CN117723749B - 基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法。该方法以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；以SpyCatcher与抗原模拟表位肽或纳米抗体融合表达蛋白为检测抗原或检测抗体；以融合表达SpyTag的多价蛋白质载体为交联剂；通过SpyTag‑SpyCatcher反应引发捕获待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测。本发明提供的方法大大提高了动态光散射免疫传感方法的检测灵敏度，具有操作简单，灵敏度高的优点，能够实验复杂样本基质中微量乃至痕量待测物的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法。
背景技术
免疫学快速筛查方法因其特异性强、操作简单、检测成本低等优势，近年来得到了大量的推广和应用。例如，传统酶联免疫吸附法（ELISA）因其高通量、良好的鲁棒性以及易于商品化的特点，已成为应用最为广泛的生物检测分析技术之一。然而，传统ELISA方法显色底物摩尔消光系数较低，造成检测灵敏度相对较低，当待测样本中目标物含量较低时易出现假阳性结果，从而无法满足实际应用的要求。
高灵敏检测信号（如等离子共振、荧光信号、光热信号、动态光散射信号、电化学信号等）常被用于提升免疫学方法的灵敏度。其中，动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）信号因其高效快速、灵敏度高、能够实现均相检测等特点引起了广泛的关注。传统DLS免疫学检测方法通过将抗体标记在金纳米粒子表面，利用抗原抗体的免疫学反应引发金聚集实现检测。然而，由于抗原抗体反应亲和力弱（非共价键），探针的聚集反应效率偏低，该类型DLS检测灵敏度仅略高于ELISA方法2-10倍。此外，由于样本基质对免疫学的干扰，削弱了传统DLS免疫学传感器的检测性能，传统DLS免疫学传感器在实际应用中并不能实现超灵敏检测需求。因此，开发一种聚集反应效率高、抗基质干扰能力强的超灵敏DLS免疫学传感器具有重要意义。例如，现有专利公开号为CN113687063A中以苯硼酸-糖基顺式二醇反应构建交联反应高效聚集动态光散射探针可实现对于糖蛋白的超灵敏检测，灵敏度相较于传统ELISA方法可提升3个数量级，然而免疫学检测中存在大量非糖蛋白类目标物，包括早期疾病诊断中生物标志物，食品安全检测中的农兽药、非法添加物及真菌毒素等均不含有糖基顺式二醇结构。现有专利公开号为CN113687063A中的方法在实际应用中并不适用于所有免疫学检测对象。此外，现有专利公开号为CN113697063A中提到的苯硼酸交联剂在使用过程中，存在苯硼酸易氧化、化学制备工艺复杂等问题，在产业应用中存在一定缺陷。如何实现高亲和力反应与免疫学反应高效整合，开发实际应用价值大、普适性强的免疫学检测方法具有突出的技术难度。
分子粘合剂是一类利用多肽链中赖氨酸残基和天冬酰胺或天冬氨酸残基侧链自发结合形成不可逆共价键（异肽键）的多肽-蛋白质反应对。基于异肽键的多肽-蛋白质反应具有良好的特异性和稳定性。其中，SpyTag/SpyCatcher（多肽/蛋白质）反应对是目前应用最为广泛，性能最优的一种异肽键分子粘合剂。该分子粘合剂起源于化脓性链球菌纤维连接蛋白的结合蛋白 CnaB2 结构域，将该结构域拆分成含 13 个氨基酸残基多肽（SpyTag单元）和含 116 个氨基酸残基蛋白（SpyCatcher单元），即获得了 SpyTag/SpyCatcher 反应对。该反应对反应亲和力趋近于无限，并且该反应可在非常广泛的条件下（包括不同 pH、不同盐粒子浓度、不同温度、不同氧化还原条件及各种去污剂中）自发重组形成异肽键；此外，该系统无论是插入到蛋白质 C 端、N 端或是在内部位置，均不会影响其反应活性。目前，SpyTag/SpyCatcher 分子粘合剂在疫苗合成、纳米生物反应器开发以及蛋白质固定化等领域得到了广泛的应用，然而在动态光散射免疫传感检测领域未有报道，如何利用SpyTag/SpyCatcher 分子粘合剂构建免疫学检测探针以及交联剂，开发动态光散射免疫传感检测新方法具有一定的技术难度。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法，具体采用以下的技术方案：
一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法，所述动态光散射免疫传感检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以SpyCatcher与抗原模拟表位肽或纳米抗体融合表达蛋白为检测抗原或检测抗体；
以融合表达SpyTag的多价蛋白质载体为交联剂；
通过SpyTag-SpyCatcher反应引发捕获待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；上述交联剂中含SpyTag数目不少于12个。
其中，SpyTag/SpyCatcher是一类基于异肽键的多肽-蛋白质反应对，可通过氨基酸残基之间的自发反应形成异肽键（不可逆共价键），反应亲和力趋近于无限，并且该反应可在非常广泛的条件下（包括不同 pH、不同盐粒子浓度、不同温度、不同氧化还原条件及各种去污剂中）自发重组形成异肽键；此外，该系统无论是插入到蛋白质 C 端、N 端或是在内部位置，均不会影响其反应活性；另外含SpyTag数目过少不利于交联反应。
上述的动态光散射免疫传感检测方法，包括以下步骤：
S1：将特异性免疫识别元件标记在磁性载体的表面，得到磁性探针；
S2：采用融合表达的方法将SpyCatcher基因通过柔性linker与小分子模拟表位肽或纳米抗体基因首尾连接，在大肠杆菌表达系统中表达，得到检测探针；
S3：采用融合表达的方法将Spytag基因通过柔性linker与能够自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质基因首尾连接，在大肠杆菌表达系统中表达，得到多价交联剂；
S4：将磁性探针和检测探针加入到待测目标物溶液中，在37℃的条件下，反应，磁吸，洗涤，然后加入多价交联剂，继续反应，反应结束后，得到反应待检样品，最后通过马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中目标物的含量。
作为进一步优选的实施方式，上述特异性免疫识别元件为单克隆抗体或者适配体。
作为进一步优选的实施方式，上述磁性载体为表面为羧基或氨基的磁性纳米材料。该磁性载体的粒径为70 nm-500 nm。粒径过小磁性载体回收性能差/弱，粒径过大易发生沉降不利于交联反应。
作为进一步优选的实施方式，步骤S2和步骤S3中所述柔性linker为（GGGGS）n，其中n取1、2、3中任一正整数。当n取1时，linker的序列如SEQ ID NO：19所示：GGGGS；当n取2时，linker的序列如SEQ ID NO：20所示：GGGGSGGGGS；当n取3时，linker的序列如SEQ IDNO：21所示：GGGGSGGGGSGGGGS；在具体实验过程中根据不同蛋白大小，选择合适的linker数量，从而可以有效避免空间位阻影响蛋白质反应效率。
