백질을 첨가하여 제어했고, 결과적으로 미-비오티닐화되었다(SpyTag-파지 패닝이 경우 SpyCatcher, 및 SpyCatcher-파지의 경우 SpyTag-MBP). 파지는 PEG/NaCl 침전을 사용하여 미반응 비오티닐화된 미끼로부터 정제하고, 상청액은 제거했다. 파지-비오티닐화된 미끼 부가물을 함유하는 펠릿은 선택 라운드에 적당한 것으로서 200-800 μL PBS pH 7.5 0.1%(v/v) Tween20에 재현탁시켰다(반응 시간이 길고 비오티닐화된 미끼 농도가 높은 초기 라운드는 모든 변이체의 결합이 보장되도록 하기 위해 더 많은 수의 비드가 필요할 것으로 예상했다). 웰당 25 ㎕ Biotin-Binder Dynabeads(ThermoFisher Scientific)는 PBS pH 7.5 + 0.1%(v/v) Tween 20 중의 3%(w/v) BSA로 25℃에서 2 시간 동안 사전 차단된 96-웰 저 결합(low bind) Nunc 플레이트에 첨가하였다. 비드는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 자성 분리 랙(NEB)을 사용하여 포획했고 200 μL/웰 PBS pH 7.5 + 0.1%(v/v) Tween-20으로 4 회 세척하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰마다 파지-비오티닐화된 미끼 부가물을 함유하는 200 μL의 PBS pH 7.5 0.1%(v/v) Tween-20에 비드를 재현탁시키고 25℃에서 1 시간 동안 800 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 약하게 결합된 파지를 제거하기 위해, 비드는 150 μL 글리신-HCl pH 2.2로 1회 세척한 다음, 0.5%(v/v) Tween-20 함유 TBS 150 μL로 4회 세척하였다. 파지는 50 μL 0.72 mg/mL MBP-TEV 프로테아제를 사용하여 0.5 mM EDTA 함유 50 mM Tris pH 8.0에서 1,000 rpm으로 진탕시키면서 34℃에서 2 시간 동안 TEV 프로테아제 분해시켜 비드로부터 용리시켰다. 용리된 파지는 25 μg/mL 테트라사이클린이 보충된 LB에서 성장한 ER2738(SpyTag-파지의 경우) 또는 XL-1 Blue(SpyCatcher-파지의 경우)의 중간-log(OD600 = 0.5) 배양물 1ml를 37℃에서 80rpm으로 30 분 동안 진탕시켜 회수했다. 이어서, 세포는 100mL 2xTY(1% (v/v) 글루코오스, 100 μg/mL 앰피실린 및 25 μg/mL 테트라사이클린으로 보충됨)로 희석하고 세포가 정지기에 들어갈 때까지 200rpm에서 진탕하면서 12-16 시간 동안 성장시켰다. 글리세롤은 최종 농도 20%(v/v)로 첨가 한 후, 세포 분취액을 급속 냉동시키고 -80 ℃에서 저장하였다. 용리된 파지 수는 연속 희석물을 플레이팅하여 정량화했다.
