CN117706083A - 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117706083A CN117706083A CN202311795986.1A CN202311795986A CN117706083A CN 117706083 A CN117706083 A CN 117706083A CN 202311795986 A CN202311795986 A CN 202311795986A CN 117706083 A CN117706083 A CN 117706083A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lys
- antibody
- polypeptide
- avidin
- detection antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 162
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 100
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 99
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 51
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 51
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 47
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2,6-dimethylphenoxy]carbonylacridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C=1C(C)=C(OC(=O)C=2C3=CC=CC=C3[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C3C=CC=CC3=2)C(C)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutyl]-(4-methylphenyl)sulfonylcarbamoyl]acridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(=O)C=1C2=CC=CC=C2[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C2C=CC=CC2=1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KQFCNGKUXYNDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 36
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 36
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 23
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 21
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 21
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 90
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 82
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 37
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 30
- 102100036859 Troponin I, cardiac muscle Human genes 0.000 description 27
- 101710128251 Troponin I, cardiac muscle Proteins 0.000 description 27
- -1 acridine ester Chemical class 0.000 description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 19
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 18
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 16
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 16
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 16
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 16
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 16
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 15
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 14
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 14
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 13
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 12
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 12
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 8
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N Tetrazine Chemical compound C1=CN=NN=N1 DPOPAJRDYZGTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 3
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- ZKPMRASGLDBKPF-OWOJBTEDSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[[(4e)-cyclooct-4-en-1-yl]oxycarbonylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCOCCOCCOCCOCCNC(=O)OC1CCC\C=C\CC1 ZKPMRASGLDBKPF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- LGTUBYUOUFRQNT-IPIKRLCPSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LGTUBYUOUFRQNT-IPIKRLCPSA-N 0.000 description 1
- RQJMOCIAILRHIC-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RQJMOCIAILRHIC-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- NTOKKQYUXMUQQD-GDZDFWBTSA-N (2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NTOKKQYUXMUQQD-GDZDFWBTSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQSIXGDDUJJEQH-QRPNPIFTSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DQSIXGDDUJJEQH-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- YQWJKRXJKVPHPG-OMSMUOAWSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YQWJKRXJKVPHPG-OMSMUOAWSA-N 0.000 description 1
- XCDJMQRPMLFIHY-PZMMFNHRSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 XCDJMQRPMLFIHY-PZMMFNHRSA-N 0.000 description 1