作为进一步优选的实施方式，上述能够自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质包括铁蛋白、I3-01蛋白中的至少一种。
作为进一步优选的实施方式，上述步骤S4的具体过程如下：
若待测目标物为小分子时：将目标待测溶液中加入磁性探针和检测探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min，反应结束后加入pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后，再加入多价交联剂，反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量；
若待测目标物为大分子时：将目标待测溶液加入磁性探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后加入检测探针，继续反应，反应结束后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤，再加入多价交联剂反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量。上述磷酸缓冲液的浓度为0.01 mol/L。
本发明还提供了一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法在对非糖蛋白类物质检测中的应用，该非糖蛋白类物质为p24抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素A或赭曲霉毒素A。
本发明的有益效果为：本发明首次公开了一种基于SpyTag/SpyCatcher反应对的动态光散射免疫传感检测新方法，该方法使用免疫识别元件标记的磁性载体作为免疫探针，利用SpyTag-SpyCatcher可基因改造的优势，采用融合表达方式制备含有Spy单元的检测探针以及多价交联剂，通过SpyTag/SpyCatcher系统超强的反应亲和力以及极高的反应效率实现对目标物的快速超灵敏检测。本发明的方法与传统方法相比，操作简单，在短时间内可实现超灵敏检测，且所制备的免疫磁珠可将目标物从复杂的样本基质汇总分离富集出来，有效消除了样本基质对后续检测的干扰。此外，本发明与现有专利CN113687063A相比可实现对于非糖蛋白类目标物（例如p24抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素A、赭曲霉毒素A等）的检测，可覆盖近乎全部免疫学检测目标物，并且通过大肠杆菌表达体系可实现大批量制备检测试剂，无复杂化学工艺修饰，绿色无毒无害，具有突出的实际应用前景。
附图说明
图1所示为本发明的原理图；
图2所示为基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射均相免疫分析检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的标准曲线；
图3所示为基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射均相免疫分析检测玉米中赭曲霉毒素A的标准曲线；
图4所示为基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射均相免疫分析检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素A的标准曲线；
图5所示为基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射均相免疫分析检测牛肉中金黄色葡萄球菌肠毒素A的标准曲线；
图6所示为基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射均相免疫分析检测HIV病患血清中p24抗原的标准曲线。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干个实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本文中，除非另有说明，用语“％”是指“质量％”；用语“μg/mL”是指：微克每毫升。在本文中，除非另有说明，本文用语“％”均是指基于本申请组合物的总重量而言的。
在本文中，限定的所有范围是指：包括给定范围内的每个特定范围以及给定范围之间的子范围的组合。例如，1～5的范围具体包括1、2、3、4和5，也包括如2～5、3～5、2～3、2～4、1～4等子范围。
实施例1
一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法，其原理见图1所示，其动态光散射免疫传感检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以SpyCatcher与抗原模拟表位肽或纳米抗体融合表达蛋白为检测抗原或检测抗体；
以融合表达SpyTag的多价蛋白质载体为交联剂；
通过SpyTag-SpyCatcher反应引发捕获待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；上述交联剂中含SpyTag数目不少于12个。
实施例2
基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射免疫传感检测方法用于葡萄酒中OTA的含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
1.1 羧基化磁性载体制备免疫磁珠
取商业化羧基表面180 nm磁珠100 μg加入到500 μL的pH为6.0 的磷酸盐缓冲液中，随后加入5 μg单克隆抗体，于室温下搅拌反应30 min后，加入0.5 μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）反应30 min，重复3次，随后加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭，室温搅拌1 h后，磁吸5 min后弃上清，pH为7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗三遍后，重悬于pH为7.5 的磷酸盐缓冲液中，于4℃保存。
2 检测探针的制备
2.1赭曲霉毒素A检测探针基因序列构建