개선된 변이체의 시험관내 '파지 위(on-phage)' 동역학적 검증
서열분석된 모노클로널 파지 변이체를 박테리아 발현 벡터로 클로닝하기 전에, 변이체는 동등한 야생형 파지보다 더 잘 반응할 수 있는 것에 대해 사전선별했다. 파지의 발현 및 정제(상기 기술됨) 후, 생산된 배취(야생형 변이체는 매번 포함됨)에서 파지 농도를 보통 2 x 1012 파지/mL의 값으로 정규화(normalisation)한 후 개정형 패닝 프로토콜을 사용하여 미끼와의 반응성을 분석하였다. 사용된 반응 조건은 200-500 μM 비오틴-AP-미끼(AP-SpyTag-MBP 또는 AP-SpyCatcher)를 사용하는 25℃, PBS pH 7.5 + 2.5%(w/v) BSA였다. 반응을 개시하기 위해, PCR 튜브에서 6 μL의 반응 완충액에 2 μL 파지를 첨가하였다. 필요한 반응 시간(전형적으로 15 분) 후, 반응은 미비오틴화된 미끼(100μM 최종 농도)로 25℃에서 20분 동안 켄칭(quench)시켰다. 이어서, 7 μL 파지 침전 완충액을 첨가하고 4℃에서 1 시간 동안 항온배양하였다. PCR 튜브는 15,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 파지 펠릿은 200 μL PBS + 0.1%(v/v) Tween20에 재현탁시켰다. 이어서, 파지는 비드와 파지 패닝을 위해 전술한 바와 같이 Biotin-Bind Dynabeads에 첨가하였다. 비드를 150 μL/웰 글리신-HCl pH 2.2로 1회 세척한 후, 150 μL/웰 TBS-Tween20(0.5% v/v)으로 4 회 세척한 후, 비드는 최종적으로 150 μL PBS에 재현탁시키고 50μL는 새로운 PCR 튜브로 분리하고, 파지를 95℃에서 7분 동안 비등가열함으로써 용해시켰다. 비드를 MagRack 6 마그넷 (GE)으로 포획하고, 상청액을 상기와 같이 qPCR에 의해 파지 수에 대해 정량했다.
SpyCatcher 및 SpyTag 변이체의 발현 및 정제
SpyCatcher 변이체(SpyCatcher002-EQ 포함)는 E. coli C41 DE3(Anthony Watts(Oxford 대학)의 선물)에서 발현시켰고 SpyTag-MBP 변이체(SpyTag002-DA-MBP 포함)는 E. coli BL21 DE3 RIPL(Stratagene)에서 발현시켰다. 앰피실린(pDEST14) 또는 카나마이신(pET28a)을 함유하는 10mL LB로 단일 콜로니를 취하여 밤새 성장시켰다. 0.8%(w/v) 글루코오스 및 적절한 항생제가 보충된 1 L LB가 담긴 고 수율 배플형(baffled) 플라스크에 포화 밤샘 배양물의 1/100 희석액을 접종하고, 200 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. OD600 0.5-0.6에 도달한 후, 배양물에 0.42mM IPTG를 접종하고 200 rpm으로 4-5 시간 동안 진탕하면서 30℃에서 항온배양했다. 세포를 회수하고 혼합 프로테아제 억제제(완전 소형 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일; Roche) 및 1 mM PMSF를 함유하는 TBS에서 초음파 처리에 의해 용해시키고 Ni-NTA(Qiagen)에 의해 정제하였다. 단백질은 3회의 완충액 교환 하에 PBS로 투석시켰다. AP-SpyCatcher(WT/EQ), AP-SpyTag(WT/DA)-MBP, SpyCatcher-sfGFP, SpyCatcher002-sfGFP, MBPx-SpyCatcher, His6-MBP, MBP-x-SpyCatcher002의 발현 및 정제 또한 동일한 절차를 사용하여 수행했다. NH2-MBP-His6-TEV 프로테아제는 단백질을 50mM Tris HCl pH 8.0 + 0.5mM EDTA로 3회 투석하도록 절차를 변형시킨 유사한 방식으로 발현시키고 정제했다.
