CN118033110A - 一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，采用一步混合包被法进行偶联，具体操作为：将氨基磁珠用包被缓冲液进行洗涤后，加入至包被缓冲液中，再加入BS3溶液和抗原，于18℃～37℃下混匀进行偶联，分离得到偶联抗原后的氨基磁珠进行封闭，封闭完成后分离得到氨基磁珠，加入磁珠保存液，制备得到抗原偶联氨基磁珠；本发明使用BS3做交联剂并结合一步混合包被法具有更好的适用性，不需要单独活化氨基磁珠和抗原，抗原包被量大大提升，同时提高了检测的灵敏度，反应效率更高，本发明简化操作过程，缩短反应时间，所制备的抗原偶联氨基磁珠的稳定性也更好。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫分析领域，涉及一种免疫磁珠的制备，尤其涉及一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法。
背景技术
磁珠，即磁微粒，一般指尺寸在微米及纳米级的球形复合物，通过适当的方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的、具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁珠被广泛用于细胞分离、核酸提取、生物医药的靶点鉴定及代谢性质研究和蛋白纯化与免疫分析等诸多领域，特别在体外诊断领域，磁珠与化学发光免疫分析技术结合，被用作抗原或抗体的固相载体来检测血清或血浆中的待测物。
因磁珠表面官能团的不同，可分为甲苯磺酰基磁珠、羧基磁珠、链霉亲和素磁珠和氨基磁珠等。其中，氨基磁珠表面富含氨基(-NH2)，而带有负电性，呈碱性，在碱性溶液里能够稳定存在。
因氨基磁珠表面官能团的特殊的化学特性，与抗原或抗体蛋白进行偶联时需要添加交联剂做介导。目前，最常用的交联剂为戊二醛。但是，由于戊二醛所介导的连接反应没有方向性，除了可引起磁珠与蛋白质的偶联外，还会引起蛋白质之间或磁珠之间的偶联，因此偶联效率较低。
为了提高氨基磁珠和抗原或抗体蛋白偶联效率，文献号为200810115278.8的中国专利申请《一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法》中公开了用SMCC和Sulfo-SMCC作为活化剂，先分别对氨基磁珠和蛋白质分子进行活化，再进行共价偶联。虽然该文献可以提高了蛋白质与磁珠的偶联效率，但是操作复杂、耗时长，仅偶联过程就需要耗时12h～16h，活化过程对操作人员专业要求高。
所以需要进一步对抗原偶联氨基磁珠的方法进行优化和研究，提供一种过程简单、易操作、耗时更短的制备方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有偶联方法效率不高或者操作过于复杂、耗时过长等问题，提供一种操作过程简单、制备耗时短，更利于推广和应用的抗体偶联氨基磁珠的制备方法。
本发明采用的技术方案提供了一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，关键在于，采用一步混合包被法进行偶联，具体操作为：将氨基磁珠用包被缓冲液进行洗涤后，加入至包被缓冲液中，再加入BS3溶液和抗原，于18℃～37℃下混匀进行偶联，偶联结束后，分离得到偶联抗原后的氨基磁珠，加入磁珠封闭液混匀进行封闭，封闭完成后分离得到氨基磁珠，加入磁珠保存液，制备得到抗原偶联氨基磁珠。
进一步的，上述的BS3溶液的浓度为5mg/mL～15mg/mL，制备过程为将BS3溶于去离子水。
进一步的，偶联时所加入的包被缓冲液与BS3溶液的体积比为5～15:1。
具体的，上述的偶联的时间为2h～8h。
更具体的，上述的混匀方式为滚轴混匀，转速为40rpm～60rpm。
更具体的，上述的包被缓冲液为PBS、MES及Tris缓冲液中的任意一种，洗涤的次数为2～4次。
需要说明的，加入磁珠保存液后制备得到抗原偶联氨基磁珠的浓度为5mg/mL～15mg/mL。
优选的，上述的偶联温度为25℃。
优选的，上述的偶联时所加入的包被缓冲液与BS3溶液的体积比为10:1。
优选的，上述的偶联的时间为5h。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明选用了一种较为特殊的交联剂，即二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(即BS3)，BS3是一种水溶性DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)类似物，具有不通透膜。BS3在8个碳原子间隔臂的每一个末端，都有一个胺反应性N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS酯在pH7～9条件下与伯胺反应可形成稳定的酰胺键，同时释放N-羟基磺基琥珀酰亚胺离去基团。