已知赭曲霉毒素A（OTA）模拟表位肽氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示：GMSWMMA，SpyCatcher氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示：VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过柔性Linker将OTA模拟表位肽连接在SpyCatcher氨基酸的N端，得到OTA检测探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示：GMSWMMAGGGGSVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过蛋白质逆转录翻译得到OTA检测探针的基因序列为SEQ ID NO：4所示：ggcatgagctggatgatggcgggcggcggcggcagcgtgaccaccctgagcggcctgagcggcgaacagggcccgagcggcgatatgaccaccgaagaagatagcgcgacccatattaaatttagcaaacgcgatgaagatggccgcgaactggcgggcgcgaccatggaactgcgcgatagcagcggcaaaaccattagcacctggattagcgatggccatgtgaaagatttttatctgtatccgggcaaatatacctttgtggaaaccgcggcgccggatggctatgaagtggcgaccccgattgaatttaccgtgaacgaagatggccaggtgaccgtggatggcgaagcgaccgaaggcgatgcgcatacc。
2.2 OTA检测探针的诱导表达
（1）将基因序列SEQ ID NO：4送公司合成得到含有OTA检测探针基因片段的pET22b质粒载体；
（2）将1 ng该质粒载体在冰浴中转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后在冰浴中静置30 min后转移至42℃水浴热激45 s，迅速放回冰中放置2 min后，添加0.7 mL不含抗生素的LB培养基；
（3）37℃振荡培养1h，吸取适量体积均匀涂布到含有100 μg/mL氨苄抗生素（AMP）的LB琼脂培养基平板中；
（4）37℃正置至液体被吸收，然后倒置37℃过夜培养。挑取单菌落接种至10ml LB液体培养基（含AMP 100 μg/mL），37℃振荡培养8 h；
（5）按1：50的比例将活化的菌液扩大培养，当OD590在0.5-1.8范围内加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1 mmol/L，于25℃，180 rpm培养6h后离心去除上清。
2.3 OTA检测探针的纯化
（1）沉淀用15 mL 上样缓冲液复溶，超声破碎1h后收集上清，得重组蛋白液；
（2）取Ni纯化柱，去除保护液后，加入3mL上样缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（3）将重组蛋白溶液加进柱子中，加入3mL洗涤缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（4）用1mL 洗脱缓冲液洗脱蛋白，重复五次；
（5）收集洗脱下来的重组蛋白溶液，用PBS 7.5缓冲液低温透析72h后，于4℃保存。
3 多价交联剂的制备
3.1 基于铁蛋白的多价交联剂基因序列构建
已知SpyTag氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示：RGVPHIVMVDAYKRYK，铁蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示：MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPGLLMQGGE，通过柔性Linker将SpyTag连接在铁蛋白氨基酸序列的N端，得到多价交联剂的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示：RGVPHIVMVDAYKRYKGGGGSMLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPGLLMQGGE，通过蛋白质逆转录翻译得到多价交联剂的基因序列为SEQID NO：8所示：cgcggcgtgccgcatattgtgatggtggatgcgtataaacgctataaaggcggcggcggcagcatgctgagcgaacgcatgctgaaagcgctgaacgatcagctgaaccgcgaactgtatagcgcgtatctgtattttgcgatggcggcgtattttgaagatctgggcctggaaggctttgcgaactggatgaaagcgcaggcggaagaagaaattggccatgcgctgcgcttttataactatatttatgatcgcaacggccgcgtggaactggatgaaattccgaaaccgccgaaagaatgggaaagcccgctgaaagcgtttgaagcggcgtatgaacatgaaaaatttattagcaaaagcatttatgaactggcggcgctggcggaagaagaaaaagattatagcacccgcgcgtttctggaatggtttattaacgaacaggtggaagaagaagcgagcgtgaaaaaaattctggataaactgaaatttgcgaaagatagcccgcagattctgtttatgctggataaagaactgagcgcgcgcgcgccgaaactgccgggcctgctgatgcagggcggcgaa。
3.2基于铁蛋白的多价交联剂的诱导表达
（1）将基因序列SEQ ID NO：8送公司合成得到含有多价交联剂基因片段的pET22b质粒载体；
（2）将1 ng该质粒载体在冰浴中转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后在冰浴中静置30 min后转移至42℃水浴热激45 s，迅速放回冰中放置2 min后，添加0.7 mL不含抗生素的LB培养基；
（3）37℃振荡培养1h，吸取适量体积均匀涂布到含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基平板中；
（4）37℃正置至液体被吸收，然后倒置37℃过夜培养。挑取单菌落接种至10ml LB液体培养基（含AMP 100 μg/ml），37℃振荡培养8 h；
（5）按1：50的比例将活化的菌液扩大培养，当OD590在0.5-1.8范围内加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，于25℃，180 rpm培养6h后离心去除上清。
3.3基于铁蛋白的多价交联剂的纯化
（1）沉淀用15 mL 上样缓冲液复溶，超声破碎1h后收集上清，得重组蛋白液；