- WZRCIGBUPHVZGH-OFAFANGBSA-N 2-aminoacetic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WZRCIGBUPHVZGH-OFAFANGBSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- NHFPQEWGDJGKPO-OMSMUOAWSA-N NCC(O)=O.CC(C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 Chemical compound NCC(O)=O.CC(C)[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NHFPQEWGDJGKPO-OMSMUOAWSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 1
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000004905 tetrazines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
本申请涉及一种化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。该检测试剂盒包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。该试剂盒利用检测抗体与亲和素偶联物再标记发光物的一重信号放大、亲和素与生物素特异性结合的一重信号放大、多肽标记发光物的一重信号放大组合，即聚体复合物、亲和素‑生物素体系和多肽的多重放大的模式组合一起可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，减少非特异性吸附。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
免疫分析技术经历了酶免分析技术(EIA)、放射免疫分析技术(RIA)、荧光免疫分析技术(FIA)、时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)和化学发光免疫分析技术(CLIA)几个阶段。其中，CLIA作为先进的免疫分析技术，不仅自动化程度高、检测速度快，而且还具有较高的灵敏度和分析特异性，在临床检测中发挥着越来越重要的作用。
生物素-亲和素系统（Biotin-Avidin System，BAS）是利用1分子亲和素可以结合4分子生物素的特性而建立的一种放大标记技术。其中，链霉亲和素是与亲和素有类似生物学特性的一种蛋白质，由于其与固相材料的非特异性结合远少于亲和素，因此在实际应用中多采用生物素-链霉亲和素系统。基于BAS的化学发光技术结合了抗原抗体反应的特异度、化学发光反应的灵敏度以及BAS的级联放大作用，具有较高的灵敏度和稳定性，且检测线性范围更宽，被广泛用于肿瘤标志物、感染性标志物、心肌损伤标志物、各种传染病、激素、药物和核酸的检测。
传统技术中，主要有两种利用BAS标记的放大模式。第一种模式的组分有含链酶亲和素的磁珠、生物素标记的捕获抗体、化学发光物质标记的检测抗体；第二种模式的组分有磁珠包被的捕获抗体、生物素标记的检测抗体、链酶亲和素标记的化学发光物质。然而，上述两种放大模式极易使本底升高，容易形成非特异性吸附。因此，亟需一种能够降低检测本底、提高检测灵敏度的相关技术和产品。
发明内容
基于此，本申请提供一种能够降低检测本底、提高检测灵敏度的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
本申请提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。
在其中一些实施例中，所述带有生物素的多肽满足以下（a）~（c）中的至少一个条件：（a）所述多肽的结构通式为：Biotin-AA1-Lys-AA2-Lys-AA3-Lys-AA4-Lys-AA5-Lys-AA6-Lys-AA7-Lys-AA8-Lys-AA9-Lys-Biotin；
（b）所述多肽序列中AA1~AA9分别由1~3个氨基酸组成；
（c）所述多肽序列中AA1~AA9各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸中的至少一个。
在其中一些实施例中，所述多肽复合物中的多肽包括氨基酸序列如SEQ ID No:1~3所示的多肽中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述发光标记物为吖啶酯；
可选地，所述发光标记物包括NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS和NSP-DMAE-HEG-NHS中的一种。
本申请还提供一种上述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取偶联了亲和素的检测抗体，在亲和素偶联检测抗体后再标记发光物；
在带有生物素的多肽上标记发光物；
将捕获抗体连接至固相载体，获得由捕获抗体包被的固相载体。
在其中一些实施例中，获取偶联了亲和素的检测抗体的步骤包括：
将检测抗体加入第一点击化学试剂中进行活化，得到活化后的检测抗体；
将亲和素加入第二点击化学试剂中进行活化，得到活化后的亲和素；
将所述活化后的检测抗体和所述活化后的亲和素进行交联反应，得到偶联上亲和素的检测抗体；
所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂的种类不同。
在其中一些实施例中，所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂分别独立地选自四嗪-PEGn-NHS和TCO-PEGm-NHS中至少一种，其中，n为1~20，m为1~20。
在其中一些实施例中，所述检测抗体与所述第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述亲和素与所述第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述活化后的检测抗体与所述活化后的亲和素的反应摩尔比为1：（1~5）。
在其中一些实施例中，所述反应的温度为15℃~37℃。
本申请还提供了一种化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果。
与传统技术相比较，本申请的化学发光免疫检测试剂盒具有如下有益效果：
上述化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；捕获抗体和目标蛋白的结合位点和检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。化学发光免疫检测过程中，上述试剂盒检测抗体偶联亲和素后再标记发光物所形成的第一标记物与带有生物素的多肽标记发光物所形成的第二标记物反应形成检测抗体复合物，利用检测抗体与亲和素偶联物再标记发光物的一重信号放大、亲和素与生物素特异性结合的一重信号放大、多肽标记发光物的一重信号放大组合，即聚体复合物、亲和素-生物素体系和多肽的多重放大的模式组合一起可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，有效地解决化学发光免疫检测体系中的灵敏度不够的问题和减少非特异性吸附。
本申请另一实施方式公开的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，无需严格的反应条件控制，即可实现检测抗体和标记物的连接反应，使抗体复合物的制作工艺简单易控，有利于免疫检测产品的推广应用。
附图说明
图1为本申请实施例1的免疫检测方法的原理示意图；
图2为本申请对比例1的免疫检测方法的原理示意图；
图3为本申请对比例2的免疫检测方法的原理示意图；
图4为本申请对比例3的免疫检测方法的原理示意图；
图5为本申请对比例4的免疫检测方法的原理示意图。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中的“第一标记物”、“第二标记物”、“第一点击化学试剂”、“第二点击化学试剂”中的“第一”和“第二”仅用于区分性的描述目的，不能理解为指示或者暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。本申请中，AA1~AA9代表不同的氨基酸和/或多肽，“AA1”、“AA2”、“AA3”、“AA4”、“AA5”、“AA6”、“AA7”、“AA8”和“AA9”等仅用于区分性的描述目的，不能理解为指示或者暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