本发明发现使用BS3做交联剂并结合一步混合包被法具有更好的适用性，本发明不需要单独活化氨基磁珠和抗原，在BS3的作用下，抗原和氨基磁珠混合溶液可形成抗原自交联-磁珠包被物，使得抗原包被量大大提升，同时提高了检测的灵敏度，反应效率更高。
本发明不仅可以简化操作过程，制备过程对操作人员的要求不高，而且还可以缩短反应时间，所制备的抗原偶联氨基磁珠的稳定性也更好。
本发明还发现，使用滚轴混匀的方式对偶联反应更为有利。这可能是因为滚轴混匀的混匀速率低，试管呈水平放置使混匀过程中磁珠不容易聚集。
附图说明
图1是样品1～4测定不同浓度的待测标准品的发光值的线性回归图。
图2是对照品组1和样品1测定不同浓度的待测标准品的发光值的线性回归图。
图3是对照品组2和样品1测定不同浓度的待测标准品的发光值的线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，可按照常规条件的进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一～实施例四
一种抗原偶联氨基磁珠的方法，具体包括以下步骤：
S1、配制溶液：将二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(简称为“BS3”)用去离子水溶解为得到BS3溶液，配制包被缓冲液，所配制的BS3溶液的浓度和包被缓冲液的pH值及种类参见表1；
S2、洗涤磁珠：按表1的要求将氨基磁珠用包被缓冲液洗涤数次；
S3、一步混合包被法进行偶联：弃去上清液，依次加入包被缓冲液、BS3溶液和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)抗原，得到混合物，将混合物置于滚轴混匀仪上，在18℃～37℃的恒温箱中，以40rpm～60rpm转速滚轴混匀2h～8h进行偶联，其中偶联时包被缓冲液体积与BS3溶液的加入的体积比参见表1，得到偶联抗原后的氨基磁珠；
S4、将偶联抗原后的氨基磁珠磁分离后弃去上清液，再加入磁珠封闭液，在18℃～37℃的恒温箱中，置于40rpm～60rpm转速的滚轴混匀仪上，滚轴混匀1h～3h，得到封闭的氨基磁珠；
S5、封闭完成后，将磁珠分离，弃去上清液，再加入磁珠保存液得到制备完成的氨基磁珠样品1～4，置于2℃～8℃下存储。
表1：各实施例相应参数
对比例一
对比例一同实施例一，区别在于不配制和使用BS3溶液，而是分别使用相同浓度的戊二醛和SMCC，分别制备得到氨基磁珠对照品1-1和1-2。
对比例二
对比例一同实施例一，区别在于不采用一步混合包被法进行偶联，而是采用二步包被法：
利用BS3溶液分别处理氨基磁珠和抗原后，再进行混合包被，制备得到氨基磁珠对照品2-1；
利用戊二醛溶液分别处理氨基磁珠和抗原后，再进行混合包被，制备得到氨基磁珠对照品2-2；
利用SMCC分别处理氨基磁珠和抗原后，再进行混合包被，制备得到氨基磁珠对照品2-3。
对比例三
对比例一同实施例一，区别在于偶联过程的混匀方式不采用滚轴混匀，而是采用旋涡混匀，分别设置旋涡混匀的转速为500rpm、800rpm和1000rpm，制备得到氨基磁珠对照品3-1、3-2和3-3。
分析及测试
1、利用化学发光仪测定不同浓度的待测标准品的发光值(即RLU值)，试剂磁珠分别使用本发明实施例样品和对照品，酶标记物使用检测目标物的抗原酶标记物，其中标准品的抗体浓度(即HP抗体浓度)分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、80ng/mL，待测标准品的加样量为10μL，结果参见表2和图1～3。
表2：不同浓度的待测标准品的发光值检测结果汇总
在本试验中，标准品的抗体浓度和发光值相关系数越高，斜率越大，则说明所测试的氨基磁珠的灵敏度越好，相对应的抗原偶联效率也就越高。
各样品的线性回归方程如下：
样品1：y＝1002.4x+224.91，R2＝0.9998；
样品2：y＝1031.9x+138.78，R2＝0.9997；
样品3：y＝1029.2x+117.63，R2＝0.9993；
样品4：y＝1088.2x-877.54，R2＝0.9994；
对照品1-1：y＝41.031x+1109，R2＝0.734；
对照品1-2：y＝24.216x+183.19，R2＝0.9847；
对照品2-1：y＝1133.1x-567.87，R2＝0.9998；