（2）取Ni纯化柱，去除保护液后，加入3mL上样缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（3）将重组蛋白溶液加进柱子中，加入3mL洗涤缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（4）用1ml 洗脱缓冲液洗脱蛋白，重复五次；
（5）收集洗脱下来的重组蛋白溶液，用PBS 7.5缓冲液低温透析72h后，于4℃保存。
4 葡萄酒中OTA的含量的检测
4.1 样本前处理
葡萄酒样本用10 mol/L NaHCO3调节pH至7.0后，用1% PEG8000稀释后，置于4℃冰箱备用；
4.2用本发明检测方法进行OTA含量的测定：
在待测OTA加标葡萄酒样本溶液中加入5 μg免疫磁珠和0.2 μg OTA检测探针，37℃反应20 min后，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入5.3 μg多价分子交联剂反应15 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中小分子化合物的含量；
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL、0.78 pg/mL、0.39 pg/mL、0.2 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径变化值。
竞争抑制率的计算，标准品或样本的竞争抑制率等于第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径变化值减去标准品或样本的平均水化动力学粒径变化值，再除于第一个标准（0标准），即竞争抑制率（%）=（B0-B）/B0*100%，其中B0为第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径，B为标准品或样本的平均水化动力学粒径。
以竞争抑制率与OTA标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=10.37ln(x)+32.33，R2=0.992，见图2。该方法学的最低检测限被定义为竞争抑制率为10%时所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测限为0.116 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值计算得到竞争抑制率，代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中OTA的实际浓度。因此，在上述葡萄酒中OTA的含量的检测中，测量样本平均水化粒径变化值为30.7 nm，阴性样本平均水化粒径变化值为156.2 nm，计算得抑制率为80.35%，代入标准曲线中，计算得样本浓度为102.59 pg/mL，乘以初始稀释倍数10倍，得样本中OTA实际浓度为1.03 ng/mL。
实施例3
基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射免疫传感检测方法用于玉米中OTA的含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
1.1氨基化磁性载体制备免疫磁珠
取商业化氨基表面150 nm磁珠100 μg加入到500 μL含有5%戊二醛的PBS 7.5缓冲液中，室温下震荡2h后，磁吸5 min去除上清，用pH为7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗三遍后，重悬于500 μL pH为7.5 的磷酸盐缓冲液中。随后向其中加入1 nmol氨基化适配体，在室温下震荡2h后，加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭后，磁吸5 min去除上清，用pH为7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗三遍后，重悬于500 μL，pH为7.5 的磷酸盐缓冲液中，于4℃保存。
上述制备过程中氨基化适配体的序列可以表示为5'-A-3'，其中A的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示：GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA。
2 检测探针的制备
如实施例2所述。
3 多价交联剂的制备
如实施例2所述。
4 玉米中OTA的含量的检测
4.1样本前处理
取5.0 g玉米样本，在涡旋振荡下，用25 mL甲醇/水溶液（80%:20%， v/v）提取玉米样本基质20 min后，以10000 rpm转速离心5 min，去除沉淀，将上清液稀释20倍后于4℃下储存。
4.2用本发明检测方法进行OTA含量的测定：
在待测OTA加标玉米样本溶液中加入5 μg免疫磁珠和0.2 μg OTA检测探针，37℃反应20 min后，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入5.3 μg多价分子交联剂反应15 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中小分子化合物的含量；
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.13 pg/mL、1.56 pg/mL、0.78 pg/mL、0.39 pg/mL、0.2 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径变化值。
竞争抑制率的计算，标准品或样本的竞争抑制率等于第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径变化值减去标准品或样本的平均水化动力学粒径变化值，再除于第一个标准（0标准），即竞争抑制率（%）=（B0-B）/B0*100%，其中B0为第一个标准（0标准）的平均水化动力学粒径，B为标准品或样本的平均水化动力学粒径。
以竞争抑制率与OTA标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=10.77ln(x)+24.91，R2=0.992，见图3。该方法学的最低检测限被定义为竞争抑制率为10%时所需的抗原浓度。通过该标准曲线计算得最低检测限为0.25 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值计算得到竞争抑制率，代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中OTA的实际浓度。因此，上述玉米中OTA的含量检测中，测量样本平均水化粒径变化值为162.1 nm，阴性样本平均水化粒径变化值为99.3 nm，计算得抑制率为38.74%，代入标准曲线中，计算得样本浓度为3.6 pg/mL，乘以初始稀释倍数16倍，得样本中OTA实际浓度为57.78 pg/mL.