이소펩타이드 결합 재구성 실험
이소펩타이드 결합 형성은 전술한 바와 같이 모니터했다(Zakeri et al., 2012, 상기 문헌 참조). 사용된 완충액은 HEPES [50 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 pH 7.5], HBS (50 mM HEPES + 150 mM NaCl pH 7.5), TBS [50 mM Tris-하이드록시메틸 아미노메탄 + 150 mM NaCl pH 7.5), PBS, PBS + 1 mM EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산) pH 7.5였다. 6 x SDS-PAGE 로딩 염료 (0.23 M Tris HCl pH 6.8, 24%(v/v) 글리세롤, 120 μM 브로모페놀 블루, 0.23 M SDS)를 첨가한 뒤, Bio-Rad C1000 열 사이클러에서 95℃에서 6 분 동안 가열하여 시점(time-points)에 켄칭했다. 반응물은 InstantBlue (Expedeon) Coomassie를 사용하여 염색하는 16% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 분석하고 밴드 강도는 Gel Doc XR imager 및 Image Lab 5.0 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 정량했다. 이소펩타이드 재구성 백분율은 공유 복합체에 대한 밴드 강도를 레인 내 모든 밴드의 강도로 나누고 100을 곱하여 계산하였다. SpyCatcher:SpyTag-MBP 공유 복합체 형성에 대한 2 차 속도 상수는 SpyTag-MBP와 함께 배양되지 않은 대조군과 대비하여 SpyCatcher에 대한 밴드의 강도 감소를 모니터링하여 미반응 SpyCatcher의 농도를 제공하여 확인했다. 반응 진행 곡선의 선형 부분 동안 시점을 분석하였다. 1/[SpyCatcher]를 시간에 대해 플롯팅하고 Excel을 사용하여 선형 회귀로 분석하였다.
0.1 μM에서 분석을 수행했을 때(도 9B)에는 SpyCatcher-sfGFP 및 SpyCatcher002-sfGFP를 사용했다. sfGFP의 형광을 유지하기 위해 SDS 로딩 완충액을 첨가한 후 50℃의 저온에서 반응을 켄칭시켰다. 반응물은 16% SDS-PAGE에서 진행시키고, 반응하지 않은 SpyCatcher-sfGFP 및 SpyTag-MBP:SpyCatcher-sfGFP 공유 생성물의 밴드는 Fluorescent Image Analyzer FLA-3000(FujiFilm) 및 ImageGauge 버전 4.21 소프트웨어를 사용하여 정량했다.
반응의 온도-의존성은 각 단백질을 0.5 μM로 함유한 PBS pH 7.5(pH가 온도에 따라 약간의 변화를 갖기 때문에)에서 측정했다. pH-의존성의 경우, 각 단백질은 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액(12.5 mM 숙신산, 43.75 mM NaH2PO4, 43.75 mM 글리신; pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정)에서 0.5 μM 및 25℃에서 혼합하여, 넓은 pH 범위에 걸쳐 적당한 완충작용을 할 수 있게 했다.
완충액-의존성은 25℃에서 각 단백질 0.5 μM로 사용하여 pH 7.5에서 PBS (± EDTA), HBS, HEPES 또는 TBS에서 측정했다. 계면활성제-의존성은 1%(v/v) Tween 20 또는 1%(v/v) Triton X-100이 보충된 PBS pH 7.5에서 25℃ 하에 각 단백질 0.5 μM을 사용하여 측정했다.
SpyCatcher002 및 SpyTag002가 완결 반응하는지 시험하기 위한 분석은 pH 7.0의 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에서 25 ℃에서 1 시간 동안 수행했다. SpyCatcher002가 완결 반응하는지 시험하기 위해, 10 μM SpyCatcher002를 20 μM SpyTag002-MBP와 반응시켰다. SpyTag002-MBP가 완결 반응하는지 시험하기 위해, 10μM SpyTag002-MBP를 20μM SpyCatcher002와 반응시켰다.
우레아의 증가 농도에서 SpyTag002-MBP와 SpyCatcher002 반응을 시험하기 위한 분석은 필요한 농도의 우레아(0 내지 8 M)를 포함하는 PBS에서 수행했고, 이어서 HCl을 사용하여 pH 7.5로 조정했다. 모든 반응은 새로 제조한 우레아 함유 완충 용액을 사용하여 25 ℃에서 2μM의 각 단백질로 수행했다. 반응 정도는 30 분 및 120 분 후에 분석했다.