传统技术中，信号放大的方式多种多样，可以一种模式放大，也可以两种模式进行放大，如利用树状高分子和BAS系统进行双重信号放大的方法。然而，信号放大的方式虽然有多种，也可以取到不错的效果，但上述方法中极易使本底升高，容易形成非特异性吸附，如树状分子做载体的非特异性吸附严重，本底非常高，还有多肽做载体也存在本底升高的问题。此外，树状大分子、牛血清白蛋白、多聚赖氨酸等都可作为信号放大的载体，但也极易形成非特异性吸附，造成本底升高的现象。由此，对于一些高灵敏度检测项目来说，还是无法拉开低端样本之间的信噪比。
申请人在经过大量的创造性实验研究发现：利用检测抗体与亲和素标记物再偶联发光标记物的一重信号放大、亲和素与生物素特异性结合的一重信号放大、多肽偶联发光标记物的一重信号放大组合，即聚体复合物、亲和素-生物素体系和多肽的多重放大的模式组合一起可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，有效的解决化学发光免疫检测体系中的灵敏度不够的问题和减少非特异性吸附。
本申请一实施方式提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；捕获抗体和目标蛋白的结合位点和检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。
上述化学发光免疫检测试剂盒，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；捕获抗体和目标蛋白的结合位点和检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。化学发光免疫检测过程中，上述试剂盒第一标记物与第二标记物偶联形成检测抗体复合物，利用了聚体复合物、亲和素-生物素体系和多肽的多重放大的模式可以极大地提高发光信号，从而可以提高检测体系的灵敏度，有效地解决化学发光免疫检测体系中的灵敏度不够的问题和减少非特异性吸附。
在其中一些实施例中，上述带生物素的多肽的结构通式为：Biotin-AA1-Lys-AA2-Lys-AA3-Lys-AA4-Lys-AA5-Lys-AA6-Lys-AA7-Lys-AA8-Lys-AA9-Lys-Biotin。
在其中一些实施例中，上述多肽序列中AA1~AA9分别由1~3个氨基酸组成。
需要说明的是，上述多肽序列中AA1~AA9分别由1~3个氨基酸组成，即可以是AA1~AA9分别由1个氨基酸组成、AA1~AA9分别由2个氨基酸组成和AA1~AA9分别由3个氨基酸组成。
在其中一些实施例中，上述多肽序列中AA1~AA9各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸中的至少一种。
可选地，上述多肽序列中AA1~AA9各自独立地选自苯丙氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-缬氨酸、苯丙氨酸-亮氨酸和苯丙氨酸-异亮氨酸中的至少一个；
进一步可选地，上述多肽序列中AA1~AA9各自独立地选自苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸、苯丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸和苯丙氨酸-甘氨酸-异亮氨酸中的至少一个。
在其中一些实施例中，上述多肽复合物中的多肽包括氨基酸序列如SEQ ID No:1~3所示的多肽中的至少一种。
具体地，如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列为：Gly-Lys-Val-Lys-Phe-Ala-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys-Ile-Lys-Phe-Pro-Ile-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys；如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列为：Phe-Ala-Lys-Ile-Lys-Phe-Pro-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Lys-Phe-Val-Lys-Leu-Lys-Phe-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Ala-Lys；如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列为：Phe-Gly-Lys-Phe-Pro-Val-Lys-Phe-Pro-Ile-Lys-Ile-Lys-Ala-Lys-Phe-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Lys-Leu-Lys-Phe-Pro-Ala-Lys。
在其中一些实施例中，多肽的分子量为2KDa~4KDa。
在其中一些实施例中，多肽序列的亲水性氨基酸（赖氨酸）与疏水性氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸）的数量比例为1：（1~3）。
可理解，多肽分子量大小会影响空间位阻，多肽的亲疏水性和等电点会影响非特异性吸附，通过设计的多肽可以控制多肽的分子量大小、亲疏水性和等电点，从而起到减小免疫反应过程中的空间位阻和非特异性吸附的效果，使其更加高效地与亲和素结合形成放大效果。
通过设计上述多肽的结构，控制多肽分子量大小可以减小免疫反应过程中的空间位阻，所设计的多肽序列在2KDa~4KDa之间，分子量较小，空间位阻也较小；控制多肽中亲疏水氨基酸的比例可以调节多肽的水溶性和减少亲疏水性吸附，所设计的多肽序列亲水性氨基酸与疏水性氨基酸比例为1：（1~3），且间隔排列，可避免与抗体的亲水区域或疏水区域的结合；控制多肽中氨基酸的侧链反应基团可以减少分子间的相互作用从而减小非特异性吸附，所设计的多肽序列中除赖氨酸侧链的氨基可以反应，其他氨基酸的侧链均无法反应；控制多肽中带电荷氨基酸数量可以减小电荷吸附的影响，所设计的多肽序列的酸碱性在中性或弱碱性，电荷吸附较小；控制多肽中氨基的数量可以更加高效的连接发光物，所设计的多肽序列中含有8个赖氨酸，可连接发光物。本申请中通过特定多肽可以起到减小免疫反应过程中的空间位阻和非特异性吸附的效果，使其更加高效地与亲和素结合形成放大效果，有效地解决化学发光免疫检测体系中的灵敏度不够的问题和减少非特异性吸附。
在其中一些实施例中，上述发光物为吖啶酯。
在其中一些实施例中，上述发光物包括NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS和NSP-DMAE-HEG-NHS中的一种。
本申请一实施方式还提供一种上述化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括步骤S110~步骤S130。
步骤S110：获取偶联了亲和素的检测抗体，在亲和素偶联检测抗体后再标记发光物，得到第一标记物。
在其中一些实施例中，步骤S110中，获取偶联了亲和素的检测抗体的步骤包括步骤S111~步骤S113。
步骤S111：将检测抗体加入第一点击化学试剂中进行活化，得到活化后的检测抗体。
步骤S112：将亲和素加入第二点击化学试剂中进行活化，得到活化后的亲和素。
步骤S113：将上述活化后的检测抗体和上述活化后的亲和素进行交联反应，得到偶联上亲和素的抗体。
在其中一些实施例中，第一点击化学试剂和第二点击化学试剂的种类不同。
在其中一些实施例中，上述活化处理的温度为15℃~37℃。
在其中一些实施例中，上述活化处理的时间为30min~120min。
在其中一些实施例中，上述点击化学试剂中含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团。
在其中一些实施例中，上述第一点击化学试剂和第二点击化学试剂分别独立地选自四嗪-PEGn-NHS和TCO-PEGm-NHS中的一种，其中，n为1~20，m为1~20。
可理解，当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
需要说明的是，n的取值范围为“1~20”，即可取1~20的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20，或这些数值中任意两个组成的范围。
m的取值范围为“1~20”，即可取1~20的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20，或这些数值中任意两个组成的范围。
可理解，四嗪可以和环状烯烃或环状炔烃非常快速高效地发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应(inverse electron-demand Diels-Alder reaction, IEDDA)生成稳定的产物，基于四嗪类化合物的连接反应，无需催化剂，上述点击化学的方式合成偶联了亲和素的检测抗体的效率更高，稳定性更好。
在其中一具体示例中，当检测抗体连接四嗪的时候，亲和素连接的是TCO；当检测抗体连接TCO时，亲和素连接的是四嗪。
在其中一些实施例中，上述检测抗体与第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）。