实施例4
基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射免疫传感检测方法用于牛奶中SEA含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
1.1 羧基化磁性载体制备免疫磁珠
取商业化羧基表面180 nm磁珠100 μg加入到500 μL的pH为6.0 的磷酸盐缓冲液中，随后加入5 μg单克隆抗体，于室温下搅拌反应30 min后，加入0.5 μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）反应30 min，重复3次，随后加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭，室温搅拌1 h后，磁吸5 min后弃上清，pH为7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗三遍后，重悬于pH为7.5 的磷酸盐缓冲液中，于4℃保存。
2 检测探针的制备
2.1金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）检测探针基因序列构建
已知SEA纳米抗体氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTDSARGVSLDHYAIGWFRQAPGKEREAVSCISRSGRNTAIADSVKGRFTISRDNAMNTVTLQMNSLNPEDTAVYICAARPTPFNECEMSEGWFTYWGQGTQVTVSS，SpyCatcher氨基酸序列与实施例2中SEQ ID NO：2序列相同，其序列为：VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过柔性Linker将SEA纳米抗体连接在SpyCatcher氨基酸序列的N端，得到SEA检测探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTDSARGVSLDHYAIGWFRQAPGKEREAVSCISRSGRNTAIADSVKGRFTISRDNAMNTVTLQMNSLNPEDTAVYICAARPTPFNECEMSEGWFTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过蛋白质逆转录翻译得到SEA检测探针的基因序列为SEQ ID NO：12所示：caggtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcaccgatagcgcgcgcggcgtgagcctggatcattatgcgattggctggtttcgccaggcgccgggcaaagaacgcgaagcggtgagctgcattagccgcagcggccgcaacaccgcgattgcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgatgaacaccgtgaccctgcagatgaacagcctgaacccggaagataccgcggtgtatatttgcgcggcgcgcccgaccccgtttaacgaatgcgaaatgagcgaaggctggtttacctattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtgaccaccctgagcggcctgagcggcgaacagggcccgagcggcgatatgaccaccgaagaagatagcgcgacccatattaaatttagcaaacgcgatgaagatggccgcgaactggcgggcgcgaccatggaactgcgcgatagcagcggcaaaaccattagcacctggattagcgatggccatgtgaaagatttttatctgtatccgggcaaatatacctttgtggaaaccgcggcgccggatggctatgaagtggcgaccccgattgaatttaccgtgaacgaagatggccaggtgaccgtggatggcgaagcgaccgaaggcgatgcgcatacc。
2.2 SEA检测探针的诱导表达
（1）将基因序列SEQ ID NO：12送公司合成得到含有SEA检测探针基因片段的pET22b质粒载体；
（2）将1 ng该质粒载体在冰浴中转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后在冰浴中静置30 min后转移至42℃水浴热激45 s，迅速放回冰中放置2 min后，添加0.7 mL不含抗生素的LB培养基；
（3）37℃振荡培养1h，吸取适量体积均匀涂布到含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基平板中；
（4）37℃正置至液体被吸收，然后倒置37℃过夜培养。挑取单菌落接种至10ml LB液体培养基（含AMP 100 μg/mL），37℃振荡培养8 h；
（5）按1：50的比例将活化的菌液扩大培养，当OD590在0.5-1.8范围内加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，于25℃，180 rpm培养6h后离心去除上清。
2.3 SEA检测探针的纯化
（1）沉淀用15 mL 上样缓冲液复溶，超声破碎1h后收集上清，得重组蛋白液；
（2）取Ni纯化柱，去除保护液后，加入3mL 上样缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（3）将重组蛋白溶液加进柱子中，加入3mL 洗涤缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（4）用1mL 洗脱缓冲液洗脱蛋白，重复五次；
（5）收集洗脱下来的重组蛋白溶液，用PBS 7.5缓冲液低温透析72h后，于4℃保存。
3 多价交联剂的制备
3.1基于I3-01蛋白的多价交联剂基因序列构建
已知SpyTag氨基酸序列与实施例2中SEQ ID NO：5相同，其序列为：RGVPHIVMVDAYKRYK，I3-01蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示：MKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKKKALAVFLGGVHLIEITFTVPDADTVIELSFLKEMGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPVEVAEKAKAFVEKIRGCTE，通过柔性Linker将SpyTag连接在I3-01蛋白氨基酸序列的N端，得到多价交联剂的氨基酸序列为SEQ ID NO：14所示：RGVPHIVMVDAYKRYKGGGGSMKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKKKALAVFLGGVHLIEITFTVPDADTVIELSFLKEMGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPVEVAEKAKAFVEKIRGCTE，通过蛋白质逆转录翻译得到多价交联剂的基因序列为SEQ ID