SpyCatcher002-EQ 및 SpyTag002-DA-MBP 돌연변이체는 QuikChange 부위 지정 돌연변이유발로 작제했다. 분석은 pH 7.0의 숙시네이트-포스페이트-글리신 완충액에서 25℃에서 1h 동안 각 단백질 10 μM로 수행하였다.
단백질 농도의 정량
단백질 농도는 ProtParam에 의해 계산된 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 확인했다.
질량 분광분석
95μM SpyCatcher002를 220μm 펩티드 함유 SpyTag002(KGVPTIVMVDAYKRYK (서열번호 100), Insight Biotechnology에서 >95% 순도로 고상 합성됨)와 PBS pH 7.0에서 25℃에서 3h 동안 반응시켰다. 반응물은 3.5 kDa 컷오프 Spectra/Por 투석 튜브(Spectrum labs)를 사용하여 10 mM 암모늄 아세테이트 pH 7.5에 대하여 각각 4 ℃에서 3 시간 동안 3회 투석하였다. 샘플을 Merck Chromolith C18 2 x 5 mm 가드 컬럼을 통과시킨 후 전기분무 인터페이스가 장착된 Waters LCT Premier XE(Waters Corporation)를 사용하여 질량 분광분석을 수행하였다. 데이터를 분석하고 m/z 스펙트럼을 분자 질량 프로파일로 변환하는데 사용한 소프트웨어는 MassLynx 4.1 (OpenLynx open access 구비) (Waters Corporation)였다. 공유 복합체의 예상 분자량은 N-말단 fMet의 절단을 고려하고 이소펩타이드 결합 형성에 대한 18 Da를 감하여 ExPASy ProtParam을 사용하여 계산하였다.
서열 정렬
복수의 서열 정렬은 Clustal Omega를 사용하여 생성하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> Proteins and peptide tags with enhanced rate of spontaneous isopeptide bond formation and uses thereof <130> 20.131607/01 <150> GB1706430.4 <151> 2017-04-24 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> X is arginine or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> X is glycine or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is threonine or histidine, preferably histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> X is alanine, glycine or valine, preferably alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X is arginine or lysine, preferably arginine <400> 1 Xaa Xaa Val Pro Xaa Ile Val Met Val Asp Xaa Tyr Lys Xaa Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 A92P Q100D <400> 2 Gly Ala Met Val Thr Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Pro Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Asp Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 <400> 3 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 T3H <400> 4 Val Pro His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 RG-T3H <400> 5 Arg Gly Val Pro His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag <400> 6 Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher <400> 7 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Ile 115 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated SpyTag002 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> X is threonine or histidine, preferably histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> X is alanine, glycine or valine, preferably alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> X is arginine or lysine, preferably arginine <400> 8 Val Pro Xaa Ile Val Met Val Asp Xaa Tyr Lys Xaa Tyr Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 RG variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> X is threonine or histidine, preferably histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> X is alanine, glycine or valine, preferably alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X is arginine or lysine, preferably arginine <400> 9 Arg Gly Val Pro Xaa Ile Val Met Val Asp Xaa Tyr Lys Xaa Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 RG H5 variant <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> X is alanine, glycine or valine, preferably alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> X is arginine or lysine, preferably arginine <400> 10 Arg Gly Val Pro His Ile Val Met Val Asp Xaa Tyr Lys Xaa Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 <400> 11 gtgccgacca tcgtgatggt ggacgcctac aagcgttaca ag 42 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 <400> 12 gtgcctcata tcgtgatggt ggacgcctac aagcgttaca ag 42 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 <400> 13 cgtggcgtgc ctcatatcgt gatggtggac gcctacaagc gttacaag 48 <210> 14 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 <400> 14 ggcgccatgg taaccacctt atcaggttta tcaggtgagc aaggtccgtc cggtgatatg 60 acaactgaag aagatagtgc tacccatatt aaattctcaa aacgtgatga ggacggccgt 120 gagttagctg gtgcaactat ggagttgcgt gattcatctg gtaaaactat tagtacatgg 180 atttcagatg gacatgtgaa ggatttctac ctgtatccag gaaaatatac atttgtcgaa 240 accgcagcac cagacggtta tgaggtagca actccaatta cctttacagt taatgaggac 300 ggtcaggtta ctgtaaatgg cgaagcaact aaaggtgacg ctcatact 348 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib1 <400> 15 Pro Pro Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib2 <400> 16 Arg Pro Cys Tyr Val Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib3 <400> 17 Gly Arg Tyr Ala Trp Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib1 <400> 18 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Tyr Lys Arg Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib2 <400> 19 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Cys Leu Phe Cys 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib3 <400> 20 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Phe