需要说明的是，检测抗体与第一点击化学试剂的摩尔比的取值范围为“1:（1~20）”即可取1:（1~20）的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或者1:20。或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：1：（5~10）。
优选地，检测抗体与第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~5）。
在其中一些实施例中，上述亲和素与第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）
需要说明的是，亲和素与第二点击化学试剂的摩尔比的取值范围为“1:（1~20）”即可取1:（1~20）的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或者1:20。或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：1：（5~10）。
优选地，亲和素与第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~5）。
在其中一些实施例中，上述活化后的检测抗体与活化后的亲和素的反应摩尔比为1：（1~5）。
在其中一些实施例中，步骤S110中，反应的温度为15℃~37℃。
步骤S120：在带有生物素的多肽上标记发光物，得到第二标记物。
步骤S130：将捕获抗体连接至固相载体，获得由捕获抗体包被的固相载体。
在其中一些实施例中，固相载体为磁性颗粒或胶乳粒子，但不限于此，可根据需要选择其他常规的固相载体。
上述制备化学发光免疫检测试剂盒的方法，无需严格的反应条件控制，即可实现检测抗体和标记物的连接反应，使化学发光免疫检测试剂盒的制作工艺简单易控，有利于免疫检测产品的推广应用。
本申请的另一些实施方式还提供一种化学发光免疫检测方法，包括取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果的步骤。
具体地，上述取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果的步骤包括步骤S210~步骤220。
步骤S210：取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，固液分离，得到反应产物。
在其中一个实施例中，待测样本和上述试剂盒中由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物的反应温度为37±1℃。
步骤S220：通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果。
本申请提供的免疫检测试剂盒的检测方法，简单易操作，用于检测样本中待测抗原，能够降低检测本底、显著提高了检测体系的灵敏度。
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。下文中，除非特殊说明，所使用的缓冲液试剂均购自国药公司，级别为分析纯。TCO PEG4 succinimidyl ester（货号790435）、Tetrazine-PEG5-NHS ester（货号900913）、树状大分子PAMAM（货号412422）、牛血清蛋白BSA（货号A1933）、碳二亚胺EDC（货号39391）、N-羟基丁二酰亚胺NHS（货号130672）、链酶亲和素（货号189730）、生物素（货号203112）购于默克公司。下文中使用的吖啶酯购于深圳市美凯特科技有限公司。下文中使用的单克隆抗体由深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司合成提供。下文中使用的多肽为自行设计序列交由生工生物工程股份有限公司合成并交付。
实施例1
以心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测项目为例，验证本申请检测方法的检测灵敏度。
一、链霉亲和素-cTnI检测抗体-吖啶酯标记物的标记步骤
（1）取0.2mg cTnI蛋白检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，将TCO-PEG4-NHS粉末溶于DMSO，配置成1mg/mL的溶液，向上述溶液中加入2μL的TCO-PEG4-NHS溶液，cTnI蛋白检测抗体与TCO-PEG4-NHS的摩尔比约为1：3，在25℃恒温箱中反应1h；
（2）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（3）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的TCO-PEG4-NHS，浓缩至体积为100μL浓度2mg/mL的活化后的检测抗体；
（4）取0.2mg 链霉亲和素，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，将四嗪-PEG5-NHS粉末溶于DMSO，配置成5mg/mL的溶液，向上述溶液中加入1μL的四嗪-PEG5-NHS溶液，链霉亲和素与四嗪-PEG5-NHS的摩尔比约为1:3，在25℃恒温箱中反应1h；
（5）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（6）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的四嗪-PEG5-NHS，浓缩至体积为100μL浓度2mg/mL的活化后的链霉亲和素；
（7）将步骤（3）中得到的活化后的cTnI检测抗体和步骤（6）中得到活化后的链霉亲和素混合进行交联反应，活化后的cTnI检测抗体与活化后的链霉亲和素的摩尔比约为1:2，在25℃恒温箱中反应1h；
（8）用GE公司的AKTA纯化设备，选用Superdex 200 Increase 10/300 GL预装柱纯化，以50mM PBS(pH7.2)缓冲液作为平衡缓冲液，除去未反应的抗体和链酶亲和素，得到链霉亲和素-cTnI检测抗体偶联物；
（9）将AKTA收集的馏分用10KDa的超滤管进行浓缩至1mg/mL，缓冲液体系为PBS溶液（50mM、pH7.2），向其中加入2uL吖啶酯NSP-DMAE-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），cTnI蛋白检测抗体与吖啶酯NSP-DMAE-NHS的摩尔比约为1:12，在25℃恒温箱中反应2h；
（10）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（11）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到链霉亲和素-cTnI检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以cTnI检测抗体为准，保存浓度为100μg/mL。保存稀释液为含有0.1%的吐温-20、含有0.02%Na3N、含有的0.2%的Proclin 300的50mM的磷酸盐缓冲液（pH7.4），下文所述的保存液和保存浓度与此一致。如图1所示，图1中A为各图例所代表的物质，图1中B为链霉亲和素-检测抗体-吖啶酯偶联物的合成路线图。
二、生物素-多肽-吖啶酯标记物的标记步骤
（1）多肽结构为：
Biotin-Gly-Lys-Val-Lys-Phe-Ala-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys-Ile-Lys-Phe-Pro-Ile-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys-Biotin，溶解在PBS溶液（50mM、pH7.2）中，浓度为5mg/mL；
（2）取0.025mg多肽加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，加入10μL吖啶酯NSP-DMAE-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），多肽与吖啶酯NSP-DMAE-NHS的摩尔比约为1:10，在25℃恒温箱中反应2h；
（3）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（4）使用3KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到生物素-多肽-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以多肽为准，保存浓度为100μg/mL。标记流程见图1中C。
三、磁珠-cTnI捕获抗体结合物的包被步骤
（1）取1mL羧基纳米磁珠（粒径2μm，10mg/mL，600nmol/mg）溶液，在磁分离器处理3分钟，用移液器移除上清，用10mL 100mM的MES溶液（pH6.0）洗涤3次。
（2）往洗涤好的羧基纳米磁珠中加入2mL 50mM的MES溶液（pH6.0），加入0.3mLEDC溶液（浓度10mg/mL）和0.3mL Sulfo-NHS溶液（浓度8mg/mL），25℃旋转（40转/min）反应1h，得到活化好的羧基磁珠。