NO：15所示：cgcggcgtgccgcatattgtgatggtggatgcgtataaacgctataaaggcggcggcggcagcatgaaaatggaagaactgtttaaaaaacataaaattgtggcggtgctgcgcgcgaacagcgtggaagaagcgaaaaaaaaagcgctggcggtgtttctgggcggcgtgcatctgattgaaattacctttaccgtgccggatgcggataccgtgattgaactgagctttctgaaagaaatgggcgcgattattggcgcgggcaccgtgaccagcgtggaacagtgccgcaaagcggtggaaagcggcgcggaatttattgtgagcccgcatctggatgaagaaattagccagttttgcaaagaaaaaggcgtgttttatatgccgggcgtgatgaccccgaccgaactggtgaaagcgatgaaactgggccataccattctgaaactgtttccgggcgaagtggtgggcccgcagtttgtgaaagcgatgaaaggcccgtttccgaacgtgaaatttgtgccgaccggcggcgtgctggataacgtgtgcgaatggtttaaagcgggcgtgctggcggtgggcgtgggcagcgcgctggtgaaaggcaccccggtggaagtggcggaaaaagcgaaagcgtttgtggaaaaaattcgcggctgcaccgaa。
3.2 基于I3-01蛋白的多价交联剂的诱导表达
（1）将基因序列SEQ ID NO：15送公司合成得到含有多价交联剂基因片段的pET22b质粒载体；
（2）将1 ng该质粒载体在冰浴中转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后在冰浴中静置30 min后转移至42℃水浴热激45 s，迅速放回冰中放置2 min后，添加0.7 mL不含抗生素的LB培养基；
（3）37℃振荡培养1h，吸取适量体积均匀涂布到含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基平板中；
（4）37℃正置至液体被吸收，然后倒置37℃过夜培养。挑取单菌落接种至10ml LB液体培养基（含AMP 100 μg/ml），37℃振荡培养8 h；
（5）按1：50的比例将活化的菌液扩大培养，当OD590在0.5-1.8范围内加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，于25℃，180 rpm培养6h后离心去除上清。
3.3 基于I3-01蛋白的多价交联剂的纯化
（1）沉淀用15 mL 上样缓冲液复溶，超声破碎1h后收集上清，得重组蛋白液；
（2）取Ni纯化柱，去除保护液后，加入3mL 上样缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（3）将重组蛋白溶液加进柱子中，加入3mL 洗涤缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（4）用1mL 洗脱缓冲液洗脱蛋白，重复五次；
（5）收集洗脱下来的重组蛋白溶液，用PBS 7.5缓冲液低温透析72h后，于4℃保存；
4 牛奶中SEA含量的检测
4.1 样本前处理
牛奶样本离心至明显分层，取中间层置于4℃冰箱备用。
4.2 用本发明检测方法进行SEA含量的测定
在0.1 mL待测SEA加标牛奶样本中加入5 μg免疫磁珠，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入0.1 μg SEA检测探针，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入4 μg多价分子交联剂反应10 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中SEA的含量。
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125pg/mL、62.5 pg/mL、31.3 pg/mL、15.6 pg/mL、7.8 pg/mL、3.9 pg/mL、1.95 pg/mL、0.98pg/mL、0.49 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径。
以平均水化动力学粒径与SEA标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=35.11ln(x)+182.11，R2=0.980，见图4。该方法学的最低检测限被定义20个第一个标准（0标准时溶液的平均水化粒径）时平均水化粒径加上3倍标准偏差（3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差），所需的抗原浓度，通过该标准曲线计算得最低检测限为1.57 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度。因此，牛奶中SEA含量的检测中，测量样本平均水化粒径为299.2 nm，代入标准曲线中，计算得样本浓度为28.06 pg/mL，乘以初始稀释倍数3倍，得样本中SEA实际浓度为84.18 pg/mL。
实施例5
基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射免疫传感检测方法用于牛肉中SEA含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
如实施例4所述。
2 检测探针的制备
如实施例4所述。
3 多价交联剂的制备
如实施例4所述。
4 牛肉中SEA含量的检测
4.1 样本前处理
称取10g 牛肉样品绞碎，加15mL 水进行均质，振摇15min。于15℃，3500g 离心10min。取 5mL 上层悬浮液加入等体积庚烷，充分混匀 5后于15℃，3500g 离心5min。将上部有机相(庚烷层)全部弃去，将下部水相层进行过滤除菌后于4℃保存。
4.2 用本发明检测方法进行SEA含量的测定
在0.1 mL待测SEA加标牛肉样本中加入5 μg免疫磁珠，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入0.1 μg SEA检测探针，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入4 μg多价分子交联剂反应10 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中SEA的含量。
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125pg/mL、62.5 pg/mL、31.3 pg/mL、15.6 pg/mL、7.8 pg/mL、3.9 pg/mL、1.95 pg/mL、0.98pg/mL、0.49 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径。
以平均水化动力学粒径与SEA标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=33.45ln(x)+161，R2=0.9827，见图5。该方法学的最低检测限被定义20个第一个标准（0标准时溶液的平均水化粒径）时平均水化粒径加上3倍标准偏差（3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差），所需的抗原浓度，通过该标准曲线计算得最低检测限为3.5 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度。因此，上述肉中SEA含量的检测中，测量样本平均水化粒径为366.5 nm，代入标准曲线中，计算得样本浓度为465.94 pg/mL，乘以初始稀释倍数5倍，得样本中SEA实际浓度为2.33 ng/mL.