Trp Met Arg Cys 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib4 <400> 21 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Arg Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib5 <400> 22 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Gln Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib6 <400> 23 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Ser Leu Ser Pro 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib7 <400> 24 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Pro Tyr Gln Gly Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib8 <400> 25 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Tyr Pro Ser Arg Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib9 <400> 26 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Cys Tyr Lys Arg Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLib10 <400> 27 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Phe Ile Leu Ala Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of NLib1 <400> 28 Pro Pro Val Pro Thr 1 5 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of NLib1-1 <400> 29 Pro Val Pro Thr 1 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib1-1 <400> 30 Pro Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 15 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib1-2 <400> 31 Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLib1-3 <400> 32 Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1C1 <400> 33 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Asp Gln Gly Gln 1 5 10 15 Ser Cys Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Val Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Ala Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Pro Ser Gly Glu Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Ser Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Tyr Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1C4 <400> 34 Gly Ala Met Val Asp Thr Phe Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Arg Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1C2 <400> 35 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Glu Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 36 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2C1 <400> 36 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Cys Gln 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 Arg Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 37 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1C3 <400> 37 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Thr Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Ala Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 38 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1C6 <400> 38 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2C8 <400> 39 Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 40 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 (SC002) <400> 40 Gly Ala Met Val Thr Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Portion of SpyTag <400> 41 Ile Val Met Val Asp Ala 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of SpyCatcher L1C6 <400> 42 Gly Ala Met Val Asp Thr 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of L1C6 D5T <400> 43 Gly Ala Met Val Thr Thr 1 5 <210> 44 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 D5A <400> 44 Gly Ala Met Val Ala Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 D5A A92P <400> 45 Gly Ala Met Val Ala Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Pro Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 46 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 D5A Q100D <400> 46 Gly Ala Met Val Ala Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Asp Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 47 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyCatcher002 D5A A92P Q100D <400> 47 Gly Ala Met Val Ala Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Glu Gln Gly Pro 1 5 10 15 Ser Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe 20 25 30 Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly 50 55 60 His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu 65 70 75 80 Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Pro Ile Thr Phe Thr 85 90 95 Val Asn Glu Asp Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Glu Ala Thr Lys Gly 100 105 110 Asp Ala His Thr 115 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gattacgaca tcccaacgac cgaaaacctg 30 <210> 49 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gcctgaacga tatttttgaa gcgcagaaaa ttgaatggca tgaaggcgat tacgacatcc 60 caacgaccga aaacctg 77 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 gtgatggtga tggtgatggt agtacgacat atg 33 <210> 51 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 tgccattcaa ttttctgcgc ttcaaaaata tcgttcaggc cgctgccgtg atggtgatgg 60 tgatggtagt acgacatatg 80 <210> 52 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 attacatatg ggtctgaatg atattttcga agcgcagaaa attgaatggc atgaaggtag 60 cggagcccac atcgtgatgg tg 82 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 ggggaagctt ttacgagctc gaattagtct g 31 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 ccgaaaacct gtattttcag ggcgccatg 29 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 gcatcaacca tttagctacc actggatcc 29 <210> 56 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 gtttaacttt aataaggaga tataccatgt cgtactacca tcaccatcac c 51 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 ctttacggcc tgaaccacca atatgagcgt cacctttagt tgc 43 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 ggtggttcag gccgtaaagg 20 <210> 59 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 ccttggggct cgagttatca tttgtacagt tcatccatac catgc 45 <210> 60 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 catggtatat ctccttatta aagttaaaca aaattatttc tacaggg 47 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 tgataactcg agccccaagg 20 <210> 62 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 catggtatat ctccttatta aagttaaaca aaattatttc tacaggg 47 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 tgataactcg agccccaagg 20 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 ggtggttcag gccgtaaagg cgaagagctg 30 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcctc 60 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 gccctgaaaa tacaggtttt cggtcgttgg g 31 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 gaggacggta cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg 60 <210> 68 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 cgagctcggg ttcgggcggt agtggtgcca tggtaaccac cttatcaggt ttatcaggtg 60 <210> 69 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 gtggtggtgc tcgagtgcgg ccgcaagctt ctattaagta tgagcgtcac ctttagttgc 60 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcg 28 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 catggcacca ctaccgcccg aacccgagct cg 32 <210> 72 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc 50 <210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacc 28 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 ggcagcattg aatttattaa agtgaacaaa ggcagtggtg agtcgggatc cggagctagc 60 <210> 75 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 75 gtttattatt tatagcgttt gtaggcgtcc accataacaa tagtaggaac accggaacct 60 tccccggatc cctcgaggcc 80 <210> 76 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 ggacgcctac aaacgctata aataataaac tctagcacca ctgagatccg gctgctaac 59 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 actgcctttg ttcactttaa taaattcaat gctgcccagt ttccccatat ggctgccgcg 60 <210> 78 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 tcgagggcgg cgcccacatc gtgatggtgg acgcctacaa gccgacgaag ggcgc 55 <210> 79 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 ggccgccttc gtcggcttgt aggcgtccac catcacgatg tgggcgccgc cc 52 <210> 80 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 80 tcgagggcgg cgcccacatc gtgatggtgg ccgcctacaa gccgacgaag ggcgc 55 <210> 81 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 81 ggccgccttc gtcggcttgt agcggccacc atcacgatgt gggcgccgcc c 51 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 82 taatctcgag atcagggcgc catggttgat accttatc 38 <210> 83 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 83 atatgcggcc gctccactcc cctggaagta gaggttttc 39 <210> 84 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 gcgtttagcg catcggcggg cagctaccca tacgatgttc cagattacgc tggtgcagct 60 gcaggtcg 68 <210> 85 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 cgccgatgcg ctaaacgcta aaactaaacc agccagcgcc agccaaatct ttttcatagc 60 tgtttcctgt gtgaaattg 79 <210> 86 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 86 ggtgcagctg caggtcg 17 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 87 tttcatagct gtttcctgtg tgaaattg 28 <210> 88 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> k is g or t <400> 88 acctcgagat nnknnknnkn nknnkatcgt gatggtggac gcctacaagc c 51 <210> 89 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 89 attcatatgg tttaccagcg ccaaagacaa aaggg 35 <210> 90 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48) <223> k is g or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51) <223> k is g or t <400> 90 cgacctcgag atgtgcctac tatcgtgatg gtggacnnkn nknnknnknn kgcggccgca 60 ggctctaaag atatcagacc 80 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 91 gatcgttgtc agaagtaagt tggcc 25 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 92 ggccaactta cttctgacaa cgatc 25 <210> 93 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 93 gtccaccatc acgatagtag gcacatctcg aggtcgacct gc 42 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 94 ggatccagtg gtagcgaaaa cc 22 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 