（3）配置1mL的cTnI捕获抗体的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)，cTnI捕获抗体浓度为0.1mg/mL。水浴加热至37℃，保持该温度2h。
（4）将cTnI捕获抗体的磷酸盐缓冲液加到活化好的羧基磁珠中，控制混合后溶液的pH为7.2，加入80μL的DMAP的DMSO溶液（10mg/mL），在37℃下旋转（60转/min）反应24h。
（5）磁分离，用移液器移除上清。用含有0.1%的吐温-20的50mM的PBS溶液洗涤3次，每次2mL。将洗涤好的cTnI捕获抗体-纳米磁珠保存在1mL的保存液中，以磁珠为准，保存浓度为10mg/mL。
实施例2
本实施例以甲胎蛋白(AFP)检测项目为例，验证本申请检测方法的检测灵敏度。
具体实验步骤如下：
一、链霉亲和素-AFP检测抗体-吖啶酯标记物的标记步骤
（1）取0.2mg AFP检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，
将TCO-PEG12-NHS粉末溶于DMSO，配置成1mg/mL的溶液，向上述溶液中加入8μL的TCO-PEG12-NHS溶液，AFP检测抗体与TCO-PEG12-NHS的摩尔比约为1:12，在15℃恒温箱中反应1h；
（2）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（3）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的TCO-PEG12-NHS，浓缩至体积为100μL浓度2mg/mL的活化后的检测抗体；
（4）取0.3mg 链霉亲和素，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，将四嗪-PEG12-NHS粉末溶于DMSO，配置成5mg/mL的溶液，向上述溶液中加入4μL的四嗪-PEG12-NHS溶液，AFP检测抗体与四嗪-PEG12-NHS的摩尔比约为1:6，在15℃恒温箱中反应1h；
（5）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（6）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的四嗪-PEG12-NHS，浓缩至体积为100μL浓度3mg/mL的活化后的链霉亲和素；
（7）将步骤（3）中得到的活化后的AFP检测抗体和步骤（6）中得到活化后的链霉亲和素混合进行交联反应，活化后的AFP检测抗体与活化后的链霉亲和素的摩尔比约为1:3，在15℃恒温箱中反应1h；
（8）用GE公司的AKTA纯化设备，选用Superdex 200 Increase 10/300 GL预装柱纯化，以50mM PBS(pH7.2)缓冲液作为平衡缓冲液，除去未反应的抗体和链酶亲和素，得到链霉亲和素-AFP检测抗体偶联物；
（9）将AKTA收集的馏分用10KDa的超滤管进行浓缩至1mg/mL，缓冲液体系为PBS溶液（50mM、pH7.2），向其中加入2μL吖啶酯NSP-SA-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），AFP检测抗体与吖啶酯NSP-SA-NHS的摩尔比约为1:11，在15℃恒温箱中反应2h；
（10）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（11）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到链霉亲和素-AFP检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以AFP检测抗体为准，保存浓度为100μg/mL。
二、生物素-多肽-吖啶酯标记物的标记步骤
（1）多肽结构为：
Biotin-Phe-Ala-Lys-Ile-Lys-Phe-Pro-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Lys-Phe-Val-Lys-Leu-Lys-Phe-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Ala-Lys-Biotin，溶解在PBS溶液（50mM、pH7.2）中，浓度为5mg/mL；
（2）取0.025mg多肽加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，加入10uL吖啶酯NSP-SA-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），多肽与吖啶酯NSP-SA-NHS的摩尔比约为1:10，在15℃恒温箱中反应2h；
（3）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（4）使用3KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到生物素-多肽-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以多肽为准，保存浓度为100μg/mL。
三、磁珠-AFP捕获抗体结合物的包被步骤
（1）取1mL羧基纳米磁珠（粒径2μm，10mg/mL，600nmol/mg）溶液，在磁分离器处理3分钟，用移液器移除上清，用10mL 100mM的MES溶液（pH6.0）洗涤3次。
（2）往洗涤好的羧基纳米磁珠中加入2mL 50mM的MES溶液（pH6.0），加入0.3mLEDC溶液（浓度10mg/mL）和0.3mL Sulfo-NHS溶液（浓度8mg/mL），25℃旋转（40转/min）反应1h，得到活化好的羧基磁珠。
（3）配置1mL的APF捕获抗体的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)，cTnI捕获抗体浓度为0.1mg/mL。水浴加热至37℃，保持该温度2h。
（4）将cTnI捕获抗体的磷酸盐缓冲液加到活化好的羧基磁珠中，控制混合后溶液的pH为7.2，加入80μL的DMAP的DMSO溶液（10mg/mL），在37℃下旋转（60转/min）反应24h。
（5）磁分离，用移液器移除上清。用含有0.1%的吐温-20的50mM的PBS溶液洗涤3次，每次2mL。将洗涤好的AFP捕获抗体-纳米磁珠保存在1mL的保存液中，以磁珠为准，保存浓度为10mg/mL。
实施例3
本实施例以降钙素原(PCT)检测项目为例，验证本申请检测方法的检测灵敏度。
具体实验步骤如下：
一、链霉亲和素-PCT检测抗体-吖啶酯标记物的标记步骤
（1）取0.2mg PCT检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，
将TCO-PEG20-NHS粉末溶于DMSO，配置成1mg/mL的溶液，向上述溶液中加入14μL的TCO-PEG20-NHS溶液，PCT检测抗体与TCO-PEG20-NHS的摩尔比约为1:20，在37℃恒温箱中反应1h；
（2）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100uL，进行淬灭反应；
（3）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的TCO-PEG20-NHS，浓缩至体积为100μL浓度2mg/mL的活化后的检测抗体；
（4）取0.4mg 链霉亲和素，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，将四嗪-PEG20-NHS粉末溶于DMSO，配置成5mg/mL的溶液，向上述溶液中加入10uL的四嗪-PEG20-NHS溶液，链霉亲和素与四嗪-PEG20-NHS的摩尔比约为1:12，在37℃恒温箱中反应1h；
（5）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（6）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的四嗪-PEG20-NHS，浓缩至体积为100μL浓度4mg/mL的活化后的链霉亲和素；
（7）将步骤（3）中得到的活化后的PCT检测抗体和步骤（6）中得到活化后的链霉亲和素混合进行交联反应，活化后的PCT检测抗体与活化后的链霉亲和素的摩尔比约为1:5，在37℃恒温箱中反应1h；
（8）用GE公司的AKTA纯化设备，选用Superdex 200 Increase 10/300 GL预装柱纯化，以50mM PBS(pH7.2)缓冲液作为平衡缓冲液，除去未反应的抗体和链酶亲和素，得到链霉亲和素-PCT检测抗体偶联物；
（9）将AKTA收集的馏分用10KDa的超滤管进行浓缩至1mg/mL，缓冲液体系为PBS溶液（50mM、pH7.2），向其中加入2μL吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），PCT检测抗体与吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的摩尔比约为1:10，在37℃恒温箱中反应2h；