实施例6
基于SpyTag-SpyCatcher反应的动态光散射免疫传感检测方法用于HIV病患血清中p24抗原含量的检测实验
1 免疫磁珠的制备
1.1 羧基化磁性载体制备免疫磁珠
取商业化羧基表面180 nm磁珠100 μg加入到500 μL的pH为6.0 的磷酸盐缓冲液中，随后加入5 μg 抗p24抗原单克隆抗体，于室温下搅拌反应30 min后，加入0.5 μg EDC反应30 min，重复3次，随后加入质量体积分数为1%的牛血清白蛋白进行封闭，室温搅拌1 h后，磁吸5 min后弃上清，pH为7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗三遍后，重悬于pH为7.5 的磷酸盐缓冲液中，于4℃保存。
2 检测探针的制备
2.1 p24抗原检测探针基因序列构建
已知p24纳米抗体氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示：DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISRFNAMGWWRQAPGKEREFVARIVKGFDPVLDSVKGRFTISIDSAENTLALQMNRLKPEDTAVYYCFAALDTAYWGQGTQVTVSS，SpyCatcher氨基酸序列与实施例2中SEQ ID NO：2序列相同，其序列为：VTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过柔性Linker将SEA纳米抗体连接在SpyCatcher氨基酸序列的N端，得到SEA检测探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示：DVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISRFNAMGWWRQAPGKEREFVARIVKGFDPVLDSVKGRFTISIDSAENTLALQMNRLKPEDTAVYYCFAALDTAYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT，通过蛋白质逆转录翻译得到SEA检测探针的基因序列为SEQ ID NO：18所示：gatgtgcagctgcaggaaagcggcggcggcctggtgcaggcgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggcagcattagccgctttaacgcgatgggctggtggcgccaggcgccgggcaaagaacgcgaatttgtggcgcgcattgtgaaaggctttgatccggtgctggatagcgtgaaaggccgctttaccattagcattgatagcgcggaaaacaccctggcgctgcagatgaaccgcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgctttgcggcgctggataccgcgtattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtgaccaccctgagcggcctgagcggcgaacagggcccgagcggcgatatgaccaccgaagaagatagcgcgacccatattaaatttagcaaacgcgatgaagatggccgcgaactggcgggcgcgaccatggaactgcgcgatagcagcggcaaaaccattagcacctggattagcgatggccatgtgaaagatttttatctgtatccgggcaaatatacctttgtggaaaccgcggcgccggatggctatgaagtggcgaccccgattgaatttaccgtgaacgaagatggccaggtgaccgtggatggcgaagcgaccgaaggcgatgcgcatacc。
2.2 p24抗原检测探针的诱导表达
（1）将基因序列SEQ ID NO：18送公司合成得到含有p24抗原检测探针基因片段的pET22b质粒载体；
（2）将1 ng该质粒载体在冰浴中转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，随后在冰浴中静置30 min后转移至42℃水浴热激45 s，迅速放回冰中放置2 min后，添加0.7 mL不含抗生素的LB培养基；
（3）37℃振荡培养1h，吸取适量体积均匀涂布到含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基平板中；
（4）37℃正置至液体被吸收，然后倒置37℃过夜培养。挑取单菌落接种至10ml LB液体培养基（含AMP 100 μg/ml），37℃振荡培养8 h；
（5）按1：50的比例将活化的菌液扩大培养，当OD590在0.5-1.8范围内加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，于25℃，180 rpm培养6h后离心去除上清。
2.3 p24抗原检测探针的纯化
（1）沉淀用15 mL上样缓冲液复溶，超声破碎1h后收集上清，得重组蛋白液；
（2）取Ni纯化柱，去除保护液后，加入3mL 上样缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（3）将重组蛋白溶液加进柱子中，加入3mL 洗涤缓冲液，对柱子进行清洗，重复三次；
（4）用1ml 洗脱缓冲液洗脱蛋白，重复五次；
（5）收集洗脱下来的重组蛋白溶液，用PBS 7.5缓冲液低温透析72h后，于4℃保存。
3 多价交联剂的制备
如实施例4所述。
4 HIV病患血清中p24抗原含量的检测
4.1 样本前处理
将已在医院通过化学发光定量的p24抗原阳性样本用PB 7.5缓冲液（0.01 M）稀释，浓度按照所需的实际检测限确定，稀释后的p24抗原于4℃下储存。
4.2 用本发明检测方法进行p24抗原含量的测定