95 aaccatggcg ccctgatctc g 21 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 cctcgagatc agggcgccat gg 22 <210> 97 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 gaagtagagg ttttcgctac cactggatc 29 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 gtctgacctg cctcaacctc 20 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 tcaccggaac cagagccac 19 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpyTag002 containing peptide <400> 100 Lys Gly Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 101 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated SpyCatcher002 variant <400> 101 Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Arg 1 5 10 15 Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr 20 25 30 Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly His Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr 35 40 45 Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu 50 55 60 Val Ala Thr Pro Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Asp Gly Gln Val Thr 65 70 75 80 Val Asn Gly

Claims (21)

  1. 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 2-파트 링커로서,
    a) 상기 펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되,
    (i) 위치 1의 X가 아르기닌이거나 아미노산이 없고;
    (ii) 위치 2의 X가 글리신이거나 아미노산이 없고;
    (iii) 위치 5의 X가 히스티딘 또는 트레오닌, 바람직하게는 히스티딘이고;
    (iv) 위치 11의 X가 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
    (v) 위치 14의 X가 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이고;
    상기 위치 1의 X에 아미노산이 없을 때, 위치 2의 X에도 아미노산이 없고; 그리고,
    b) 상기 폴리펩타이드는
    i) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열;
    ii) 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
    iii) 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고, 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
    1) 위치 5에 트레오닌;
    2) 위치 16에 프롤린;
    3) 위치 40에 아르기닌;
    4) 위치 65에 히스티딘;
    5) 위치 92에 프롤린;
    6) 위치 100에 아스파르트산:
    7) 위치 108에 글루탐산; 및
    8) 위치 116에 트레오닌 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로서, 상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는 아미노산 서열; 또는
    iv) 서열번호 101에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고, 위치 10에 리신, 위치 56에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
    1) 위치 16에 아르기닌;
    2) 위치 41에 히스티딘;
    3) 위치 68에 프롤린; 및
    4) 위치 76에 아스파르트산 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로서, 상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 101의 위치들과 동등한 위치들에 있는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분을 포함하고,
    상기 펩타이드 및 폴리펩타이드는 서열번호 1의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34 또는 서열번호 101의 위치 10에 있는 리신 잔기 사이에 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는, 2-파트 링커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드가
    1) 위치 5에 히스티딘;
    2) 위치 11에 알라닌; 및
    3) 위치 14에 아르기닌 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는, 2-파트 링커.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 2-파트 링커.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산 및
    1) 위치 5에 트레오닌;
    2) 위치 16에 프롤린;
    3) 위치 40에 아르기닌;
    4) 위치 65에 히스티딘;
    5) 위치 108에 글루탐산; 및
    6) 위치 116에 트레오닌을 모두 포함하고,
    상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는, 2-파트 링커.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산 및
    1) 위치 5에 트레오닌;
    2) 위치 16에 프롤린;
    3) 위치 40에 아르기닌;
    4) 위치 65에 히스티딘;
    5) 위치 92에 프롤린;
    6) 위치 108에 글루탐산; 및
    7) 위치 116에 트레오닌을 모두 포함하고,
    상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는, 2-파트 링커.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산 및
    1) 위치 5에 트레오닌;
    2) 위치 16에 프롤린;
    3) 위치 40에 아르기닌;
    4) 위치 65에 히스티딘;
    5) 위치 92에 프롤린;
    6) 위치 100에 아스파르트산;
    7) 위치 108에 글루탐산; 및
    8) 위치 116에 트레오닌을 모두 포함하고,
    상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는, 2-파트 링커.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가
    1) 위치 12에 글리신; 및
    2) 위치 22에 트레오닌 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는, 2-파트 링커.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드가 핵산 분자, 단백질, 펩타이드, 소분자 유기 화합물, 형광단(fluorophore), 금속-리간드 착물, 다당류, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자 또는 이들의 조합에 접합되는, 2-파트 링커.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 고체 기질 위에 고정되어 있는, 2-파트 링커.
  10. 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서,
    (i) 위치 1의 X는 아르기닌이거나 아미노산이 없고;
    (ii) 위치 2의 X는 글리신이거나 아미노산이 없고;
    (iii) 위치 5의 X는 히스티딘 또는 트레오닌, 바람직하게는 히스티딘이고;
    (iv) 위치 11의 X는 알라닌, 글리신 또는 발린, 바람직하게는 알라닌이고; 그리고
    (v) 위치 14의 X는 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 아르기닌이고,
    위치 1의 X에 아미노산이 없을 때, 위치 2의 X에도 아미노산이 없고;
    상기 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩타이드 결합은 서열번호 1의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34에 있는 리신 잔기 사이에 형성되는, 펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩타이드가 제2항, 제3항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 펩타이드.