（10）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（11）使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到链霉亲和素-PCT检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以PCT检测抗体为准，保存浓度为100μg/mL。
二、生物素-多肽-吖啶酯偶联物的标记步骤
（1）多肽结构为：Biotin-Phe-Gly-Lys-Phe-Pro-Val-Lys-Phe-Pro-Ile-Lys-Ile-Lys-Ala-Lys-Phe-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Lys-Leu-Lys-Phe-Pro-Ala-Lys-Biotin，溶解在PBS溶液（50mM、pH7.2）中，浓度为5mg/mL；
（2）取0.025mg多肽加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，加入10μL吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），多肽与吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的摩尔比约为1:10，在37℃恒温箱中反应2h；
（3）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（4）使用3KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯，得到生物素-多肽-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，以多肽为准，保存浓度为100μg/mL。
三、磁珠-PCT捕获抗体结合物的包被步骤
（1）取1mL羧基纳米磁珠（粒径2μm，10mg/mL，600nmol/mg）溶液，在磁分离器处理3分钟，用移液器移除上清，用10mL 100mM的MES溶液（pH6.0）洗涤3次。
（2）往洗涤好的羧基纳米磁珠中加入2mL 50mM的MES溶液（pH6.0），加入0.3mLEDC溶液（浓度10mg/mL）和0.3mL Sulfo-NHS溶液（浓度8mg/mL），25℃旋转（40转/min）反应1h，得到活化好的羧基磁珠。
（3）配置1mL的PCT捕获抗体的100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)，cTnI捕获抗体浓度为0.1mg/mL。水浴加热至37℃，保持该温度2h。
（4）将cTnI捕获抗体的磷酸盐缓冲液加到活化好的羧基磁珠中，控制混合后溶液的pH为7.2，加入80μL的DMAP的DMSO溶液（10mg/mL），在37℃下旋转（60转/min）反应24h。
（5）磁分离，用移液器移除上清。用含有0.1%的吐温-20的50mM的PBS溶液洗涤3次，每次2mL。将洗涤好的PCT捕获抗体-纳米磁珠保存在1mL的保存液中，以磁珠为准，保存浓度为10mg/mL。
对比例1
对比例1中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1的区别在于：对比例1没有利用聚体复合物、多肽和链酶亲和素-生物素体系的多重放大的模式，其标记方式是检测抗体直接标记吖啶酯，检测抗体与吖啶酯与实施例1中所用一致。取0.2mg cTnI蛋白检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，向其中加入2uL吖啶酯NSP-DMAE-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），cTnI蛋白检测抗体与吖啶酯NSP-DMAE-NHS的摩尔比约为1:12，在25℃恒温箱中反应2h；加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯得到cTnI检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例1保持一致。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例2
对比例2中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1的区别在于：对比例2仅利用了链酶亲和素-生物素体系的放大体系，其标记方式是检测抗体标记生物素，链酶亲和素标记吖啶酯，检测抗体与吖啶酯与实施例1中所用一致。cTnI检测抗体-生物素标记物的标记步骤与对比例1中的标记步骤基本一致， cTnI蛋白检测抗体和生物素的用量分别为0.2mg和0.005mg，cTnI检测抗体与生物素的摩尔比约为1:12，得到cTnI检测抗体-生物素标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例1保持一致。链酶亲和素-吖啶酯标记物的标记步骤与与对比例1中的标记步骤基本一致，链酶亲和素和吖啶酯的用量分别为0.2mg和0.02mg，链酶亲和素与吖啶酯的摩尔比约为1:12，得到链酶亲和素-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例1保持一致。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例3
对比例3中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1的区别在于：对比例3仅利用了多肽的放大体系，其标记方式是检测抗体偶联多肽，再用检测抗体-多肽偶联物标记吖啶酯，检测抗体、多肽和吖啶酯与实施例1中所用一致。cTnI检测抗体偶联多肽后再标记吖啶酯的步骤与实施例1中链霉亲和素-心肌肌钙蛋白I-吖啶酯偶联物的标记步骤基本一致，检测抗体、多肽和吖啶酯的用量分别为0.2mg、0.025mg和0.02mg，检测抗体、多肽和吖啶酯的摩尔比约为1:5:24，得到cTnI检测抗体-多肽-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例1保持一致。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例4
对比例4中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1的区别在于：对比例4利用了BAS体系和多肽双重放大方式，其标记方式是检测抗体偶联链酶亲和素，带有生物素的多肽标记吖啶酯，检测抗体、链酶亲和素、多肽和吖啶酯与实施例1中所用一致。检测抗体偶联链酶亲和素的步骤与实施例1基本一致，检测抗体偶联链酶亲和素，得到cTnI检测抗体-链酶亲和素偶联物。带有生物素的多肽标记吖啶酯的步骤与实施例1一致，得到生物素-多肽-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例1保持一致。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例5
对比例5中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1的区别在于：对比例5中用BSA替换多肽结构进行放大，其标记方式是检测抗体偶联链酶亲和素再标记吖啶酯，BSA同时标记生物素和吖啶酯，检测抗体、链酶亲和素和吖啶酯与实施例1中所用一致。链霉亲和素-cTnI检测抗体-吖啶酯标记物与实施例1一致，BSA同时标记生物素和吖啶酯的标记步骤如下：
（1）取0.1mgBSA加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，加入2μL吖啶酯NSP-DMAE-NHS的DMSO溶液（5mg/mL）和1μL生物素的DMSO溶液（5mg/mL），BSA、吖啶酯和生物素的摩尔比约为1:10:10，在25℃恒温箱中反应2h；
（2）加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；
（3）使用3KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯和游离的生物素，得到生物素-BSA-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，标记物在保存液中的最终浓度与实施例1一样。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例6
对比例6中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1大致相同，其不同在于，对比例6中用的多肽为随机设计的多肽，其特点在于也含有生物素和赖氨酸，多肽中其他氨基酸为随机选择的，该多肽的序列为Biotin-Asp-Cys-Lys-Thr-Val-Ser-Asn-Lys-Asp-Phe-Tyr-Lys-Asp-Phe-Lys-Tyr-Gly-Trp-Lys-Asp-Phe-Tyr-Lys-Thr-Ser-Lys-Val-Asn-Cys-Lys-Biotin,，对比例6的具体制备方法与实施例1保持一致，标记物在保存液中的最终浓度与实施例1一样。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例7