在0.1 mL待测p24抗原样本中加入5 μg免疫磁珠，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入0.1 μg p24抗原检测探针，37℃反应15 min，用PB 7.5磁吸洗涤2次后，加入5 μg多价分子交联剂反应10 min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定血清样本中p24抗原的含量。
4.3 分析结果
取上述制备的13个不同浓度的标准品500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5pg/mL、31.3 pg/mL、15.6 pg/mL、7.8 pg/mL、3.9 pg/mL、1.95 pg/mL、0.98 pg/mL、0.49pg/mL、0.24 pg/mL和0，在马尔文纳米粒度仪上测定溶液对应的平均水化动力学粒径。
以平均水化动力学粒径与p24抗原标准品浓度的对数值绘制竞争抑制曲线。求出直线方程。标准曲线为，y=31.58ln(x)+195.15，R2=0.9884，见图6。该方法学的最低检测限被定义20个第一个标准（0标准时溶液的平均水化粒径）时平均水化粒径加上3倍标准偏差（3倍的第一个标准样品三个平行样品的标准偏差），所需的抗原浓度，通过该标准曲线计算得最低检测限为1.24 pg/mL。当进行实际样本检测时，将样本的平均水化粒径值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的样本浓度。因此，上述HIV病患血清中p24抗原含量的检测中，测量样本平均水化粒径为353.2 nm，代入标准曲线中，计算得样本浓度为149.17 pg/mL，乘以初始稀释倍数20倍，得样本中p24抗原实际浓度为2.98 ng/mL。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
Claims (10)
1.一种基于分子粘合剂的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，所述动态光散射免疫传感检测方法包括：
以识别元件标记的免疫磁珠为动态光散射捕获探针；
以SpyCatcher与抗原模拟表位肽或纳米抗体融合表达蛋白为检测抗原或检测抗体；
以融合表达SpyTag的多价蛋白质载体为交联剂；
通过SpyTag-SpyCatcher反应引发捕获待测物的免疫磁珠复合物发生交联反应，进而使免疫磁珠平均水化动力学粒径发生变化，通过监控免疫磁珠水化动力学粒径变化实现待测物的检测；所述交联剂中含SpyTag数目不少于12个。
2.根据权利要求1所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将特异性免疫识别元件标记在磁性载体的表面，得到磁性探针；
S2：采用融合表达的方法将SpyCatcher基因通过柔性linker与小分子模拟表位肽或纳米抗体基因首尾连接，在大肠杆菌表达系统中表达，得到检测探针；
S3：采用融合表达的方法将Spytag基因通过柔性linker与能够自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质基因首尾连接，在大肠杆菌表达系统中表达，得到多价交联剂；
S4：将磁性探针和检测探针加入到待测目标物溶液中，在37℃的条件下，反应，磁吸，洗涤，然后加入多价交联剂，继续反应，反应结束后，得到反应待检样品，最后通过马尔文纳米粒度仪测定溶液的平均水化动力学粒径，利用水化动力学粒径变化测定反应待检样品中目标物的含量。
3.根据权利要求2所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，所述特异性免疫识别元件为单克隆抗体或者适配体。
4.根据权利要求2所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，所述磁性载体为表面为羧基或氨基的磁性纳米材料。
5.根据权利要求4所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，所述磁性载体的粒径为70 nm-500 nm。
6.根据权利要求2所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，步骤S2和步骤S3中所述柔性linker为（GGGGS）n，其中n取1、2、3中任一正整数。
7.根据权利要求2所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，所述能够自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质包括铁蛋白、I3-01蛋白中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，步骤S4的具体过程如下：
若待测目标物为小分子时：将目标待测溶液中加入磁性探针和检测探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min，反应结束后加入pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后，再加入多价交联剂，反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量；
若待测目标物为大分子时：将目标待测溶液加入磁性探针，在温度为37℃的条件下反应5 min-20 min后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤2-3次后加入检测探针，继续反应，反应结束后，用pH为7.5的磷酸缓冲液磁吸洗涤，再加入多价交联剂反应5 min-20 min，最后测定平均水化动力学粒径确定目标物的含量。
9.根据权利要求8所述的动态光散射免疫传感检测方法，其特征在于，磷酸缓冲液的浓度为0.01 mol/L。
10.权利要求1-9任一项所述的动态光散射免疫传感检测方法在对非糖蛋白类物质检测中的应用，其特征在于，所述非糖蛋白类物质为p24抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素A或赭曲霉毒素A。
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