  12. 폴리펩타이드로서,
    i) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열; 또는
    ii) 서열번호 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
    iii) 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 위치 34에 리신, 위치 80에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
    1) 위치 5에 트레오닌;
    2) 위치 16에 프롤린;
    3) 위치 40에 아르기닌;
    4) 위치 65에 히스티딘;
    5) 위치 92에 프롤린;
    6) 위치 100에 아스파르트산:
    7) 위치 108에 글루탐산; 및
    8) 위치 116에 트레오닌 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로서, 상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 2의 위치들과 동등한 위치들에 있는 아미노산 서열; 또는
    iv) 서열번호 101에 제시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 위치 10에 리신, 위치 56에 글루탐산 및 다음 중 하나 이상, 즉
    1) 위치 16에 아르기닌;
    2) 위치 41에 히스티딘;
    3) 위치 68에 프롤린; 및
    4) 위치 76에 아스파르트산 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열로서, 상기 명시된 아미노산 잔기들이 서열번호 101의 위치들과 동등한 위치들에 있는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분을 포함하고,
    상기 폴리펩타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩타이드 결합은 서열번호 5의 위치 10에 있는 아스파르트산 잔기와 서열번호 2의 위치 34 또는 서열번호 101의 위치 10에 있는 리신 잔기 사이에 형성되는, 폴리펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 폴리펩타이드.
  14. 폴리펩타이드 및 제10항 또는 제11항에 정의된 바와 같은 펩타이드 및/또는 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 또는 합성 폴리펩타이드.
  15. 제10항 또는 제11항에 정의된 바와 같은 펩타이드, 제12항 또는 제13항에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 제14항의 재조합 또는 합성 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  16. 제15항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  17. 제15항의 핵산 또는 제16항의 벡터를 포함하는, 세포.
  18. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 생산하거나 발현시키는 방법으로서,
    a) 제15항에 정의된 바와 같은 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계;
    b) 상기 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 발현시키는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로
    c) 상기 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 두 분자 또는 성분을 이소펩타이드 결합을 통해 접합시키기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 2-파트 링커 펩타이드의 용도로서,
    이소펩타이드 결합을 통해 접합된 상기 분자 또는 성분은
    a) 제10항 또는 제11항의 펩타이드를 포함하는 제1 분자 또는 성분; 및
    b) 제12항 또는 제13항의 폴리펩타이드를 포함하는 제2 분자 또는 성분을 포함하는, 용도.
  20. 두 분자 또는 성분을 이소펩타이드 결합을 통해 접합시키는 방법으로서,
    a) 제10항 또는 제11항의 펩타이드를 포함하는 제1 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
    b) 제12항 또는 제13항의 폴리펩타이드를 포함하는 제2 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
    c) 상기 제1 및 제2 분자 또는 성분을, 상기 펩타이드와 폴리펩타이드 사이에 이소펩타이드 결합을 자발적으로 형성할 수 있게 하는 조건 하에 접촉시켜 상기 제1 분자 또는 성분을 상기 제2 분자 또는 성분에 이소펩타이드 결합을 통해 접합시켜 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제19항의 용도 또는 제20항의 방법에 사용하는 것이 바람직한 키트로서,
    상기 키트가
    (a) 분자 또는 성분에 선택적으로 접합 또는 융합된, 제10항 또는 제11항의 펩타이드;
    (b) 분자 또는 성분에 선택적으로 접합 또는 융합된, 제12항 또는 제13항의 폴리펩타이드; 및/또는
    (c) 상기(a)에 정의된 바와 같은 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및
    (d) 상기(b)에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터를 포함하는, 키트.
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