对照品2-2：y＝879.1x-5.9419，R2＝0.9984；
对照品2-3：y＝927.79x+71.949，R2＝0.9996；
对照品3-1：y＝504.53x+931.29，R2＝0.9776；
对照品3-2：y＝273.48x+1663.9，R2＝0.8834；
对照品3-3：y＝157.13x+487.54，R2＝0.9734。
在图1中，本发明样品1～4不仅线性程度很好，相关系数均能达到0.999以上，而且斜率高，可以达到1000以上。图1～3中，除对比例二即二步包被法对比外，其他对照品的线性程度不高，灵敏度最低的对照品1-1和对照品1-2的斜率不到50。说明使用传统的交联剂，如戊二醛，由于戊二醛是一种单功能基团的生物交联剂，介导的连接反应方向性差，抗体偶联效率非常低；使用SMCC做交联剂，较戊二醛的偶联效果有所提升，这是因为SMCC是一种双功能交联剂，可以一定程度上提高介导的方向性。
由表2结果和线性方程可见，二步混合包被法可以提高抗原偶联效率。而本发明以BS3做介导可采用一步混合包被法偶联，其偶联效率与二步混合包被法相当，比二步混合包被更加简单易操作。BS3是一种水溶性DSS类似物，具有不通透膜，是一种反应基团为双功能的N-羟基硫代琥珀酸亚胺酯，BS3在8个碳原子间隔臂的每个末端有一个胺反应性N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)酯，NHS酯在pH7-9的条件下与伯胺反应可形成稳定的酰胺键，同时释放N-羟基磺基琥珀酰亚胺离去基团。蛋白(即抗原)通常在赖氨酸残基的侧链和每个多肽的N端有若干伯胺，这些伯胺可用作NHS酯交联试剂的靶标，一步混合包被时，抗原和氨基磁珠在BS3的作用下，可直接形成抗原自交联-磁珠包被物，相比于市面使用的的戊二醛和SMCC，抗原包被量大大提升，提高了检测的灵敏度，反应效率更高。相比与两步混合包被法，一步包被法操作简便，缩短了包被的时间，成本更加低廉。
2、抗原偶联氨基磁珠稳定性试验
取氨基磁珠样品1、样品2、对照品2-1、2-3和3-1，在37℃下加速7天，测试其发光值(HP抗体浓度10ng/mL)，结果参见表3。
表3：氨基磁珠稳定性试验结果
由表3结果可见，本发明制备的氨基磁珠样品的稳定性更高，在37℃下加速7天，测试效果平均降幅为5.5％。
综合考虑线性相关系数、斜率和稳定性，可以将实施例1的工艺作为最优工艺。
Claims (10)
1.一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，采用一步混合包被法进行偶联，具体操作为：将氨基磁珠用包被缓冲液进行洗涤后，加入至包被缓冲液中，再加入BS3溶液和抗原，于18℃～37℃下混匀进行偶联，偶联结束后，分离得到偶联抗原后的氨基磁珠，加入磁珠封闭液混匀进行封闭，封闭完成后分离得到氨基磁珠，加入磁珠保存液，制备得到抗原偶联氨基磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的BS3溶液的浓度为5mg/mL～15mg/mL，制备过程为将BS3溶于去离子水。
3.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，偶联时所加入的包被缓冲液与BS3溶液的体积比为5～15:1。
4.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的偶联的时间为2h～8h。
5.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的混匀方式为滚轴混匀，转速为40rpm～60rpm。
6.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的包被缓冲液为PBS、MES及Tris缓冲液中的任意一种，洗涤的次数为2～4次。
7.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，加入磁珠保存液后制备得到抗原偶联氨基磁珠的浓度为5mg/mL～15mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的偶联温度为25℃。
9.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的偶联时所加入的包被缓冲液与BS3溶液的体积比为10:1。
10.根据权利要求1所述的一种抗原偶联氨基磁珠的制备方法，其特征在于，所述的偶联的时间为5h。
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