对比例7中检测抗体吖啶酯标记物与实施例1大致相同，其不同在于，对比例7中用树状大分子替换多肽结构进行放大，对比例7的具体制备方法与对比例5基本一致，树状大分子标记生物素和吖啶酯的摩尔比与对比例5一致，标记物在保存液中的最终浓度与实施例1一样。所用磁珠包被物与实施例1的磁珠-cTnI捕获抗体结合物保持一致。
对比例8
对比例8中检测抗体吖啶酯标记物与实施例2的区别在于：对比例8没有利用聚体复合物、多肽和链酶亲和素-生物素体系的多重放大的模式，其标记方式是检测抗体直接标记吖啶酯，检测抗体与吖啶酯与实施例2中所用一致。取0.2mg AFP检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，向其中加入2uL吖啶酯NSP-SA-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），AFP检测抗体与吖啶酯NSP-SA-NHS的摩尔比约为1:11，在25℃恒温箱中反应2h；加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯得到AFP检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例2保持一致。所用磁珠包被物与实施例2的磁珠-AFP捕获抗体结合物保持一致。
对比例9
对比例9中检测抗体吖啶酯标记物与实施例3的区别在于：对比例9没有利用聚体复合物、多肽和链酶亲和素-生物素体系的多重放大的模式，其标记方式是检测抗体直接标记吖啶酯，检测抗体与吖啶酯与实施例3中所用一致。取0.2mg PCT检测抗体，加入PBS溶液（50mM、pH7.2），浓度0.5mg/mL，向其中加入2uL吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的DMSO溶液（5mg/mL），PCT检测抗体与吖啶酯NSP-DMAE-HEG-NHS的摩尔比约为1:10，在25℃恒温箱中反应2h；加入10g/L的甘氨酸的PBS溶液100μL，进行淬灭反应；使用10KDa的超滤管进行纯化，除去游离的吖啶酯得到PCT检测抗体-吖啶酯标记物，用保存液稀释后保存，浓度与实施例3保持一致。所用磁珠包被物与实施例3的磁珠-PCT捕获抗体结合物保持一致。
性能检测一
将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7中得到的吖啶酯标记物分别应用于心肌肌钙蛋白I的化学发光免疫分析检测，采用iFlash3000化学发光免疫分析仪（亚辉龙生物），心肌肌钙蛋白I化学发光试剂盒半成品进行测试。实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的化学发光免疫反应模式见图1中D、图2、图3、图4、图5，对比例5、对比例6、对比例7的化学发光免疫反应模式与实施例1一致。具体步骤包括：（1）捕获抗体-磁珠工作液的制备：实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7的磁珠组分工作液一致，将实施例1中磁珠-cTnI捕获抗体结合物用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系（0.1mol/L）稀释50倍；（2）检测抗体-吖啶酯复合物工作液的制备：实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7的检测抗体复合物母液浓度一致，将检测抗体-吖啶酯复合物用磷酸氢二钠（12水）-磷酸二氢钠缓冲液体系（0.2mol/L）稀释500倍；（3）测试：取不同的样本50μL，分别加入50μL捕获抗体包被的磁珠工作液和实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7制备的工作液50μL，37℃反应10min后，磁分离清洗3次，各组分分别先后加入100μLHNO3-H2O2溶液和100μL的NaOH溶液，用iFlash3000化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3次测量，取平均值。样本包含校准品，阴性样本和阳性样本，其中校准品由抗原稀释而来，抗原由亚辉龙生物科技有限公司提供，校准品1为无值样本，校准品2为低值样本，校准品3为高值样本，所有样本经雅培试剂盒测试确认，测试结果见表1。
表1
/>
由表1可知，实施例1与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4四种反应模式，其不同点在于实施例1采用聚体复合物、多肽和BAS的多重放大模式，对比例1未采用任何的放大模式，对比例2采用BAS放大模式，对比例3采用多肽放大模式，对比例4采用多肽和BAS的双重放大模式，五组数据比较中可发现，实施例1测出来的信号最强，本底也略高，但信噪比最高，本申请检测方法显著提高了检测试剂的灵敏度。实施例1与对比例5、对比例6、对比例7使用四种不同的载体放大方式，其不同点在于实施例1采用特定的多肽，对比例5采用的载体为BSA，对比例6采用的载体为随机设计的多肽序列，对比例7采用的载体为树状大分子，四组数据比较中可发现，对比例5中测试的校准品1和阴性血清样本的值比较高，有非特异性吸附，信号提升也很明显，但整体信噪比偏低，灵敏度较差，可能是由于BSA的分子量较大，空间位阻也大引起的。对比例6和对比例7中测试的校准品1和阴性血清样本的值较大，说明本底较高，阳性样本测试的值比实施例1略低，说明有一定的非特异性吸附，可能是由于多肽中某些氨基酸会吸附于磁珠上引起的。对比例7中测试的校准品1和阴性血清样本的值非常高，与阳性样本测试的值一致，有非常严重的非特异性吸附，可能是由于树状分子中的基团过多会吸附于磁珠上引起的。所以实施例1中的多肽可以有效的解决空间位阻和非特异性吸附的问题。
性能检测二
将实施例2、对比例8中得到的吖啶酯标记物分别应用于甲胎蛋白的化学发光免疫分析检测，采用iFlash3000化学发光免疫分析仪（亚辉龙生物），甲胎蛋白化学发光试剂盒半成品进行测试。具体步骤包括：（1）捕获抗体-磁珠工作液的制备：实施例2、对比例8的磁珠组分工作液一致，将实施例2中磁珠-AFP捕获抗体结合物用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系（0.1mol/L）稀释50倍；（2）检测抗体-吖啶酯复合物工作液的制备：实施例2、对比例8的检测抗体复合物母液浓度一致，将检测抗体-吖啶酯复合物用磷酸氢二钠（12水）-磷酸二氢钠缓冲液体系（0.2mol/L）稀释500倍；（3）测试：取不同的样本50μL，分别加入50μL捕获抗体包被的磁珠工作液和实施例2、对比例8制备的工作液50μL，37℃反应10min后，磁分离清洗3次，各组分分别先后加入100μLHNO3-H2O2溶液和100μL的NaOH溶液，用iFlash3000化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3次测量，取平均值。样本包含校准品，阴性样本和阳性样本，其中校准品由抗原稀释而来，抗原由亚辉龙生物科技有限公司提供，校准品1为无值样本，校准品2为低值样本，校准品3为高值样本，所有样本经雅培试剂盒测试确认，测试结果见表2。
表2
由表2可知，在甲胎蛋白项目中，实施例2采用的是聚体复合物、多肽和BAS的多重放大模式，对比例8没有放大体系，为直接标记方式，由表2的数据可知，实施例2的信号值提升明显，本底也增高一倍左右，但信噪比增大，所以本申请检测方法显著提高了检测试剂的灵敏度。
性能检测三
将实施例3、对比例9中得到的吖啶酯标记物分别应用于降钙素原的化学发光免疫分析检测，采用iFlash3000化学发光免疫分析仪（亚辉龙生物），降钙素原化学发光试剂盒半成品进行测试。具体步骤包括：（1）捕获抗体-磁珠工作液的制备：实施例3、对比例9的磁珠组分工作液一致，将实施例3中磁珠-PCT捕获抗体结合物用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系（0.1mol/L）稀释50倍；（2）检测抗体-吖啶酯复合物工作液的制备：实施例3、对比例9的检测抗体复合物母液浓度一致，将检测抗体-吖啶酯复合物用磷酸氢二钠（12水）-磷酸二氢钠缓冲液体系（0.2mol/L）稀释500倍；（3）测试：取不同的样本50μL，分别加入50μL捕获抗体包被的磁珠工作液和实施例3、对比例9制备的工作液50μL，37℃反应10min后，磁分离清洗3次，各组分分别先后加入100μLHNO3-H2O2溶液和100μL的NaOH溶液，用iFlash3000化学发光免疫分析仪测量发光值，平行进行3次测量，取平均值。样本包含校准品，阴性样本和阳性样本，其中校准品由抗原稀释而来，抗原由亚辉龙生物科技有限公司提供，校准品1为无值样本，校准品2为低值样本，校准品3为高值样本，所有样本经雅培试剂盒测试确认，测试结果见表3。
表3
由表3可知，在降钙素原项目中，实施例3采用的是聚体复合物、多肽和BAS的多重放大模式，对比例9没有放大体系，为直接标记方式，由表3的数据可知，实施例3的信号值提升明显，本底略有增高，但信噪比增大，所以本申请检测方法显著提高了检测体系的灵敏度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括由捕获抗体包被的固相载体、检测抗体偶联亲和素后再标记发光物的第一标记物和带有生物素的多肽标记发光物的第二标记物；所述捕获抗体和目标蛋白的结合位点和所述检测抗体与目标蛋白的结合位点不同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述带有生物素的多肽满足以下（a）~（c）中的至少一个条件：
（a）所述多肽的结构通式为：
Biotin-AA1-Lys-AA2-Lys-AA3-Lys-AA4-Lys-AA5-Lys-AA6-Lys-AA7-Lys-AA8-Lys-AA9-Lys-Biotin；
（b）所述多肽序列中AA1~AA9分别由1~3个氨基酸组成；
（c）所述多肽序列中AA1~AA9各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸中的至少一个。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述带有生物素的多肽包括氨基酸序列如SEQ ID No:1~3所示的多肽中的一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光物为吖啶酯；
可选地，所述发光物包括NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS和NSP-DMAE-HEG-NHS中的一种。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取偶联了亲和素的检测抗体，在亲和素偶联检测抗体后再标记发光物；
在带有生物素的多肽上标记发光物；
将捕获抗体连接至固相载体，获得由捕获抗体包被的固相载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，获取偶联了亲和素的检测抗体的步骤包括：
将检测抗体加入第一点击化学试剂中进行活化，得到活化后的检测抗体；
将亲和素加入第二点击化学试剂中进行活化，得到活化后的亲和素；
将所述活化后的检测抗体和所述活化后的亲和素进行交联反应，得到偶联上亲和素的检测抗体；
所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂的种类不同。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一点击化学试剂和所述第二点击化学试剂分别独立地选自四嗪-PEGn-NHS和TCO-PEGm-NHS中的一种，其中，n为1~20，m为1~20。
8.根据权利要求6~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述检测抗体与所述第一点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述亲和素与所述第二点击化学试剂的摩尔比为1:（1~20）；和/或所述活化后的检测抗体与所述活化后的亲和素的反应摩尔比为1：（1~5）。
9.根据权利要求6~7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为15℃~37℃。
10.一种化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测样本，采用权利要求1~4任一项所述的试剂盒进行免疫反应，通过对反应产物进行发光值检测，分析检测结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311795986.1A CN117706083A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311795986.1A CN117706083A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117706083A true CN117706083A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90158749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311795986.1A Pending CN117706083A (zh) | 2023-12-25 | 2023-12-25 | 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117706083A (zh) |
-
2023
- 2023-12-25 CN CN202311795986.1A patent/CN117706083A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113419059B (zh) | 用于化学发光免疫分析方法的封闭剂 | |
| CN112285353A (zh) | 一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法 | |
| WO2022199107A1 (zh) | 抗体复合物及其制备方法、检测试剂盒 | |
| CN113640511B (zh) | 一种磁微粒电化学发光试剂盒 | |
| CN117706083A (zh) | 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 | |
| WO2023124154A1 (zh) | 磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒 | |
| WO2018006268A1 (zh) | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 | |
| US20220205993A1 (en) | Detection method of multiple analytes | |
| WO2021193682A1 (ja) | 免疫学的分析方法及び免疫学的分析試薬キット | |
| WO2018006264A1 (zh) | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 | |
| CN110672836B (zh) | 磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒 | |
| CN114994330A (zh) | 检测抗HSP 90-beta-IgG自身抗体的试剂盒及其应用 | |
| RU2684325C1 (ru) | Способ получения конъюгата на основе магнитных металл-углеродных наночастиц, пригодного для диагностических и аналитических целей, с использованием ЯМР-релаксометрии в качестве метода детекции | |
| CN112763704A (zh) | 用于抗原检测的组合物、制备方法 | |
| CN111781371B (zh) | 一种基于磁珠载体双抗夹心elisa的考古现场快速检测痕量丝素蛋白的方法 | |
| WO2023182520A1 (ja) | 免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析用試薬 | |
| CN118033110A (zh) | 一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法 | |
| CN116004221B (zh) | 环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒 | |
| CN113533272B (zh) | 一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用 | |
| CN113567684B (zh) | 基于核酸适配体探针的IFNg识别方法及检测IFNg的试剂盒 | |
| CN114113610B (zh) | 吖啶酯标记复合物和检测试剂盒 | |
| CN112110994B (zh) | 一种长臂活化生物素分子标记抗原及其制备方法、应用 | |
| JP4121432B2 (ja) | 免疫測定試薬用カゼイン | |
| CN115097123A (zh) | 一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法 | |
| CN117589992A (zh) | 分枝杂交链式反应免疫检测试剂及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |